KR20130085863A

KR20130085863A - 중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물

Info

Publication number: KR20130085863A
Application number: KR1020120006985A
Authority: KR
Inventors: 박소라; 최병현; 김나경
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2012-01-20
Filing date: 2012-01-20
Publication date: 2013-07-30

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물 및 이의 유도방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 콜로니 자극인자를 포함하는 상기 조성물 및 유도방법은 중간엽 줄기세포를 자극, 증식시키고 CXCR4, SDF-1에 의해 조절되어 말초혈액으로 중간엽 줄기세포의 이동을 유도하는데, 이러한 중간엽 줄기세포의 증식 및 이동 유도효과는 세포의 자가재생에 유용할 뿐 아니라 중간엽 줄기세포의 수득, 채취를 용이하게 하며, 다양한 상처와 질환의 세포치료제로 활용될 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물 {Composition for inducing migration of mesenchymal stem cells}

본 발명은 중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물 및 이의 유도방법에 관한 것이다.

골수유래 중간엽 줄기세포 (bone marrow mesenchymal stem cell)는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell)와 함께 골수 내에 존재하는 줄기세포로, in vitro 배양시 증식 및 팽창이 가능하고 적절한 배양환경이 주어지면 골세포, 연골세포, 지방세포, 근아세포, 간세포, 심근세포, 신경세포 등 다양한 계통의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지니고 있다 (M.F. Pittenger 등, 1999 ; R.J. Deans 등, 2000). 이러한 이유로 조직재생을 위한 골수유래 중간엽 줄기세포의 연구가 세포생물학, 조직공학 분야 등에서 많이 진행되었으며, 또한 심근손상과 뇌손상에 골수유래 중간엽 줄기세포의 이식을 통한 임상시험 연구도 이루어지고 있다.

골수에서 분리된 골수유래 중간엽 줄기세포는 in vitro 상태에서 콜로니 (colony)를 형성하면서 섬유아세포 (fibroblast)와 유사한 특징을 이루며 배양되므로 이를 콜로니 형성 단위 섬유아세포 (colony forming unit-fibroblasts, 이하 CFU-Fs)라고 명하였는데 CFU-Fs는 하나의 골수유래 중간엽 줄기세포가 증식되어서 콜로니를 이루는 것으로 밝혀졌다 (Castro-Malaspina H 등, 1980 ; Friedenstein A 등, 1970 ; Owen M 등, 1988). 즉 CFU-Fs는 골수유래 중간엽 줄기세포의 수를 의미하는 것으로 골수유래 중간엽 줄기세포에 대한 연구에 많이 사용되고 있으며, CFU-Fs가 클수록 많은 양의 골수유래 중간엽 줄기세포를 얻었음을 의미한다. 하지만 골수내의 세포들은 매우 이질적 (heterogeneous) 상태 (Paolo Bianco 등, 2001 ; D. Baksh 등, 2004)로 그 중 골수 유래 중간엽 줄기세포의 비율은 1×10⁵의 골수세포 중 하나로 상당히 낮으며 (Galotto M 등, 1999), 낮은 비율의 골수유래 중간엽 줄기세포 중에서도 CFU-Fs를 형성하는 능력을 지닌 집단이 따로 있는 것으로 알려져 있다 (Gronthos S 등, 2003 ; Kortesidis A 등, 2005). 또한 환자의 나이가 증가함에 따라 골수 내의 골수유래 중간엽 줄기세포의 비율은 감소하는 것으로 알려져 있다 (Gianluca D'ippolito 등, 1999 ; Christine fehrer 등, 2005).

한편, 중간엽 줄기세포는 세포치료에 있어서 매력적인 후보물질이나 현재는 주로 골수에서 단핵구 세포를 추출한 다음 중간엽 줄기세포를 분리하여 사용하고 있는데, 단핵구세포를 골수에서 직접 추출할 경우 환자에 많은 고통이 수반되기 때문에 큰 문제가 되고 있다. 지금까지 골수 유래 줄기세포의 말초혈관 이동에 대한 연구는 주로 조혈줄기세포에서 진행되었으며 IGF-1 (insulin-like growth factor-1 을 포함하여 몇몇 단백질이 조혈줄기세포의 증식과 이동을 촉진한다고 알려졌다.

하지만, 골수 중간엽 줄기세포를 말초혈액으로 이동시키는 기전 및 방법에 대한 연구는 거의 이루어져 있지 않으며, 따라서 중간엽 줄기세포의 수득, 채취 및 치료 효율의 향상을 위해 줄기세포의 이동에 관여하는 인자를 규명하는 것은 중요한 과제가 되어왔다.

본 발명은 콜로니 자극인자 (CSF)를 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포의 말초 혈액으로의 이동 유도방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 콜로니 자극인자 (CSF)를 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물을 제공한다.

상기 콜로니 자극인자는 GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating growth factor) 및 G-CSF (granulocyte-colony stimulating growth factor)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 골수에 존재할 수 있다.

상기 콜로니 자극인자는 중간엽 줄기세포를 증식시키고 증식된 중간엽 줄기세포를 말초혈액으로 이동시킬 수 있다.

본 발명은 콜로니 자극인자를 처리하여 중간엽 줄기세포를 증식시키는 단계; 및 상기 증식된 중간엽 줄기세포를 말초혈액으로 이동시키는 단계;를 포함하는 중간엽 줄기세포의 말초 혈액으로의 이동 유도방법을 제공한다.

본 발명의 GM-CSF, G-CSF를 포함하는 콜로니 자극인자는 중간엽 줄기세포를 자극하여 활성화, 증식시키고 이를 말초혈액으로 이동시켰는데, 이러한 콜로니 자극인자에 의한 중간엽 줄기세포의 증식 및 말초혈액으로의 이동은 중간엽 줄기세포의 수득 및 채취를 용이하게 하며, 세포, 조직의 자가재생 및 다양한 상처와 질환의 세포치료제로 사용될 수 있다.

도 1은 실험개요를 나타낸 것이다.
도 2는 GM-CSF 투여 1, 3 및 5일 후의 BM 및 PB에서의 단핵세포의 변화를 나타낸 것이다. 도 2A는 전체 대퇴골로부터 골수 단핵구세포 (BM-MNCs)의 수를 계산한 것이고, 도 2B는 18cc 혈액의 말초혈액 단핵구세포 (PB-MNCs)의 수를 계산한 것이다 (**p<0.01, SE=standard errors).
도 3는 GM-CSF 투여 후, 골수와 말초혈액의 단핵구세포 (MNCs)로부터 콜로니의 형성 양상을 분석한 결과를 나타낸 것으로, 도 3A는 12일 배양 후, CFU-Fs를 계산한 것이고, 도 3B는 14일 배양 후 콜로니형성단위-과립 대식세포 (colony forming unit-granulocyte macrophage, CFU-GM)를 현미경하에서 계산한 것이다. (*p<0.05, **p<0.01, SE=standard errors).
도 4는 사이토카인 투여 후 골수와 말초혈액의 단핵구세포의 수 및 CFU-Fs를 분석한 것으로, 도 4A는 흰쥐에 아무 처리하지 않은 것 (검정막대)과 GM-CSF (회색막대), G-CSF (진한 회색막대)를 투여한 후에 골수 단핵구세포 (BM-MNCs) 및 말초혈액 단핵구세포 (PB-MNCs)의 수를 조사하였다. 도 4B는 흰쥐에 사이토카인 투여 후 골수 및 말초혈액으로부터 CFU-Fs를 계산한 것이다 (*p<0.05, **p<0.01, SE=standard errors).
도 5은 트랜스웰에서 중간엽 줄기세포에 사이토카인 (GM-CSF, G-CSF)과 키모카인 (SDF-1)의 이동 효과를 나타낸 것으로, 도 5A는 중간엽 줄기세포가 자라고 있는 트랜스웰 챔버의 배지에 GM-CSF 및 G-CSF (10~500 ng/ml)을 처리하고 24시간 후에 챔버의 아래쪽으로 이동한 세포를 계산한 것이고, 도 5B는 트랜스웰 하위챔버의 배지에 SDF-1 (10~500 ng/ml)을 처리하고 24시간 후에 챔버의 아래쪽으로 이동한 세포를 계산한 것이다 (*p<0.05, SE=standard errors).
도 6은 GM-CSF 투여 5일 때까지 골수에서 대퇴부 (femur) 환경 변화를 나타낸 것이다. 도 6A, 6D, 6G는 피모니다졸 (pimonidazole)을 colorimetric DAB를 사용하여 가시화한 다음 수를 계산한 것이고, HIF-1α(6B, 6E, 6H) 및 MMP-9 (6C, 6F, 6I)을 또한 분석하였다. GM-CSF 투여 1, 3 및 5일 후, 수의 변화를 도 6A, 6B, 6C에 표현하였고, GM-CSF를 5일간 처리하기 전 (6D, 6E, 6F)과 후 (6G, 6H, 6I)를 현미경하에서 관찰하였다.
도 7은 GM-CSF 투여에 의한 대퇴골 (femur)에서의 SDF-1 및 CXCR4의 발현 양상의 변화를 나타낸 것으로, 상기 데이터는 형광의 상대적 강도치를 나타낸 것이다.
도 8은 중간엽 줄기세포에서 발현된 이동관련 단백질을 나타낸 것으로, GM-CSF (A) 및 G-CSF (B)을 단독으로 처리하거나, SDF-1와 처리하고, HIF-1α, CXCR4, 및 SDF-1 단백질의 발현변화를 관찰한 것이다.

본 발명은 콜로니 자극인자 (CSF)를 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물 및 이의 유도방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

골수는 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 보고로, 종래에는 중간엽 줄기세포를 얻기 위해 골수에서 단핵구 세포를 추출한 다음 중간엽 줄기세포를 분리하였는데, 단핵구 세포를 골수에서 직접 추출할 경우 환자에게 많은 고통이 수반되었기 때문에 문제가 되었다. 이에 본 발명자는 환자에게 고통을 주지 않고 골수로부터 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있는 방법을 찾고자 노력하던 중 본 발명의 조성물 및 방법에 의할 때 상기 문제점이 해결됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 콜로니 자극인자는 과립구나 대식세포의 산생을 촉진하는 인자일 수 있으며, multi-CSF (IL-3), 과립 대식세포 콜로니 자극인자 (granulocyte macrophage-colony stimulating growth factor, GM-CSF), 과립구 콜로니 자극인자 (granulocyte-colony stimulating growth factor, G-CSF), 대식세포 콜로니자극인자 (macrophage-colony stimulating growth factor, M-CSF) 등을 포함하며 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating growth factor) 및 G-CSF (granulocyte-colony stimulating growth factor)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating growth factor)일 수 있다.

종래에는 상기 콜로니 자극인자가 중간엽 줄기세포를 활성화하여 증식시킬 수 있음이 알려져 있지 않았으나, 본 발명에서는 상기 콜로니 자극인자에 의해 중간엽 줄기세포가 활성화, 증식될 뿐만 아니라 말초혈액으로 이동함이 확인되었다.

실시예 2에 나타난 바와 같이, GM-CSF과 G-CSF는 모두 중간엽 줄기세포를 이동시키는 능력이 우수하며, 특히 GM-CSF가 말초혈액으로의 이동능력이 더 우수할 수 있다.

일례로, 50 내지 250 ng/ml 농도에서 GM-CSF가 G-CSF보다 중간엽 줄기세포를 말초혈액으로 이동시키는 능력이 더욱 우수할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포의 존재 부위는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 골수에 존재하는 것일 수 있다.

일례로, 상기 콜로니 자극인자는 골수에 존재하는 중간엽 줄기세포를 활성화하여 증식시키며, 증식된 중간엽 줄기세포에 의해 산소소비가 증가되고 골수는 저산소상태 (hypoxic condition)가 되어 HIF-1α 발현이 유도됨을 확인할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포의 이동은 시간의 경과에 따른 말초혈액의 중간엽 줄기세포의 수를 계산함으로 확인할 수 있다. 일례로, 쥐 골수와 대퇴골로부터 말초혈액에서의 중간엽 줄기세포의 수를 비교해 본 결과, GM-CSF 또는 G-CSF 투입 후 첫날에는 골수에서 중간엽 줄기세포가 증가하다가 시간이 경과함에 따라 감소되는 반면, 말초혈액에서는 시간이 경과함에 따라 중간엽 줄기세포의 수가 증가되어, 상기 콜로니 자극인자에 의해 중간엽 줄기세포가 골수에서 말초혈액으로 이동함을 확인할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포의 이동은 CXCR4 및 SDF-1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 의해 조절되어질 수 있다.

본 발명의 GM-CSF 또는 G-CSF와 같은 콜로니 자극인자를 중간엽 줄기세포에 처리시, CXCR4 및 SDF-1의 발현이 유도될 수 있다. CXCR4 발현의 증가는 중간엽 줄기세포가 SDF-1과 같은 키모카인을 향해 이동할 수 있으며, 이동능력 또한 증가될 수 있다.

상기 콜로니 자극인자는 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, GM-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군에 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 GM-CSF을 포함할 수 있다.

상기 중간엽줄기세포의 말초혈액으로의 이동은 CXCR4 및 SDF-1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 의해 조절될 수 있다.

종래부터 중간엽 줄기세포는 골수 (bone marrow)에 가장 많이 존재한다고 알려져 있지만 골수조직 내 10⁵ 분의 1에 해당하는 세포만이 중간엽 줄기세포로 굉장히 희소할 뿐 아니라, 중간엽 줄기세포의 채취는 수회 수술침으로 찌르는 등 침습적인 (invasive) 기술이므로 실용화하기 어렵고, 시술할 경우 전신마취를 필요로 하므로 환자에게 정신적, 육체적으로 큰 고통을 수반하였다.

그러나, 본 발명의 콜로니 자극인자를 사용할 경우 골수에서 말초혈액으로 중간엽 줄기세포가 스스로 이동하기 때문에, 복잡한 수술이나 채취과정을 거치치 않고도 손쉽게 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다는 장점이 있고, 상기 얻어진 중간엽 줄기세포는 자가복제 및 다분화 능력이 우수하기에 다양한 상처, 질환의 자가재생 및 세포치료에 중요한 역할을 할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 들은 본 발명을 예시한 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: CSF 에 의한 골수 단핵구세포 (MNCs ) 및 중간엽 줄기세포 ( MSCs )의 말초혈액으로의 이동

실시예 1-1: 동물실험

GM-CSF와 G-CSF를 각각 5일간 연속적으로 50 ㎍/kg으로 복강에 투여하였다.

실시예 1-2: 골수 및 말초혈액의 단핵구세포 ( MNCs )의 분리

근육내 주사를 통해 졸레틸 (zoletil; Virbac, Australia) 및 럼푼 (rompun) (1:1)의 혼합물 1 cc/kg 체중을 사용하여 10-12주가 된 수컷 Sprague Dawley (SD)쥐를 마취하였다. 이후 대퇴골 (femurs)을 쥐로부터 제거한 다음, 골수를 분리하기 위해 대퇴골의 양쪽 말단을 절단하였다. DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline; GIBCO, USA)으로 씻어내면서 골수를 수거하여 세포 현탁액을 70㎛ nylon mesh cell strainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 통과시켰다. 10 mL PB가 심장으로부터 직접적으로 채취하여 15 mL PBS와 혼합하였다. 세포 현탁액을 15mL ficoll 용액 (Ficoll-Paque^TMPLUS; Amersham Biosciences, Sweden) 위에 섞이지 않게 조심스레 올려서, 2000rpm에서 20분간 원심분리하였다. 파이펫을 사용하여, 플라즈마와 ficoll-paque간 계면에 단핵구세포 (MNCs) 층을 분리하여 원심분리 튜브에서 DPBS를 사용하여 두 번 세척하였다.

실시예 1-3: 콜로니 분석

중간엽 줄기세포 (MSCs)를 분리하기 위해, 37℃, 5% CO₂ / 95% air의 배양 조건 하에서 100 IU/L 페니실린 및 10 ㎍/mL 스트렙토마이신, 10%의 태아소혈청 (FBS; Gibco-BRL, Scotland)을 함유하는 α-minimum essential media (α-MEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 배양 배지에서 단핵구세포 (MNCs)를 배양하였다.

초기 배양한 세포의 수는 100 mm 배양접시에서 1x10⁷cells이었고 6일 동안 배지의 교환하지 않고 배양하였다. 단 3일째 되는날 배지를 첨가해준다. 6일 후에 비부착된 세포와 배지를 제거하고 새로운 배지로 교환하였다. 부착된 세포들을 섬유아세포 콜로니 (colony-forming unit-fibroblast, CFU-F)를 형성할 때까지 12일간 배양하였다. 콜로니들을 크리스탈 바이올렛 용액 (5% crystal violet in methanol)을 사용하여 5분간 염색하였다. 중간엽 줄기세포를 분리하기 위해, 단핵구세포 (MNCs)을 Methocult methylcellulose-based 삼차원 배지 (StemCell Technologies Inc, CA)에서 배양하였다. 1x10⁵세포들을 35 mm 배양접시 당 0.3 mL Methocult 배지에 도말하고 14일간 >95% 습도를 유지하였다. 과립대식세포 (glanulocyte-macrophage)에 대한 콜로니형성유닛인 CFU-GM 수를 40x 배율이 장착된 도립현미경 (inverted microscope)을 사용하여 측정하였다. 각 실험그룹으로부터 10 마리 쥐의 우대퇴골을 추출하였고, 대퇴골의 무게의 차이를 측정함으로 골수에서의 단핵세포 수의 오차를 고려하였다.

표 1은 쥐의 우대퇴골의 무게를 나타낸 것으로, 실험군 간에 대퇴골 무게는 큰 차이가 없음이 확인되었다.

쥐의 대퇴골로부터의 골수 및 말초혈액의 단핵구세포 (MNCs)의 수가 계산되었고 시간에 따른 변화를 체크하였다. 상기 실험결과, 골수 단핵구세포 (BM-MNCs)의 수가 GM-CSF 투여 후 첫날에 증가되고, 이후, 5일째 대조군에 비해 GM-CSF 투여그룹에서 감소되었다. 그러나, 말초혈액 단핵구세포 (PB-MNCs)의 수는 대조군과 비교할 때 GM-CSF 그룹에서 크게 증가되었다 (도 2A 및 B). 중간엽 줄기세포는 쥐 대퇴골 골수로부터 분리되었다. 2주 동안 줄기세포를 배양한 다음, 콜로니들이 형성되고 증식하여 중간엽 줄기세포의 특징을 나타내는 CFU-Fs를 형성하였다. CFU-F 콜로니 수는 골수에서 감소되었으나, 말초혈액에서는 증가되었다 (도 3A). 배양 14일째, 메틸셀루로오스 배지에서 형성된 CFU-GM 콜로니들이 분석되었다. 상기 결과는 골수에서 대조군보다 더 적은 CFU-GMs 수가 GM-CSF에서 보였고, 말초혈액에서 대조군보다 상당히 증가된 CFU-GMs 수가 실험군에서 보였다 (도 3B).

다른 구획의 단핵구세포 (MNCs) 변화를 G-CSF 및 GM-CSF와 비교하였다 (도 4A). 5일째, 사이토카인 그룹의 총 단핵구세포 (MNCs)가 골수에서 감소되었다. 상기 결과는 어떤 세포군집이 사이토카인에 의해 이동됨을 나타내는 것이다. CFU-Fs의 변화는 또한 단핵구세포 (MNCs)와 동일한 방식으로 비교되었다 (도 4B). 골수의 총 CFU-Fs는 감소되었으나, 대조군과 비교할 때 말초혈액의 CFU-Fs는 사이토카인 그룹에서 증가되었다. 상기 결과는 골수의 중간엽 줄기세포 군집이 또한 말초혈액으로 이동함을 나타낸다.

실시예 2: 체외 배양 조건에서 중간엽 줄기세포의 이동

실시예 2-1: 세포배양

중간엽 줄기세포를 분리하기 위해, 37℃, 5% CO₂ / 95% air의 배양 조건 하에서 100 IU/L 페니실린 및 10 ㎍/mL 스트렙토마이신, 10%의 태아소혈청 (FBS; Gibco-BRL, Scotland)을 함유하는 α-minimum essential media (α-MEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 배양 배지에서 단핵구세포 (MNCs)를 배양하였다. 초기 배양한 세포의 수는 100 mm 배양접시에서 1x10⁷cells이었고 6일 동안 배지의 교환하지 않고 배양하였다. 단 3일째 되는 날 배지를 첨가해준다. 6일 후에 비부착된 세포와 배지를 제거하고 새로운 배지로 교환하였다. 이 후 세포는 계대배양을 위해, 2x10⁵세포들을 100mm 배양접시에서 배양하고, Passage 2~4의 세포를 중간엽 줄기세포로 간주하여 다음 실험에 사용하였다.

실시예 2-2: 트렌스웰 분석 ( Transwell assay )

생체 밖에서 중간엽 줄기세포의 이동능력에 대한 GM-CSF의 효과를 조사하였다. 배양된 골수 중간엽 줄기세포를 계대배양 4번째에 트랜스웰 (transwell)로 옮겨 실험을 수행하였다. 싸이토카인으로서는 GM-CSF 및 G-CSF을 처리하였고 키모카인으로서 SDF-1를 10-500ng/ml 농도로 사용하였다. 10⁶/ml (upper-chamber: 100ul; lower-chember: 600ul) 밀도로 세포를 도말하였다. 24시간 동안 GM-CSF 처리 후에, 세포들을 고정하고 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였고, 트렌스웰의 내부 용기 (insert)에 있는 세포들을 sterile cotton swab로 제거하였다. 염색된 내부 용기의 막을 현미경으로 관찰하여 남아있는 세포 (이동한 중간엽 줄기세포)를 세었다.

도 5에서 나타난 바와 같이, 24시간에 GM-CSF 와 G-CSF 모두가 10 ng/mL부터 500 ng/mL까지의 농도로 처리하였을 때, 농도에 의존적으로 이동된 중간엽 줄기세포 수를 증가시켰으며, 100 ng/mL가 최고의 효과를 나타내었다 (도 5A). 이동률은 첨가하지 않을 때에 비해 사이토카인 그룹에서 4배 이상 증가 되었다. 키모카인인 SDF-1을 10 ng/mL에서 500 ng/mL 범위로 처리하였을 때, 농도의 의존적으로 이동한 세포수를 증가시켰으며 50 내지 100 ng/mL에서 가장 우수한 이동력을 나타내었다 (도 5B). 상기 결과는 생체 밖에서 GM-CSF가 배양된 중간엽 줄기세포의 이동성에 긍정적인 효과를 나타냄을 가리킨다.

실시예 3: SDF- 1 및 CXCR4 발현의 유도

실시예 3-1: 면역염색 ( Immunostaining )

샘플들을 4% 파라포름알데하이드로 고정하였고, 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) 및 1% 소혈청알부민 (BSA, Sigma-Aldrich)을 함유하는 인산완충염 용액 (PBS, Gibco-BRL)으로 블로킹 (blocking)하였다. 블로킹 후, 샘플들을 실온에서 2시간 동안 일차항체인 HIF-1α(1:1,000; Novus), MMP-9 (1:1,000; Santa Cruz Bio), SDF-1 (1:1,000; Abcam), 및 CXCR4 (1:1,000; Abcam)와 함께 반응하였다. 이후에, 상기 세포들을 PBS로 세척하고 실온에서 30분간 이차항체인 anti-mouse IgG-fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate (1:500, Abcam, Cambridge, UK), anti-rabbit IgG-Cy3 conjugate (1:500, Abcam) 및 anti-rabbit IgGhorseradish peroxidase (HRP) conjugate (Vector, Burlingame, CA)를 배양하였다. 광학으로 관찰하기 위해 HRP-conjugated 일차 항체를 사용하였고 거기에 3,3-diaminobenzi- dine tetrahydrochloride (DAB) substrate (Vector)를 사용하여 가시화하였다. PBS로 세척 후 마운팅한 다음, 세포들을 공초점 현미경 (Eclipse E600, Nikon, Japan)하에서 관찰하였다.

실시예 3-2: 웨스턴 블롯 ( Western blot ) 분석

웨스턴 블롯 분석에 사용된 일차 항체는 HIF-1α(1:1,000), CXCR4 (1:500), SDF-1 (1:1,000), β-액틴 (1:2,000)이였다. 세포의 단백질 추출물을 정량하여 동량의 단백질은 SDS-PAGE에 전기영동 후 PVDF 막 (membrane)으로 이동시켰다. 실온에서 2시간 동안 일차항체인 HIF-1α(1:1,000; Novus), SDF-1 (1:1,000; Abcam), 및 CXCR4 (1:1,000; Abcam)를 반응시키고, 세척한 후 HRP-conjugated anti-rabbit 또는 anti-mouse 이차항체 (Santa Cruz Bio)에 반응시켰다. 막 (membrane)에 ECL 시스템 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ))을 1~2분 처리한 후 X-선 필름에 감광하였다.

GM-CSF 및 G-CSF에 노출 시 이동 관련 단백질의 발현이 조사되었고, 쥐의 골수에서 SDF-1와 CXCR4의 발현을 검출하기 위해 현광 면역조직화학 (immunohistochemistry)을 수행되었다.

피모니다졸 (pimonidazol), HIF-1α, 및 MMP-9에 특이적 항원이 검출되었고 DAB로 염색되었다. 이는 내부 대퇴골에서 저산소 상태 (pimonidazol)를 나타내었고, 단핵구세포 (MNCs)를 발현하는 저산소로 유도된 factor-1a가 GM-CSF 투여 후 대퇴골에서 증가되었다 (도 6A 및 B). 단핵구세포 (MNCs)를 발현하는 MMP-9가 또한 증가되었고, GM-CSF를 투여하는 동안 유지되었다 (도 6C). 5일째 대조군으로 도 6D-F에서 그리고 GM-CSF 그룹으로 도 6G-I에서 면역염색 (immunostaining)의 사진이 보였다. 상기 결과는 systemic GM-CSF 투여에 의해 대퇴골 내에의 골수의 환경이 저산소 상태와 유연한 구조로 변화되었음을 나타낸 것이다. 또한, GM-CSF 처리 후에, 쥐의 골수에서 SDF-1와 CXCR4의 발현을 검출하기 위해 현광 면역조직화학 (immunohistochemistry)을 수행한 결과 (도 7), CXCR4는 GM-CSF 투여 후 첫째 날에 대퇴골의 골수 내부에서 증가되었고, 이후 5일에 이르기까지 점차적으로 감소 되었다. SDF-1의 발현이 투여 동안 증가되어 유지되었다.

세포가 GM-CSF 및 G-CSF에 노출되었을 때, HIF-1α 및 CXCR4의 발현은 급격하게 증가되었다 (도 8). CXCR4 발현의 증가는, MSCs가 SDF-1와 같은 키모카인을 향해 이동하며 이러한 이동능력이 또한 증가되었음을 제시한다. SDF-1에 대한 MSCs의 민감성은 또한 증가 되었다.

Claims

콜로니 자극인자 (CSF)를 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 콜로니 자극인자는 GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating growth factor) 및 G-CSF (granulocyte-colony stimulating growth factor)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수에 존재하는, 중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 콜로니 자극인자는 중간엽 줄기세포를 증식시키고 증식된 중간엽 줄기세포를 말초혈액으로 이동시키는, 중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물.
콜로니 자극인자를 처리하여 중간엽 줄기세포를 증식시키는 단계; 및
상기 증식된 중간엽 줄기세포를 말초혈액으로 이동시키는 단계;를 포함하는 중간엽 줄기세포의 말초 혈액으로의 이동 유도방법.