CN105238746A - 骨髓间充质干细胞的诱导方法及其诱导液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种骨髓间充质干细胞的诱导方法，包括以下步骤：获取骨髓间充质干细胞进行体外培养；在体外培养过程中用诱导液进行诱导；其中，所述诱导液包括血管紧张素II和骨形态发生蛋白-2。通过采用能够促进骨髓间充质干细胞的生长和分化的骨形态发生蛋白以及能够促进骨髓间充质干细胞增殖的血管紧张素II作为诱导剂诱导培养骨髓间充质干细胞，不仅能够防止骨髓间充质干细胞过早脱壁凋亡，而且能够提高骨髓间充质干细胞的活性，并提高其转化率。

Description

骨髓间充质干细胞的诱导方法及其诱导液

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种骨髓间充质干细胞的诱导方法以及所使用的诱导液。

背景技术

冠心病心肌梗死及心力衰竭是严重影响人民生活质量和寿命的主要疾病之一。研究资料显示，成熟的心肌细胞缺乏再生能力，心肌梗死(MI)发生后，梗死区心肌只能通过纤维组织增生，由无收缩功能的疤痕组织代替，导致心功能下降。临床上缺乏针对梗死心肌再生、重建的根本性治疗方法，而细胞替代治疗应运而生成为一个理想的治疗策略。

骨髓间充质干细胞(Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势，因此，探讨MSCs体外大量扩增及向心肌细胞诱导分化条件将对损伤心肌的修复治疗具有深远意义。

在研究MSCs向心肌细胞分化诱导中，目前主要使用化学诱导剂5-氮胞苷(5-azacytidine，5-AZA)。5-AZA是胞苷的类似物，它可以与DNA共价结合形成复合物从而导致DNA甲基在细胞分裂周期中进行性丢失，发挥去甲基化作用，启动MyoD等某些相关等位基因的表达。国外有学者将成年小鼠骨髓基质细胞经5-氮胞苷诱导后，能产生自主收缩的肌管结构的细胞团，显微镜下结构类似胚胎心肌细胞。但细胞经过5-AZA处理后可导致细胞部分皱缩，脱壁，降解、或胞浆内形成脂肪空泡，说明5-AZA作为一种诱导剂对细胞也有一定毒性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中骨髓间充质干细胞诱导转化为心肌细胞的方法所获得的心肌细胞存在细胞易皱缩脱壁死亡等缺陷，提供一种能够提高骨髓间充质干细胞的活性及转化率的骨髓间充质干细胞的诱导方法及该方法中所使用的诱导液。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种骨髓间充质干细胞的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞进行体外培养；

在体外培养过程中用诱导液进行诱导；

其中，所述诱导液包括血管紧张素II和骨形态发生蛋白-2。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，所述血管紧张素II的浓度为1-5μmol/L，骨形态发生蛋白-2的浓度为50-200μg/L。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，获取骨髓间充质干细胞的方法步骤包括：

抽取人骨髓，在含有低糖DMEM的离心管中混合，再过筛，得到细胞悬液，再将所述细胞悬液加入到含Percoll分层液的离心管中，离心，获取单个核细胞。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，所述Percoll分层液的密度为1.067-1.082kg/L。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，获取骨髓间充质干细胞的方法步骤还包括：在获取单个核细胞后，用含有胎牛血清、青霉素和/或链霉素的DMEM对单个核细胞进行培养，再于CO₂培养箱中孵育，36-96个小时后更换培养基，除去未贴壁的细胞，以后每2-4天换液1次，直到单个核细胞增殖达到融合状态，即获得纯化后的原代骨髓间充质干细胞。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，所述DMEM培养基中，胎牛血清的浓度为180-120mg/L，青霉素的浓度为90-110ug/ml，和/或链霉素的浓度为90-110ug/ml。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，用所述诱导液进行诱导反应之前，还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：

S21、用1.5～3mL/L胰蛋白酶将原代骨髓间充质干细胞消化分离，再用完全培养基中止消化，制成细胞悬液；然后传代接种于含新生牛血清的DMEM培养瓶中培养，隔1～3天换液，直至细胞达到90％以上融合；

S22、重复步骤S21继续传代至第4代骨髓间充质干细胞后，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，再用PBS冲洗后，以0.5～1.5×10⁵个/ml的密度接种于多孔板上，培养2-5天。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，用所述诱导液对第4代骨髓间充质干细胞进行诱导反应，包括以下步骤：

利用所述诱导液诱导分化12-36个小时，吸弃诱导液，再用PBS清洗3次，继续用完全培养基培养，每2-5天换液一次，继续培养1-4周。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，所述DMEM培养基中，所述多孔板中内置涂有多聚赖氨酸的盖玻片。

本发明进一步保护骨髓间充质干细胞的诱导方法中所使用的诱导液，该诱导液包括浓度为1-5μmol/L的血管紧张素II，和浓度为50-200μg/L的骨形态发生蛋白-2。

实施本发明提供的诱导液及骨髓间充质干细胞的诱导方法，可以达到以下有益效果：通过采用能够促进骨髓间充质干细胞的生长和分化的骨形态发生蛋白以及能够促进骨髓间充质干细胞增殖的血管紧张素II作为诱导剂诱导培养骨髓间充质干细胞，不仅能够防止骨髓间充质干细胞过早脱壁凋亡，而且能够提高骨髓间充质干细胞的活性，并提高其转化率。

具体实施方式

为解决现有技术中采用5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞转化成的心肌细胞存在细胞易皱缩脱壁、降解死亡等缺陷，本发明的创新点在于提供一种新的骨髓间充质干细胞的诱导方法及诱导液，该方法中采用血管紧张素II和骨形态发生蛋白-2作为诱导剂进行骨髓间充质干细胞的诱导培养，不仅能够促进骨髓间充质干细胞转化成心肌细胞，提高转化率，而且还能够增强细胞活性，解决了现有技术中，由骨髓间充质干细胞转化后获得的心肌细胞易脱壁降解死亡的问题。

具体地，本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法，先获取到骨髓间充质干细胞进行体外培养；在体外培养过程中利用本发明的诱导液进行诱导反应。在本发明实施例中，体外培养过程包括先提纯出骨髓间充质干细胞的单个核细胞，进行扩增培养，传代培养，诱导反应等步骤。具体包括以下步骤：

S1、获取骨髓间充质干细胞；

S2、对骨髓间充质干细胞进行传代培养至第四代骨髓间充质干细胞；

S3、用诱导液对第4代骨髓间充质干细胞进行诱导反应至收获心肌细胞。

进一步地，在步骤S1中，本发明所采用的骨髓间充质干细胞是通过密度梯度离心结合贴壁培养的方式分离纯化获取的骨髓间充质干细胞，密度梯度离心法能够根据不同细胞之间存在的沉降系数差，在一定离心介质和离心力作用下，不同细胞各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带，从而能够去除骨髓血中的大量红细胞、粒细胞和成纤维细胞等混杂细胞。然后，再利用骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性对密度梯度离心法获得的单个核细胞进行贴壁培养，通过去除非贴壁细胞，以进一步纯化骨髓间充质干细胞。步骤S1的具体过程为：

S11、密度梯度离心法获取单个核细胞；

抽取人骨髓，在含有低糖DMEM的离心管中混合，再过筛，得到细胞悬液，再将所述细胞悬液加入到含Percoll分层液的离心管中，离心，获取单个核细胞。其中，Percoll分层液的密度为1.067-1.082kg/L。

S12、贴壁培养法进一步纯化骨髓间充质干细胞；

用含有胎牛血清、青霉素和/或链霉素的DMEM对步骤S11获得的单个核细胞进行培养，再于CO₂培养箱中孵育，36-96个小时后更换培养基，除去未贴壁的细胞，以后每2-4天换液1次，直到单个核细胞增殖达到融合状态，即获得纯化后的原代骨髓间充质干细胞。

其中，DMEM培养基中，胎牛血清的浓度为180-120mg/L，青霉素的浓度为90-110ug/ml，和/或链霉素的浓度为90-110ug/ml。青霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导致细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长；链霉素能够作用于细菌的核糖体，阻碍蛋白翻译，从而抑制细菌生长；自然环境下，不考虑人为产生的抗药性，对青霉素不敏感的绝大多数微生物对链霉素敏感，反之亦然；因此，最为优选地是将青霉素和链霉素搭配使用能够控制几乎全部常见的细菌，从而能够尽量避免细菌对骨髓间充质干细胞的生长及活性造成的不良影响。

步骤S2中，对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养，以获取生长及活性最佳的第四代骨髓间充质干细胞进行诱导反应，具体步骤为：

S21、用1.5～3mL/L胰蛋白酶将步骤S12中获得的原代骨髓间充质干细胞进行消化分离，再用完全培养基中止消化，制成细胞悬液；然后传代接种于含新生牛血清的DMEM培养瓶中培养，隔1～3天换液，直至细胞达到90％以上融合；

S22、重复步骤S1继续传代至第4代骨髓间充质干细胞后，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，再用PBS冲洗后，以0.5～1.5×10⁵个/ml的密度接种于多孔板上，培养2-5天。

其中，多孔板中内置涂有多聚赖氨酸的盖玻片；多聚赖氨酸是带正电荷的氨基酸，能够消除器皿与细胞膜的电荷排斥作用，能够促进细胞与器皿的粘合，提高细胞贴壁能力。因此，将骨髓间充质干细胞置于涂有多聚赖氨酸的细胞培养容器中，能够促进骨髓间充质干细胞贴壁生长。

步骤S3的具体过程为：

利用诱导液对步骤S22中获得的第4代骨髓间充质干细胞进行诱导分化12-36个小时，吸弃诱导液，再用PBS清洗3次，继续用完全培养基培养，每2-5天换液一次，继续培养1-4周至心肌细胞成熟并增殖到临床使用量。

其中，诱导液包括血管紧张素II和骨形态发生蛋白-2。血管紧张素II是一种肤类激素，作为一种细胞因子及生长因子，能够刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞的增殖；另外，血管紧张素II是血管平滑肌细胞强大的丝裂原，它可通过自分泌、旁分泌刺激血管平滑肌细胞的DNA和蛋白质合成增加，导致细胞数目增多；还可促进血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的合成和释放，使血管紧张素II促血管平滑肌细胞分裂、增殖作用加强；血管紧张素II与其受体结合，能活化多条信号通路，导致细胞活化；优选地，血管紧张素II的浓度为1-5μmol/L。而骨形态发生蛋白是一族多功能的糖蛋白，属于转化生长因子β家族成员，可调节骨髓间充质干细胞的生长，分化和凋亡。优选地，骨形态发生蛋白的浓度为50-200μg/L。

本发明通过大量实验证明，血管紧张素II结合骨形态发生蛋白共同诱导骨髓间充质干细胞，能够抑制细胞的凋亡，促进骨髓间充质干细胞转化为心肌细胞，并促进心肌细胞的生长和增殖，提高细胞的活性。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法，包括以下步骤：

S1、密度梯度离心法初步筛选骨髓间充质干细胞

将抽取的骨髓，立即注入含5ml低糖DMEM的离心管中并充分混合，经200目不锈钢滤网过滤后获得混合细胞悬液，将混合细胞悬液贴壁轻轻加入到预置等体积的Percoll分层液的离心管中(Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性；来源于GE，美国)，Percoll分层液的密度为1.082kg/L，于2400r/min离心速度下离心20min，收集云雾状白膜层的单个核细胞，利用PBS溶液于1200r/min离心速度下离心洗涤两次，每次各10min，获得初步筛选的骨髓间充质干细胞。

S2、贴壁培养法进一步筛选骨髓间充质干细胞

取本实施例1中步骤S1获得的骨髓间充质干细胞于含100mg/L的胎牛血清、100ug/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素的低糖DMEM培养基重新悬浮细胞，调整细胞密度为5×10⁵个/ml，并接种于50ml培养瓶中，放置于CO₂培养箱中孵育，72h后换液，除去未贴壁的细胞，以后每3d换液1次，直到细胞增殖达到80％融合，用2.5mg/L胰蛋白酶将贴壁细胞于37℃下消化分离3-5min，见细胞间隙增大，且细胞形态回缩为圆形时，用完全培养基中止消化，然后用吸管吹打制成细胞悬液，即获得最终纯化后的原代骨髓间充质干细胞。

S3、原代骨髓间充质干细胞的传代培养

A、取本实施例1中步骤S2中的原代骨髓间充质干细胞悬液按1：2的比例进行传代接种于含100mg/L新生牛血清的DMEM培养瓶中培养，隔日换液，直至贴壁细胞彼此接近融合，铺满整个培养瓶的底面；

B、再重复以上步骤A中的操作，反复传代，传至第4代后，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，用PBS溶液冲洗后以1×10⁵个/ml的密度接种于内置涂有多聚赖氨酸盖玻片的6孔板上，用完全培养基继续培养3天。

S4、第4代骨髓间充质干细胞的诱导

向6孔板中加入浓度为2μmol/L的血管紧张素II和100μg/L的骨形态发生蛋白-2进行诱导24小时后，吸弃诱导液，PBS溶液清洗3次，继续用完全培养基培养，每3天换液一次，继续培养4周，以维持诱导后细胞的活性及生长增殖；然后，通过磁珠分选法或流式细胞仪分选出诱导后的心肌细胞。

为进一步验证本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。

检测对象

检测组1—本发明实施例1获得的细胞；

检测组2—与本发明实施例1不同之处在于，采用1μmol/L的血管紧张素II和200μg/L的骨形态发生蛋白-2诱导骨髓间充质干细胞所获得的细胞；

检测组3—与本发明实施例1不同之处在于，采用5μmol/L的血管紧张素II和50μg/L骨形态发生蛋白-2诱导骨髓间充质干细胞所获得的细胞；

对照组—与本发明实施例1的不同之处在于，采用10μmol/L的5-氮杂胞苷诱导间充质干细胞所获得的细胞。

检测实验一、心肌细胞转化率的测定

分别取检测组1-3和对照组培养第7天、14天、21天和24天所收获的细胞，并分别对其执行以下操作：

1、用丙酮固定细胞15分钟；

2、PBS溶液冲洗3次，每次5分钟；

3、加入0.3％triton-100润湿剂(聚乙二醇辛基苯基醚，购于Sigma公司，德国)，室温静置10分钟；

4、PBS溶液冲洗3次，每次5分钟；

5、滴加3％H₂O₂室温孵育20分钟，消除内源性过氧化物酶活性；

6、PBS溶液冲洗3次，每次5分钟；

7、加入10％山羊血清封闭液封闭20分钟；

8、加入一抗4℃下静置12小时；

9、PBS溶液冲洗3次，每次5分钟；

10、加入二抗，室温静置一小时；

11、PBS溶液冲洗3次，每次5分钟；

12、DAB(二氨基联苯胺，来源于sigma公司，美国)显色：加入稀释好的DAB显色液，室温环境显微镜下控制显色时间，显色适度后，冲洗终止显色；

13、苏木轻度复染30-60分钟；

14、梯度酒精脱水；

15、二甲苯透明；

16、中性树胶封片；

17、显微镜下观察染色结果；每组随机选4个非重复高倍镜视野(×400)，计数显黄色的阳性细胞数(N1)和总细胞数(N)，显黄色的阳性细胞即为心肌细胞，最后按公式(N1/N×100％)计算心肌样细胞转化率。

表1：

检测结果：由表1中数据可知，检测组1-3中心肌细胞所占比例均大于对照组，由此说明，通过本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法所获得的心肌细胞数量较多，骨髓间充质干细胞的转化率较高。

检测实验二、免疫细胞常规化学法检测心肌特异性蛋白的表达

分别取出检测组1-3和对照组中培养4周后的细胞，PBS溶液冲洗2次，冷丙酮固定15min，对cTnT(肌钙蛋白，肌肉的主要调节蛋白质)和Cx-43(间隙链接蛋白)表达率进行检测。

表2：

检测结果：如表2所示，测得的检测组1-3中cTnT和Cx-43的表达率均大于对照组，而cTnT分布于心肌细胞的胞浆中，或与心肌结构蛋白结合；Cx-43是心肌细胞间的主要连接蛋白，因此，心肌特异性蛋白cTnT和Cx-43的表达率高说明心肌样细胞的转化率高，由此说明，检测组1-3中获得的心肌样细胞较多，并且本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法提高了骨髓间充质干细胞的转化率。

综上所述，本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法，采用血管紧张素II和骨形态发生蛋白-2作为诱导剂诱导培养骨髓间充质干细胞，不仅能够促进骨髓间充质干细胞转化成心肌细胞，提高转化率，而且还能够增强细胞活性，解决了现有技术中，由骨髓间充质干细胞转化后获得的心肌细胞易脱壁降解死亡的问题。

以上结合对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种骨髓间充质干细胞的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞进行体外培养；

在体外培养过程中用诱导液进行诱导反应；

其中，所述诱导液包括血管紧张素II和骨形态发生蛋白-2。

2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞的诱导方法，其特征在于，所述血管紧张素II的浓度为1-5μmol/L，骨形态发生蛋白-2的浓度为50-200μg/L。

3.根据权利要求1或2所述的骨髓间充质干细胞的诱导方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的方法步骤包括：

抽取人骨髓，在含有DMEM的离心管中混合，再过筛，得到细胞悬液，再将所述细胞悬液加入到含Percoll分层液的离心管中，离心，获取单个核细胞。

4.根据权利要求3所述的骨髓间充质干细胞的诱导方法，其特征在于，所述Percoll分层液的密度为1.067-1.082kg/L。

5.根据权利要求3所述的骨髓间充质干细胞的诱导方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的方法步骤还包括：在获取单个核细胞后，用含有胎牛血清、青霉素和/或链霉素的DMEM对单个核细胞进行培养，再于CO₂培养箱中孵育，36-96个小时后更换培养基，除去未贴壁的细胞，以后每2-4天换液1次，直到单个核细胞增殖达到融合状态，即获得纯化后的原代骨髓间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的骨髓间充质干细胞的诱导方法，其特征在于，所述DMEM培养基中，胎牛血清的浓度为180-120mg/L，青霉素的浓度为90-110ug/ml，和/或链霉素的浓度为90-110ug/ml。

7.根据权利要求5所述的骨髓间充质干细胞的诱导方法，其特征在于，用所述诱导液进行诱导反应之前，还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：

S21、用1.5～3mL/L胰蛋白酶将原代骨髓间充质干细胞消化分离，再用完全培养基中止消化，制成细胞悬液；然后传代接种于含新生牛血清的DMEM培养瓶中培养，隔1～3天换液，直至细胞达到90％以上融合；

S22、重复步骤S21继续传代至第4代骨髓间充质干细胞后，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，再用PBS冲洗后，以0.5～1.5×10⁵个/ml的密度接种于多孔板上，培养2-5天。

8.根据权利要求7所述的骨髓间充质干细胞的诱导方法，其特征在于，用所述诱导液对第4代骨髓间充质干细胞进行诱导反应，包括以下步骤：

利用所述诱导液诱导分化12-36个小时，吸弃诱导液，再用PBS清洗3次，继续用完全培养基培养，每2-5天换液一次，继续培养1-4周。

9.根据权利要求7所述的骨髓间充质干细胞的诱导方法，其特征在于，所述多孔板中内置涂有多聚赖氨酸的盖玻片。

10.一种诱导液，用于诱导分化骨髓间充质干细胞，其特征在于，包括浓度为1-5μmol/L的血管紧张素II，和浓度为50-200μg/L的骨形态发生蛋白-2。