PT1272204E - Aumento e enchimento de tecidos moles e osso utilizando células progenitoras derivadas de músculo, suas composições e tratamentos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Aumento e enchimento de tecidos moles e osso utilizando células progenitoras derivadas de músculo, suas composições e tratamentos" 0 presente invento refere-se a células progenitoras (ou estaminais) derivadas de músculo (MDC ou MDSC) e a composições de MDC e à sua utilização no aumento de tecidos corporais, nomeadamente tecido mole e osso. Em particular, o presente invento refere-se a células progenitoras derivadas de músculo que apresentam sobrevivência prolongada após introdução em tecido mole e osso, métodos para isolar MDC e métodos para utilizar composições contendo MDC para o aumento de tecidos moles e osso humano ou animal, incluindo tecido epitelial, adiposo, nervoso, de órgão, muscular, de ligamento e de cartilagem. 0 invento também se refere a novas utilizações de células progenitoras derivadas de músculo para o tratamento de condições cosméticas ou funcionais, tais como condições dermatológicas, refluxo gastroesofágico, refluxo vesico-ureteral, incontinência urinária, incontinência fecal, fraqueza do músculo esquelético, insuficiência cardíaca e lesão ou fraqueza associada a enfarte do miocárdio. 0 aumento de tecido mole utilizando materiais sintéticos tais como silicone ou politetrafluoroetileno (PTFE) é bem conhecido na arte. A patente U.S. n.° 5 876 447 de Arnett revela a utilização de implantes de silicone para cirurgia plástica facial. Contudo, tais materiais sintéticos são estranhos ao tecido hospedeiro e causam uma resposta imunológica que resulta na encapsulação do implante e formação de cicatrizes nos tecidos circundantes. Assim, o implante pode produzir problemas funcionais ou estéticos adicionais.

Foi também descrito o aumento de tecido mole utilizando biopolímeros tais como colagénio ou ácido hialurónico. Por exemplo, a patente U.S. n.° 4 424 208 de Wallace et al. revela métodos para aumentar tecido mole utilizando material de implante de colagénio. Adicionalmente, a patente U.S. n.° 4 965 353 de delia Valle et al. revela ésteres de ácido hialurónico que podem ser utilizados em cirurgia cosmética. Contudo, estes biopolímeros são também estranhos ao tecido 2 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ hospedeiro e causam uma resposta imunológica que resulta na reabsorção do material injectado. Os biopolimeros são assim incapazes de proporcionar aumento de tecido a longo prazo. No geral, a utilização de biopolimeros ou materiais sintéticos tem sido globalmente insatisfatória para o objectivo de aumentar tecido mole. 0 aumento de tecido mole utilizando composições baseadas em células tem também sido desenvolvido. A patente U.S. n.° 5 858 390 de Boss, Jr. revela a utilização de fibroblastos dérmicos autólogos para o tratamento de defeitos de pele cosméticos e estéticos. Apesar deste tratamento evitar os problemas inerentes ao implante ou injecção de materiais sintéticos ou biopolimeros, resulta noutras complicações. Devidos aos fibroblastos produzirem colagénio, as células podem causar o enrijamento e distorção dos tecidos circundantes ao local do implante. A utilização de células gordas autólogas como um agente de enchimento injectável foi também descrita (para uma revisão, consultar K. Mak et al., 1994, Otolaryngol. Clin. North. Am. 27: 211-22; American Society of Plastic and Reconstructive

Surgery: Report on autologous fat transplantation by the ad hoc committee on new procedures, 1987, Chicago: American Society of Plastic and Reconstructive Surgery; A. Chaichir et al., 1989, Plast. Reconstr. Surg. 84: 921-935; R.A. Ersek, 1991, Plast. Reconstr. Surg. 87: 219-228; H.W. Horl et al., 1991, Ann. Plast. Surg. 26: 248-258; A. Nguyen et al., 1990, Plast. Reconstr. Surg. 85: 378-389; J. Sartynski et al., 1990, Otolaryngol. Head Neck Surg. 102: 314-321. Contudo, o procedimento de enxerto de gordura proporciona apenas aumento temporário, pois a gordura injectada é reabsorvida pelo hospedeiro. Além disso, o enxerto de gordura pode resultar em formação de nódulos e assimetria de tecidos.

Os mioblastos, os precursores das fibras musculares, são células musculares mononucleadas que se fundem para formar miotubos multinucleados pós-mitóticos, que podem proporcionar expressão a longo prazo e entrega de proteínas bioactivas (T.A. Partridge e K.E. Davies, 1995, Brit. Med. Bulletin 51: 123-137; J. Dhawan et al., 1992, Science 254: 1509-12; A.D.

Grinnell, 1994, Myology 2a ed, A.G. Engel e C.F. Armstrong, 3 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ

McGraw-Hill, Inc., 303-304; S. Jiao e J.A. Wolff, 1992, Brâin Research 575: 143-7; H. Vandenburgh, 1996, Human Gene Therapy 7: 2195-2200).

Os mioblastos em cultura contêm uma subpopulação de células que apresentam algumas propriedades de auto-renovação de células estaminais (A. Baroffio et ai., 1996, Differentiation 60: 47-57). Tais células não se fundem para formar miotubos e não se dividem a não ser que sejam cultivadas separadamente (A. Baroffio et al., supra). Estudos de transplante de mioblastos (consultar adiante) demonstraram que a maioria das células transplantadas morre rapidamente, enquanto que uma minoria sobrevive e medeia formação de novos músculos (J.R. Beuchamp et al., 1999, J. Cell Biol. 144: 1113-1122) .

Esta minoria de células apresenta comportamento caracteristico, incluindo crescimento lento em cultura de tecidos e crescimento rápido após transplante, sugerindo que estas células podem representar células estaminais de mioblasto (J.R. Beuchamp et al., supra).

Os mioblastos têm sido utilizados como veículos para terapia génica no tratamento de várias doenças relacionadas com músculo e não relacionadas com músculo. Por exemplo, tem-se utilizado transplante de mioblastos modificados geneticamente ou não modificados para o tratamento de distrofia muscular de Duchenne (E. Gussoni et al., 1992, Nature, 356: 435-8; J. Huard et al., 1992, Muscle & Nerve, 15: 550-60; G. Karpati et al., 1993, Ann. Neurol., 34: 8-17; J.P. Trembla et al., 1993, Cell Transplantation, 2: 99-112; P.A. Moisset et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 247: 94-9; P.A. Moisset et al., 1998, Gene Ther. 5: 1340-46). Além disso, modificaram-se por engenharia genética mioblastos para produzirem pró-insulina para o tratamento de diabetes Tipo 1 (L. Gros et al., 1999, Hum. Gen. Ther. 10: 1207-17); Factor IX para o tratamento de hemofilia B (M. Roman et al., 1992, Somat. Cell. Mol. Genet. 18: 247-58; S.N. Yao et al., 1994, Gen. Ther. 1: 99-107; J.M. Wang et al., 1997, Blood 90: 1075-82; G. Hortelano et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10: 1281-8); adenosina-desaminase para o tratamento de síndrome de deficiência de adenosina-desaminase (C.M. Lynch et al., 1992, 4 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 1138-42); eritropoietina para o tratamento de anemia crónica (E. Regulier et al., 1998, Gene Ther. 5: 1014-22; B. Dalle et al., 1999, Gene Ther. 6: 157-61) e hormona de crescimento humano para o tratamento de atraso do crescimento (K. Anwer et al., 1998, Hum. Gen. Ther. 9: 659-70) .

Os mioblastos têm sido também utilizados para tratar lesão ou doença do tecido muscular, tal como revelado na patente U.S. n.° 5 130 141 de Law et al., patente U.S. n.° 5 538 722 de Blau et al. e pedido U.S. n.° de série 09/302 896 apresentada a 30 de Abril de 1999 por Chancellor et al. Além disso, o transplante de mioblastos tem sido utilizado para tratamento de disfunção do miocárdio (C.E. Murry et al., 1996, J. Clin. Invest. 98: 2512-23; B.Z. Atkins et al., 1999, Ann. Thorac. Surg. 67: 124-129; B.Z. Atkins et al., 1999, J. Heart Lung Transplant. 18: 1173-80).

Apesar do referido acima, na maioria dos casos, os tratamentos derivados de mioblastos primários têm sido associados com baixas taxas de sobrevivência das células após transplante devido a migração e/ou fagocitose. Para solucionar este problema, a patente U.S. 5 667 778 de Atala, revela a utilização de mioblastos suspensos num polímero líquido tal como alginato. A solução de polímero actua como uma matriz para evitar que os mioblastos migrem e/ou sofram fagocitose pós-injecção. Contudo, a solução de polímero apresenta os mesmos problemas que os biopolímeros discutidos acima.

Além disso, a patente de Atala limita-se às utilizações de mioblastos apenas em tecido muscular e em mais nenhum outro tecido.

Assim, há necessidade de outros materiais de aumento de tecido mole diferentes que tenham duração prolongada, sejam compatíveis com uma vasta gama de tecidos hospedeiros e que causem inflamação, cicatrizes e/ou enrijamento mínimos dos tecidos que rodeiam o local do implante. Assim, proporcionam-se as composições contendo células progenitoras derivadas de músculo do presente invento como materiais melhorados e novos para aumentar tecido moles. Proporcionam-se adicionalmente métodos para produzir composições de células 5 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ progenitoras derivadas de músculo que apresentam sobrevivência prolongada após transplante e métodos para utilizar MDC e composições contendo MDC para tratar vários defeitos estéticos e/ou funcionais, incluindo, por exemplo, condições ou lesões dermatológicas e fraqueza, lesão, doença ou disfunção musculares.

Note-se que tentativas anteriores para utilizar mioblastos para aumento de tecido mole não foram bem sucedidas (patente U.S. n.° 5 667 778 de Atala). Assim, as revelações aqui reveladas são inesperadas dado que demonstram como células progenitoras derivadas de músculo de acordo com o presente invento podem ser transplantadas com sucesso para tecido mole não muscular e muscular, incluindo tecido epitelial e apresentar sobrevivência prolongada. Em resultado, podem utilizar-se MDC e composições incluindo MDC como um material de aumento geral para aumento de tecido mole muscular ou não muscular, assim como para produção de osso. Além disso, dado que as células progenitoras derivadas de músculo e composições do presente invento podem ser derivadas de fontes autólogas, apresentam um risco reduzido de complicações imunológicas no hospedeiro, incluindo a reabsorção de materiais de aumento e a inflamação e/ou formação de cicatrizes nos tecidos que rodeiam o local do implante.

Apesar de se poderem encontrar células estaminais mesenquimatosas em vários tecidos conjuntivos do corpo incluindo músculo, osso, cartilagem, etc. (H.E. Young et al., 1993, In Vitro Cell Dev. Biol. 29A: 723-736; H.E. Young, et al., 1995, Dev. Dynam. 202: 137-144), a expressão mesenquimatosa tem sido utilizada historicamente em referência a uma classe de células estaminais purificadas de medula óssea e não de músculo. Assim, as células estaminais mesenquimatosas distinguem-se das células progenitoras derivadas de músculo do presente invento. Além disso, as células mesenquimatosas não expressam o marcador celular CD34 (M.F. Pittenger et al., 1999, Science 284: 143-147), que é expresso pelas células progenitoras derivadas de músculo aqui descritas.

Constitui um problema principal da terapia celular a fraca sobrevivência e alastramento limitado das células injectadas, 6 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ assim como a rejeição imunitária de recebedores contra células dadoras (Y. Fan et al., 1996, Muscle & Nerve, 19: 853-860).

As células estaminais derivadas de músculo (MDSC ou mdc) tal como descritas pelo presente invento, apresentam a capacidade de auto-renovação elevada e proliferação a longo prazo quando utilizadas em terapias de transplante de células para aumentar e encher tecido mole e osso. Tanto as células autólogas como as alogénicas deste invento podem proporcionar terapias celulares eficazes para as doenças e condições descritas. Adicionalmente, tais células podem melhorar a eficácia da terapia celular em músculos gravemente doentes.

Num primeiro aspecto do invento proporciona-se utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina apresentando sobrevivência prolongada in situ ou uma sua população clonal e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para utilização no aumento ou enchimento de tecido muscular esofágico ou de tecido muscular gastroesofágico num mamífero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher o tecido muscular esofágico ou gastroesofágico.

De acordo com um segundo aspecto do invento proporciona-se utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina apresentando sobrevivência prolongada in situ ou uma sua população clonal e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para utilização no aumento ou enchimento de tecido muscular de esfíncter num mamífero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher o tecido muscular de esfíncter.

Num terceiro aspecto do presente invento proporciona-se utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina apresentando sobrevivência prolongada in situ ou uma sua população clonal e (ii) um transportador, 7 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para utilização no aumento ou enchimento de tecido seleccionado de tecido muscular da bexiga, uréter ou uretra num mamifero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher o tecido da bexiga, uréter ou uretra.

De acordo com um quarto aspecto do invento proporciona-se utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina apresentando sobrevivência prolongada in situ ou uma sua população clonal e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para utilização no aumento ou enchimento de um defeito cosmético ou estético de tecido mole num mamifero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher o defeito cosmético ou estético.

Num quinto aspecto do invento proporciona-se utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina apresentando sobrevivência prolongada in situ ou uma sua população clonal e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para utilização no aumento ou enchimento de tecido incluindo um ou mais de uma depressão, ferida, fissura ou abertura cutâneas num animal, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher a depressão, ferida, fissura ou abertura cutâneas.

De acordo com um sexto aspecto do invento proporciona-se utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina apresentando sobrevivência prolongada in situ ou uma sua população clonal e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para utilização no aumento ou enchimento de tecido muscular num mamifero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher o tecido muscular; sendo o referido tecido muscular seleccionado de (a) tecido digestivo 8 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ seleccionado do grupo que consiste em tecido estomacal, intestinal, da língua, esofágico, pilórico e anal; (b) tecido reprodutivo seleccionado do grupo que consiste em tecido uterino, vaginal, clitoriano, do tubo de Falópio, cervical, peniano e do vaso deferente; (c) tecido urológico seleccionado do grupo que consiste em tecido do rim, da bexiga, uréter, uretra e do esfíncter; ou (d) tecido respiratório seleccionado do grupo que consiste em tecido da traqueia e do pulmão.

Num sétimo aspecto do invento proporciona-se utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina apresentando sobrevivência prolongada in situ ou uma sua população clonal e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para utilização no aumento ou enchimento de (a) tecido mole não muscular, ou (b) tecido mole não muscular e não ósseo num mamífero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou o (a) tecido mole não muscular, ou (b) tecido mole não muscular e não ósseo.

De acordo com um oitavo aspecto do invento proporciona-se utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina apresentando sobrevivência prolongada in situ ou uma sua população clonal e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para utilização no restauro ou melhoria da contractilidade de músculo liso seleccionado do grupo que consiste em músculo liso esofágico, músculo liso estomacal, músculo liso pilórico e músculo liso intestinal; e adicionalmente em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para restaurar ou melhorar a contractilidade de músculo liso.

As concretizações preferidas do invento em qualquer dos seus vários aspectos são como descritas adiante ou como definidas nas reivindicações dependentes.

As Figuras 1A-1F ilustram os resultados do aumento de tecido mole utilizando injecções de composições de MDC comparativamente com injecção de colagénio bovino 9 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ convencional. Nas figuras 1A-1F, injectou-se MDC (figuras 1D-1F) ou colagénio (1A-1C) na pele da parede abdominal. A área de injecção foi a interface da derme e do tecido conjuntivo subcutâneo que é a pele. As figuras 1A-1F apresentam coloração tricromática a uma ampliação de 40X pós-injecção de colagénio ou MDC na pele. Aos 5 dias, 2 semanas ou 4 semanas pós-injecção, obtiveram-se amostras de tecido e prepararam-se para análise. As figuras IA e 1D apresentam os resultados de MDC relativamente a injecção de colagénio na pele aos 5 dias pós-injecção; as figuras 1B e 1E apresentam os resultados às 2 semanas pós-injecção; e as figuras 1C e 1F apresentam os resultados às 4 semanas pós-injecção. As setas nas figuras 1D-1F indicam a presença de MDC nas áreas injectadas (cor-de-rosa escuro). As figuras 1A-1F demonstram que pós-injecção no espaço subcutâneo, MDC persistiu e manteve/aumentou o tecido subcutâneo da parede abdominal durante até pelo menos 4 semanas, enquanto que o colagénio não persistiu 2 semanas pós-injecção na pele. (exemplo 3).

As Figuras 2Ά e 2B ilustram os resultados de aumento de tecido mole do esófago inferior (figura 2A) e do esfincter anal (figura 2B) utilizando injecções de composições de MDC. Aplicaram-se injecções na junção gastro-esofágica ou no esfincter anal. No dia 3 pós-injecção, obtiveram-se amostras de tecido e prepararam-se para análise. As MDC indicam-se por coloração de β-galactosidase. A figura 2A apresenta tecidos injectados a uma ampliação de 100X; a figura 2b apresenta tecidos injectados a uma ampliação de 40X. As figuras 2A e 2B demonstram que injecções de MDC mantiveram o aumento de tecido mole do esófago inferior e do esfincter anal durante até 3 dias pós-injecção.

As Figuras 3A e 3B ilustram os resultados de aumento de tecido mole da junção bexiga-ureteres utilizando injecções de composições de MDC. As injecções foram na junção vesico-ureteral. No dia 3 pós-injecção, obtiveram-se amostras de tecido e prepararam-se para análise. As MDC são indicadas por coloração de β-galactosidase tal como observado perto da seta. A figura 3A apresenta tecidos injectados a baixa ampliação (40X); a figura 3B apresenta tecidos injectados a ampliação elevada (100X). As figuras 3A e 3B demonstram que injecções de 10 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ MDC mantiveram ο aumento de tecido mole da junção bexiga-ureteres durante até 3 dias pós-injecção.

As Figuras 4A e 4B ilustram o tratamento de lesão criogénica da bexiga utilizando injecções de tecido mole de composições de MDC. Administraram-se as injecções na parede da bexiga no local da lesão criogénica. No dia 30 pós-injecção, obtiveram-se amostras de tecido e prepararam-se para análise. As setas indicam o local da lesão criogénica e injecção de MDC. Ampliação de 100X. A figura 4A apresenta tecido de bexiga danificado criogenicamente não tratado. A figura 4B apresenta tecido de bexiga danificado criogenicamente tratado com injecções de MDC; indicam-se as MDC por coloração de β-galactosidase. As figuras 4A e 4B demonstram que injecções de MDC mantiveram o aumento de tecido mole do tecido de bexiga danificado criogenicamente durante até 30 dias pós-injecção.

As Figuras 5A-5I ilustram diferenciação celular de MDC pós-injecção em tecido de bexiga danificado criogenicamente. Administraram-se injecções na parede da bexiga no local da lesão criogénica e obtiveram-se amostras de tecido e prepararam-se para análise aos 5, 35 ou 70 dias pós-injecção. Apresentam-se MDC injectadas por coloração de β-galactosidase e apresentam-se MDC não diferenciadas por coloração de actina α de músculo liso (actina α-SM) . Apresentam-se as MDC que se diferenciaram em miotubos ou miofibras por coloração de cadeia pesada de miosina rápida (MyHC rápida). As setas apresentam MyHC rápida. No dia 5 pós-injecção, observaram-se várias MDC na área de injecção e apenas algumas MDC tinham diferenciado para miotubos, tal como demonstrado pelos níveis elevados de coloração de β-galactosidase (figura 5A) e actina a-SM (figura 5D) e os níveis relativamente reduzidos de coloração de MyHC rápida (figura 5G) . No dia 35 pós-in jecção, observaram-se várias MDC na área de injecção e muitas tinham diferenciado para miotubos, tal como demonstrado pelos níveis elevados de coloração de β-galactosidase (figura 5B), a diminuição da coloração de actina α-SM (figura 5E); e o aumento de coloração de MyHC rápida (figura 5H) . No dia 70 pós-injecção, observaram-se MDC na área de injecção e quase todas as MDC diferenciaram para miofibras, tal como demonstrado pelos níveis elevados de coloração de β-galactosidase (figura 5C), a diminuição da coloração de 11 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ actina α-SM (figura 5F) e os níveis elevados de coloração de actina α-SM (figura 51). A ampliação é de 200X. As figuras 5A-51 demonstram que as MDC permanecem viáveis e iniciam diferenciação durante até 70 dias pós-injecção no tecido mole de bexiga.

As Figuras 6A-6D ilustram a reinervação de MDC injectadas no tecido mole da bexiga. A inervação é indicada por coloração de acetilcolina (Ach), que apresenta a junção neuromuscular. No dia 3 pós-injecção, observam-se pouca inervações, tal como demonstrado por coloração de Ach (figura 6A) . No dia 15 pós-injecção observaram-se várias inervações (figura 6B). No dia 30 pós-injecção observaram-se mais inervações (figura 6C). 6 meses pós-injecção observam-se numerosas inervações a baixa ampliação (100X) (figura 6D) . As figuras 6A-6C apresentam tecido injectado a ampliação elevada (200X). As figuras 6A-6D demonstram que MDC induz inervação durante até 6 meses pós-injecção em tecidos de bexiga danificados criogenicamente.

As Figuras 7A e 7B ilustram os resultados de aumento de tecido mole de músculo liso do miocárdio utilizando injecções de composições de MDC. Administraram-se injecções na parede ventricular e prepararam-se amostras de tecido 3 dias pós-injecção. Indicam-se as MDC por coloração de β-galactosidase. A figura 7A apresenta tecido injectado a baixa ampliação (100X); a figura 7B apresenta tecido injectado a ampliação elevada (200X).

As Figuras 8A e 8B ilustram os resultados de injecções de MDC em tecido de fígado. Administraram-se injecções em tecido de fígado no lóbulo inferior esquerdo e prepararam-se amostras de tecido 4 dias pós-injecção. Indicam-se as MDC por coloração de β-galactosidase. A figura 8A apresenta baixa ampliação (100X); a figura 8B apresenta ampliação elevada (200X).

As Figuras 9A e 9B ilustram os resultados de injecções de MDC em tecido de baço. Administraram-se injecções em tecido de baço no seu aspecto interior e prepararam-se amostras de tecido 4 dias pós-injecção. Indicam-se as MDC por coloração de β-galactosidase. A figura 9A apresenta tecidos injectados observados a ampliação baixa (100X); a figura 9B apresenta tecidos injectados observados a ampliação elevada (200X). 12 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ

As Figuras 10Α e 10B ilustram os resultados de injecções de MDC no tecido da espinal-medula. Administraram-se injecções no tecido da espinal-medula e prepararam-se amostras de tecido 4 dias pós-injecção. Indicam-se as MDC por coloração de β-galactosidase. A figura 10A apresenta tecidos injectados observados a ampliação baixa (100X); a figura 10B apresenta tecidos injectados observados a ampliação elevada (200X) . As figuras 7A-7B, 8A-8B, 9A-9B e 10A-10B demonstram que as MDC permanecem viáveis pós-injecção em vários tipos de tecidos diferentes sem danificar os tecidos hospedeiros.

As Figuras 11A-11L ilustram análise imuno-histoquímica de populações de células PPl-4 e PP6 de ratinhos mdx apresentando marcadores de expressão celular incluindo desmina, MyoD e miogenina (marcadores específicos para linhagens miogénicas), M-caderina (marcador específico de célula satélite), Bcl-2 (marcador de miogénese precoce), CD34 (marcador celular hematopoiético ou estromal). As figuras 11A-11L demonstram que as populações de células PPl-4 e PP6 apresentam percentagens comparáveis de células que expressam desmina (figuras 11A e IIG) , MyoD (figuras 11E e 11K) e miogenina (figuras 11F e 11L), enquanto que a população PP6 apresenta uma menor percentagem de células que expressam M-caderina (figuras 11D e 11J), mas uma percentagem mais elevada de células que expressam Bcl-2 (figuras 11C e 111) e CD34 (figuras 11B e IIH) , comparativamente com a população de PPl-4.

As Figuras 12A-12I ilustram a co-localização intracelular de coloração de CD34 ou Bcl-2 com coloração de desmina em células de músculo de ratinho e células endoteliais vasculares. A figura 12A apresenta células de músculo de ratinho normais (ver seta) e células endoteliais vasculares (ver ponta da seta) coradas com anticorpos anti-CD34 e visualizadas por microscopia de fluorescência. A figura 12B apresenta as mesmas células co-coradas com desmina e anticorpos de colagénio tipo iv. A figura 12C apresenta as mesmas células co-coradas com Hoechst para evidenciar os núcleos. A figura 12D apresenta um compósito das células co-coradas para CD34, desmina, colagénio tipo IV e Hoechst. A figura 12E apresenta células de músculo de ratinho normais (ver seta) coradas com anticorpos anti-Bcl-2 e visualizadas 13 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ por microscopia de fluorescência. A figura 12F apresenta as mesmas células co-coradas com desmina e anticorpos de colagénio tipo IV. A figura 12G apresenta as mesmas células co-coradas com Hoechst para evidenciar os núcleos. A figura 12H apresenta um compósito das células co-coradas para CD34, desmina, colagénio tipo IV e Hoechst. A figura 121 apresenta células satélite coradas com anticorpos anti-M-caderina (ver seta) . As células são observadas a uma ampliação de 40 X. As figuras 12A-12D demonstram a co-localização de CD34 e desmina, enquanto que as figuras 12E-12H demonstram a co-localização de Bcl-2 e desmina.

As Figuras 13A-13E ilustram as alterações morfológicas e expressão de osteocalcina resultantes da exposição de células mcl3 a rhBMP-2. Incubaram-se células mcl3 em meio de crescimento com ou sem rhBMP-2 durante 6 dias. A figura 13A apresenta células crescidas até >50% de confluência celular na ausência de rhBMP-2. A figura 13B apresenta células crescidas até >50% de confluência celular na presença de rhBMP-2 a 200 ng/ml. A figura 13C apresenta células crescidas até >90% de confluência celular na ausência de rhBMP-2. A figura 13D apresenta células crescidas até > 90% de confluência celular na presença de rhBMP-2 a 200 ng/ml. A figura 13E apresenta células coradas para expressão de osteocalcina (marcador de células osteoblásticas; ver setas). Observaram-se as células a uma ampliação de 10X. As figuras 13A-13E demonstram que células mcl3 são capazes de se diferenciar para osteoblastos por exposição a rhBMP-2.

As Figuras 14A-14D ilustram os efeitos na percentagem de células mcl3 que expressam desmina e fosfatase alcalina em resposta a tratamento com rhBMP-2. A figura 14A apresenta

coloração de desmina de clones de mcl3 recentemente isolados. A figura 14B apresenta uma vista de contraste de fase das mesmas células. A figura 14C apresenta os niveis de coloração de desmina de células mcl3 após 6 dias de incubação em meio de crescimento com ou sem rhBMP-2 a 200 ng/ml. A figura 14D apresenta os niveis de coloração de fosfatase alcalina em células PPl-4 e células mcl3 após 6 dias de incubação em meio de crescimento com ou sem rhBMP-2 a 200 ng/ml. * indica um resultado estatisticamente significativo (teste-t de Student). A figura 14C demonstra que um menor número de células mcl3 14 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ expressa desmina na presença de rhBMP-2, enquanto que a figura 14D demonstra que um maior número de células mcl3 expressa fosfatase alcalina na presença de rhBMP-2, sugerindo diminuição das caracteristicas miogénicas e aumento das caracteristicas osteogénicas das células na presença de rhBMP-2.

As Figuras 15A-15G ilustram a diferenciação in vivo de células mcl3 para linhagens miogénicas e osteogénicas. As células mcl3 foram transfectadas de forma estável com uma construção contendo LacZ e o gene de distrofina e introduzidas por injecção intramuscular ou intravenosa nos membros posteriores de ratinhos mdx. Após 15 dias sacrificaram-se os animais e isolou-se a musculatura dos membros posteriores para histologia. A figura 15A apresenta células mcl3 no local da injecção intramuscular coradas para LacZ. A figura 15B apresenta as mesmas células co-coradas para distrofina. A figura 15C apresenta células mcl3 na região da injecção intravenosa coradas para LacZ. A figura 15D apresenta as mesmas células co-coradas para distrofina. Numa experiência independente, transduziram-se células mcl3 com adBMP-2 e injectaram-se 0,5-1,0 x 106 células nos membros posteriores de ratinhos SCID. Após 14 dias sacrificaram-se os animais e analisaram-se os tecidos musculares dos membros posteriores. A figura 15E apresenta a análise radiográfica do membro posterior para determinar formação de osso. A figura 15F apresenta as células derivadas do membro posterior coradas para LacZ. A figura 15G apresenta células coradas para distrofina. As figuras 15A-15D demonstram que células mcl3 podem salvar expressão de distrofina através de entrega intramuscular ou intravenosa. As figuras 15E-15G demonstram que células mcl3 estão envolvidas na formação de osso ectópica. As células foram observadas às seguintes ampliações: 40X (figuras 15A-15D), 10X (figuras 15F-15G).

As Figuras 16A-16E ilustram o aumento de cicatrização de osso por células de músculo primárias produtoras de rhBMP-2. Criou-se um defeito de 5 mm no crânio de ratinhos SCID fêmea utilizando uma broca dentária e encheu-se o defeito com uma esponja de colagénio inoculada com células mcl3 com ou sem adBMP-2. Sacrificaram-se os animais aos 14 dias, inspeccionaram-se e analisaram-se microscopicamente 15 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ relativamente a indicações de cicatrização de osso. A figura 16A apresenta um crânio tratado com células mcl3 sem adBMP-2. A figura 16B apresenta um crânio tratado com células mcl3 transduzidas com adBMP-2. A figura 16C apresenta uma amostra histológica do crânio tratado com células mcl3 sem adBMP-2 analisada por coloração von Kossa. A figura 16D apresenta uma amostra histológica de um crânio tratado com células mcl3 transduzidas com adBMP-2 analisada por coloração von Kossa. A figura 16E apresenta uma amostra histológica de um crânio tratado com células mcl3 transduzidas com adBMP-2 analisada por hibridação com sonda especifica do cromossoma-Y para identificar as células injectadas (fluorescência verde salientada por setas) e coradas com brometo de etidio para identificar os núcleos (indicados por fluorescência vermelha). As figuras 16A-16E demonstram que células mcl3 que expressam rhBMP-2 podem contribuir para a cicatrização dos defeitos do osso.

As Figuras 17A-17F apresentam enxertos resultantes da injecção de MDSC na pré-placa tardia (LP), (ou seja, MDSC [LP]-PP5 ou PP6) ou na pré-placa precoce (EP), (ou seja, MDSC [EP] ) -PPl-2) . Tal como apresentado nas figuras 17C e 17D, observou-se um grande enxerto com um número significativo de miofibras positivas para distrofina (distrofina+) em músculo mdx injectado com MDSC [LP] aos dez dias pós-injecção (exemplo 10). Uma comparação do músculo injectado com MDSC [LP] com músculo injectado com MDSC [EP] (figuras 17A e 17B), mostra que o enxerto MDSC [LP] contém muitas mais miofibras pequenas, sugerindo assim que as células MDSC [LP] injectadas apresentam uma elevada capacidade de proliferação in vivo. Em ambos os músculos injectou-se o mesmo número de células de músculo de cada tipo. O número de miofibras distrofina+ em músculo injectado com MDSC [LP] foi cerca de 5 vezes o verificado em músculo injectado com MDSC [EP] (2,798 +/- 1,114, n=4 em mdsc relativamente a 430 +/- 148, n=6 em EP; média +/- DP) . É importante que quando se utilizaram MDSC [LP], estavam presentes muitas miofibras distrofina+ no músculo aos 30 dias pós-injecção (figuras 17E e 17F) . Uma comparação da figura 17C com a figura 17E indica que ambos os enxertos tinham áreas semelhantes; contudo, para o músculo de 30 dias (figura 17E), apenas se injectou metade da quantidade de células da que foi injectada para o músculo de 10 dias 16 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ (figura 17C). Adicionalmente, as fibras de músculo eram muito maiores no enxerto de 30 dias do que no enxerto de 10 dias, indicando assim que a maioria das miofibras distrofina+ que se tinham formado aos 10 dias pós-injecção ainda sobreviviam 20 dias mais tarde. Contrariamente, observou-se um aumento acentuado do número de miofibras distrofina+ em músculo injectado com MDSC [EP] aos 30 dias pós-injecção, resultando numa diferença superior a dez vezes entre o número de miofibras distrofina+ do grupo MDSC [EP] (134 +/- 42, n=3) e do grupo MDSC [LP] (2 000 + /- 658, n=3).

As Figuras 18A e 18B demonstram a exequibilidade de utilizar MDSC fetal humano nos métodos de acordo com o presente invento. Verificou-se que tais células são imunotolerantes e persistiram em ratinhos SCID durante > 2 semanas. Injectaram-se 1 x 106 MDSC [LP] fetais humanas contendo o gene LacZ num vector de expressão na parede da bexiga de ratinhos SCID. Observou-se coloração para LacZ ao dia 5 (figura 18A) e ao dia 15 (figura 18B) pós-injecção, demonstrando assim excelente sobrevivência das MDSC.

As Figuras 19A e 19B apresentam coloração para desmina de animais normais e injectados com MDSC [LP]. Injectaram-se 3 x 105 MDSC de ratinhos normais por via intravenosa em ratinhos normais não imunocomprometidos. Após duas semanas recolheu-se o timo dos ratinhos injectados e corou-se para desmina especifica de músculo-esquelético. A figura 19A demonstra que o controlo de timo normal cora negativamente para desmina. Contudo, 2 semanas pós injecção periférica de MDSC de outro animal, o timo torna-se positivo para coloração com desmina (figura 19B).

As figuras 20A e 20B ilustram os resultados de injecção de composições de MDSC no disco espinal de coelhos. As MDSC continham vectores de expressão com LacZ para expressão de β-galactosidase tal como descrito. Introduziram-se injecções de MDSC obtidas de ratinhos no disco espinal de nivel T6 do coelho. No dia 10 pós-injecção, obtiveram-se amostras de tecido e prepararam-se para análise. A presença de MDSC injectada foi indicada por coloração com β-galactosidase. A figura 20A apresenta tecidos injectados a 100 X (ampliação elevada); a figura 20B apresenta tecidos injectados a 40 X 17 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ (ampliação baixa). Os resultados apresentados nas figuras 20A e 20B demonstram que injecções de MDC persistem no disco vertebral durante pelo menos 10 dias e podem aumentar o tamanho e função de discos normais e disfuncionais. Células derivadas de músculo e composições O presente invento proporciona MDC incluindo células progenitoras precoces (também aqui denominadas células progenitoras derivadas de músculo ou células estaminais derivadas de músculo (MDSC)) que apresentam taxas de sobrevivência prolongada após transplante para tecidos corporais, de preferência tecido moles. Para obter as MDC deste invento, obtém-se um explante de músculo, de preferência esquelético, a partir de um dador animal, de preferência de um mamífero, incluindo humanos. Este explante serve como um sincício estrutural e funcional incluindo "resíduos" de células do músculo precursor (T.A. Partridge et al., 1978, Nature 73: 306-8; B.H. Lipton et al., 1979, Science 205: 1292-4). As MDC utilizadas para transplante ou como terapias celulares de acordo com o presente invento podem ser obtidas quer de dadores autólogos, quer de dadores não autólogos (ou seja, alogénicos), incluindo células dadoras adultas, fetais, embrionárias ou placentárias humanas.

As células isoladas de tecido de músculo primário contêm uma mistura de células de fibroblastos, mioblastos, adipócitos, hematopoiéticas e células progenitoras derivadas de músculo. As células progenitoras de uma população derivada de músculo podem ser enriquecidas utilizando as características de aderência diferencial de células de músculo primárias em frascos de cultura de tecidos revestidos com colagénio, tal como descrito no pedido de patente U.S. série n.° 09/302 896 de Chancellor et al. As células que são lentas a aderir tendem a ser morfologicamente redondas, expressam níveis elevados de desmina e apresentam a capacidade de fundir e diferenciar para miotubos multinucleados (U.S. série n.° 09/302 896 de Chancellor et al.). Demonstrou-se que uma subpopulação destas células responde a proteína 2 morfogénica de osso recombinante (rhBMP-2) in vitro por expressão de níveis aumentados de fosfatase alcalina, 3',5'-cAMP dependente de hormona paratiróide e osteocalcina, indicativo da sua 18 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ capacidade de diferenciar para linhagem osteogénica e linhagens miogénicas (U.S. série n.° 09/302 896 de Chancellor et ai.; T. Katagiri et ai., 1994, j. Cell Biol. 127: 1755- 1766).

De acordo com o presente invento, isolaram-se populações de MDC de adesão rápida (PPl-4) e de MDC redondas de adesão lenta (PP6) e enriquecidas de transplantes de músculo esquelético e ensaiaram-se relativamente a expressão de diferentes marcadores utilizando imuno-histoquimica para determinar a presença de células pluripotentes entre as células de adesão lenta (exemplo 1; pedido de patente U.S. série n.° 09/302 896 de Chancellor et ai.). Tal como apresentado na tabela 3, no exemplo 9, as células PP6 expressam marcadores miogénicos, incluindo desmina, MyoD e miogenina. As células PP6 também expressaram c-met e MNF, dois genes que são expressos num estágio precoce de miogénese (J.B. Miller et ai., 1999, Curr. Top. Dev. Biol. 43: 191-219; consultar tabela 3). As PP6 apresentaram uma menor percentagem de células que expressam M-caderina, um marcador especifico de células satélite (A. Irintchev et ai., 1994, Development Dynamics 199: 326-337), mas uma percentagem mais elevada de células que expressam Bcl-2, um marcador limitado a células nos estágios precoces da miogénese (J.A. Dominov et ai., 1998, J. Cell Biol. 142: 537-544). As células PP6 também expressaram CD34, um marcador identificado com células progenitoras hematopoiéticas humanas, assim como com células precursoras do estroma na medula óssea (R.G. Andrews et ai., 1986, Blood 67: 842-845; C.I. Civin et ai., 1984, J. Immunol. 133: 157-165; L. Fina et ai., 1990, Blood 75: 2417-2426; P.J. Simmons et ai., 1991, Blood 78: 2848-2853; consultar tabela 3).

As células PP6 também expressaram Flk-1, um homólogo de ratinho do gene KDR humano que foi recentemente identificado como um marcador de células hematopoiéticas com caracteristicas do tipo de células estaminais (B.L. Ziegler et al., 1999, Science 285: 1553-1558; consultar tabela 3). De igual modo, as células PP6 expressaram Sca-1, um marcador presente em células hematopoiéticas com caracteristicas do tipo de células estaminais (M. van de Rijn et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86: 4634-8; M. Osawa et al., 1996, J. Immunol. 156: 3207-14; consultar tabela 3). Contudo, as 19 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ células ΡΡ6 não expressaram os marcadores de células hematopoiéticas estaminais, CD45 ou c-Kit (revisto em L.K. Ashman, 1999, Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31: 1037-51; G.A. Koretzky, 1993, FASEB J. 7: 420-426; consultar tabela 3).

Prefere-se no presente invento a população PP6 de células progenitoras derivadas de músculo apresentando as características aqui descritas. Estas células progenitoras derivadas de músculo expressam os marcadores celulares desmina, CD34 e Bcl-2. De acordo com o presente invento, isolam-se as células PP6 pelas técnicas aqui descritas (exemplo 1) para obter uma população de células progenitoras derivadas de músculo que apresentam sobrevivência prolongada após transplante. A população de células progenitoras derivadas de músculo PP6 inclui uma percentagem significativa de células que expressam marcadores de células progenitoras tais como desmina, CD34 e Bcl-2. Além disso, as células PP6 expressam os marcadores celulares Flk-1 e Sca-1 mas não expressam os marcadores CD45 ou c-Kit. De preferência, mais de 95% das células PP6 expressam os marcadores desmina, Sca-1 e Flk-1, mas não expressam os marcadores CD45 ou c-Kit. Prefere-se que as células PP6 sejam utilizados no prazo de cerca de 1 dia ou cerca de 24 horas após o último plaqueamento.

Como uma alternativa ao método de pré-plaqueamento, as MDC do presente invento podem ser isoladas por análise de citometria de fluxo (FACS) utilizando anticorpos marcados contra um ou mais marcadores de superfície celular expressos pelas MDC (C. Webster et al., 1988, Exp. Cell. Res. 174: 252-65; J.R. Blanton et al., 1999, Muscle Nerve 22: 43-50). Por exemplo, pode efectuar-se análise de FACS utilizando anticorpos marcados dirigidos contra CD34, Flk-1, Sca-1 e/ou os outros marcadores de superfície celular aqui descritos, para seleccionar uma população de células do tipo PP6 que apresentem sobrevivência prolongada quando introduzidas no tecido hospedeiro. Também se encontra abrangida pelo presente invento a utilização de um ou mais marcadores de detecção por fluorescência, por exemplo, fluoresceina ou rodamina, para detecção de anticorpos de diferentes proteínas marcadoras de células. 20 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ

Tratamentos baseados em células derivadas de músculo

Numa concretização do presente invento, isolam-se as MDC a partir de uma fonte de músculo-esquelético e introduzem-se ou transplantam-se para um local de interesse de tecido mole de músculo ou não de músculo, ou para estruturas de osso. Vantajosamente, as MDC do presente invento são isoladas e enriquecidas para conterem um número elevado de células proqenitoras apresentando sobrevivência prolonqada após transplante. Além disso, as células progenitoras derivadas de músculo deste invento expressam vários marcadores celulares caracteristicos, tais como desmina, CD34 e Bcl-2. Adicionalmente, as células progenitoras derivadas de músculo deste invento expressam os marcadores celulares Sca-1 e Flk-l, mas não expressam os marcadores celulares CD45 ou c-Kit (consultar exemplo 1).

Podem utilizar-se MDC e composições contendo MDC do presente invento para reparar, tratar ou melhorar várias condições estéticas ou funcionais (por exemplo, defeitos) através do aumento de tecidos moles de músculo ou não de músculo. Nomeadamente, podem utilizar-se tais composições como agentes de enchimento de tecido mole para o tratamento de: 1) condições cosméticas e estéticas da pele; 2) condições do lúmen; 3) sintomas ou condições de refluxo gastroesofágico; 4) incontinência fecal; 5) fraqueza, doença, lesão ou disfunção do músculo esquelético; 6) fraqueza, doença, lesão ou disfunção do músculo liso; e 7) sintomas ou condições congénitas, degenerativas ou traumáticas do disco vertebral, incluindo dores de costas e deficiência do disco. Além disso, tais MDC e suas composições podem ser utilizadas para aumentar tecido mole não associado com lesão por adição de volume a uma área, abertura, depressão ou espaço vazio em tecido mole na ausência de doença ou traumatismo, tal como para "amaciar" ou remover uma ruga. Encontram-se igualmente abrangidas pelo presente invento administrações múltiplas e sucessivas de MDC.

Para tratamentos baseados em MDC, obtém-se um explante de músculo-esquelético de preferência a partir de uma fonte humana ou animal autóloga ou heteróloga, ou seja, alogénica. Prefere-se uma fonte humana ou animal autóloga, apesar de células estaminais derivadas de músculo alogénico serem 21 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ altamente adequadas para utilização em muitos casos. Preparam-se e isolam-se então composições de MDC tal como aqui descrito. Para introduzir ou transplantar as MDC e/ou composições incluindo as MDC de acordo com o presente invento num recebedor humano ou animal, prepara-se uma suspensão de células de músculo mononucleadas. Tais suspensões contêm concentrações das células progenitoras derivadas de músculo do invento num transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável. Por exemplo, as suspensões de MDC para administração a um indivíduo podem incluir 108 a 109 células/ml numa solução estéril de um meio completo modificado para conter o soro do indivíduo, como alternativa a soro fetal bovino. Alternativamente, as suspensões de MDC podem estar contidas em soluções isentas de soro, estéreis, tais como soluções de crioconservação (Celox Laboratories, St. Paul, Minesota). As suspensões de MDC podem ser então introduzidas, por exemplo, através de injecção em um ou mais locais do tecido dador.

As células descritas podem ser administradas como uma preparação ou composição farmacêutica ou fisiologicamente aceitável contendo um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável e administradas aos tecidos do organismo recebedor de interesse, incluindo humanos e animais não humanos. A composição contendo MDC pode ser preparada por ressuspensão das células num líquido ou solução adequados tal como solução salina fisiológica estéril ou outros líquidos aquosos injectáveis fisiologicamente aceitáveis. As quantidades das componentes a utilizar em tais composições podem ser rotineiramente determinadas pelos peritos na arte.

As MDC ou suas composições podem ser administradas colocando as suspensões de MDC em material absorvente ou aderente, ou seja, uma matriz de esponja de colagénio e inserção do material contendo MDC no interior ou exterior do local de interesse. Alternativamente, as MDC podem ser administradas por vias de injecção parentérica, incluindo via subcutânea, intravenosa, intramuscular e intra-esternal.

Outros modos de administração incluem, entre outros, intranasal, intratecal, intracutânea, percutânea, entérica e sublingual. Numa concretização do presente invento, a 22 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ administração das MDC pode ser mediada por cirurgia endoscópica.

Para administração injectável, a composição encontra-se numa solução ou suspensão estéril ou pode ser ressuspensa em veículos aquosos ou oleaginosos farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis, que podem conter conservantes, estabilizantes e material para tornar a solução ou suspensão isotónica relativamente aos fluidos corporais (ou seja, sangue) do recebedor. Constituem exemplos não limitativos de excipientes adequados para utilização, entre outros, água, solução salina tamponada de fosfato, pH 7,4, solução aquosa de cloreto de sódio 0,15 M, dextrose, glicerol, etanol diluído e semelhantes e suas misturas. Constituem exemplos ilustrativos de estabilizadores polietilenoglicol, proteínas, sacáridos, aminoácidos, ácidos inorgânicos e ácidos orgânicos, que podem ser utilizados quer sozinhos quer como misturas. As quantidades assim como as vias de administração utilizadas são determinadas numa base individual e correspondem às quantidades utilizadas em tipos de aplicações ou indicações semelhantes conhecidas dos peritos na arte.

Para optimizar o sucesso do transplante, pretende-se uma correspondência imunológica o mais próxima possível entre doador e recebedor. Se não estiver disponível uma fonte autóloga, podem analisar-se os antigénios de histocompatibilidade de classe I e de classe II do doador e do recebedor para determinar a correspondência mais próxima disponível. Tal minimiza ou elimina a rejeição imunitária e reduz a necessidade para terapia imunossupressora ou imunomoduladora. Caso necessário, pode iniciar-se terapia imunossupressora ou imunomoduladora antes, durante e/ou após o procedimento de transplante. Por exemplo, podem administrar-se ciclosporina A ou outros fármacos imunossupressores ao recebedor do transplante. A tolerância imunológica pode também ser induzida antes do transplante por métodos alternativos conhecidos na arte (D.J. Watt et al., 1984, Clin. Exp.

Immunol. 55: 419; D. Faustman et al., 1991, Science 252: 1701).

Consistentemente com o presente invento, as MDC podem ser administradas a tecidos corporais, incluindo osso, tecido 23 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ epitelial (ou seja, pele, lúmen, etc.), tecido conjuntivo (ou seja, adiposo, de cartilagem, de ligamentos, linfa, etc.), tecido de músculo (ou seja, músculo esquelético/estriado ou liso) e vários tecidos de órgãos tais como os órgãos associados com o sistema digestivo (ou seja, boca, lingua, esófago, estômago, figado, pâncreas, vesícula biliar, intestino, ânus, etc.), sistema cardiovascular (ou seja, coração, veias, artérias, capilares, etc.), sistema respiratório (ou seja, pulmões, traqueia, etc.), sistema reprodutor (ou seja, vaso deferente, escroto, testículos, pénis, tubos de Falópio, vagina, clitóris, útero, mamas, ovários, vulva, etc.), sistema urológico (ou seja, bexiga, uretra, uréter, rins, etc.) e sistema nervoso (ou seja, cérebro, espinal medula, nervos, etc.). 0 número de células numa suspensão de MDC e o modo de administração pode variar dependendo do local e condição a ser tratada. Como exemplos não limitativos, de acordo com o presente invento, injectam-se cerca de 1-1,5 x 106 MDC para o tratamento de uma região de aproximadamente 8 mm de diâmetro de lesão criogénica em tecido de músculo liso de bexiga (consultar exemplo 6), enquanto que se administram cerca de 0,5-1,0 x 106 MDC através de uma matriz de esponja de colagénio para o tratamento de uma região de aproximadamente 5 mm de defeito do crânio (consultar exemplo 9).

Consistentemente com os exemplos aqui revelados, um perito na arte pode modular as quantidades e métodos de tratamentos baseados em MDC de acordo com os requisitos, limitações e/ou optimizações determinadas para cada caso.

Condições dermatológicas

As MDC e suas composições de acordo com o presente invento têm actividade marcante como materiais para aumento de tecido mole em procedimentos cosméticos, por exemplo, cirurgia plástica ou procedimentos anti-idade. Especificamente, tais MDC e composições contendo MDC podem ser utilizadas para tratar várias condições dermatológicas num indivíduo humano ou animal, incluindo, entre outras, feridas, rugas, rídulas, depressões cutâneas de origem não traumática, estrias, depressões de cicatrizes, cicatriz de acne vulgar e hipoplasia do lábio. Mais especificamente, as MDC e composições do 24 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ presente invento podem ser utilizadas para tratar rugas, ridulas ou depressões cutâneas da face e especialmente a região que rodeia os olhos. Para tratar condições dermatológicas, preparam-se as MDC tal como aqui revelado e seguidamente administram-se, por exemplo, por injecção na pele, subcutânea ou intradermicamente para preencher, avolumar ou reparar o defeito. 0 número de MDC introduzido é modulado para reparar depressões ou defeitos cutâneos profundos, assim como depressões ou defeitos superficiais da superfície, tal como necessário. Por exemplo, utilizam-se cerca de 1-1,5 x 106 MDC para o aumento de uma região da pele com aproximadamente 5 mm (consultar exemplo 3).

Condições do lúmen

Noutra concretização, as MDC e suas composições de acordo com o presente invento têm utilidade adicional como tratamentos para condições do lúmen num indivíduo animal ou mamífero, incluindo humanos. Especificamente, as células progenitoras derivadas de músculo são utilizadas para bloquear, aumentar, alargar, selar, reparar, encher ou preencher completa ou parcialmente vários lúmenes ou espaços vazios biológicos no interior do corpo. Lúmenes inclui, entre outros, vasos sanguíneos, intestino, estômago, esófago, uretra, vagina, tubos de Falópio, vaso deferente e traqueia. Os espaços vazios podem incluir, entre outros, várias lesões de tecido (ou seja, perda de músculo e volume de tecido mole devido a traumatismo; destruição de tecido mole devido a projécteis penetrantes tal como uma lesão de facada ou lesão de bala; a perda de tecido mole provocada por doença ou a morte de tecido devido a remoção cirúrgica do tecido incluindo perda de tecido da mama após uma mastectomia de cancro de mama ou perda de tecido de músculo após cirurgia para tratar sarcoma, etc.), lesões, fissuras, divertículo, quistos, fístulas, aneurismas e outras depressões ou aberturas indesejáveis ou não requeridas que possam existir no interior do corpo de um animal ou mamífero, incluindo humanos. Para o tratamento de condições do lúmen, preparam-se as MDC tal como aqui revelado e seguidamente administram-se, por exemplo por injecção ou entrega intravenosa ao tecido do lúmen para preencher ou reparar o espaço vazio. 0 número de MDC 25 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ introduzidas é modulado para reparar espaços vazios grandes ou pequenos num ambiente de tecido mole, tal como necessário.

Condições do esfíncter

As MDC e suas composições de acordo com o presente invento podem também ser utilizadas para o tratamento de uma lesão, fraqueza, doença ou disfunção do esfíncter num animal ou num mamífero, incluindo humanos. Nomeadamente, utilizam-se as MDC para aumentar tecidos dos esfíncteres esofágico, anal, cardíaco, pilórico e urinário. Mais especificamente, o presente invento proporciona tratamentos de aumento de tecido mole para sintomas de refluxo gastroesofágico e incontinência urinária e fecal. Para o tratamento de defeitos do esfíncter, preparam-se as MDC tal como aqui descrito e seguidamente administram-se ao tecido do esfíncter, por exemplo por injecção, para proporcionar volume, enchimento ou suporte adicionais. 0 número de MDC introduzidas é modulado para proporcionar quantidades variáveis de material de enchimento tal como requerido. Por exemplo, utilizam-se cerca de 1-1,5 x 106 MDC para proporcionar aumento a uma região de aproximadamente 5 mm da junção gastro-esofágica ou a uma região de aproximadamente 5-10 mm do esfíncter anal (consultar exemplo 4).

Aumento e contractilidade muscular

No presente invento, as MDC e suas composições podem ser utilizadas para o tratamento de condições do músculo num indivíduo humano ou animal. Nomeadamente, as MDC podem ser utilizadas para aumentar os músculos esquelético ou liso para tratar fraqueza ou disfunção causadas por lesão, doença, inactividade ou traumatismo induzido por anoxia ou cirurgia. Mais especificamente, o presente invento proporciona tratamentos para fraqueza ou disfunção de músculo-esquelético tal como lesões relacionadas com desporto. O presente invento também proporciona tratamentos para doença ou disfunção de músculo liso, tais como insuficiência cardíaca ou lesão associada com enfarte do miocárdio.

Para aumento de músculo ou tratamento de condições relacionadas com músculo, preparam-se as MDC como descrito 26 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ acima e administram-se, por exemplo por injecção, no tecido de músculo para proporcionar volume, enchimento ou suporte adicionais. Tal como pode ser avaliado pelo perito na arte, o número de MDC introduzidas é modulado para proporcionar quantidades variáveis de material de enchimento, tal como necessário ou requerido. Por exemplo, injectam-se cerca de 1-1,5 x 106 MDC para o aumento de uma região de aproximadamente cerca de 5 mm de tecido de coração (consultar exemplo 7).

Adicionalmente, as MDC e suas composições podem ser utilizadas para afectar a contractilidade do tecido de músculo liso, tal como tecido gastrointestinal, tecido esofágico e tecido de bexiga, como exemplos. De facto, observou-se que a contractilidade do músculo era restaurada em tecido de bexiga danificado criogenicamente após a introdução de células progenitoras derivadas de músculo, ou seja, MDC, tal como demonstrado no exemplo 6. Assim, o presente invento também abrange uma utilização de MDC do invento na restauro da contracção muscular e/ou melhoria ou resolução de problemas de contractilidade de músculo liso, tais como mobilidade gastrointestinal diminuida, incluindo os músculos lisos do esófago, estômago e intestino. Constitui um exemplo especifico, apesar de não limitativo, de uma condição que as MDC do invento podem melhorar, reduzir ou corrigir, a gastroparesia, ou seja, mobilidade e esvaziamento reduzidos do estômago. Células derivadas de músculo modificadas por engenharia genética

As MDC do presente invento podem ser modificadas por engenharia genética para conterem uma ou mais sequência(s) de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais biomoléculas activas e para expressarem essas biomoléculas, incluindo proteínas, polipéptidos, péptidos, hormonas, metabolitos, fármacos, enzimas e semelhantes. Tais MDC podem ser histocompatíveis (autólogas) ou não histocompatíveis (alogénicas) relativamente ao recebedor, incluindo humanos. Estas células podem servir como sistemas de entrega local prolongada para vários tratamentos, por exemplo, para o tratamento de doenças e patologias tais como cancro, rejeição de transplante e a regeneração de tecidos de músculo e de 27 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ nervo, diabetes, insuficiência hepática, insuficiência renal, defeitos neurais e doenças tais como doença de Parkinson e para entregar um produto génico a um local de aumento de tecido ou enchimento de espaço vazio, tal como um agente terapêutico, tal como aqui descrito. São preferidas no presente invento células progenitoras derivadas de músculo autólogas, que não serão reconhecidas como estranhas pelo recebedor. Neste contexto, as mdc utilizadas para transferência ou entrega génica mediada por célula serão desejavelmente avaliadas relativamente ao local major de histocompatibilidade (MHC ou HLA em humanos). Tais células compatibilizadas relativamente a MHC ou HLA podem ser autólogas. Alternativamente, as células podem ser de uma pessoa apresentando um perfil de antigénios de MHC ou HLA igual ou semelhante. 0 doente pode também ser tornado tolerante aos antigénios MHC alogénicos. O presente invento também abrange uma utilização de células isentas de antigénios de MHC de classe I e/ou li, tal como descrito em patente U.S. n.0 5 538 722.

As MDC podem ser modificadas por engenharia genética por várias técnicas e métodos moleculares conhecidos dos peritos na arte, por exemplo, transfecção, infecção ou transdução. Transdução tal como aqui utilizada refere-se de um modo geral a células que foram modificadas por engenharia genética para conter um gene externo ou heterólogo através da introdução de um vector virai ou não virai nas células. A transfecção refere-se mais habitualmente a células que foram modificadas por engenharia genética para conterem um gene estranho transportado por um plasmideo ou vector não virai. As MDC podem ser transfectadas ou transduzidas por diferentes vectores e assim servirem como veículos de entrega de genes para transferir os produtos expressos para o músculo.

Apesar de se preferirem vectores virais, os peritos na arte considerarão que a engenharia genética de células para conterem sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas ou polipéptidos, citoquinas e semelhantes pretendidas, pode ser efectuada por métodos conhecidos na arte, por exemplo, tal como descrito em patente U.S. n.° 5 538 722, incluindo fusão, transfecção, lipofecção mediada pela 28 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ utilização de lipossomas, electroporação, precipitação com DEAE-Dextrano ou fosfato de cálcio, bombardeamento de partículas (biolistica) com partículas revestidas com ácido nucleico (por exemplo, partículas de ouro), micro-injecção e semelhantes. São bem conhecidos na arte vectores para introdução de ácido nucleico (ADN ou ARN) heterólogo (ou seja, estranho) em células de músculo para a expressão de produtos bioactivos. Tais vectores apresentam uma sequência de promotor, de preferência um promotor que é específico da célula e colocado a montante da sequência a ser expressa. Os vectores podem também conter, opcionalmente, um ou mais genes marcadores expressáveis para expressão como uma indicação de transfecção bem sucedida e expressão das sequências de ácido nucleico contidas no vector.

Constituem exemplos ilustrativos de construções de veículos ou vector para transfecção ou infecção das células derivadas de músculo do presente invento, entre outros, vectores virais com replicação deficiente, vectores de vírus de ADN ou de vírus de ARN (retrovírus), tais como adenovírus, vírus da herpes simplex e vectores virais adeno-associados. Os vectores virais adeno-associados são em cadeia simples e permitem a entrega eficaz de cópias múltiplas de ácido nucleico ao núcleo de uma células. Preferem-se vectores de adenovírus. Os vectores serão normalmente substancialmente isentos de qualquer ADN procariótico e podem incluir várias sequências de ácido nucleico funcionais diferentes. Constituem exemplos de tais sequências funcionais, entre outras, polinucleótidos, por exemplo, ADN ou ARN, sequências incluindo sequências de regulação de iniciação e terminação de transcrição e tradução, incluindo promotores (por exemplo, promotores fortes, promotores indutíveis e semelhantes) e facilitadores que são activos em células de músculo.

Também se inclui como parte das sequências funcionais um quadro de leitura aberta (sequência de polinucleótidos) que codifica uma proteína de interesse; podem também incluir-se sequências flanqueadoras para integração dirigida ao local. Nalgumas situações, a sequência flanqueadora a 5' permitirá recombinação homóloga, alterando assim a natureza da região de 29 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ iniciação de transcrição de modo a proporcionar transcrição indutível ou não indutivel para aumentar ou diminuir o nivel de transcrição, por exemplo.

De um modo geral, a sequência de ácido nucleico que se pretende expressar pela célula progenitora derivada de músculo é a de um gene estrutural ou um fragmento, segmento ou parte funcional do gene, que é heterólogo à célula progenitora derivada de músculo e codifica um produto de proteina ou polipéptido pretendido, por exemplo. 0 produto codificado e expresso pode ser intracelular, ou seja, retido no citoplasma, núcleo ou um organelo de uma célula ou pode ser excretado pela célula. Para excreção, a sequência de sinalização natural presente no gene estrutural pode ser retida, ou pode utilizar-se uma sequência de sinalização que não se encontra naturalmente presente no gene estrutural. Quando o polipéptido ou péptido é um fragmento de uma proteina maior, pode proporcionar-se uma sequência de sinalização de modo que após excreção e processamento no local de processamento, a proteína pretendida apresentará a sequência natural. Constituem exemplos de genes de interesse para utilização de acordo com o presente invento, entre outros, genes que codificam factores de crescimento celular, factores de diferenciação celular, factores de sinalização celular e factores de morte celular programada. Constituem exemplos específicos, entre outros, genes que codificam BMP-2 (rhBMP-2), IL-1 Ra, Factor IX e conexina 43.

Tal como mencionado acima, pode estar presente um marcador para selecção de células contendo a construção de vector. 0 marcador pode ser um gene indutível ou não indutível e permitirá geralmente selecção positiva por indução ou sem indução, respectivamente. Constituem exemplos de genes marcadores utilizados habitualmente, entre outros, neomicina, di-hidrofolato-redutase, glutamina-sintetase e semelhantes. 0 vector utilizado incluirá também geralmente uma origem de replicação e outros genes que são necessários para replicação nas células do hospedeiro, tal como rotineiramente utilizado pelos peritos na arte. Como um exemplo, pode incluir-se como parte da construção o sistema de replicação incluindo a origem de replicação e quaisquer proteínas 30 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ associadas com replicação codificadas por um virus especifico. O sistema de replicação deve ser seleccionado de modo a que os genes que codificam os produtos necessários para replicação não transformem em última instância as células derivadas de músculo. Tais sistemas de replicação são representados por adenovirus com replicação deficiente construídos tal como descrito, por exemplo, por G. Acsadi et ai., 1994, Hum. Mol. Genet. 3: 579-584, e por vírus de Epstein-Barr. Constituem exemplos de vectores com replicação deficiente, nomeadamente, vectores retrovirais que apresentam replicação deficiente tal como BAG, descrito por Price et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84: 156; e Sanes et al., 1986, EMBO J., 5: 3133. Considerar-se-á que a construção génica final pode conter um ou mais genes de interesse, por exemplo, um gene que codifica uma molécula metabólica bioactiva. Além disso, podem utilizar-se ADNc, ADN produzido sinteticamente ou ADN cromossómico, utilizando métodos e protocolos conhecidos e levados à prática pelos peritos na arte.

Caso pretendido, podem utilizar-se vectores virais com replicação deficiente infecciosos para modificar por engenharia genética as células antes de injecção in vivo das células. Neste aspecto, os vectores podem ser introduzidos em células produtoras de retrovírus para empacotamento anfotrópico. A expansão natural de células progenitoras derivadas de músculo para regiões adjacentes evita um grande número de injecções no local ou locais de interesse. O presente invento também proporciona entrega ex vivo de genes a células e tecidos de um recebedor mamífero hospedeiro, incluindo humanos, através de uma utilização de MDC, por exemplo, células progenitoras de músculo precoces, que foram transduzidas por vírus utilizando um vector adenoviral concebido racionalmente para conter um gene heterólogo que codifica um produto génico pretendido. Tal abordagem ex vivo proporciona a vantagem de transferência génica virai eficaz, que é superior às abordagens de transferência génica directa. O procedimento ex vivo envolve a utilização das células progenitoras derivadas de músculo de células isoladas de tecido de músculo. A biopsia de músculo que servirá como fonte de células progenitoras derivadas de músculo pode ser obtida 31 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ de um local de lesão ou de outra área que pode ser mais facilmente obtenível pelo cirurgião clínico.

Considerar-se-á que de acordo com o presente invento, podem derivar-se isolados de clones da população de células progenitoras derivadas de músculo (ou seja, células PP6) utilizando vários procedimentos conhecidos na arte, por exemplo, plaqueamento por diluição limitativa em meio de cultura de tecidos. Os isolados de clones incluem células geneticamente idênticas originárias de uma célula única e solitária. Adicionalmente, podem derivar-se isolados de clones utilizando análise de FACS tal como descrito acima, seguido de diluição limitativa para atingir uma única célula por poço para estabelecer uma linha celular de clone isolado. Um exemplo de um isolado de clone derivado da população de células PP6 é mcl3, que se descreve no exemplo 9. De preferência, utilizam-se isolados de clones de MDC nos presentes métodos, assim como para engenharia genética para a expressão de uma ou mais moléculas bioactivas ou em terapias de substituição génica.

As MDC são primeiramente infectadas com vectores virais concebidos racionalmente contendo pelo menos um gene heterólogo que codifica um produto génico pretendido, suspensas num transportador ou excipiente fisiologicamente aceitável, tal como solução salina ou solução salina tamponada de fosfato e seguidamente administradas num local apropriado no hospedeiro. Em concordância com o presente invento, as MDC podem ser administradas a tecidos corporais, incluindo osso, tecido epitelial, tecido conjuntivo, tecido de músculo e vários tecidos de órgãos tais como os órgãos que estão associados com o sistema digestivo, sistema cardiovascular, sistema respiratório, sistema reprodutor, sistema urológico e sistema nervoso, tal como descrito acima. 0 produto génico pretendido é expresso pelas células injectadas que assim introduzem o produto génico no hospedeiro. Os produtos génicos introduzidos e expressos podem ser então utilizados para tratar, reparar ou melhorar a lesão, disfunção ou doença, devido a serem expressos ao longo de períodos de tempo prolongados pelas MDC do invento, apresentando sobrevivência prolongada no hospedeiro. 32 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ

Em estudos de modelo animal de terapia génica mediada por mioblastos, foi necessário implantar 106 mioblastos por 100 mg de músculo para correcção parcial de defeitos enzimáticos do músculo (consultar, J.E. Morgan et al., 1988, J. Neural. Sei. 86: 137; T.A. Partridge et al.r 1989, Nature 337: 176).

Extrapolando a partir destes dados, podem implantar-se aproximadamente 1012 MDC suspensas num meio compatível fisiologicamente em tecido de músculo para terapia génica para um humano de 70 kg. Este número de MDC do invento pode ser produzido a partir de uma única biopsia de 100 mg de músculo-esquelético de uma fonte humana (consultar adiante). Para o tratamento de um local de lesão específico, uma injecção de MDC modificadas por engenharia genética num dado tecido ou local de lesão inclui uma quantidade terapeuticamente eficaz de células em solução ou suspensão, de preferência, cerca 105 a 106 células por cm3 de tecido a ser tratado num meio aceitável fisiologicamente. Células estaminais derivadas de músculo alogénicas proporcionam transplante celular eficaz

Obteve-se transplante celular eficaz por injecção de MDSC das pré-placas tardias, por exemplo, PP5-6, tal como descrito, num hospedeiro não autólogo (alogénico). Por exemplo, observou-se um elevado número de células incluindo enxertos alogénicos nos músculos do hospedeiro aos 30 dias pós-injecção (por exemplo, observaram-se > 2000 miofibras distrofina+ nos músculos do hospedeiro após injecção de 3 x 105 células estaminais derivadas de músculo de origem distinta do hospedeiro). (Exemplo 10) . Este resultado indica que as MDSC injectadas não só evitam o espalhamento geralmente fraco e a sobrevivência fraca que se segue à injecção, mas também que as células injectadas evitaram imunorrejeição pelos músculos do hospedeiro que é muitas vezes observada em transplante de células entre MDSC dadoras para transplante diferentes apresentando origem distinta do hospedeiro, por exemplo, tal como diferentes estirpes de ratinhos. Os resultados demonstraram que as células estaminais derivadas de músculo não autólogas melhoraram significativamente a eficácia da terapia celular em músculos doentes do hospedeiro. Além disso, pode considerar-se que as MDSC são imunoprivilegiadas. Células MDSC alogénicas de pré-placas tardias (por exemplo, PP5 ou 6) 33 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ sobrevivem durante um período de tempo mais de 10 vezes mais longo do que células não estaminais de pré-placas precoces, por exemplo, PPl-2 ou PPl-4, quando injectadas ou transplantadas para um animal hospedeiro de uma estirpe diferente. A tabela 1 apresenta os resultados descritos no exemplo 10 e figuras 17A-17F que comparam a utilização de células MDSC [EP] e MDSC [LP] normais transplantadas para ratinhos mdx hospedeiros. Os dados da tabela 1 representam o número de miofibras positivas para distrofina (distrofina+) verificadas em músculo mdx injectado com células estaminais MDSC [EP] ou MDSC [LP] . TABELA 1 MDSC [EP] MDSC [LP] M DP M DP Dia 10 430,7 147, 9 2798,0 1141,6 Dia 30 134,0 41, 6 2000,1 657,6 3-6 músculos por grupo; M = média; DP = desvio padrão A natureza imunoprivilegiada das MDSC de células de pré-placas tardias é apoiada por resultados imuno-histoquímicos (coloração para desmina) que mostram que quando se injectam MDSC perifericamente, estas podem migrar e migram de facto para o timo. Seguidamente as MDSC injectadas podem diferenciar para linfócitos T e induzir tolerância quimérica. (por exemplo, figura 19 - coloração do timo positiva para desmina após injecção periférica de MDSC).

Além disso, comparativamente com MDSC [EP], algumas MDSC [LP] podem diferenciar não apenas para células de músculo maduras ou de linhagem diferente após injecção num animal hospedeiro, mas também para células satélite quando injectadas em músculo hospedeiro. Em tais casos, uma população de células MDSC [LP] localiza-se no músculo assim como na lâmina basal de miofibras que é o local de células satélite. Células derivadas de MDSC [LP] e localizadas na lâmina basal de miofibras tornam-se positivas para M-caderina ao longo do tempo. Células satélite recém-criadas nestes locais pode formar novas miofibras, por exemplo, se as miofibras do hospedeiro morrem. Sem limitações teóricas, as MDSC [LP] que migram para a lâmina 34 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ basal de miofibras podem responder a sinais ou factores neste local e perto dele que causam o seu desenvolvimento para células satélite. Assim, a injecção de MDSC [LP] faculta um meio para proporcionar uma população sustentada futura de células precursoras de músculo que formam células satélite em locais de músculo do hospedeiro nos quais existem e se desenvolvem células satélite. 0 invento também proporciona a capacidade para utilizar MDSC fetais ou embrionárias humanas em metodologias e tratamentos de transplante, sob orientações adequadas e condições e regulamentações aprovadas, com nenhuns ou poucos problemas de rejeição devido a incompatibilidades doador-hospedeiro. Por exemplo, verificou-se que MDSC humanas de músculo de membro fetal são imunotolerantes e apresentam niveis elevados de sobrevivência, uma vez que foram capazes de persistir em ratinhos SCID durante > 2 semanas (figuras 18A e 18B) pós-injecção. Assim, de acordo com o invento e sob orientações, regulamentações e condições adequadas, pode utilizar-se por exemplo, MDSC fetais humanas de banco e injectadas em quaisquer tecidos ou órgãos de doentes para tratamentos que estão disponíveis para injecção ou transplante de MDSC tal como aqui descrito.

EXEMPLO 1: Enriquecimento, isolamento e análise de MDC

Enriquecimento e isolamento de MDC

Preparam-se MDC tal como descrito (pedido de patente U.S. série n.° 09/302 896 de Chancellor et al.). Obtiveram-se explantes de músculo das patas traseiras de diferentes fontes, nomeadamente de ratinhos mdx de 3 semanas de idade (distróficos) (C57BL/10ScSn mdx/mdx, Jackson Laboratories), ratos fêmea SD de 4-6 semanas de idade (Sprague Dawley) ou ratinhos SCID (imunodeficiência grave combinada). Dissectou-se o tecido de músculo de cada uma das fontes animais para remover quaisquer ossos e moeu-se numa pasta. Digeriu-se então a pasta durante 1 hora de incubações em série com colagenase tipo XI a 0,2%, dispase (grau II, 240 unidades) e tripsina a 0,1% a 37°C. A suspensão celular resultante foi passada através de agulhas de calibre 18, 20 e 22 e centrifugada a 3000 rpm durante 5 minutos. Subsequentemente, suspenderam-se as células em meio de cultura (DMEM suplementado com soro 35 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ fetal bovino a 10%, soro de cavalo a 10%, extracto de embrião de galinha a 0,5% e penicilina/estreptomicina a 2%). Pré-plaquearam-se então as células em frascos revestidos de colagénio (pedido de patente U.S. série n.° 09/302 896 de Chancellor et al.). Após aproximadamente 1 hora, removeu-se o sobrenadante do frasco e tornou-se a plaquear num frasco revestido de colagénio fresco. As células que aderiram rapidamente nesta 1 hora de incubação foram maioritariamente fibroblastos (Z. Qu et ai., supra; pedido de patente U.S. série n.° 09/302 896 de Chancellor et al.). Removeu-se o sobrenadante e tornou-se a plaquear após 30-40% das células terem aderido a cada frasco. Após aproximadamente 5-6 plaqueamentos em série, enriqueceu-se a cultura com células pequenas e redondas designadas como células PP6, que foram isoladas da população celular inicial e utilizadas em estudos posteriores. As células aderentes isoladas no plaqueamento precoce foram juntas e designadas como células PPl-4.

Examinaram-se as populações de células mdx PPl-4, mdx PP6, PP6 normal e de fibroblastos por análise imuno-histoquimica para expressão de marcadores celulares. Apresentam-se os resultados desta análise na tabela 2.

Tabela 2 células mdx PPl-4 células Mdx PP 6 células nor PP 6 fibroblastos desmina + /- + + - CD34 - + + - Bcl-2 (-) + + - Flk-1 na + + - Sca-1 na + + - M-caderina -/ + -/ + -/ + - MyoD -/ + + /- + /- - miogenina -/ + + /- + /- -

Tabela 2: Marcadores celulares expressos em populações de células PPl-4 e PP6. As células mdx PPl-4, mdx ΡΡβ, PP6 normal e de fibroblastos foram derivadas pela técnica de pré-plaqueamento e examinadas por análise imuno-histoquímica. indica que menos de 2% das células apresentaram expressão; "-/+" indica que 5-50% das células apresentaram expressão; " + /-" indica que ~ 4 0 — 8 0 % das células apresentaram expressão; "+" indica que >95% das células apresentaram expressão; "nor" indica células normais; "na" indica que os dados imuno-histoquímicos não estão disponíveis 36 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ

Note-se que tanto os ratinhos mdx como normais apresentaram distribuição idêntica de todos os marcadores celulares ensaiados neste ensaio. Assim, a presença da mutação mdx não afecta a expressão de marcadores celulares da população derivada de células de músculo PP6 isolada.

Cresceram-se MDC em meio de proliferação contendo DMEM (meio de Eagle modificado da Dulbecco) com fbs (soro fetal de bovino) 10%, HS (soro de cavalo) a 10%, extracto de embrião de galinha a 0,5% e penicilina/estreptomicina a 1% ou meio de fusão contendo DMEM suplementado com soro fetal de bovino a 2% e solução de antibiótico a 1%. Todos os meios foram adquiridos a Gibco Laboratories (Grand Island, Nova Iorque). EXEMPLO 2: Vectores de MDC e transfecção

Vectores de retrovirus e adenovirus

Utilizou-se o vector retroviral MFG-NB (N. Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 8377-81) para as experiências de MDC. Este vector contém um gene LacZ modificado (NLS-LacZ) que inclui uma sequência de localização nuclear clonada a partir do antigénio T grande do virus simio (SV40) transcrito a partir da sequência longa terminal repetitiva (LTR). Cresceu-se a solução-mãe de retrovirus e preparou-se tal como previamente descrito (J.C. van Deutekom et al., 1998, Neuromuscul. Disord. 8: 135-48). Titulou-se o retrovirus a 1 x 107 a 1 x 109 cfu/ml.

Utilizou-se igualmente um vector de adenovirus. Este vector continha o gene LacZ sob o controlo do promotor de citomegalovirus humano (HuCMV) (J. Huard et al., 1994, Hum Gene Ther 5: 949-58) . Obteve-se o adenovirus recombinante deletado E1-E3 através de Dr. I. Kovesdi (Gene Vec Inc., Rockville, Maryland).

Transdução virai de MDC

Para transdução virai, plaquearam-se MDC a uma densidade de 1-1,5 x 106 em frascos T 75. Lavaram-se MDC PP6 em HBSS (solução salina equilibrada de Hank) e incubaram-se com 37 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ suspensões de retrovírus (1 x 107 - 1 x 109 cfu/ml) ou de adenovírus (1 x 109 cfu/ml) em 5 ml de DMEM contendo 8 pg/ml de Polybrene (Abbott Laboratories, Chicago, Ilinois) durante 4 h a 37°C. Cresceram-se mdc transduzidas com vírus em 10 ml de meio de proliferação durante 24 h a 37°C. Lavaram-se então as MDC com HBSS e digeriram-se enzimaticamente com tripsina a 0,25% durante 1 minuto. As MDC tratadas e transduzidas por vírus foram centrifugadas durante 5 minutos a 3 500 rpm e ressuspendeu-se o sedimento em 20 μΐ de HBSS. EXEMPLO 3: Aumento de tecido mole da pele

Injecção de MDC e colagénio

Prepararam-se ratos SD para cirurgia por anestesia com halotano utilizando métodos padrão e lavando o local da cirurgia com solução de Betadine®. Injectou-se a pele do abdómen inferior com 10 microlitros (μΐ) de uma suspensão de MDC em HBSS (aproximadamente 1-1,5 χ 106 células), 10 μΐ de colagénio bovino disponível comercialmente (Contigen™; C.R. Bard, Covington, Geórgia) ou 10 μΐ de solução salina estéril utilizando uma micro-seringa Hamilton. Aos 5 dias, 2 semanas e 4 semanas pós-injecção, excisou-se a área circundante de cada local de injecção, preparou-se para análise histoquímica, examinou-se microscopicamente e fotografou-se. A análise histoquímica incluiu coloração com hematoxilina, eosina ou tricrómica.

Os resultados demonstram que as MDC eram viáveis durante até cerca de pelo menos 4 semanas pós-injecção no tecido da pele, sem qualquer evidência de inflamação do tecido no local de injecção (figuras 1D-1F). Contrariamente, o colagénio não era visível às 2 semanas pós-injecção em tecido de pele (figuras 1B e 1C). Assim, podem utilizar-se composições de MDC como materiais de aumento de pele para utilização, por exemplo, em aplicações ou cirurgias cosméticas e estéticas. Tal é uma revelação inesperada dado que se pensava anteriormente que células de músculo transplantadas necessitavam estar rodeadas por fibras de músculo do hospedeiro às quais se ligar de modo a sobreviverem. A sobrevivência das MDC do presente invento após injecção em tecido não muscular é demonstrada adicionalmente nos exemplos 8 e 9. 38 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ EXEMPLO 4: Aumento de tecido mole da junção gastroesofàgica e do esfíncter anal

Prepararam-se ratos SD para cirurgia tal como descrito acima. Efectuou-se uma incisão no abdómen médio para expor a junção gastroesofàgica e o esfíncter anal. Injectou-se o tecido mole com 10 μΐ de uma suspensão de células progenitoras derivadas de músculo em HBSS (1-1,5 x 106 células) utilizando uma micro-seringa Hamilton. Ao dia 3 pós-injecção, excisou-se a área circundante de cada local de injecção, preparou-se para análise histoquímica, corou-se para β-galactosidase para determinar a localização e viabilidade das células apresentando o marcador LacZ, examinou-se microscopicamente e fotografou-se. Os resultados destas experiências demonstram que composições de MDC podem ser utilizadas como materiais de enchimento esofágico e de esfíncter anal (figuras 2A e 2B) para o tratamento de sintomas ou condições de refluxo gastroesofágico ou incontinência fecal. EXEMPLO 5: Aumento de tecido mole da junção vesico-ureteral

Prepararam-se ratos SD para cirurgia tal como descrito acima. Efectuou-se uma incisão no abdómen médio para expor a junção ureteral-bexiga (vesico-ureteral). Injectou-se o tecido com 10 μΐ de uma suspensão de MDC em HBSS (1- 1,5 x 106 células) utilizando uma micro-seringa Hamilton. Ao dia 3 pós-injecção, excisou-se a área circundante de cada local de injecção, preparou-se para análise histoquímica, corou-se para β-galactosidase para determinar a localização e viabilidade das células apresentando o marcador LacZ, examinou-se microscopicamente e fotografou-se. Estes resultados demonstram que composições baseadas em MDC podem ser utilizadas como materiais de aumento ureteral-bexiga (figuras 3A e 3B) para o tratamento de sintomas ou condições de refluxo vesico-ureteral. EXEMPLO 6: Tratamento com MDC de tecido de bexiga crio-danificado

Danos criogénicos e transplante de MDC

Prepararam-se ratos SD para cirurgia tal como descrito acima. Efectuou-se uma incisão na linha média inferior para 39 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ expor a bexiga e uretra. Encheu-se então a bexiga com 1 ml de solução salina. Efectuaram-se danos criogénicos com uma vareta de aluminio de 8 mm de diâmetro arrefecida em gelo seco. A sonda gelada foi colocada contra um lado da parede da bexiga durante 15 ou 30 segundos (referido como uma lesão "suave" ou "grave", respectivamente) . Imediatamente após danos criogénicos, injectou-se um grupo com danos graves com células derivadas de músculo do invento (1-1,5 x 106 de células em 15 μΐ de HBSS), enquanto que se injectou um grupo de danos graves de controlo com HBSS (15 μΐ) (n = 3 por grupo) . Uma semana após danos criogénicos, injectaram-se os outros grupos de danos suaves e graves com uma suspensão de MDC em 50 μΐ de HBSS (2-3 x 106 células), enquanto que se injectaram grupos de controlo de danos suaves e graves com 50 μΐ de HBSS (n = 4 por grupo). Para cada grupo, administraram-se injecções no centro da região danificada utilizando uma agulha de calibre 30 e uma micro-seringa Hamilton.

Coloração imuno-histoquímica para actina de músculo liso (actina g-SM)

Para preparar amostras para análise imuno-histoquímica, fixaram-se amostras de tecidos ou células em acetona fria a -20°C durante 2 minutos e bloquearam-se com HS a 5% durante 1 hora. Incubaram-se as amostras durante a noite à temperatura ambiente numa câmara húmida com anticorpos primários monoclonais de ratinho anti-actina de músculo liso (n.° de catálogo F-3777; Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) (diluição 1:400 em PBS pH 7,4). Lavaram-se então as amostras 3 vezes com PBS e incubaram-se com anticorpos secundários anti-IgG de ratinho conjugados com o fluorocromo Cy3 (Sigma Chemical Co.) (diluição 1:200 em PBS pH 7,4).

Coloração imuno-histoquimica para cadeia pesada de miosina rápida (MyHC rápida)

Fixaram-se amostras de tecido ou células em acetona fria a 20°C durante 2 minutos e bloquearam-se com HS a 5%. Incubaram-se então as amostras durante a noite à temperatura ambiente numa câmara húmida com anticorpos primários monoclonais de ratinho anti-miosina (rápida) esquelética (n.° de catálogo M-4276; Sigma Chemical Co.) (diluição 1:400 em PBS 40 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ ρΗ 7,4) . Lavaram-se então as amostras 3 vezes com PBS e incubaram-se com anticorpos secundários anti-lgG de ratinho conjugados com Cy3 (Sigma Chemical Co.) (diluição 1:200 em PBS pH 7,4).

Cultura de células

Plaquearam-se células progenitoras derivadas de músculo tal como preparadas no exemplo 1 em placas de 35 mm revestidas com colagénio em meio de proliferação. Após 24 horas, substituiu-se o meio de proliferação por meio de fusão. Mantiveram-se as células em meio de fusão com mudanças médias diárias até diferenciação das MDC para miotubos.

Estudos de contractilidade

Duas semanas após a injecção de MDC, sacrificaram-se os animais e utilizaram-se para preparar tiras de bexiga. Preparam-se duas tiras a partir de cada bexiga e cortaram-se ambas as tiras de modo a abranger toda a circunferência da bexiga. Montaram-se as tiras de bexiga num banho de tecido e submeteram-se a contracções neuronais (20 Hz, 10 e 80 choques), que foram registadas e analisadas como descrito adiante.

Recolha de tecido e histologia

Sacrificaram-se ratos SD e removeram-se amostras do tecido circundante ao local de injecção. Congelaram-se instantaneamente as amostras utilizando 2-metilbutano pré-arrefecido em azoto liquido. A análise histoquimica das amostras incluiu coloração com hematoxilina e eosina. Coraram-se as amostras, examinaram-se microscopicamente e fotografaram-se. Cada secção criostática media 10 pm de espessura.

Electroestimulação de tecido de músculo liso de bexiga

Sacrificaram-se os animais e removeram-se rapidamente as bexigas. De cada bexiga obtiveram-se duas tiras abrangendo a circunferência da parede da bexiga. Montaram-se as tiras em 5 ml de banhos de órgãos contendo solução de Kreb (NaCl 41 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ 113 mmol/1, KC1 4,7 mmol/1, CaCl2 1,25 mmol/1, MgS04 I, 2 mmol/1, NaHC03 25 mmol/1, KH2PO4 1,2 mmol/1 e glucose II, 5 mmol/1) arejado com O2 a 95% e CO2 a 5%. Estabeleceu-se a tensão inicial a 10 mN e mediram-se contracções isométricas com transdutores extensimetros acoplados a um amplificador de extensimetro TBM4 (World Precision Instruments). Compilaram-se medidas de contracção utilizando um programa de aquisição de dados (Windaq, DATAQ Instruments, Inc., Akron, Ohio). A taxa de amostragem por canal foi estabelecida a 100 Hz. Computou-se a amplitude das contracções utilizando um programa de cálculo (WindaqEx, DATAQ Instruments, Inc.). Após um período de equilíbrio de 20 minutos, aplicaram-se estímulos de campo eléctrico através de dois eléctrodos de fio de platina separados por 4 cm no topo e na base do banho de órgãos.

Manteve-se a temperatura a 37°C ao longo da experiência.

Estímulo químico do tecido de músculo liso da bexiga

Estimularam-se as tiras de bexiga com impulsos de onda quadrada com 0,25 ms de duração com voltagem máxima (100 V) e construiu-se uma curva de resposta de frequência utilizando 10 ou 80 choques a 1, 2, 5, 10, 20 ou 40 Hz. Após estimulação eléctrica, adicionou-se carbacol 5, 10 ou 20 μΜ a tiras de bexiga para induzir contracções. Em experiências paralelas adicionou-se atropina 1 μΜ, aplicou-se estimulação eléctrica como acima e adicionou-se metileno ATP 50 μΜ para induzir contracções.

Coloração para inervação

Utilizou-se coloração para acetilcolina (Ach) para avaliar a reinervação de MDC em músculo liso. Ach é uma coloração para junção neuromuscular que indica a presença de terminações nervosas. Após injecção de MDC, excisou-se tecido aos dias 3, 15, 30 ou após 6 meses, corou-se para Ach, observou-se por microscopia e fotografou-se.

Análise estatística

Os valores são apresentados média ± desvios padrão. Considerou-se que um valor de "P" menor que 0,05 era 42 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ estatisticamente significativo. Utilizou-se o teste de Student.

Diferenciação de MDC

Avaliaram-se células progenitoras derivadas de músculo tal como preparadas no exemplo 1 relativamente a diferenciação celular. A actina alfa-SM é o marcador conhecido há mais tempo para fenótipo de célula de músculo liso (K.M. McHugh, 1995, Dev. Dyn. 204: 278-90) e o principal marcador do fenótipo miofibroblástico (I. Darby et al., 1990, Lab. Invest. 63: 21-9). Durante diferenciação de células musculares a expressão de actina α-SM diminui enquanto que a expressão de MyHC rápida aumenta. A análise histoquimica de tecidos de bexiga tratados com MDC utilizando marcadores de actina α-SM e MyHC rápida demonstra a diferenciação de MDC pós-injecção no local da lesão criogénica. No dia 5 pós-injecção em tecido de bexiga com lesão criogénica, várias MDC (pelo menos 20%) apresentaram coloração para actina α-SM (figura 5B), indicativa que as células ainda estavam indiferenciadas. Após 6 meses pós-injecção, contudo, virtualmente todas as MDC diferenciaram para miotubos ou miofibras tal como demonstrado por uma diminuição de coloração para actina α-SM (figura 5F) com um aumento concomitante de coloração para MyHC rápida (figura 51) .

Reinervação dos músculos

Devido à presença de acetilcolina (Ach) na junção neuromuscular, esta pode servir como um indicador da inervação do músculo. A análise histoquimica de tecidos de bexiga tratados com MDC utilizando o marcador Ach demonstra a reinervação das MDC pós-injecção em locais de lesão criogénica. No dia 3 pós-injecção em tecido de bexiga com lesão criogénica, as MDC injectadas mostram inervação minima tal como indicado pelos níveis relativamente baixos de coloração para Ach (figura 6A). No dia 15 pós-injecção, observam-se níveis aumentados de inervação tal como indicado pelos níveis aumentados de coloração para Ach (figura 6B). No dia 30 pós-injecção, observa-se ainda mais coloração para Ach (figura 6C), indicativa de aumento adicional da inervação. Aos 6 meses pós-injecção, observa-se inervação extensiva tal como 43 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ indicado por coloração para Ach substancial ao longo da área injectada com MDC observada a baixa ampliação (figura 6D) . Estes resultados indicam que o nervo pélvico se encontra em crescimento na área injectada com MDC da bexiga e sugere que as MDC podem melhorar a contractilidade e função do tecido injectado.

Estudos de fisiologia de contractilidade

Para determinar se as MDC injectadas melhoram a função dos tecidos de bexiga tratados, efectuaram-se vários estudos de contractilidade (consultar acima). A tabela 3 apresenta os dados que apresentam os parâmetros de contractilidade do músculo de bexiga após lesão criogénica com ou sem injecções de MDC.

Tabela 3 N.2 do grupo Amplitude da contracção (mN/mg) Velocidade (contracção)(mN/s) N.2 de espécimes 20Hz/ 10 choques 20Hz/ 80 choques 20Hz/ 10 choques 20Hz/ 80 choques 1 Simul. 0,375±0,24 0,697±0,46 18,08+8,15 15,56+8,39 6 MDC 0,368±0,26 0,812±0,31 16,23110,3 16,3817,54 6 2 Simul. 0,427±0,17 0,966±0,31 22,9618,93 24,56+5,03 8 MDC 0,539±0,24 1,161±0,55 27,86114,08 30,59+13,05 8 3 Simul. 0,389±0,14* 0,708+026” 25,7015,87 24,2416,38 8 MDC 0,564±0,16* 1, 13910, 29** 30,59117,8 29,31+15,3 8 4 Normal 0,927±0,23 1,74810,52 34,2318,82 29,05+7,08 6 * p<0,05, ** p<0,01

Tabela 3: Parâmetros de contractilidade de músculo da bexiga após lesão criogénica. Os valores são médias ± desvios padrão. Para análise estatística efectuou-se o teste de Student para grupos de controlo e de injecção de MDC. Grupo n.° 1: grupo de lesões graves com injecções de MDC imediatamente após lesão criogénica. Grupo n.° 2: grupo de lesões ligeiras com injecções de MDC uma semana após lesão criogénica. Grupo n.° 3: grupo de lesões graves com injecções de MDC uma semana após lesão criogénica. Grupo n.° 4: tecido de bexiga normal. 0 grupo de lesões graves com injecções de MDC imediatamente após lesão criogénica (grupo 1) apresentou contractilidade semelhante ao grupo de controlo (simulado) (comparar niveis de contractilidade apresentados nas colunas de simulado e de MDC no grupo 1, tabela 3) . Contudo, o grupo de lesões graves com injecções de MDC uma semana após lesão 44 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ criogénica (grupo 3) apresentou amplitude de contracção aumentada (145% e 161% da bexiga de controlo a 20 Hz/10 choques e 20 Hz/80 choques, respectivamente) comparativamente com o grupo de controlo (comparar níveis de amplitude de contracção nas coluna de simulado e de MDC indicados com asteriscos na tabela 3). De igual modo, o grupo de lesões graves com injecções de MDC uma semana após lesão criogénica (grupo 3) apresentou velocidade de contracção aumentada (119% e 121% daquela da faixa de controlo a 20 Hz/10 choques e 20 Hz/80 choques, respectivamente) comparativamente com grupos de controlo (comparar valores de velocidade de contracção nas colunas de simulado MDC no grupo 3, tabela 3). O grupo de lesões ligeiras com injecções de MDC uma semana após lesão criogénica (grupo 2) também apresentou amplitude de contracção e velocidade aumentada comparativamente com o grupo de controlo (comparar níveis de contractilidade apresentados nas coluna de simulado grupo 2, tabela 3). Os resultados destes estudos mostram que injecções de MDC podem restaurar contractilidade de tecido de músculo de bexiga com lesão criogénica e indicam que composições baseadas em MDC podem ser utilizadas para o tratamento de incontinência urinária. EXEMPLO 7: Aumento de tecido mole do miocárdio

Prepararam-se ratos SD para cirurgia como descrito acima. Efectuou-se uma incisão torácica para expor o coração. Injectou-se a parede ventricular com 10 μΐ de suspensão de MDC em HBSS (1-1,5 x 106 células) utilizando uma micro-seringa Hamilton. No dia 3, excisou-se a área circundante de cada local de injecção, preparou-se para análise histoquímica, corou-se para β-galactosidase para determinar a localização e viabilidade das células que apresentam o marcador LacZ, analisou-se microscopicamente e fotografou-se. Os resultados destas experiências demonstram que composições de MDC podem ser utilizadas como materiais para aumento de tecido mole do miocárdio (figuras 7A e 7B) para o tratamento de lesão ou fraqueza em consequência de insuficiência cardíaca ou enfarte do miocárdio. 45 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ exemplo 8: Injecção de mdc em tecidos do fígado, baço e espinal-medula

Prepararam-se ratos SD para cirurgia como descrito acima. Efectuou-se uma incisão na linha média do abdómen para expor o figado e o baço. Injectaram-se ambos os locais com 10 μΐ de suspensão de MDC em HBSS (1-1,5 x 106 células) utilizando uma micro-seringa Hamilton. Ao mesmo tempo, efectuou-se uma incisão na linha média das costas e uma laminectomia parcial para expor a espinal-medula. Injectaram-se então tecidos da espinal-medula ao nível TIO com a suspensão de MDC em HBSS tal como efectuado para os tecidos de fígado e baço. No dia 4, excisou-se a área que rodeia cada local de injecção, preparou-se para análise histoquímica, corou-se para β-galactosidase para determinar a localização e viabilidade das células que apresentam o marcador LacZ, analisou-se microscopicamente e fotografou-se. Estas experiências mostram que podem utilizar-se composições de MDC como materiais para aumento de tecido mole de fígado, baço e espinal-medula (figuras 8A-8B, 9A-9B e 10A-10B) para tratar várias lesões, doenças ou disfunções de fígado, baço e espinal-medula. EXEMPLO 9: Tratamento com MDC de defeitos do osso

Isolamento de células derivadas de músculo

Obtiveram-se MDC de ratinhos mdx tal como descrito no exemplo 1.

Isolamento clonal de células PP6 progenitoras derivadas de músculo

Para isolar clones da população de células PP6, transfectaram-se células PP6 com um plasmídeo contendo os genes LacZ, mini-distrofina e resistência à neomicina. Sucintamente, inseriu-se um fragmento Smal/Sall contendo o gene de resistência à neomicina de pPGK-NEO no local Smal/Sall do plasmídeo plEPlacZ contendo o gene LacZ, originando o plasmídeo pNEOlacZ. Inseriu-se o fragmento Xhol/Sall de DysM3 que contém a versão curta do gene de distrofina (K. Yuasa et al., 1998, FEBS Lett. 425: 329-336; oferta do Dr. Takeda, Japão) no local Sall de pNEOlacZ para gerar um plasmídeo que 46 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ contém os genes mini-distrofina, LacZ e resistência à neomicina. Linearizou-se o plasmideo por digestão com Sal I antes da transfecção.

Transfectaram-se células PP6 com 10 pg do plasmideo linear contendo os genes mini-distrofina, LacZ e resistência à neomicina utilizando o reagente Lipofectamina (Gibco BRL) de acordo com as instruções do fabricante. Às 72 horas após transfecção, seleccionaram-se as células com 3000 pg/ml de G418 (Gibco BRL) durante 10 dias até aparecerem colónias discretas. Isolaram-se então colónias e expandiram-se para obter uma grande quantidade das células transfectadas e seguidamente ensaiaram-se para expressão de LacZ. Utilizou-se um destes clones derivados de PP6, mcl3, para estudos posteriores.

Imuno-histoquímica

Plaquearam-se células PP6, mcl3 e de fibroblastos de ratinho numa placa de cultura de 6 poços e fixaram-se com metanol frio durante 1 minuto. Lavaram-se então as células com solução salina tamponada de fosfato (PBS) e bloquearam-se com soro de cavalo a 5% à temperatura ambiente durante 1 hora. Diluíram-se os anticorpos primários em PBS como se segue: anti-desmina (1:100, Sigma), anti-CD34 de ratinho biotinilado (1:200, Pharmingen), de coelho anti-Bcl-2 de ratinho (1:500, Pharmingen), de coelho anti-M-caderina de ratinho (1:50, dádiva de Dr. A. Wernig), de ratinho anti-MyoD de ratinho (1: 100, Pharmingen), de ratinho anti-miogenina de rato (1:100, Pharmingen), de coelho anti-Flk-1 de ratinho (1:50, Research Diagnostics) e Sca-1 biotinilado (1:100, Pharmingen). Incubaram-se as células com os anticorpos primários à temperatura ambiente durante a noite. Lavaram-se então as células e incubaram-se com os anticorpos secundários biotinilados adequados durante 1 hora à temperatura ambiente. Subsequentemente, enxaguaram-se as células com PBS e seguidamente incubaram-se à temperatura ambiente com 1/300 de estreptavidina conjugada com fluorócromo Cy3 durante 1 hora. Analisaram-se então as células por microscopia de fluorescência. Para cada marcador, a percentagem de células coradas foi calculada para 10 campos de células escolhidos aleatoriamente. 47 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ

Fixaram-se secções criogénicas de amostras de músculo de um ratinho normal de quatro semanas de idade (C-57 BL/6J, Jackson Laboratories) com acetona fria durante 2 minutos e pré-incubaram-se com soro de cavalo a 5% diluído em PBS durante 1 hora.

Para CD34, Bcl-2 e colagénio tipo IV, utilizaram-se os seguintes anticorpos primários: biotina anti-CD34 de ratinho (1:200 em PBS, Pharmingen), de coelho anti-Bcl-2 de ratinho (1:1000, Pharmingen) e de coelho anti-colagénio tipo IV de ratinho (1:100 em PBS, Chemicon). Para coloração com distrofina, utilizou-se anticorpo de ovelha anti-DYlO humano (diluição 1:250 em PBS) como anticorpo primário e amplificou-se o sinal utilizando anti-biotina de ovelha (diluição 1:250 em PBS) e estreptavidina-FITC (diluição 1:250 em PBS).

Estimulação com rhBMP-2, coloração com osteocalcina e ensaio de fosfatase alcalina

Plaquearam-se células em triplicado a uma densidade de 1-2 x 104 células por poço em frascos de 12 poços revestidos com colagénio. Estimularam-se as células por adição de BMP-2 recombinante humana (rhBMP-2) a 200 ng/ml ao meio de crescimento. Mudou-se o meio de crescimento aos dias 1, 3 e 5 após o plaqueamento inicial. Em paralelo, cresceu-se um grupo de células de controlo sem adição de rhBMP-2. Após 6 dias com ou sem estimulação com rhBMP-2, contaram-se as células utilizando um microcitómetro e analisou-se para expressão de osteocalcina e fosfatase alcalina. Para coloração para osteocalcina, incubaram-se as células com anticorpos de cabra anti-osteocalcina de ratinho (1:100 em PBS, Chemicon), seguido de incubação com anticorpos anti-cabra conjugados com o fluorócromo Cy3. Para medir actividade de fosfatase alcalina, prepararam-se lisados de células e analisaram-se utilizando um kit disponível comercialmente que utiliza alteração de cor no reagente devida a hidrólise de fosfato inorgânico de p-nitrofenilfosfato (Sigma). A alteração de cor resultante foi medida num espectrofotómetro e expressaram-se os dados em unidades internacionais de actividade ALP por litro 48 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ normalizados para ΙΟ6 células. Analisou-se a significância estatística utilizando o teste t de Student (p <0,05).

Diferenciação in vivo de células mc!3 em linhagem miogénica e osteogénica - Miogénica

Injectaram-se intramuscularmente as células mcl3 (5 x 105 células) no músculo do membro posterior de ratinhos mdx. Sacrificaram-se os animais aos 15 dias pós-injecção e congelou-se o tecido muscular injectado, seccionou-se criogenicamente e ensaiou-se para distrofina (consultar acima) e expressão de LacZ. Para ensaiar para expressão de LacZ, fixaram-se as secções de músculo com glutaraldeído a 1% e seguidamente incubaram-se com substrato X-gal (5-bromocloro-3-indolil-p-D-galactósido (Boehringer-Mannheim) a 0,4 mg/ml, MgCl2 1 mM, K4Fe(CN)6 5 mM e K3Fe(CN)ê 5 mM em solução salina tamponada de fosfato) durante 1-3 horas. Contra-coraram-se secções com eosina antes da análise. Em experiências paralelas, injectaram-se células mcl3 (5 χ 105 células) por via intravenosa na veia da cauda de ratinhos mdx. Sacrificaram-se os animais aos 7 dias pós-injecção e isolaram-se os membros posteriores e ensaiaram-se para a presença de distrofina e β-galactosidase como descrito.

Osteogénica

Para construir o plasmídeo BMP-2 de adenovírus (adBMP-2), excisou-se a sequência de codificação de rhBMP-2 do plasmídeo BMP-2-125 (Genetics Institute, Cambridge, Massachusetts) e subclonou-se para um vector de adenovírus com replicação deficiente (genes El e E3 eliminados) contendo o promotor HuCMV. Sucintamente, digeriu-se o plasmídeo BMP-2-125 com Sall, resultando num fragmento de 1237 pares de bases contendo o ADNc de rhBMP-2. Inseriu-se então o ADNc de rhBMP-2 no local Sall do plasmídeo pAd.lox o que colocou o gene sob o controlo do promotor HuCMV. Obtiveram-se adenovírus recombinantes por co-transfecção de pAd.lox com ADN virai psi-5 para células CRE-8. O plasmídeo adBMP-2 resultante foi armazenado a -80°C até utilização posterior.

Trataram-se com tripsina células mcl3 e contaram-se utilizando um microcitómetro antes da infecção. Lavaram-se as 49 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ células várias vezes utilizando HBSS (GibcoBRL). Pré-misturaram-se partículas de adenovírus equivalentes a multiplicidade de infecção 50 em HBSS e seguidamente deitaram-se em camada sobre as células. Incubaram-se as células a 37°C durante 4 horas e seguidamente incubaram-se com um volume igual de meio de crescimento. Efectuaram-se injecções de 0,5-1,0 x 108 células utilizando uma agulha de calibre 30 num seringa estaque a gás em tricípites surais expostos de ratinhos SCID (Jackson Laboratories). Aos dias 14-15, anestesiaram-se os animais com metoxiflurano e sacrificaram-se por deslocamento cervical. Analisaram-se os membros posteriores por radiografia. Subsequentemente, isolaram-se os tricípites surais e congelaram-se rapidamente em 2-metilbutano tamponado em solução salina tamponada de fosfato e pré-arrefecida em azoto liquido. Cortaram-se as amostras congeladas em secções de 5-10 pm utilizando um crióstato (Microm, HM 505 E, Fisher Scientific) e armazenaram-se a -20°C para análise adicional.

Análise por RT-PCR

Isolou-se ARN total utilizando reagente TRIzol (Life Technologies). Efectuou-se transcrição reversa utilizando o sistema de pré-amplificação para síntese de primeira cadeia de ADNc SuperScript (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Sucintamente, hibridaram-se 100 ng de hexâmeros aleatórios com 1 pg de arn total a 70°C durante 10 minutos e seguidamente arrefeceu-se em gelo. Efectuou-se transcrição reversa com 2 pl de 10 X tampão de PCR, 2 pl de MgCl2 25 mM, 1 pl de mistura de dNTP 10 mM, 2 pl de DTT 0,1 M e 200 U de transcriptase reversa Superscript II. Incubou-se a mistura reaccional durante 50 minutos a 42°C.

Efectuou-se amplificação por reacção de polimerização em cadeia (PCR) dos alvos em 50 pl de mistura reaccional contendo 2 pl de produto de reacção de transcriptase reversa, 100 pl (5 U) de Taq adn polimerase (Life Technologies) e MgCl2 1,5 mM. Os iniciadores de PCR de CD34 foram concebidos utilizando o utilitário Oligo e apresentavam as seguintes sequências: CD34 UP: taa ctt gac ttc tgc tac ca (SEQ ID NO:l); e CD34 DOWN: gtg gtc tta ctg ctg tcc tg (SEQ ID NO:2). Conceberam-se os outros iniciadores de acordo com estudos 50 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ anteriores (J. Rohwedel et al., 1995, Exp. Cell Res. 220: 92-100; D.D. Cornelison et al., 1997, Dev. Biol. 191: 270-283) e tinham as seguintes sequências: C-MET UP: gaa tgt cgt cct aca cgg cc (SEQ id no:3); C-met down: cac tac aca gtc agg aca ctg c (SEQ ID NO: 4); MNF UP: tac ttc ate aaa gtc cct cgg tc (SEQ ID NO:5); MNF DOWN: gta ctc tgg aac aga ggc taa ctt (SEQ ID NO:6); BCL-2 UP: age cct gtg cca cca tgt gtc (SEQ ID NO:7); BCL-2 DOWN: ggc agg ttt gtc gac ctc act (SEQ ID NO:8); MYOGENIN UP: caa cca gga gga gcg cga tet ccg (SEQ id NO:9); MYOGENIN DOWN: agg ege tgt ggg agt tgc att cac t (SEQ ID NO: 10); MYOD UP: gct ctg atg gea tga tgg att aca gcg (SEQ ID NO:ll); e MYOD DOWN: atg ctg gac agg cag teg agg c (SEQ ID NO:12).

Utilizaram-se os seguintes parâmetros de PCR: 1) 94°C durante 45 segundos; 2) 50°C durante 60 segundos (CD34) ou 60°C durante 60 segundos (para miogenina e c-met); e 3) 72°C durante 90 segundos durante 40 ciclos. Verificaram-se os produtos de PCR através de géis de agarose-TBE-brometo de etidio. Os tamanhos dos produtos de PCR esperados são: 147 pb para CD34; 86 pb para miogenina; e 370 pb para c-met. Para excluir a possibilidade de contaminação por ADN genómico, completaram-se duas reacções de controlo: 1) transcrição reversa em paralelo na ausência de transcriptase reversa e 2) amplificação de β-actina utilizando um conjunto de iniciadores abrangendo intrões (Clonetech).

Ensaio de defeito de crânio

Utilizaram-se três ratinhos fêmea SCID de 6-8 semanas de idade (Jackson Laboratories) em grupos de controlo e experimentais. Anestesiaram-se os animais com metoxiflurano e colocaram-se de bruços na mesa de operações.

Utilizando uma lâmina número 10, dissectou-se o escalpe para expor o crânio e rasgou-se o periósteo. Criou-se um defeito craniano circular com aproximadamente 5 mm de espessura total utilizando um broca dentária com penetração minima na dura-máter. Inoculou-se uma matriz de esponja de colagénio (Helistat™, Colla-Tec, Inc.) com 0,5-1,0 x 106 MDC com ou sem transdução adBMP-2 e colocou-se no defeito craniano. Fechou-se o escalpe utilizando uma sutura de 51 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ nylon 4-0 e forneceu-se alimento e permitiu-se actividade aos animais. Após 14 dias, sacrificaram-se os animais e observaram-se os espécimes de crânio e seguidamente analisaram-se microscopicamente. Para coloração de von Kossa, fixaram-se espécimes de crânio em formaldeido a 4% e seguidamente mergulharam-se em solução de AgNCg 0,1 M durante 15 minutos. Expuseram-se os espécimes à luz durante pelo menos 15 minutos, lavou-se com PBS e seguidamente corou-se com hematoxilina e eosina para visualização.

Fluorescência de hibridação in situ utilizando sondas Y

Fixaram-se as secções criogénicas durante 10 minutos em metanol/ácido acético glacial (v:v) 3:1 e secaram-se ao ar. Desnaturaram-se então as secções em formamida a 70% em SSC 2X (NaCl 0,3 M, NaCitrato 0,03 M) pH 7,0 a 70°C durante 2 minutos. Subsequentemente, desidrataram-se as lâminas com uma série de lavagens com etanol (70%, 80% e 95%) durante 2 minutos a cada concentração. A sonda específica do cromossoma Y (Y. Fan et al., 1996, Muscle Nerve 19: 853-860) foi biotinilada utilizando um kit BioNick (Gibco BRL) de acordo com as instruções do fabricante. Purificou-se então a sonda biotinilada utilizando uma coluna G-50 Quick Spin (Boehringer-Mannheim) e a sonda purificada foi liofilizada conjuntamente com ADN de esperma de salmão tratado com ultra-sons a 5 ng/ml. Antes da hibridação, ressuspendeu-se a sonda numa solução contendo formamida a 50%, SSC lx e sulfato de dextrano a 10%.

Após desnaturação a 75°C durante 10 minutos, colocou-se a sonda nas secções desnaturadas e deixou-se hibridar durante a noite a 37°C. Após hibridação, enxaguaram-se as secções com solução SSC 2X a pH 7,0 a 72°C durante 5 minutos. Enxaguaram-se então as secções em solução BMS (NaHC03 0,1 M, NaCl 0,5 Μ, NP-40 a 0,5%, pH 8,0). Detectou-se a sonda hibridada com avidina marcada com fluoresceína (ONCOR, Inc) . Contra-coraram-se os núcleos com brometo de etídio 10 ng/ml em meio de montagem Vectashield (Vector, Inc).

Análise de marcação de células mc!3

Os marcadores bioquímicos expressos por células mcl3, PP6 e fibroblastos foram analisados utilizando RT-PCR e imuno- 52 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ histoquímica. A tabela 4 (adiante) mostra que células mcl3 expressaram Flk-1, um homólogo de ratinho do gene humano KDR, que foi recentemente identificado como um marcador de células hematopoiéticas com características do tipo de células estaminais (B.L. Ziegler et al., supra), mas não expressaram CD34 ou CD45. Contudo, outros isolados clonais derivados de MDC de PP6 do presente invento expressaram CD34, assim como outros marcadores de células PP6. Os peritos considerarão que os procedimentos aqui descritos poderão ser utilizados para clonar a população PP6 de células progenitoras derivadas de músculo e obter isolados clonais que expressam marcadores celulares caracteristicos de células progenitoras derivadas de músculo. Tais isolados clonais podem ser utilizados de acordo com os métodos do invento. Por exemplo, os isolados clonais expressam marcadores de células progenitoras, incluindo desmina, CD34 e Bcl-2. De preferência, os isolados clonais também expressam os marcadores celulares Sca-1 e Flk-1 mas não expressam os marcadores celulares CD45 ou c-Kit.

Tabela 4 células PP6 células MC13 Fibroblastos Im RT-PCR Im RT-PCR Im RT-PCR desmina + na + na - na CD34 + + - - - - Bcl-2 + na + / na - na Fik-1 + na + na - na Sca-1 + na + na - na M-caderina -/ + na + na - na Miogenina + /- + + /- + - - c-met na + na + na - MNF na + na + na - MyoD -/ + + na + na - c-Kit - na - na na na CD45 - na - na na na

Tabela 4: Marcadores celulares expressos por células PP6 de mdx, mcl3 de mdx e de fibroblastos. Isolaram-se as células como descrito acima e examinaram-se por análise imuno-histoquímica. indica que 0% das células apresentaram expressão; "+" indica que >98% das células apresentaram expressão; indica que 40-80% das células apresentaram expressão; indica que 5-30% das células apresentaram expressão; "na" indica que os dados não se encontram disponíveis. 53 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ

Localização in vivo de células CD34+ e Bcl-2+

Para identificar a localização das células CD34+ e Bcl-2+ in vivo, coraram-se secções de tecido de músculo dos tricípites surais de ratinhos normais utilizando anticorpos anti-CD34 e anti-Bcl-2. As células positivas para CD34 constituíram uma pequena população de células derivadas de músculo (figura 12A) que eram também positivas para desmina (figura 12B) . A co-coloração de células CD34 + , desmina+ com anticorpo anti-colagénio tipo IV, localizou-as no interior da lâmina basal (figuras 12B e 12D). Tal como indicado pelas setas nas figuras 12A-D, pequenos vasos sanguíneos foram também positivos para CD34 e colagénio tipo IV, mas não se co-localizaram com a coloração nuclear. A expressão de CD34 por células vasculares endoteliais foi demonstrada em estudos anteriores (L. Fina et al., supra). As células Bcl-2+, desmina+ foram identificadas de igual modo (figuras 12E e 12H) e localizadas no interior da lâmina basal (figuras 12f e 12H). As secções foram igualmente coradas para M-caderina para identificar a localização de células satélite (figura 121) . Identificaram-se as células satélite em localizações semelhantes às das células CD34+, desmina+ ou Bcl-2+, desmina+ (seta, figura 121) . Contudo, várias tentativas para co-localizar CD34 ou Bcl-2 e M-caderina não foram bem sucedidas, sugerindo que as células que expressam M-caderina não co-expressam quer Bcl-2 quer CD34. Tal é consistente com o facto de células PP6 expressarem niveis elevados de CD34 e Bcl-2, mas expressarem niveis minimos de M-caderina, tal como aqui revelado.

Diferenciação in vitro de células progenitoras de músculo clonais na linhagem osteoqénica

Avaliaram-se células mcl3 relativamente a potencial de diferenciação osteogénica por estimulação com rhBMP-2. Plaquearam-se células em placas de cultura de 6 poços e cresceram-se até à confluência na presença ou ausência de rhBMP-2 a 200 ng/ml. No intervalo de 3-4 dias, as células mcl3 expostas a rhBMP-2 apresentaram alterações morfogénicas drásticas comparativamente com células sem rhBMP-2. Na ausência de rhBMP-2 as células mcl3 começaram a fundir em 54 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ miotubos multinucleados (figura 13A). Quando expostas a rhBMP-2 a 200 ng/ml, contudo, as células permaneceram mononucleadas e não fundiram (figura 13B). Quando a densidade das células atingiu uma confluência > 90%, a cultura de células não tratadas fundiu para formar vários miotubos (figura 13C), ao passo que as células tratadas se tornaram circulares e hipertróficas (figura 13D). Utilizando imuno-histoquimica, analisaram-se estas células hipertróficas para expressão de osteocalcina. A osteocalcina é uma proteína de matriz que é depositada no osso, especificamente expressa por osteoblastos. Contrariamente ao grupo não tratado, as células hipertróficas tratadas com rhBMP-2 apresentaram expressão significativa de osteocalcina (figura 13E), sugerindo assim que as células mcl3 são capazes de se diferenciar para osteoblastos por exposição a rhBMP-2.

Analisaram-se então células mcl3 relativamente a expressão de desmina após estimulação com rhBMP-2. Células mcl3 recentemente isoladas apresentaram coloração uniforme com desmina (figuras 14A e 14B) . Após 6 dias de exposição a rhBMP-2, apenas 30-40% das células mcl3 apresentaram coloração para desmina. Na ausência de estimulação com rhBMP-2, aproximadamente 90-100% das células mcl3 apresentaram coloração para desmina (figura 14C). Este resultado sugere que a estimulação de células mcl3 com rhBMP-2 resulta na perda de potencial miogénico por estas células.

Além disso, analisaram-se células mcl3 relativamente à expressão de fosfatase alcalina após estimulação com rhBMP-2. A fosfatase alcalina tem sido utilizada como um marcador bioquimico para diferenciação osteoblástica (T. Katagiri et al., 1994, J. Cell Biol., 127: 1755-1766). Tal como apresentado na figura 14D, a expressão de fosfatase alcalina por células mcl3 foi aumentada em mais de 600 vezes em resposta a rhBMP-2. Células PPl-4, utilizadas como controlo, não apresentaram actividade de fosfatase alcalina aumentada em resposta a rhBMP-2 (figura 14D). Tomados conjuntamente, estes dados demonstram que células de um isolado clonal de PP6, por exemplo, células mcl3 podem perder os seus marcadores miogénicos e diferenciarem-se para linhagem osteogénica em resposta a exposição a rhBMP-2 in vitro. 55 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ

Diferenciação in vivo de células mcl3 para linhagens miogénica e osteoqénica

Para determinar se as células mcl3 foram capazes de diferenciar para linhagem miogénica in vivo, injectaram-se as células no tecido muscular do membro posterior de ratinhos mdx. Sacrificaram-se os animais 15 dias pós-injecção e recolheram-se os seus membros posteriores para análise histológica e imuno-histoquimica. várias miofibras apresentaram coloração para LacZ e distrofina na região circundante ao local da injecção (figuras 15A e 15B), indicado que células mcl3 podem diferenciar para linhagem miogénica in vivo e aumentar regeneração muscular e restaurar distrofina no músculo distrófico.

Numa experiência paralela, injectaram-se células mcl3 por via intravenosa na veia da cauda de ratinhos mdx. Sacrificaram-se os animais aos 7 dias pós-injecção e recolheram-se os músculos dos membros posteriores para análise histológica e imuno-histoquimica. Várias células do músculo de membros posteriores apresentaram coloração para LacZ e distrofina (figuras 15C-15D; consultar também sugerindo que células mcl3 podem ser entregues de modo sistémico ao tecido alvo para recuperação de expressão de distrofina.

Para ensaiar as caracteristicas pluripotentes de células mcl3 in vivo, transduziram-se as células com um vector adenoviral que codifica rhBMP-2 (adBMP-2). Injectaram-se então as células mcl3 com adBMP-2 nos membros posteriores de ratinhos SCID. Sacrificaram-se os animais aos 14 dias pós-injecção e removeram-se os membros posteriores para análise histoquímica e imunoquimica. A análise com ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) de células mcl3 transduzidas com adBMP-2 demonstrou que células infectadas eram capazes de produzir rhBMP-2. Análise radiográfica de membros posteriores de ratinhos SCID injectados revelou formação de osso ectópico robusto no prazo de 14 dias após injecção (figura 15E). Análise histológica utilizando coloração para LacZ de osso ectópico demonstra que as células mcl3 positivas para LacZ se localizavam uniformemente no interior de matriz mineralizada ou lacunas, 56 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ uma localização típica para se encontrarem osteoblastos e osteócitos (figura 15F) .

Para confirmar adicionalmente o papel de mcl3 na formação de osso ectópico, as secções de músculo foram também coradas para presença de distrofina. Tal como apresentado na figura 15G, o osso ectópico continha células altamente positivas para distrofina sugerindo que as células mcl3 participam estreitamente na formação de osso. Como controlo, efectuaram-se experiências semelhantes com fibroblastos. Verificou-se que os fibroblastos apoiavam formação de osso ectópico robusto mas as células injectadas foram uniformemente encontradas fora do osso e nenhumas se localizaram no interior da matriz mineralizada. Tal sugere que os fibroblastos são capazes de entregar rhBMP-2 para formar osso ectópico, mas são incapazes de se diferenciar para osteoblastos. Neste caso, as células que participam na mineralização do osso ectópico são provavelmente derivadas do tecido hospedeiro. Assim, estes resultados demonstram que células mcl3 se podem diferenciar para osteoblastos, tanto in vivo como in vitro.

Melhoria de cicatrização de osso por células derivadas de músculo modificadas por engenharia genética

Criaram-se defeitos no crânio (aproximadamente 5 mm) em ratinhos SCID fêmea com esqueleto maduro (6-8 semanas de idade) utilizando uma broca dentária como descrito acima. Experiências anteriores tinham demonstrado que os defeitos no crânio de 5 mm são "não cicatrizáveis" (P.H. Krebsbach et al., 1998, Transplantation 66: 1272-1278). 0 defeito craniano foi preenchido com uma matriz de esponja de colagénio com células mcl3 transduzidas ou não transduzidas com adBMP-2. Sacrificaram-se estes ratinhos aos 14 dias e analisou-se a cicatrização do defeito do crânio. Tal como apresentado na figura ΙβΑ, o grupo de controlo tratado com células mcl3 sem rhBMP-2 não apresentou evidências de cicatrização do defeito. Contrariamente, o grupo experimental tratado com células mcl3 transduzidas para expressarem rhBMP-2 apresentaram um fecho praticamente completo do defeito do crânio às 2 semanas (figura 16B). A coloração de von Kossa, que marca osso mineralizado, apresentou formação de osso robusto no grupo tratado com células mcl3 transduzidas para expressar rhBMP-2 57 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ (figura 16D) mas observou-se formação de osso mínima no grupo de controlo (figura 16C). A área de osso novo no grupo experimental foi analisada por hibridação in situ por fluorescência (FISH) com uma sonda específica de cromossoma Y para identificar células transplantadas. Tal como apresentado na figura 16E, identificaram-se células positivas para cromossoma Y no interior do osso recém-formado, indicando participação activa de células transplantadas na formação de osso sob a influência de rhBMP-2. As células negativas para cromossoma Y foram também identificadas no interior do crânio recém-formado, indicando assim participação activa também de células derivadas do hospedeiro. Estes resultados demonstram que células mcl3 podem mediar a cicatrização de um defeito ósseo "não cicatrizável" por estimulação com rhBMP-2 e indicam que as MDC do presente invento podem ser utilizadas no tratamento de defeitos, lesões ou traumas ósseos. EXEMPLO 10: Tratamento com MDSC não autólogas (alogénicas) de defeitos ósseos Métodos

Os ratinhos normais (C57 BL/6J) ou ratinhos mdx (ratinhos C57BL/10ScSn mdx/mdx) utilizados nas experiências descritas neste exemplo foram adquiridos de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine) e utilizaram-se como doadores e hospedeiros, respectivamente.

Para preparação de culturas de células estaminais derivadas de músculo (MDSC) e de células satélite (scs), removeram-se os músculos dos membros posteriores de ratinhos normais recém-nascidos (3-5 dias de idade) e dissociaram-se enzimaticamente células de músculo por adição de colagenase tipo XI a 0,2% durante 1 hora a 37°C. Adicionaram-se 2,4 unidades/ml de dispase durante 45 minutos e tripsina a 0,1% durante 30 minutos. O extracto de células de músculo foi então pré-plaqueado em frascos revestidos com colagénio em meio de proliferação (DMEM contendo soro de cavalo a 10%, soro fetal de bovino a 10%, extracto de embrião de galinha a 0,5% e penicilina/estreptomicina a 1%). As scs de pré-placas precoces 58 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ ligaram-se ao substrato do frasco em 1-4 dias, enquanto que as mdsc demoraram 5-7 dias (por exemplo, PP5-6), tal como descrito.

Injectaram-se 0,35-0,74 x 106 células tanto de pré-placa tardia (LP) (PP5 ou PP6), como de pré-placa precoce (EP) (PPl-2) em cada músculo dos membros posteriores de ratinhos mdx por injecção em ponto único. Excisaram-se os músculos injectados aos 10 e 30 dias pós-transplante, respectivamente e congelaram-se em azoto liquido. Prepararam-se secções criogénicas do músculo injectado para análise imuno- histoquímica. Para análise imuno-histoquimica de secções transversais de músculo, efectuou-se coloração para distrofina. Observou-se coloração utilizando microscopia de fluorescência (Nikon Optiphot) e contou-se o número de células positivas para distrofina (distrofina+).

Observou-se um grande enxerto com um número elevado de miofibras distrofina+ no músculo injectado com MDSC [LP] aos dez dias pós-injecção (figuras 17C e 17D). Comparativamente com músculo injectado com MDSC [EP] (figuras 17A e 17B), o enxerto MDSC [LP] continha muitas mais miofibras pequenas, sugerindo assim que as células MDSC [LP] injectadas apresentam uma elevada capacidade de proliferação in vivo. Injectou-se o mesmo número de células de músculo em ambos os músculos. O número de miofibras distrofina+ no músculo injectado com MDSC [LP] foi cerca de 5 vezes maior do que no músculo injectado com MDSC [EP] (scs), (2, 798 +/- 1,114, n=4 em mdsc contra 430 + /- 148, n=6 em EP; média +/- DP).

Adicionalmente, encontrava-se presente um número mais elevado de miofibras distrofina+ no enxerto aos 30 dias pós-injecção de MDSC [LP] (figuras 17E e 17F) . Tal como descrito acima, a maioria das miofibras distrofina+ que se tinham formado aos 10 dias pós-injecção sobreviveram 20 dias mais tarde ao dia 30. Verificou-se que as MDSC de placa tardia (por exemplo, PP5-6) deram origem a mais células satélite no músculo hospedeiro do que as células de placa precoce (por exemplo, PPl-2), o que poderia contribuir para o número elevado de miofibras distrofina+ no músculo injectado com placa tardia. As células estaminais derivadas de músculo melhoraram significativamente a eficácia do transplante 59 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ celular para músculo distrófico. Além da elevada capacidade de auto-renovação confirmada em células de placa tardia, as células MDSC evitam a rejeição imunitária, que é provavelmente um factor responsável pela elevada taxa de sobrevivência das células de placa tardia em músculo hospedeiro não autólogo. EXEMPLO 11: Aumento do disco vertebral

Prepararam-se coelhos fêmea para cirurgia na posição lateral por anestesia com halotano. Efectuou-se uma incisão periespinal na região do nivel espinal T4-L2 para expor os discos. Injectaram-se os discos com 10 μΐ de uma suspensão de células progenitoras derivadas de músculo apresentando o marcador LacZ em HBSS (1-1,5 x 106 células) utilizando uma micro-seringa Hamilton. Ao dia 10 pós-injecção, excisou-se o disco, preparou-se para análise histoquimica, corou-se para β-galactosidase para determinar a localização e viabilidade das células que apresentam o marcador LacZ, examinou-se microscopicamente e fotografou-se. Os resultados destas experiências demonstram que podem utilizar-se composições de MDC como materiais de aumento de disco (figuras 20A e 20B) para o tratamento de sintomas, lesões ou condições congénitas, degenerativas ou traumáticas dos discos incluindo dores de costas e deficiência dos discos e da coluna vertebral.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> University of Pittsburgh 200 Gardner Steel Conference Center Thackeray & 0'Hara Streets Pittsburgh, PA 15260

<120> "AUMENTO E ENCHIMENTO DE TECIDOS MOLES E OSSO UTILIZANDO CÉLULAS PROGENITORAS DERIVADAS DE MÚSCULO, SUAS COMPOSIÇÕES E TRATAMENTOS" <130> 27104007PC2 <140> A ATRIBUIR <141> 2001-04-12 <150> US09/549,937 <151> 2000-04-14 <16 0> 12 <170> Patentln Ver. 2.1 60 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ

<210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA CD34 UP < 4 0 0 > 1 taacttgact tctgctacca 20

<210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA CD34 DOWN < 4 0 0 > 2 gtggtcttac tgctgtcctg 20

<210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA C-MET UP < 4 0 0 > 3 gaatgtcgtc ctacacggcc 20

<210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA C-MET DOWN < 4 0 0 > 4 cactacacag tcaggacact gc 22

<210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA MNF UP < 4 0 0 > 5 tacttcatca aagtccctcg gtc 23 61 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ <210> 6 <211> 24

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο >

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA MNF DOWN < 4 0 0 > 6 gtactctgga acagaggcta actt 24

<210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA BCL-2 UP < 4 0 0 > 7 agccctgtgc caccatgtgt c 21

<210> 8 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA BCL-2 DOWN < 4 0 0 > 8 ggcaggtttg tcgacctcac t 21

<210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA MYOGENIN UP < 4 0 0 > 9 caaccaggag gagcgcgatc tccg 24

<210> 10 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA MYOGENIN DOWN < 4 0 0 > 10 aggcgctgtg ggagttgcat tcact 25 62 ΕΡ 1 272 204/ΡΤ

<210> 11 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο >

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA MYOD UP < 4 0 0 > 11 gctctgatgg catgatggat tacagcg 27

<210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: SEQUÊNCIA OLIGONUCLEOTÍDICA MYOD DOWN < 4 0 0 > 12 atgctggaca ggcagtcgag gc 22

Lisboa,

Claims (22)

1. ΕΡ 1 272 204/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina, apresentando sobrevivência prolongada in situ, ou de uma sua população clonal e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitáveis, para o fabrico de um medicamento para utilização para aumento ou enchimento de tecido de músculo esofágico ou tecido de músculo gastroesofágico num mamífero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher o tecido de músculo esofágico ou gastroesofágico.
2. 2. Utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina, apresentando sobrevivência prolongada in situ, ou de uma sua população clonal e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitáveis, para o fabrico de um medicamento para utilização para aumento ou enchimento de tecido de músculo de esfíncter num mamífero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher o tecido de músculo de esfincter.
3. 3. Utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina, apresentando sobrevivência prolongada in situ, ou de uma sua população clonal, e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitáveis, para o fabrico de um medicamento para utilização para aumento ou enchimento de tecido seleccionado entre tecido de músculo da bexiga, ureteral ou uretral num mamífero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher o tecido de bexiga, ureteral ou uretral.
4. 4. Utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina, apresentando sobrevivência prolongada in situ, ou de uma sua população clonal e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente ΕΡ 1 272 204/ΡΤ 2/5 aceitáveis, para ο fabrico de um medicamento para utilização para aumento ou enchimento de um defeito cosmético ou estético de tecido mole num mamífero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher o defeito cosmético ou estético.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o defeito cosmético ou estético é seleccionado do grupo que consiste em rugas, depressões cutâneas de origem não traumática, rídulas, estrias, depressões de cicatrizes, cicatrizes de acne vulgar, hipoplasia do lábio, depressões faciais, lesões dermatológicas e depressões faciais em torno dos olhos .
6. 6. Utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina, apresentando sobrevivência prolongada in situ, ou de uma sua população clonal, e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitáveis, para o fabrico de um medicamento para utilização para aumento ou enchimento de tecido incluindo uma ou mais de depressão cutânea, ferida, fissura ou abertura num mamífero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher a depressão cutânea, a ferida, a fissura ou a abertura.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a depressão cutânea, a ferida, a fissura ou a abertura é seleccionada de entre lesões, divertículos, quistos, fístulas, aneurismas e feridas em consequência de lesões, traumatismos, cirurgia ou doença.
8. 8. Utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina, apresentando sobrevivência prolongada in situ, ou de uma sua população clonal e, (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitáveis, para o fabrico de um medicamento para utilização para aumento ou enchimento de tecido muscular num mamífero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher o tecido muscular; em que o referido tecido muscular é seleccionado de entre (a) tecido ΕΡ 1 272 204/ΡΤ 3/5 digestivo seleccionado do grupo que consiste em tecido estomacal, intestinal, lingual, esofágico, pilórico e anal; (b) tecido reprodutor seleccionado do grupo que consiste em tecido uterino, vaginal, clitoriano, de tubo de Falópio, cervical, peniano e de vaso deferente; (c) tecido urológico seleccionado do grupo que consiste em tecido de rim, de bexiga, uretral, ureteral e do esfíncter; ou (d) tecido respiratório seleccionado do grupo que consiste em tecido de traqueia e de pulmão.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o aumento ou enchimento trata uma fraqueza ou disfunção que é (a) consequência de uma lesão relacionada com desporto; ou (b) seleccionada do grupo que consiste em refluxo vesico-ureteral, incontinência urinária, incontinência fecal e refluxo gastroesofágico.
10. 10. Utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina, apresentando sobrevivência prolongada in situ, ou uma sua população clonal, e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitáveis, para o fabrico de um medicamento para utilização para aumento ou enchimento de (a) tecido mole não muscular, ou (b) tecido mole não ósseo e não muscular, num mamífero, em que a composição se encontra presente numa quantidade suficiente para aumentar ou encher o (a) tecido mole não muscular, ou (b) tecido mole não ósseo e não muscular.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o aumento ou enchimento resulta na reparação de um defeito seleccionado do grupo que consiste em lesões, fissuras, divertículos, quistos, fístulas, aneurismas e feridas em consequência de lesões, traumatismos, cirurgia e doença no tecido mole não muscular ou no tecido mole não ósseo e não muscular.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o tecido mole não ósseo e não muscular é a) tecido digestivo seleccionado do grupo que consiste em tecido oral, estomacal, intestinal, esofágico, pilórico, pancreático, de fígado, de vesícula biliar e anal; (b) tecido reprodutor seleccionado do ΕΡ 1 272 204/ΡΤ 4/5 grupo que consiste em tecido uterino, vaginal, clitoriano, de tubo de Falópio, vulvar, cervical, peniano, de escroto, de testículo e de vaso deferente; (c) tecido urológico seleccionado do grupo que consiste em tecido de rim, de bexiga, uretral, ureteral e de esfíncter; (d) tecido respiratório seleccionado do grupo que consiste em tecido da traqueia e de pulmão; (e) tecido neural seleccionado do grupo que consiste em tecido de nervo, espinal medula, disco vertebral e cerebral; e (f) tecido epitelial seleccionado do grupo que consiste em tecido em pele e tecido de lúmen.
13. 13. Utilização de uma composição incluindo (i) células progenitoras derivadas de músculo (MDC) isoladas e que expressam desmina, apresentando sobrevivência prolongada in situ, ou uma sua população clonal, e (ii) um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitáveis, para o fabrico de um medicamento para utilização para restauro ou melhoria da contractilidade de músculo liso, em que o músculo liso é músculo liso gastrointestinal seleccionado do grupo que consiste em músculo liso esofágico, músculo liso estomacal, músculo liso pilórico e músculo liso intestinal; e adicionalmente em que a composição está presente numa quantidade suficiente para restaurar ou melhorar a contractilidade do músculo liso.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o restauro ou melhoria do músculo liso gastrointestinal resulta em melhoria ou correcção de gastroparesia.
15. 15. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 ou 13, em que as MDC na composição do medicamento contêm ADN heterólogo que codifica uma ou mais biomoléculas activas e em que as biomoléculas são expressas pelas células, auxiliando assim no tratamento do tecido, em que a biomolécula activa é seleccionada do grupo que consiste em um ou mais de entre factores de crescimento celular, factores de diferenciação celular, factores de sinalização celular e factores de morte celular programada.
16. 16. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 ou 13, em que o transportador inclui um material absorvente ou aderente. ΕΡ 1 272 204/ΡΤ 5/5
17. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o transportador é um material de esponja de colagénio.
18. 18. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que a composição adicionalmente melhora ou trata fraqueza ou disfunção no tecido.
19. 19. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 ou 13, em que o medicamento é susceptível de ser injectado no tecido ou administrado endoscopicamente.
20. 20. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 ou 13, em que a composição inclui MDC que são autólogas para o tecido.
21. 21. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 ou 13, em que a composição inclui MDC que são alogénicas para o tecido.
22. 22. Utilização de acordo com a reivindicação 20 ou reivindicação 21, em que a composição inclui MDC obtidas de uma fonte humana. Lisboa,