CN1533431A - 细胞移植的方法和试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于生产移植到哺乳动物(例如，人)心肌组织中的细胞的方法。该方法包括下列步骤：(a)提供骨髓干细胞群，(b)在诱导该细胞成为生心肌细胞的条件下培养该细胞，(c)监测步骤(b)的细胞的分化状态，(d)当至少约10％和多至100％的细胞是生心肌细胞时，收集步骤(b)的细胞。所述骨髓干细胞可以是，例如，人的骨髓干细胞。在其中一个实施方案中，所述方法包括把分化的干细胞移植到哺乳动物(例如，人)中的步骤。

Description

细胞移植的方法和试剂
发明背景
本发明涉及细胞移植领域。
人们已经提出骨髓可能是循环心肌细胞的祖细胞的体内来源。在一个实验中，人们观察到移植的骨髓来源的细胞分布在营养不良小鼠的心脏中。虽然还没有鉴定这些细胞的分子特性，但它们在心脏组织中的位置表明这些细胞是心肌细胞。骨髓间充质干细胞(BMSC)具有在引入诱导剂，如5-氮胞苷后分化为搏动心肌细胞的能力。人们以这些发现为基础，提出了将BMSC用于治疗心脏疾病和心脏异常的细胞的来源。
尽管BMSC具有潜在的治疗价值，但现在用于心脏组织的细胞移植法不适于临床，这是因为移植物掺入到宿主组织中的速率较慢。例如，Orlic等(Nature 410：701-705，2001)报道了只有40％接受BMSC移植物的小鼠显示出一定程度的心肌修复。
因此，仍然需要一种细胞移植方法，它具有高速率的细胞掺入和细胞存活。
发明概述
我们发现了一种方法，通过这种方法可对干细胞分化的诱导进行体外监测，然后收集用于移植的干细胞。
因此，本发明提供一种用于生产移植到哺乳动物(例如，人)心肌组织中的细胞的方法。该方法包括下列步骤：(a)提供还没有无限增殖化的骨髓干细胞群，(b)在诱导该细胞成为生心肌细胞(例如，心肌细胞的祖细胞)的条件下培养该细胞，(c)监测步骤(b)的细胞的分化状态，(d)当至少约10％和多至100％的细胞是生心肌细胞时，收集步骤(b)的细胞。所述细胞可以是，例如，人，猪，或狒狒的BMSC。在其中一个实施方案中，该方法进一步包括把步骤(d)的细胞移植到哺乳动物(例如，人)中的步骤(e)。移植可以是自体移植，即移植来源于所治疗哺乳动物的细胞。优选，至少约15％，20％，30％，40％或50％的所收集细胞是生心肌细胞(例如，心肌细胞的祖细胞)。优选多至约60％，70％，80％，90％，95％或99％的所收集细胞是生心肌细胞。最优选当至少约50％和多至约80％的细胞是生心肌细胞时，收集所述细胞。
我们还发现了一种治疗性的细胞移植法，其中血管和心肌组织在所治疗的心肌区域中共同再生。
心肌梗塞后，由于供给受影响区域的血液减少，从而危害到内源心肌细胞的健康。为了提高所注射细胞的存活，希望宿主哺乳动物能够生长出一张血管网，从而供给细胞存活所需的氧和营养物。
心肌的冠状血管系统是由从心外膜迁移到心肌中的内皮和血管平滑肌祖细胞形成的，以此观察为基础，我们相信内皮和血管平滑肌祖细胞类型与心肌细胞或心肌细胞祖细胞的联合给予可促进治疗上有效的心肌细胞存活所必需的血管网形成。梗塞的心肌是通过联合使用心肌细胞的祖细胞、内皮祖细胞和血管平滑肌祖细胞再生新的心肌细胞以及新的血管而修复的。在其中一个实施例中，祖细胞来源于离体干细胞。
因此，第二个方面，本发明还提供一种用于生产细胞的方法，所述细胞可受引发分化成内皮细胞，从而用于移植到哺乳动物(例如，人)的心肌组织中。该方法包括下列步骤：(a)提供还没有无限增殖化的干细胞群，(b)在诱导该细胞成为内皮细胞的条件下培养该细胞，(c)当至少约10％和多至100％的细胞是内皮祖细胞时，收集步骤(b)的细胞。
第三个方面，本发明还提供一种用于生产细胞的方法，所述细胞可受引发分化成血管平滑肌细胞，从而用于移植到哺乳动物(例如，人)的心肌组织中。该方法包括下列步骤：(a)提供还没有无限增殖化的干细胞群，(b)在诱导该细胞成为血管平滑肌细胞的条件下培养该细胞，(c)当至少约10％和多至100％的细胞是血管平滑肌祖细胞时，收集步骤(b)的细胞。
第四个方面，本发明提供一种治疗被诊断患有以心功能不全为特征的病症的哺乳动物(例如，人)的方法。该方法包括把下列三种类型的细胞引入到哺乳动物心肌组织中的步骤：(1)心肌细胞或心肌细胞的祖细胞；(2)内皮细胞或内皮细胞的祖细胞；和(3)血管平滑肌细胞或血管平滑肌细胞的祖细胞，它们的量足以改善心功能。在其中一个实施例中，对于每次注射而言，一百万个心肌细胞的祖细胞是与其它两种细胞类型以大约10∶1∶1(心肌细胞的祖细胞∶内皮细胞的祖细胞∶平滑肌细胞的祖细胞)的比例一起注射到心肌中的。也可使用其它比例。例如，心肌细胞的祖细胞与内皮细胞的祖细胞或血管平滑肌细胞的祖细胞的比例单独地在约1∶1-50∶1之间或更多(例如，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1，10∶1，12∶1，15∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，或更多)。因此，在其中一个实施例中，心肌细胞的祖细胞∶内皮细胞的祖细胞∶平滑肌细胞的祖细胞的比例为10∶2∶1。在注射过程中，每种细胞类型可以是分层排列的(水平或垂直)，这样内皮细胞的祖细胞靠近心内膜，血管平滑肌细胞的祖细胞位于中间，心肌细胞的祖细胞靠近心外膜。可选择性地，在注射前，可按细胞数比混合细胞类型，例如10∶1∶1(心肌细胞的祖细胞∶内皮细胞的祖细胞∶平滑肌细胞的祖细胞)，并以混合物的形式给心肌注射。为了提高血管的产生，可把要注射的细胞与某些血管生成剂，如VEGF(例如，以1-10μM的浓度)混合。
诱导细胞成为生心肌细胞的很多方法都是本领域已知的。例如，可在培养基中培养BMSC，所述培养基含有生心肌细胞诱导量的BMP-2或bFGF。这些方法可用于实行本发明。
因为有丝分裂的细胞可能比分裂期后的细胞更容易整合到心肌中，因此希望至少约25％，50％，75％，90％，95％或更多的步骤(c)的移植细胞是有丝分裂的祖细胞(例如，心肌细胞的祖细胞，内皮细胞的祖细胞，或血管平滑肌细胞的祖细胞)。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，它在药学上可接受的载体或赋形剂中含有干细胞来源的细胞群，其中至少约10％和多至100％的细胞是内皮细胞的祖细胞。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，它在药学上可接受的载体或赋形剂中含有干细胞来源的细胞群，其中至少约10％和多至100％的细胞是血管平滑肌细胞的祖细胞。
另一方面，本发明还提供一种药物组合物，它含有三种类型的细胞：(1)心肌细胞或心肌细胞的祖细胞；(2)内皮细胞或内皮细胞的祖细胞；和(3)血管平滑肌细胞或血管平滑肌细胞的祖细胞，它们的量足以改善心功能。希望所述细胞来源于干细胞(例如，BMSC)。为了促进血管的产生，希望还含有血管生成剂(例如，1-10μM的VEGF)。此外，为了促进本发明移植细胞的存活，还可把抗凋亡剂，如caspase抑制剂(例如，zVADfmk)与所要注射的细胞联合给予。
本发明还提供一种用于生产移植到哺乳动物(例如，人)中的细胞的方法。该方法包括下列步骤：(a)提供BMSC群，(b)在诱导该细胞采取血管平滑肌细胞，内皮细胞，心外膜细胞，脂肪细胞，破骨细胞，成骨细胞，巨噬细胞，神经元祖细胞，神经元，星形胶质细胞，骨骼肌细胞，平滑肌细胞，胰前体细胞，胰β-细胞，和肝细胞细胞类型的条件下培养该细胞，(c)监测步骤(b)的细胞的分化状态，(d)当至少约10％和多至100％的细胞表达可检测量的、对所诱导细胞类型特异的蛋白时，收集步骤(b)的细胞。这里将描述适宜的标记。例如所述BMSC可以是人，猪、或狒狒的BMSC。在其中一个实施方案中，该方法包括把步骤(d)的细胞移植到哺乳动物(例如，人)中的步骤(e)。所述移植可以是自体移植，即，把细胞移植到产生骨髓干细胞的哺乳动物中。在另一实施方案中，所述培养和监测步骤(b)和(c)一直进行到至少约15％，20％，30％，40％，或50％和多至约60％，70％，80％，90％，95％，或99％的细胞表达可检测量的、所需细胞系的标记。希望所述培养和监测步骤(b)和(c)一直进行到至少约50％和多至80％的细胞表达可检测量的、所需细胞系的标记。
本发明还提供一种治疗哺乳动物，特别是人以心功能不全为特征的病症的方法。该方法包括下列步骤：(a)分离所治疗哺乳动物的骨髓干细胞，(b)在诱导该细胞分化成生心肌细胞的条件下培养该骨髓干细胞，(c)监测步骤(b)的细胞的分化状态，(d)当至少约10％和多至100％的细胞是生心肌细胞时，收集步骤(b)的细胞，(e)把所述生心肌细胞移植到哺乳动物中。
希望前述所有方法中的监测步骤(c)都是通过监测用报道基因构建体转染的包被BMSC的分化状态进行的。进行监测的BMSC对于所培养的BMSC而言可以是自体的，同源的，或异源的。
“干细胞”是指这样一种细胞：它能够(i)自我更新，并(ii)产生多种分化的细胞类型，包括心肌细胞，内皮细胞，和血管平滑肌细胞中的一种。
“BMSC”是指来源于骨髓间充质的CD45-的干细胞。BMSC还被称作“骨髓干细胞”和“骨髓多潜能祖细胞”。
此处所用“核酸”是指DNA或RNA。“核酸分子”可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。除非另有说明，单链核酸分子序列的左手方向是5’端，双链核酸分子的左手方向被称作5’方向。
“Csx/Nkx2.5”是指一种核酸或多肽，它基本上与小鼠或人的Csx/Nkx2.5 cDNA或Csx/Nkx2.5多肽相同，当在BMSC中表达时，可诱导细胞成为生心肌细胞。优选对于一段50个连续核苷酸的序列而言，所述核酸与小鼠或人Csx/Nkx2.5的同一性至少为80％，更优选至少为85％，更优选至少为90％或甚至95％。至多10％的空位可包括在一个或两个序列中。优选对于一段25个连续氨基酸的序列而言，所述多肽与小鼠或人Csx/Nkx2.5的同一性至少为80％，更优选至少85％，更优选至少90％或甚至95％。另外，10％的空位可包括在一个或两个序列中。
“治疗”是指减少或缓解以心功能不全为特征的病症的至少一个不利作用或症状。心脏疾病的不利作用或症状有很多，而且已经详细描述过。心脏疾病的不利作用或症状的非限制性例子包括：呼吸困难，胸痛，心悸，头晕，晕厥，水肿，紫绀，苍白，疲劳和死亡。各种心脏疾病的不利作用或症状的其它例子见Robbins，S.L.等(1984)疾病的病理学基础(W.B.Saunders Company，Philadelphia)547-609；和Schroeder，S.A.等编辑.(1992)当前的医疗诊断和治疗(Appleton & Lange，Connecticut)257-356。
“以心功能不全为特征的病症”包括正常心脏功能的损害或缺乏或异常心脏功能的存在。异常的心脏功能可能是疾病，损伤，和/或衰老的结果。此处所用的异常心脏功能包括心肌细胞或心肌细胞群的形态和/或功能异常。形态和功能异常的非限制性例子包括心肌细胞的物理损耗和/或死亡，心肌细胞的异常生长模式，心肌细胞间的物理连接异常，心肌细胞所致的一种或多种物质产生不足或过量产生，心肌细胞不能产生它们通常产生的一种或多种物质，异常模式或异常时间的电脉冲传输，及上述其中一种异常导致的腔室压改变。异常的心脏功能可在很多疾病中见到，包括，例如，缺血性心脏病，如，心绞痛，心肌梗塞，慢性缺血性心脏病，高血压性心脏病，肺心病(肺原性心脏病)，心脏瓣膜病，如，风湿热，二尖瓣脱垂，二尖瓣环钙化，类癌心脏病，感染性心内膜炎，先天性心脏病，心肌病，如，心肌炎，心肌病，导致充血性心力衰竭的心脏疾病、和心脏肿瘤，如，原发性肉瘤和继发性肿瘤。
“给予”，“引入”，和“移植”可互换使用，是指通过一种把细胞定位在预定位置的方法或途径，而把本发明的生心肌细胞放到患者，如，人类患者中。
“启动子”是指核酸的一个区，在翻译起始密码子上游，涉及RNA聚合酶及其它蛋白的识别和结合以引发转录。“人类启动子”是一种能够在人类细胞中引发转录的启动子，可来源于人类细胞，也可不是。“Csx/Nkx2.5启动子”来源于Csx/Nkx2.5基因的启动子区，当与异源核酸分子可操作性连接时，能够在心脏细胞中引发该分子的转录(当存在于能够支持转录的转录介质中时)。
“增强子元件”或“增强子”是指这样一种核酸序列，当其位置与启动子邻近，并存在于能够支持转录的转录介质中时，与没有增强子结构域存在条件下启动子产生的转录活性相比，它可使转录活性增加。“Csx/Nkx2.5增强子”来源于Csx/Nkx2.5基因的启动子区，当与异源核酸分子可操作性连接时，能够在心脏细胞中引发该分子的转录(当存在于能够支持转录的转录介质中时)。“Tie-2增强子”来源于Tie-2基因的启动子区，当与异源核酸分子可操作性连接时，能够在内皮细胞中引发该分子的转录(当存在于能够支持转录的转录介质中时)。“Bves增强子”来源于Bves基因的启动子区，当与异源核酸分子可操作连接时，能够在血管平滑肌细胞中引发该分子的转录(当存在于能够支持转录的转录介质中时)。
“可操作性连接”是指两个或更多个核酸分子(如，转录的核酸分子，启动子和增强子元件)以这种方式连接，从而使核酸分子在适宜的转录介质中转录。
“来源于”是指所述核酸分子是从第二种核酸分子制造或设计的，该衍生物保留制造或设计它的核酸分子的至少一个重要功能。
“表达构建体”是指支持转录的核酸分子。本发明的表达构建体至少包括，心特异性增强子元件和启动子。如此处所述，还可包括其它元件如转录终止信号。
“载体”或“表达载体”是指一种表达系统，一种基于核酸的媒介物，一种适于核酸递送的核酸分子，或一种自主的自我复制的环状DNA(例如，一种质粒)。当载体维持在宿主细胞中时，该载体可在有丝分裂过程中，作为自主结构被细胞稳定复制，并掺入到宿主细胞的基因组内，或维持在宿主细胞的细胞核或胞质中。
“心脏细胞”是指分化的心脏细胞(例如心肌细胞)或定型产生或分化为心脏细胞的细胞(例如，成心肌细胞或生心肌细胞)。
“心肌细胞”是指心脏中的肌细胞，它表达可检测量的心脏标记(例如，α-肌球蛋白的重链，cTnI，MLC2v，α-心脏肌动蛋白，和体内Cx43)，可收缩，但不会增殖。
“成心肌细胞”是指一种表达可检测量的心脏标记，可收缩，并增殖的细胞。
“生心肌细胞”是指这样一种细胞，它表达可检测量的Csx/Nkx2.5RNA或蛋白的细胞，它不显示有组织的肌原纤维节结构或收缩，并且优选不表达可检测量的肌球蛋白重链蛋白。
“心外膜细胞”是指表达可检测量的Flk-1和/或ICAM-2，而且可成为内皮细胞的细胞。
“心内膜细胞”指表达可检测量的Tie-2和/或冯维勒布兰德因子的心脏细胞。
“内皮细胞”是指这样一种细胞，它表达可检测量的下列至少一种RNA或蛋白：MUC18，VE-钙粘着蛋白，N-钙粘着蛋白，α-和β-连环蛋白，Flk-1，Tie-2，和CD34。
“使细胞受引发分化为内皮细胞”是指把还没有无限增殖化的干细胞在诱导该细胞成为内皮细胞的条件下培养，其中至少约10％，25％，50％，75％，90％，95％，99％，或甚至100％的细胞是内皮细胞。
“使细胞受引发分化为血管平滑肌细胞”是指把还没有无限增殖化的干细胞在诱导该细胞成为血管平滑肌细胞的条件下培养，其中至少约10％，25％，50％，75％，90％，95％，99％，或甚至100％的细胞是血管平滑肌细胞。
当涉及所培养BMSC的分化时，“特异性诱导一种细胞类型”是指一种培养物中至少50％的BMSC分化成所需的细胞类型(即，心肌细胞)。
蛋白的“可检测量”是指蛋白的量可使用例如这里提供的方法，通过免疫细胞化学方法检测。下面提供一种确定细胞是否用CsX/Nkx2.5或肌球蛋白的重链可检测性标记的方法。在冰上用4％甲醛固定所培养的细胞20分钟，然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.2％Triton X-100中孵育15分钟。在PBS中洗涤三次后，在印迹溶液(在PBS中含有1％BSA和0.2％Tween 20)中孵育该细胞15分钟。然后用下列抗体的一种处理样品：抗Csx(1∶100-1∶200，来源于S.Izumo，Harvard Medical School，Boston MA)，MF-20(1∶50-200，来源于Developmental Studies Hybridoma Bank，Universityof Iowa，Iowa City Iowa)，抗-结蛋白(1∶100-200，来源于Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis MO)，如果需要，还可使用它们相等浓度的同型对照(对于Csx而言，是标准兔血清；对于MF-20而言，是小鼠IgG2b；对于结蛋白而言，是小鼠IgG1)，在保湿室中4℃孵育过夜。然后用洗液(PBS中的0.5％Tween 20)洗涤样品载玻片3次，按照供货商提供的说明，用二级抗体(对于Csx而言，是驴抗兔IgG，对于MF-20和抗结蛋白而言，是驴抗小鼠IgG，全部来源于Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)孵育，然后洗涤3次。在荧光显微镜(例如，具有匹配荧光附件的Nikon TS100显微镜)下检测，根据显色给免疫标记评分。
“心脏特异性增强子元件”是指一种与启动子可操作性连接的元件，它可指导基因在心脏细胞中的表达，但不能指导基因在所有组织或所有细胞类型中的表达。例如，某些来源于Csx/Nkx2.5的心脏特异性增强子元件可驱动基因在心脏细胞及舌和胚胎胃中表达。本发明的心脏特异性增强子可天然存在或非-天然存在。
“异源”是指核酸分子来自于外界来源或，如果来自于相同的来源，则对其原始形式修饰。因此，“异源启动子”是这样一种启动子，它与本发明的重复增强子结构域通常不相关。同样，异源核酸分子是从其原始形式修饰的，或来自于和衍生与其可操作性连接的启动子的来源不同的来源。
“基本上纯的核酸”是指不含所述基因的核酸，该基因在衍生本发明核酸的生物体天然存在的基因组中与核酸侧面连接。因此该术语包括，例如，掺入到载体中的重组核酸；掺入到自主复制质粒或病毒中的重组核酸；或掺入到原核生物细胞或真核生物细胞中的基因组核酸；或作为独立于其它序列的独立分子(例如，通过PCR或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)存在。它还包括这样一种重组核酸，其是编码附加多肽序列的杂种基因的一部分。
“转基因”是指将核酸分子的任一片段(例如DNA)通过技术暂时或永久插入到细胞中，而且如果被整合到基因组中，或在染色体外维持，则可成为生物体的一部分。这种转基因可包括与转基因生物体部分或完全异源(即，外源性)的基因，或表示与生物体内源基因同源的基因。
“转基因细胞”是含有转基因的细胞。例如，用载体转化的干细胞可用于产生表型特性改变的细胞群，其中所述载体含有与异源核酸分子可操作性连接的表达载体。来源于转基因生物体的细胞也是一种转基因细胞，只要该细胞含有转基因。
本发明的其它特征和优点可从下列优选实施方案的描述以及权利要求很明显地看出。
附图简述
图1是来源于小鼠和狗的，分离、培养的骨髓干细胞相差显微照片。
图2是一组表示与小鸡心肌细胞共培养14天后，小鼠BMSC的显微照片。
图3是一组显微照片，表示利用对肌原纤维节肌球蛋白特异的MF-20抗体，或抗结蛋白抗体进行的小鼠心肌细胞，未分化BMSC，和分化BMSC的染色及形态学。
图4是一组显微照片，表示体外分化后，犬BMSC的形态学和Csx/Nkx2.5表达。
图5是一组显微照片，证实小鼠BMSC体外分化成了内皮细胞系。
图6是一组显微照片，表示移植15天后，移植的BMSC在梗塞狗心肌中的定位。
图7A是一组显微照片，表示在注射过细胞的区域中，利用DiI荧光检测的移植BMSC和利用抗-MHCα/β荧光检测的心肌细胞的共同定位。
图7B是一张显微照片，表示相对于未处理过的BMSC而言，使用caspase抑制剂可使移植BMSC的存活增加。
图8是一组显微照片，表示在离开注射位点的区域中，利用DiI荧光检测的移植BMSC和利用抗-MHCα/β荧光检测的心肌细胞的共同定位。
图9是一组显微照片，表示在离开注射位点的区域中，利用DiI荧光检测的移植BMSC和利用抗-MHCα/β荧光检测的心肌细胞的共同定位。
图10是一组显微照片，表示BMSC移植36天后，小鼠心肌梗塞的组织病理学。
图11-14是表示移植36天后，BMSC整合到小鼠心肌组织中的显微照片。
图15是一对显微照片，比较没有(左侧)或有(右侧)诱导生心肌细胞分化的生长因子存在的条件下，hCsx-lacZ小鼠BMSC中的β-半乳糖苷酶活性。
图16A表示一种代表性的包被细胞指示系统。在举例说明中，把指示细胞2包在包被材料4，如藻酸盐珠中。指示细胞2和包被材料4都包含在通透膜或筛网6中，并与细胞8在培养容器10中共培养。
图16B表示使用包被指示细胞监测培养物中的肌原性分化。所示为适于进行细胞包被的11μm和30μm尼龙筛网的显微照片；还有表示β-半乳糖苷酶反应结果的显微照片，所述β-半乳糖苷酶反应是用含有不同细胞数的hCsx-lacZ小鼠BMSC指示包囊进行的。
图17-19表示在移植诱导的BMSC之前(左侧)和之后(右侧)，梗塞犬心脏的超声心动图。
图20A表示代表性的三筒一针注射器简图。在这个例子中，各筒是同时、平均地注射到一个储存连接体中，所述储存连接体与单针相连以便精确部位注射。三个注射筒在顶部连接，并由单一的柱塞压器控制。
图20B是图20A中三筒一针注射器的横截面图。
图21A是代表性的三筒两针注射器简图，该注射器具有一个用于注射一种细胞类型的更大的筒。两个较小的筒与储存连接体相连，储存连接体则与一根针连接。较大的筒具有单独的注射用针。希望加大与较大筒连接的针孔，从而维持较小筒的筒/针孔比例，由此维持所有三个筒中的注射压相等。然而可选择性地，三个筒的三角形排列可使两根针紧挨着，并维持平行的注射角度。三个注射筒在顶部连接，并由单一的柱塞压器控制，以均衡注射压。
图22A是图21A三筒一针注射器的横截面图。
图22B是一种代表性的三筒三针设计，其中每个注射器筒都有自己的注射用针。如果需要，三个筒的三角形排列使三根针紧挨着，并维持平行的注射角度。三个注射筒在顶部连接，并由单一的柱塞压器控制，用于均衡注射压。
图22C是图22A三筒一针注射器的横截面图。
发明详述
我们已经发现，移植发育定型但未分化的细胞可提高靶组织中移植物的存活，掺入，和适应。
在发育的脊椎动物中，早期的心脏区域是通过Csx/Nkx2.5基因的表达确定的。然而，在此发展阶段，表达Csx/Nkx2.5的细胞仍然增殖。我们相信，移植仍然增殖的、表达Csx/Nkx2.5的细胞可导致心脏中掺入的功能性心肌细胞数增加。
我们还发现一种治疗性的细胞移植方法，其中血管和心肌组织在所治疗的心肌区域中共同再生。该方法包括移植未分化的细胞，其定型为三种细胞类型中的一种：心肌细胞，内皮细胞，或血管平滑肌细胞。
希望能大量供给移植的细胞。因此，一方面，移植的细胞来源于干细胞。其中一种适宜的干细胞是BMSC，可从成人骨髓中分离出来。如下所述，一旦分离，可以用生长因子处理BMSC(这里称为“引发”)，从而诱导该细胞成为心肌细胞系。可选择性地，BMSC可被引发成内皮细胞系，或血管平滑肌细胞系。在其中一个实施方案中，使用关联细胞类型-特异的指示系统监测BMSC的细胞系转化，所述指示系统在引入此处作为参考的美国临时申请系列号60/283,837中描述。为了产生细胞类型-特异的指示系统，使用基因构建体建立转基因小鼠系，其中所述基因构建体包括细胞系-特异的增强子/启动子-驱动的标记。例如，心肌细胞祖细胞的转化可使用来源于hCsx-LacZ转基因小鼠的包被BMSC监测。一旦在细胞群中检测到足够的标记基因表达，收集细胞，并把它们注射到宿主的心肌中。
在其中一个实施方案中，将心肌细胞的祖细胞，内皮祖细胞，和血管平滑肌细胞同时注射到宿主的心肌中。为了在预定区域适当分布各种细胞类型，可使用被设计用来注射多种细胞类型的多通道注射器。每根针的长度和它们之间的距离可根据所要修复的心肌中每种细胞类型的最佳位置而调节。
干细胞和干细胞衍生制品的优化对于成功的细胞移植至关重要。为了获得最大效率的细胞移植，希望移植的细胞处于适当的定型和分化阶段。目前，尽管很多动物细胞的定型和分化标记都是已知的，但不对这些标记的表达进行耗时分子生物学测定，仍然难以确定体外培养过程中收集细胞的适宜时间。我们已经发现一种生物活性指示系统，使用它可实时测定培养物中细胞的分化状态。例如这种指示系统还可用于测定细胞生长或细胞死亡过程中蛋白的基因表达量。
大多数组织-特异性的基因表达都是在转录水平由增强子和阻抑序列控制。通常，为了产生严密调节的表达，增强子采用复杂的调节机理，需要多个转录因子的合作。这些转录因子的结合位点可能距离基因启动子很多千碱基对(kb)，而且彼此相对分散。
当用于驱动小鼠中的转基因表达时，来源于hCsx/Nkx2.5和mCsx/Nkx2.5的心脏增强子概括了内源性mCsx/Nkx2.5的表达模式(见，例如，美国专利申请公开号2002022259，其引入此处作为参考)。在迄今为止已知的哺乳动物心脏增强子中，其中一种增强子(7.5kb的增强子)是在所有四个心脏腔室中都有活性的最早期的增强子。此外，这种增强子不会异位表达。在这个7.5kb的片段内，两个区(此处称为同源结构域A1和同源结构域A2)彼此分离，当与hsp68启动子-lacZ盒可操作性连接时，能一起以心脏特异性方式提高基因表达。这两个区还可用于本发明的报道基因构建体中。
实施例1：从BMSC诱导生心肌细胞
从成年小鼠和狗中分离骨髓。分离BMSC，并在含有10％胎牛血清，100μM L-抗坏血酸-2-PO4，5-15ng/ml白血病抑制因子(LIF)，和20nM地塞米松(小鼠培养物使用小鼠的LIF，狗培养物使用人的LIF)的培养基中培养。这种体外环境可使BMSC维持它们的自我更新特性，并在不损失对诸如生长因子的分化剂的反应性的条件下，通过传代扩展。此外，通过多次传代培养的干细胞维持间充质的形态学和染色质组型(图1)。在含生长因子(50ng/ml BMP2，100ng/ml bFGF)的培养物中14天后，大约80％的BMSC是Csx/Nkx2.5，MF-20(一种对肌原纤维节肌球蛋白特异的单克隆抗体)，和结蛋白抗体阳性染色，表明该细胞已经分化成心肌细胞(图3和4)。
为了模拟移植BMSC遇到的成人心肌环境，使用共培养模型系统。在该系统中，把为进行鉴定而用荧光标记物标记(VybrantTM)的BMSC，和原代小鸡胚心肌细胞以1∶40的比例共培养，培养是在涂有5ng/ml胶原的载玻片上进行的。这些混合培养物在有25ng/ml BMP2或25ng/ml bFGF存在的条件下单独生长。随后用Csx/Nkx2.5，MF-20(一种对肌原纤维节肌球蛋白特异的单克隆抗体)，和抗结蛋白抗体对细胞染色。开始后5天，在有BMP2或bFGF存在条件下生长的共培养物中，可检测到一些(0.1-1％)肌球蛋白阳性细胞，而在没有任何一种生长因子存在条件下生长的共培养物对于所有三种抗体都显阴性。然而，在没有生长因子存在的条件下共培养2周后，很多BMSC都是MF-20阳性的，表明它们已经转化成肌原性细胞系(图2)。因此，使用任何一种生长因子，如BMP2和bFGF，或通过与分化的心肌细胞共培养，BMSC都可被诱导沿着肌原性细胞系分化。
由于前述结果，我们可通过调节培养细胞的环境而调节培养物中BMSC成为生心肌细胞的速率和量。按照本发明的移植方法，希望至少10％的移植细胞是生心肌细胞(即，表达Csx/Nkx2.5，但不显示有组织的肌原纤维节结构或收缩的有丝分裂细胞，并优选不表达可检测量的肌球蛋白重链RNA或蛋白的有丝分裂细胞)。更高比例的生心肌细胞可导致移植细胞的掺入增加。因此，希望至少10％，25％，50％，75％，85％，90％，或95％，或更多的细胞是生心肌细胞。定型的实时测量可使用下面实施例5所述的细胞指示系统进行。
实施例2：来源于人和其它哺乳动物的BMSC
前面的实施例是利用小鼠BMSC进行举例说明。本领域已知人BMSC也能够产生心脏细胞(Pittenger等，Science 284：143-147，1999)。来源于其它哺乳动物的BMSC(例如，人源化的猪BMSC)也可用于本发明的方法中(Levy等，Transplantation 69：272-280，2000)。
实施例3：诱导BMSC成为生心肌细胞的方法
如上所述，在有BMP2和/或bFGF存在的条件下，把BMSC与心肌细胞共培养在培养物中可诱导能够分化为心肌细胞的生心肌细胞。各自调节BMSC与诱导性细胞的比例和生长因子的浓度可调节生心肌细胞诱导的速率和量。例如，BMSC与诱导性细胞的比例可约为1∶1-1∶1000或更高。BMP2的浓度可从约0.5ng/ml-约1μg/ml，而bFGF的浓度可从约1ng/ml-约5μg/ml。应当了解，可使用其它BMP/TGFβ和FGF家族的成员代替BMP2和/或bFGF。
其它诱导BMSC成为生心肌细胞的已知方法也可用于本发明中。并不是所有诱导心肌细胞的方法都可用于本发明。例如，5-氮胞苷可用作心肌细胞的诱导剂(Makino等，J.Clin.Invest.，103：697-705，1999)，但不适于本发明的方法。因为5-氮胞苷可使基因组序列随机脱甲基化(由此诱导正常的沉默基因)，用5-氮胞苷处理BMSC可产生除了心肌细胞(心脏肌钙蛋白I阳性)之外的多种细胞类型(例如，肌细胞(MyoD阳性))，成骨细胞(骨钙蛋白阳性)，和脂肪细胞(PPAR-γ阳性)(Wakitani等，Muscle Nerve，18：1417-1426，1995；Tomita等，Circulation，100 suppl II：247-256，1999)。与5-氮胞苷接触的BMSC已知迅速上调c-abl及白介素-6的转录物，而下调胶原I，一种主要基质蛋白的表达(Andrews等，Mol.Cell.Biol.，9：2748-2751，1989)。在本发明方法中，适宜的因子或条件是可特异性诱导一种细胞类型(例如，心肌细胞)的那些因子或条件。
实施例4：其它细胞类型的诱导
我们还希望能够诱导其它细胞类型，如血管平滑肌细胞和内皮细胞(或它们的前体)，用于移植到心肌中，因为这些细胞可在移植的生心肌细胞周围产生新的血管。所述细胞可单独移植，但优选按这里所述和适宜的生心肌细胞一起移植。
血管平滑肌细胞的分化可使用Bves基因增强子测定(Reese等，Dev.Biol.209：159-171，1999)。内皮细胞的分化可使用已经克隆的Tie-2或冯维勒布兰德因子的增强子测定(分别见Schnurch和Risau，Development 119：957-968，1993和Coffin等，Dev.Biol.148：51-62，1991)。胚胎心外膜细胞(即，内皮细胞前体)的分化可使用Flk-1或ICAM-2增强子测定(分别见Shalaby等，Nature376：62-66，1995和Tevosian等，Cell 101：729-739，2000)。
如上所述分离BMSC，并在有生物因子存在的条件下培养，其中所述生物因子已知可在胚胎发育过程中产生内皮细胞系(2％FBS，20ng/ml VEGF，1ng/ml bFGF，和2ng/ml IGF-I)。Flk-1，一种内皮特异性受体酪氨酸激酶，在大约80％的培养BMSC中大量表达，培养14天后，显示转化成内皮细胞系(图5)。
实施例5：细胞指示系统
如图16A所示，指示系统包括三个组分：指示细胞2，细胞包被系统(CES)4，和通透外膜或筛网6，它可帮助把指示细胞留在CES中，并从将移植的那些细胞8中分离指示细胞2。
在其中一个实施例中，指示系统用于测定干细胞(例如，BMCS)的细胞定型和分化状态。如此处所述，希望引发人的BMSC，以便使大约5-100％(优选约80％)的细胞是生心肌细胞(利用Csx/Nkx2.5的表达，缺少有组织的肌原纤维节结构或收缩，并优选缺少肌球蛋白的重链RNA或蛋白来测定)。因此，需要一种非常快速的测定法，以便使采集细胞用于测定和移植的时间间隔最小。因此，快速测定法可确保测定结果代表最终被移植的、表达Csx/Nkx2.5的细胞。本发明就提供了这样一种测定法。含有与报道基因可操作性连接的Csx增强子的转基因小鼠BMSC用作指示细胞。例如引入此处作为参考的美国专利申请公开号2002022259中描述了适宜的Csx增强子。指示细胞或者包被在生物材料(例如，藻酸盐，胶原，明胶，或壳聚糖)中，或者附着在生物可降解的聚合物(例如，聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，或聚交酯/乙交酯共聚物(PLGA)的无孔微球)上。然后用可渗透氧，营养物，和其它生物分子的膜把包被的或微球附着的细胞包裹起来。适宜膜的例子包括有孔的透明聚乙烯对苯二酸盐(PET)膜，透明的尼龙筛网，透明的有孔尼龙膜，和有孔透明聚四氟乙烯(PTFE/Teflon)。
除了在包囊中留有指示细胞外，外膜还可为该系统提供物理完整性。在诱导人BMSC成为生心肌细胞的过程中，与Csx增强子(例如，人Csx增强子)可操作性连接的报道基因将在指示细胞中表达。报道基因表达的无毒检测表明人细胞的分化状态。适宜的报道基因包括，但不限制于，编码绿色荧光蛋白，β-半乳糖苷酶，和荧光素酶的那些报道基因。在确定细胞已经达到所希望的分化状态后，除去整个指示系统(包括指示细胞，包被材料，及通透膜)。然后收集要种植的细胞，准备进行移植。如果需要，可把细胞冷冻贮藏，直到进行移植。
在本发明的细胞指示系统中，指示细胞可以是任何一种细胞类型，其中增强子元件/报道基因构建体进行细胞分化时是可操作的。在其中一个实施例中，使用报道基因构建体转染的BMSC细胞。这些细胞可以是任何一种动物的BMSC或，可选择性地，其它细胞类型，如用增强子元件/报道基因构建体转染的ES细胞，或来源于增强子/报道基因转基因动物的BMSC。
我们使用来源于hCsx-lacZ转基因小鼠的鼠BMSC说明包被细胞指示系统的上述原理。我们已经发现，没有被诱导沿着生心肌细胞系分化的BMSC染色较弱，或根本不能进行标准的β-半乳糖苷酶测定。(图15)。相反，按照上述方法培养的BMSC，可诱导生心肌细胞的分化，产生强烈的阳性信号(图15)。因此，作为一种可用于监测肌原性分化进展的系统鼠hCsx-lacZ BMSC对于包被而言是极好的候选物(图16A和16B)。与确定细胞分化的传统技术相比，这种指示系统具有很多优点。具体而言，可从培养基很容易地回收包囊，而且能够快速可靠地进行测定。此外，因为包囊可被掺入并从每个培养容器中回收，因此可在逐个平板的基础上进行监测。它无需为了进行监测而破坏整个培养物，而这种破坏则是传统组织学技术所必须的。当使用来源于人类患者的BMSC时，这尤为重要，这是因为骨髓样品很难获得，而且很少有干细胞可用于培养和移植。
鼠hCsx-lacZ BMSC可包被在任何适宜的材料中，它们的性质描述见上文。例如有效的包囊可通过把细胞包埋在藻酸盐中，且用11μm或30μm尼龙筛网容纳藻酸盐包埋的细胞而制造，所述尼龙筛网来源于例如Millipore Corp.(Bedford，MA)，不但耐用而且可渗透培养基和生长因子，氧，及用于β-半乳糖苷酶测定法中的化学试剂。使用上述方法，希望在每毫升含有至少约106个hCsx-lacZ BMSC的溶液中形成包囊；然而，更希望使用每毫升含有至少约107个细胞的溶液。当然，随着条件的改变，普通技术人员能够确定包囊系统中指示细胞的适宜浓度。
用于制造本发明包被监测系统的特定指示细胞不一定必须是鼠细胞。指示细胞对移植物的受体来讲可以是异源的或自体的。在BMSC相对丰富的情况下，优选用报道分子构建体，如上面所述的其中一种来转染宿主BMSC的亚组。然后把这些自体BMSC包被，并用于监测。可选择性地，在BMSC供给有限的情况下，可使用非自体(同源或异源的)指示BMSC。
实施例6：移植的方法
本发明涉及通过移植自体或异源心脏细胞而治疗受试者以心功能不全为特征的病症的方法。该方法包括给予受试者在这里详细描述的，本发明来源于干细胞的心肌祖细胞，内皮祖细胞，和血管平滑肌祖细胞。把本发明的细胞移植到患有心脏疾病的受试者的心脏中，从而替换损耗或无功能(“冬眠”)的心肌细胞。把所述细胞以适于替换损耗或无功能心肌细胞的量引入到患有心脏疾病的受试者中，以便至少部分减轻或缓解心脏疾病的至少一个不利作用或症状。细胞可通过任何适宜的途径给予受试者，从而把细胞递送到患者的预定位置，其中至少一部分细胞仍然保持活性。在给予患者之后，优选至少约5％，至少约10％，更优选至少约20％，至少约30％，至少约40％，最优选至少约50％，或更多的细胞仍然保持活性。输入患者后的细胞存活周期可以短至几小时，例如24小时，到几天，长至几周到几个月。其中一种把本发明的细胞递送给受试者的方法是把细胞直接注射到受试者的心室肌中(例如，Soonpaa等，Science 264：98-101，1994；Koh等，Am.J.Physiol.33：H1727-1733，1993)。所述细胞可在生理相容的载体，如缓冲的盐溶液中给予。为了治疗人类受试者的以心功能不全为特征的病症，可把约104-109个细胞引入到人，例如心肌中。
为了完成这些输注方法，可把本发明的细胞插入到递送装置中，通过把细胞注射或种植到患者中而促进引入。这种递送装置包括管，例如导管道，用于把细胞和流体注射到受体患者的身体中。在优选实施方案中，管道还具有一根或几根针，通过针把本发明的细胞引入到患者需要的位置。还希望在注射过程中，把每种细胞类型维持在不同的条件组中(如不同的培养基中)。在这种情况下，可使用具有一根，两根或三根针的多筒注射器进行注射(图20A，20B，21A，21B，22A，和22B)。如果使用三筒/两针注射器，优选在注射过程中混合内皮细胞的祖细胞和平滑肌细胞的祖细胞。
本发明的细胞可以不同形式插入到这种递送装置中。例如，当包含在这种递送装置中时，所述细胞可被混悬在溶液中或包埋在支持基质中。优选所述溶液含有药学上可接受的载体或稀释剂，本发明的细胞在其中仍然保持活性。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水，含水缓冲溶液，溶剂和/或分散介质。这种载体和稀释剂的使用是本领域熟知的。所述溶液优选无菌的流体。优选所述溶液在制造和贮存条件下稳定，并使用例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸或硫汞撒来防止微生物，如细菌和真菌的污染。本发明的溶液可通过把这里所述的细胞掺入到药学上可接受的载体或稀释剂中制备，如果需要，还可掺入到其它成分。
掺入或包埋本发明细胞的支持基质包括受体相容性基质，而且其可降解为对受体无害的产物。这种基质的例子是天然和/或合成的生物可降解基质。天然的生物可降解基质包括，例如，胶原基质和藻酸盐珠。合成的生物可降解基质包括合成的聚合物，如聚酐，聚原酸酯，和聚乳酸。这些基质可为体内细胞提供支持和保护。
在引入到患者中之前，可对细胞进行修饰从而抑制免疫排斥。例如，为了抑制对移植细胞的排斥，并在移植物受体中获得免疫非反应性，本发明的方法可包括在引入到患者中之前，改变细胞表面上的免疫原性抗原。改变细胞上一个或多个免疫原性抗原的步骤可单独进行，或与抑制受试者T细胞活性的药剂联合给药。可选择性地，移植细胞排斥的抑制可在没有预先改变移植细胞表面上的免疫原性抗原的条件下，通过给予受试者一种可抑制受试者T细胞活性的药剂而实现。抑制T细胞活性的药剂被定义为除去(例如，螯合)或破坏受试者的T细胞，或抑制受试者T细胞功能的药剂。T细胞可能仍然存在于患者中，但处于非功能性状态，所以它们不能增殖或引发或执行效应子功能(例如，细胞因子的产生，细胞毒性等)。抑制T细胞活性的药剂还可抑制未成熟T细胞(例如，胸腺细胞)的成熟或活性。抑制受体受试者T细胞活性的优选药剂是一种免疫抑制药物，它可抑制或干扰正常的免疫功能。优选的免疫抑制药物是环孢菌素A。可用的其它免疫抑制药物包括，例如，FK506和RS-61443。在其中一个实施方案中，所述免疫抑制药物与至少一种其它的治疗剂联合给药。可给予的其它治疗剂包括类固醇(例如，糖皮质激素，如强的松，甲基强的松龙，和地塞米松)和化疗剂(例如，硫唑嘌呤和环磷酰胺)。在另一实施方案中，免疫抑制药物与类固醇和化疗剂联合给药。适宜的免疫抑制药物可以买到。
除了用于治疗与心脏有关的疾病外，细胞移植疗法还适用于各种疾病和病症(例如，帕金森氏病，糖尿病，脊髓损伤，多发性硬化)。随着移植到心肌中，有能力而且接受所需细胞命运的有丝分裂细胞的移植很可能有助于移植细胞的整合，使更多的所需细胞掺入并在宿主组织中存活。用于检测细胞系分化，定型，或能力的增强子在下面的表1中描述。
                        表1
细胞类型                标记                     参考文献
血管平滑肌细胞          BvesReese等，            Dev.Biol.209：159-171，1999
内皮细胞                Tie-2                    Schnurch和Risau，Development
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心外膜细胞              Flk-1                    Shalaby等，Nature 376：62-66，1995
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脂肪细胞                PPAR-g2                  Zhu等，PNAS 92：7921-7925，1995
破骨细胞                TRAP                     Reddy，J.Bone Miner.Res.
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成骨细胞                骨钙蛋白                 Kcsterson，Mol Endocrinol.
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巨噬细胞                CD11b                    Dziennis等，Blood.85：319-329，1995
神经元祖细胞            Ncstin                   Yamaguchi等，Neuroreport
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神经元                  神经丝                   Leconte等，J Mol Neurosci
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星形胶质细胞              GFAP                Nolte等，Glia 33：72-86，2001
骨骼肌细胞                MyoD                Goldhammer等，Science 256：538-42，1992
平滑肌细胞                SMHC                Zilbcrman等，Circ Res 1998
                                              82：566-575，1998
胰前体细胞                Pdx-1               Marshak等，Mol.Cell.Biol.
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胰β细胞                 葡糖激酶             Jetton等，JBC 269：3641-3654，1993
肝细胞                   甲胎蛋白             Ghebranious，Dev 42：1-6，1995
上述每篇参考文献都引入此处作为参考。
实施例7：心肌梗塞的犬模型
把在体外定型为心原性细胞系的BMSC移植到梗塞的狗心肌组织中。狗心肌梗塞是通过左冠状动脉的永久闭塞而建造的。在移植BMSC之前，使梗塞至少稳定两个月。为了防止移植物免疫排斥，按照下面所述收集骨髓并准备各移植受体狗的BMSC。结扎后大约4周，在使用超声心动图证实心肌梗塞后，对髂骨穿刺，吸出骨髓。立即把骨髓与肝素混合，冷冻，并在干冰中转移到组织培养设备上，37℃解冻骨髓，微扰，用常规DMEM洗涤一次，接种在含有培养基(10％胎牛血清，100μML-抗坏血酸-2-PO4，5-15ng/ml LIF，和20nM地塞米松)的组织培养瓶中。采集时，用DiI，一种红色的荧光标记，标记BMSC，从而在移植后追踪细胞的存活和进展。然后在有100ng/ml bFGF存在的条件下培养标记的BMSC 4-7天。收集细胞(1.5-250百万)，注射到心脏梗塞区域中。
移植后的BMSC存活是利用死后DiI荧光的显色来确定。在移植15天后的心肌中观察到的大片的DiI-阳性细胞，表明BMSC的长期存活(图6)。具体而言，DiI-标记的干细胞在含有MF-20阳性心肌细胞的心肌区域内和没有MF-20阳性心肌细胞的梗塞区域内观察到的(图6)。此外，梗塞区域的边缘区域含有DiI阳性干细胞，它们也表达心肌特异性标记MHCα/β(图7-9)。总之，这些数据证实，按照所述方法体外处理的移植BMSC存活了，并掺入到宿主心肌中，表达心脏分化的标记特征。
实施例8：BMSC移植减小梗塞的面积
使用实施例7描述的犬心肌梗塞模型，通过超声心动图(ECG)体内确定BMSC移植的修复作用。ECG是在BMSC移植后3.5，4.5，和5周进行的(分别为图19、17和18)，并与移植前的ECG进行比较。在每只动物中，梗塞区域变得与心肌邻近区域的收缩更加同步。因此，ECG结果证实了实施例7的组织学结果，并证实受刺激的培养BMSC的移植可导致梗塞后心脏组织的部分修复。
实施例9：心肌梗塞的鼠模型
还可使用小鼠心肌梗塞模型系统研究移植BMSC的长期存活。为了防止免疫排斥，从小鼠的骨髓中分离BMSC，该小鼠与移植所用的那些小鼠等基因。如上所述，在有100ng/ml bFGF存在的条件下培养BMSC4-7天，然后用DiI荧光标记并采集。通过左冠状动脉结扎建立梗塞。然后如下所述，把处理过的BMSC注射到梗塞区域中。使用具有匹配29G或30G Hamilton针的50微升Hamilton注射器以倾斜的方式把BMSC(10μl PBS或HBSS中含有100,000-500,000个)注射到前间隔LV心肌中。在手术过程中，将小鼠放置在定做的热床上，使用反馈温度控制器使温度维持在37℃，使用小鼠呼吸器(设定体积200微升，速率110/分钟)辅助呼吸。移植36天后，分析梗塞区域中DiI-标记细胞的存在和心肌细胞的存活。正如在犬模型中观察到的，标记的BMSC被掺入到鼠心肌梗塞区域内。此外，存在于心肌中的DiI-标记细胞显示出心肌细胞的形态学特征。该区的苏木精和曙红染色显示出条纹状，螺旋形的细胞核，及伸长的纤维，而这正是梗塞区内心肌的特征(图10)。我们还观察了与心肌梗塞区域邻近的DiI阳性细胞。使用α-MHC，MF-20，和心脏肌钙蛋白抗体进行染色的心肌细胞的显色证实，DiI标记的细胞(移植的BMSC)完全位于心脏肌原纤维内(图11，12和14)。移植的BMSC还可掺入到心肌的邻近区域中(图13)。因此，移植的受刺激BMSC完全整合到正常和梗塞的心脏组织中，并继续分化成心肌细胞；这一过程在移植前体外刺激过程中开始。
实施例10：诱导干细胞成为内皮祖细胞的方法
为了产生受引发的内皮祖细胞，使用VEGF(10ng/ml)，bFGF(1ng/ml)，和IGF-I(2ng/ml)引发分离的干细胞(例如，人的BMSC)4-7天(Shi等，Blood 92：362-367，1998)。作为细胞指示系统中的转化指示剂，可使用含有与报道基因可操作性连接的Tie增强子的干细胞(Schlaeger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3058-3063，1997)。
实施例11：诱导干细胞成为血管平滑肌祖细胞的方法
为了产生受引发的血管平滑肌祖细胞，使用PDGF(1-10ng/ml)和TGF-β(1-10ng/ml)引发分离的干细胞(例如，人的BMSC)4-7天(Hirschi等，J.Cell Biol.141：805-814，2000)。作为细胞指示系统中的转化指示剂，可使用含有与报道基因可操作性连接的Bves增强子的干细胞(Reese等，Dev.Biol.209：159-171，1999)。
其它实施方案
本说明书中引证的所有公开出版物和专利申请都引入此处作为参考，就好像每篇公开出版物或专利申请都具体而且单独引入作为参考。虽然已经通过举例说明和用于阐明理解目的的实施例详细描述了上述发明，但在不背离权利要求的精神或范围的前提下，根据本发明的教导可以进行某些改变和改进，这对于本领域的那些普通技术人员而言是显而易见的。

Claims (29)

1.一种用于生产移植到哺乳动物心肌组织中的细胞的方法，包括下列步骤：
(a)提供还没有无限增殖化的骨髓干细胞，
(b)在诱导所述细胞分化成生心肌细胞的条件下培养所述骨髓干细胞，
(c)监测步骤(b)的细胞的分化状态，和
(d)当至少约10％和多至100％所述细胞是生心肌细胞时，收集步骤(b)的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括下列步骤：
(e)把所述生心肌细胞移植到所述哺乳动物中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述骨髓干细胞来源于所述哺乳动物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
5.根据权利要求1所述的方法，其中当至少约50％和多至80％的所述步骤(b)的细胞为生心肌细胞时，进行所述收集步骤(d)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤(b)包括的培养条件是：培养基含有BMP-2和bFGF中的至少一种，其量足以诱导所述细胞分化成生心肌细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述监测步骤(c)包括测定与所述步骤(b)的骨髓干细胞共培养的自体骨髓干细胞的分化状态，其中所述自体骨髓干细胞的分化状态与所述步骤(b)的骨髓干细胞的分化状态有关。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述监测步骤(c)包括确定与所述步骤(b)的骨髓干细胞共培养的同源或异源骨髓干细胞的分化状态，其中所述同源或异源骨髓干细胞的分化状态与所述步骤(b)的骨髓干细胞的分化状态有关。
9.一种用于生产移植到哺乳动物中的细胞的方法，包括下列步骤：
(a)提供还没有无限增殖化的骨髓干细胞，
(b)在诱导所述细胞分化成血管平滑肌细胞，内皮细胞，心外膜细胞，脂肪细胞，破骨细胞，成骨细胞，心脏成纤维细胞，巨噬细胞，神经元祖细胞，神经元，星形胶质细胞，骨骼肌细胞，平滑肌细胞，胰前体细胞，胰β-细胞，或肝细胞的条件下培养所述骨髓干细胞，
(c)监测步骤(b)的细胞的分化状态，和
(d)当至少约10％和多至100％的所述细胞表达可检测量的、对所述细胞类型特异的蛋白时，收集步骤(b)的细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，进一步包括下列步骤：
(e)把步骤(d)所述的细胞移植到所述哺乳动物中。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述骨髓干细胞来源于所述哺乳动物。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
13.根据权利要求9所述的方法，其中当至少约50％和多至80％的所述步骤(b)的细胞分化成所述细胞类型时，进行所述收集步骤(d)。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述监测步骤(c)包括确定与所述步骤(b)的骨髓干细胞共培养的自体骨髓干细胞的分化状态，其中所述自体骨髓干细胞的分化状态与所述步骤(b)的骨髓干细胞的分化状态有关。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述监测步骤(c)包括确定与所述步骤(b)的骨髓干细胞共培养的同源或异源骨髓干细胞的分化状态，其中所述同源或异源骨髓干细胞的分化状态与所述步骤(b)的骨髓干细胞的分化状态有关。
16.一种治疗哺乳动物以心功能不全为特征的病症的方法，该方法包括下列步骤：
(a)分离所述哺乳动物的骨髓干细胞，
(b)在诱导所述细胞分化成生心肌细胞的条件下培养所述骨髓干细胞，
(c)监测步骤(b)的细胞的分化状态，
(d)当至少约10％和多至100％所述细胞是生心肌细胞时，收集步骤(b)的细胞，和
(e)把所述生心肌细胞移植到所述哺乳动物中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
18.根据权利要求16所述的方法，其中当至少约50％和多至80％的所述步骤(b)的细胞分化成所述细胞类型时，进行所述收集步骤(d)。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述监测步骤(c)包括确定自体骨髓干细胞的分化状态。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述监测步骤(c)包括确定同源或异源骨髓干细胞的分化状态。
21.一种用于生产细胞的方法，所述细胞在移植到哺乳动物中后受引发分化成内皮细胞，该方法包括下列步骤：
(a)提供还没有无限增殖化的干细胞群，
(b)在诱导所述细胞分化成内皮祖细胞的条件下培养所述步骤(a)的细胞；和
(c)当至少约10％和多至100％的细胞是内皮祖细胞时，收集步骤(b)的细胞，其中所述细胞在移植到哺乳动物中后受引发分化成内皮细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，在步骤(b)和(c)之间进一步包括监测步骤(b)细胞的分化状态的步骤。
23.一种用于生产细胞的方法，所述细胞在移植到哺乳动物中后受引发分化成血管平滑肌细胞，该方法包括下列步骤：
(a)提供还没有无限增殖化的骨髓干细胞群，
(b)在诱导所述细胞分化成血管平滑肌祖细胞的条件下培养所述步骤(a)的细胞；和
(c)当至少约10％和多至100％的细胞是血管平滑肌祖细胞时，收集步骤(b)的细胞，其中所述细胞在移植到哺乳动物中后受引发分化成血管平滑肌细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，在步骤(b)和(c)之间，进一步包括监测步骤(b)细胞的分化状态的步骤。
25.一种治疗被诊断为患有以心功能不全为特征的病症的哺乳动物的方法，该方法包括把下列细胞引入到所述哺乳动物的心肌组织中：
(a)心肌细胞或心肌细胞的祖细胞；
(b)内皮细胞或内皮细胞的祖细胞；和
(c)血管平滑肌细胞或血管平滑肌细胞的祖细胞，其中引入所述细胞的量足以改善心功能。
26.根据权利要求25所述的方法，其中把至少一百万个心肌细胞的祖细胞与其它两种细胞类型注射到所述心肌中，心肌细胞的祖细胞：内皮细胞的祖细胞：血管平滑肌细胞的祖细胞的比值约为10∶1∶1。
27.根据权利要求25所述的方法，进一步包括把caspase抑制剂引入到所述心肌中。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
29.一种药物组合物，含有：
(a)心肌细胞或心肌细胞的祖细胞；
(b)内皮细胞或内皮细胞的祖细胞；和
(c)血管平滑肌细胞或血管平滑肌细胞的祖细胞，其中所述细胞的量足以在引入人体后改善心功能。
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