KR20190047880A

KR20190047880A - 에티오나마이드를 이용한 줄기세포 이동성 향상 방법

Info

Publication number: KR20190047880A
Application number: KR1020170142231A
Authority: KR
Inventors: 나덕렬; 장종욱; 손효진
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2019-05-09
Also published as: KR102025474B1; WO2019088480A3; US11913020B2; EP3705569A4; EP3705569A2; US20200339948A1; WO2019088480A2

Abstract

본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는 줄기세포 이동성 향상용 배지 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 유전자 조작이나 바이러스 벡터 등을 사용하지 않으면서 배양환경 조절이라는 간편하고도 안전한 방법을 통해 줄기세포의 이동성을 효과적으로 향상시킬 수 있으며, 상기 방법에 의해 이동성이 향상된 줄기세포는 이식 후 손상부위로 빠르게 이동하여 기능할 수 있는 줄기세포치료제로써 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

에티오나마이드를 이용한 줄기세포 이동성 향상 방법{Methods for improving migration of stem cell using ethionamide}

본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는 줄기세포 이동성 향상용 배지 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 이러한 줄기세포는 분화능력에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell) 및 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있으며, 상기 다분화능 줄기세포는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로 분화할 수 있는 줄기세포를 말한다.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 상기와 같은 다분화능과 함께, 조직의 재생, 치료 및 면역 반응에 관여하는 세포로 알려져 있어, 이와 같은 특성을 이용하여 제대혈, 골수 등으로부터 중간엽 줄기세포를 분리 배양하여 다양한 질환의 치료제로 개발하고자 하는 노력이 꾸준히 이어져오고 있다. 특히, 중간엽 줄기세포를 이용한 줄기세포치료제 개발에 있어서 줄기세포의 이동능력은 세포의 이식 후 병변 부위에서 빠른 시간 내 작용할 수 있도록 하거나 생착능을 증진시키는데 중요한 특성이므로 줄기세포의 이동 및 유도 기작이 중요한 과제로 인식되고 있다.

이에 줄기세포의 증식과 이동능을 촉진시키기 위한 연구가 이루어지고 있고 일례로 IGF-1(insulin-like growth factor-1)이 몇몇 줄기세포의 증식과 이동을 촉진한다고 보고된바 있으나(Biochem Biophys Res Commun. 2007 May 11;356(3):780-4.), 중간엽 줄기세포의 이식 후 세포의 이동 및 유도 기작은 정확히 알려진 바가 없다. 중간엽 줄기세포의 이동능이 결여되거나 감소된 경우 치료효과가 현저히 감소하므로 이동능을 효율적으로 향상시켜 줄기세포치료제의 효과를 증진시킬 수 있는 방법이 필요하다.

이에, 본 발명자는 줄기세포의 이동성을 향상시킬 수 있는 방법에 대하여 예의 연구한 결과, 종래 항생제로 알려져 있는 에티오나마이드(ethionamide)가 줄기세포의 이동성을 효과적으로 향상시킬 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는, 줄기세포 이동성 향상용 배지 조성물, 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는, 줄기세포 이동성 향상용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 에티오나마이드는 배지에 1 내지 500 μM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구체예로서, 상기 배지는 소태아혈청(FBS) 및 젠타마이신(gentamicin)이 첨가된 α-MEM(Minimum Essential Media) 배지인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 배지는 줄기세포 내 CXCR4(chemokine (C-X-C motif) receptor 4) 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 이동성 향상방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻어진, 이동성이 향상된 줄기세포를 제공한다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 인간 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 처리하여 배양한 결과 상기 줄기세포의 이동성이 현저히 증진되는 것을 실험적으로 확인하였다. 따라서 본 발명에 의하면 유전자 조작이나 바이러스 벡터 등을 사용하지 않으면서 배양환경 조절이라는 간편하고도 안전한 방법을 통해 줄기세포의 이동성을 효과적으로 향상시킬 수 있으며, 상기 방법에 의해 이동성이 향상된 줄기세포는 이식 후 손상부위로 빠르게 이동하여 기능할 수 있는 줄기세포치료제로써 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은, Wound healing assay를 통해 에티오나마이드 처리에 의한 인간 중간엽 줄기세포의 이동능력 향상을 검증한 결과로서, 현미경을 통한 스크래치 관찰 결과(도 1a) 및 이동한 세포 수를 측정한 정량적 결과(도 1b)를 나타낸 것이다.
도 2는, 트랜스웰 분석(Transwell assay)을 통해 에티오나마이드 처리에 의한 인간 중간엽 줄기세포의 침윤능력 향상을 검증한 결과로서, 현미경을 통한 헤마톡실린(hematoxylin) 염색 세포의 관찰 결과(도 2a) 및 이동한 세포 수를 측정한 정량적 결과(도 2b)이다.
도 3은, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통해 에티오나마이드를 처리 또는 비-처리한 인간 중간엽 줄기세포에서 이동능 관련 유전자인 CXCR4의 발현수준을 측정한 결과이다.

본 발명은, 에티오나마이드를 포함하는, 줄기세포 이동성 향상용 배지 조성물을 제공한다.

종래, 하기 화학구조를 갖는 에티오나마이드(2-ethylpyridine-4-carbothioamide)는 티오나마이드 계열의 항생제로써 세균에 의한 감염 질환 치료 용도가 알려져 있었으나, 본 발명에서는 에티오나마이드의 줄기세포 이동 향상 용도를 최초로 발견하였다.

[ethionamide]

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 에티오나마이드 처리에 의한 줄기세포의 이동성 향상 효과를 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는, Wound healing assay를 통해 에티오나마이드를 처리한 후 배양한 인간 제대 중간엽 줄기세포가 에티오나마이드를 처리하지 않는 동일한 종류의 줄기세포에 비하여 세포의 이동성이 현저히 향상된 것을 관찰하였고, 이러한 이동능력은 에티오나마이드의 처리농도에 비례하여 높게 나타나는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 에티오나마이드를 처리하여 배양한 인간 제대 중간엽 줄기세포와 에티오나마이드를 처리하지 않고 배양한 동일한 중간엽 줄기세포를 이용해 트랜스웰 분석을 실시한 결과, 에티오나마이드를 처리한 경우 그 농도에 비례하여 중간엽 줄기세포의 침윤능력이 증가한 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 에티오나마이드 처리에 의해 인간 제대 중간엽 줄기세포에서 이동능과 관련된 유전자인 CXCR4의 발현수준이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

상기 결과들은 에티오나마이드 처리를 통해 인간 중간엽 줄기세포의 이동성을 효과적으로 향상시킬 수 있음을 보여주는 것이다.

본 발명에서 배지에 포함되는 에티오나마이드의 농도에 제한은 없으나, 바람직하게는 1∼500uM의 농도, 보다 바람직하게는 10~200 uM로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 100 uM의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명에서 세포 배양에 이용되는 배지에 제한은 없으나, 예컨대 소태아혈청(FBS) 및 젠타마이신이 첨가된 α-MEM(Minimum Essential Media) 배지인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게 상기 소태아혈청은 10%, 젠타마이신은 50 ug/ml의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명에서 '줄기세포'란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 성체로부터 유래된 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나 이에 한정되지 않으며, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, '제대-유래 줄기세포(Wharton's Jelly-derived stem cells)'는 제대로부터 분리된 줄기세포를 모두 포함하며, 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미할 수 있고, 일반적으로 와튼 젤리(Wharton's Jelly)로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직을 의미할 수 있다.

본 발명에 있어서, '태반-유래 줄기세포(placenta-derived stem cells)'는 태반으로부터 분리된 줄기세포를 모두 포함하며, 바람직하게는 체외로 분리된 인간의 태반으로부터 분리된 4종류의 줄기세포, 즉 (1) 양막 상피세포(human amniotic epithelial cells, hAEC), (2) 양막에서 유래한 중간엽 줄기세포(human amniotic mesenchymal stromal cells 또는 human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSC), 3) 융모막 중간엽 줄기세포(human chorionic mesenchymal stromal cells 또는 human chorionic mesenchymal stem cells, hCMSC), 및 (4) 융모 영양막 세포(human chorionic trophoblastic cells, hCTC)를 포함한다.

중간엽줄기세포의 분리는 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면, Pittenger 등(Science 284: 143, 1997)와 van 등(J. Clin. Invest., 58: 699, 1976)의 문헌들에 개시되어 있는 방법으로 분리할 수 있다.

본 발명에서 줄기세포 이동성 향상이란, 줄기세포의 이동능력이 향상되는 것으로 줄기세포의 이동능과 관련된 유전자인 CXCR4(chemokine (C-X-C motif) receptor 4)의 발현이 증가하는 것을 의미할 수 있으며, 궁극적으로 상기 세포의 이식 시 이식 부위에서 치료부위로의 이동활성(migration activity)이 향상되는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 증식 향상방법, 및 이에 의해 얻어진 이동성이 향상된 줄기세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 줄기세포를 포함하는, 다양한 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 인간 제대 중간엽 줄기세포의 준비

인간 제대 중간엽 줄기세포는 삼성서울병원의 IRB (IRB# 2015-09-023-003)에 의해 승인된 기준에 따라 탯줄을 확보한 후, 다음의 방법으로 중간엽 줄기세포를 분리하였다.

우선, 3-4cm의 탯줄 조직을 잘게 자르고, 세포 외 기질을 분해하기 위해 콜라게나아제 용액(Gibco, USA)을 60-90분 동안 처리한 후, 0.25% 트립신(Gibco, USA)을 넣고 30분 동안 37℃에서 분해시켰다. 이후, 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)(Biowest, USA)을 넣고 1000×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 얻은 후, 10% FBS와 50 ug/ml 젠타마이신(Gibco, USA)이 첨가된 MEM 배지(Minimum Essential Media) (Gibco, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 환경에서 세포를 배양하여, passage 5 또는 6의 중간엽 줄기세포를 실험에 사용하였다.

실시예 2. 에티오나마이드 처리에 의한 인간 중간엽 줄기세포의 이동능 향상 확인

에티오나마이드 처리에 따른 인간 중간엽 줄기세포의 이동능 향상효과를 알아보기 위해 Wound healing assay를 실시하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1의 방법에 따라 준비한 인간 제대 중간엽 줄기세포(5×10⁴세포)를 6 well plate에 분주하고, 이와 동시에 에티오나마이드를 10 μM 또는 100 μM의 농도로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 세포증식을 억제하기 위하여 mitomycin C를 10 μg/ml의 농도로 처리하고 2시간 동안 반응시킨 후 팁을 이용해 스크래치(scratch)를 낸 다음 배양액을 새로 갈아주었다.

14시간 후 스크래치를 관찰한 결과 도 1a에 나타낸 바와 같이 에티오나마이드를 처리하지 않는 대조군(control)에 비하여 처리한 군(Ethionamide 10μM 및 Ethionamide 100μM)에서 줄기세포가 이동한 것을 관찰하였으며, 이러한 세포의 이동능력은 에티오나마이드의 처리농도에 비례하게 나타났다. 상기 결과를 정량적으로 확인하기 위해 이동된 줄기세포 수를 세어 그래프로 나타낸 결과 도 1b에 나타낸 바와 같이 에티오나마이드 처리에 의해 인간 중간엽 줄기세포의 이동능력이 유의미하게 증가한 것을 확인하였다.

실시예 3. 에티오나마이드 처리에 의한 인간 중간엽 줄기세포의 침윤능 향상 확인

상기 실시예 2의 결과에 더하여, 에티오나마이드 처리에 따른 인간 중간엽 줄기세포의 침윤능 향상효과를 알아보기 위해 트랜스웰 분석(Transwell assay)을 실시하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1의 방법에 따라 준비한 인간 제대 중간엽 줄기세포(5×10⁴ 세포)를 8.0 μm pore size를 갖는 트랜스웰(Costar, USA)에 분주하고, 에티오나마이드를 10 μM 또는 100 μM의 농도로 각각 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 이후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 이용해 세포를 고정시킨 다음 헤마톡실린(hematoxlin)으로 염색하고 면봉으로 트랜스웰의 안쪽면을 닦아낸 후 현미경으로 트랜스웰의 아래쪽면에 존재하는 세포 수를 측정하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 에티오나마이드를 처리하지 않은 군(Control)에 비하여 처리한 군(Ethionamide 10μM 및 Ethionamide 100μM)에서 염색된 줄기세포의 수가 증가한 것을 통해 에티오나마이드 처리에 의해 상기 줄기세포의 침윤능력이 증가하는 것을 확인하였으며, 이러한 세포의 침윤능력은 에티오나마이드의 처리농도에 비례하에 나타났다. 또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이 에티오나마이드 처리에 의해 인간 중간엽 줄기세포의 침윤능력이 유의미하게 증가한 것을 정량적으로 확인하였다.

실시예 4. 에티오나마이드 처리에 따른 인간 중간엽 줄기세포의 이동능 관련 유전자의 발현수준 검증

상기 실시예 2 및 3의 결과를 바탕으로, 에티오나마이드 처리 시 줄기세포의 이동능 관련 유전자의 발현수준이 변화하는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1의 방법에 따라 준비한 인간 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 72시간 동안 처리한 후 Trizol(Ambion, USA)을 이용하여 세포를 용해시켰다. 다음으로 클로로포름(chloroform, Sigma aldrich, USA)을 첨가하고 원심분리한 다음 상층액만 새 튜브에 옮겨 담고 이소프로판올(isopropanol, Amresco, USA)을 첨가한 후 다시 원심분리하여 RNA가 침전되도록 하였다. 이후 75% 에탄올(ethanol, Merck Millipore, USA)을 첨가해 RNA를 세척하고 완전히 건조시킨 RNA를 DEPC water(Biosesang, korea)에 녹였다. 상기 방법에 따라 에티오나마이드를 처리 또는 비처리한 인간 중간엽 줄기세포로부터 추출한 RNA 5 μg을 cDNA 합성에 사용하였으며 이때 cDNA synthesis kit(Invitrogen, USA)를 사용하였다. 이후 합성된 cDNA에 줄기세포 이동능과 관련된 유전자인 chemokine (C-X-C motif) receptor 4(CXCR4)에 특이적인 프라이머(Bioneer, korea) 10 pM과 SYBR green master mix(Applied biosystems, USA)를 넣고 real time PCR 기기(Applied Biosystems, USA)를 이용해 cDNA를 증폭한 다음 결과를 분석하여 초기 cDNA의 양을 파악하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 에티오나마이드를 처리하지 않은 줄기세포(Control)와 비교하여 처리한 줄기세포(Ethionamide-primed MSCs)에서 CXCR4 유전자의 발현수준이 4배 이상 증가한 것을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는, 줄기세포 이동성 향상용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 에티오나마이드는 배지에 1 내지 500 μM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배지는 소태아혈청(FBS) 및 젠타마이신(gentamicin)이 첨가된 α-MEM(Minimum Essential Media) 배지인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
제4항에 있어서,
상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배지는 줄기세포 내 CXCR4(chemokine (C-X-C motif) receptor 4) 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
제1항의 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 이동성 향상방법.
제7항에 있어서,
상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 이동성 향상방법.
제7항의 방법에 의해 얻어진, 이동성이 향상된 줄기세포.
제9항에 있어서,
상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포.