WO1999056786A1 - Diagnostisches mittel 2 oder 3 komponenten für die mr-diagnostik - Google Patents

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Mayk Kresse
Werner Weitschies
Susanne Wagner
Matthias Taupitz
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Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic agent for MR diagnostics.
  • magnetites 25 3. present in magnetite or maghamite (spinel, reverse spinel). In medical diagnostics, these superpara-agnetic iron oxides are therefore also referred to as magnetites.
  • particulate contrast media is not only understood to mean the iron oxides with a magnetite-like crystal structure, but in principle all (super) paramagnetic colloidal solutions or suspensions in para-, remote-
  • 35 magnetic or magnetic metal-containing particles for. B. magnetite, maghamite or other metal oxides or Mixed metal oxides, cobalt or other metal ferrites or mixed metal ferrites, but also remnant parts and metal-containing polymers are understood.
  • the various processes can be classified from different points of view.
  • the production of the superparamagnetic metal-containing crystals differentiates between two basic processes, namely a sintering process at high temperature and subsequent mechanical comminution, and wet-chemical synthesis in solution. So far, only particles that have been produced by wet chemical methods have been examined for medical use, while the sintering process for the production of particles for technical (sound carriers, color pigments and toners) and biotechnical applications such.
  • B. the magnetic separation technique has been described
  • a variant of the "two-pot synthesis” is the production of the particles on ion exchangers [Hasegawa M, Hokukoku S; US 4,101,435].
  • the particles are produced in the presence of the stabilizer, which already envelops the metal cores during the precipitation of the metal salts and thus prevents the aggregation and sedimentation of the particles.
  • a subdivision according to the type of solvent used can also be aqueous [Hasegawa M, Hokukoku S; US 4,101,435; Fuji Rebio KK; JP 59,195,161] and non-water processes are carried out [Porath J, Mats L; EP 179,039 A2; Shigeo A, Mikio K, Toshikatzu M; J. Mater. Chem. 2 (3); 277-280; 1992; Norio H, Saturo 0; JP 05,026,879 A2].
  • Magnetic metal oxide particles which are to be used as contrast agents in human diagnostics, require an aqueous dispersion medium for medical and toxicological reasons. A special position in this classification is given to the particles, which were produced in a non-aqueous solvent, but can be stably dispersed in an aqueous medium after production.
  • Such particles are currently generally used in ex vivo diagnostics, e.g. B. in magnetic separation technology [Chagnon MS, Groman EV, Josephson L, et al. ; US 4,554,088], but were also proposed for in vivo diagnostics [Pilgrimm H; US 5,160,725].
  • Particles that were produced by the "two-pot process” were mainly used in the early experimental studies up to the mid-80s, while e.g. At the moment, only studies with particles that are produced by a "one-pot synthesis" are described.
  • the suspensions / solutions of particles which were prepared by the "Emtopfvon" in aqueous media, can be further divided into particles of different sizes.
  • the particles in the micrometer biotechnical applications have been richly proposed [Schröder U, Mosbach K; WO 83/01738 or Schröder U; WO 83/03426] or the in-vivo use in diagnosis or therapy [Widder KJ, Senyei AE; US 4,247,406 or Jacobsen T, Klaveness J; WHERE
  • the nanometer range can also be subdivided into m “large” (approx.> 50 nm overall diameter) and "small” (approx. ⁇ 50 nm total diameter) particles.
  • iron oxides which were produced in the presence of dextran as a stabilizer substance [Bacic G, Niesmann MR, Magin RL et al. ; SMRM - Book of abstracts 328; 1987; Ohgushi M, Nagayama K, Wada A et al. ; J. Magnetic Resonance 29; 599-601; 1978; Pouliquen D, Le Jeune JJ, Perdrisot R et al.
  • glycosammoglycans r Pfefferer D Schimpfky C, Lawaczeck R; SMRM - Book of aostracts 773; 1993] or also of proteins [Widder DJ, Grief WL, Widder KJ et al. ; AJR 148; 399-404; 19871.
  • particulate contrast media such as the type of metal salts, temperature, Hull polymer (stabilizer), titration speed, choice of alkali, cleaning, etc. influence the chemical-physical properties and thus the pharmaceutical-galenical quality and ultimately the medical benefit.
  • polymers arabmogalactan; with physiological effector cells and, like Gordon, who oxidizes his large dextran-stabilized particles with periodate and then couples transferrin by reductive amination [Gordon RT; US 4,735,796]
  • the invention has for its object to provide a diagnostic agent that eliminates the aforementioned disadvantages of the prior art.
  • the invention therefore relates to a particulate diagnostic agent for MR tomography, obtainable by attaching cell and / or tissue-specific compounds as component 1 to tissue and then reacting it with a second component, which has a specific molecule with the first Component interacts.
  • the new diagnostic agents enable a more sensitive MR detection of the particle effects than according to the known prior art via the synergistic effect of an increased contrast agent effectiveness with a simultaneous local concentration increase.
  • the first sub-step the increase in effectiveness, is made possible by controlled particle aggregation (Ci ⁇ ster effect, Fig. 1).
  • Isolated in a volume element of the present MR effective particle results in the magnetic effectiveness of (Reiaxivitat) from the sum of the effects of the indi vidual ⁇ particles.
  • this particle cluster behaves magnetically as one large particles.
  • Such large particles or clusters produce strong local magnetic fields in the MRI homogenitaten as a local magnetic field ⁇ very sen sitive be mapped.
  • the clusters have a disproportionate MR activity (reiaxivity) compared to the homogeneously distributed particles - especially with susceptibility-sensitive measurement sequences.
  • the diagnostic agent according to the invention now enables both the pharmacological advantages of small particles and the high physical effectiveness of large particles (reiaxivity) to be used in specific MR diagnostics: gill particles are injected and find their biological target via a specific ligand . In a second step, a targeted particle aggregation takes place locally on the target. These aggregated particles (clusters) can be imaged accordingly with the MRI.
  • the targeted particle aggregation in the biological target should be via a second component, e.g. B. a second MR-active particle (z. B. magnetite) can be induced, which specifically recognizes only the first particle (z. B. magnetite) as the target structure.
  • the second component is thus held by the first particle at the target location and leads z. B. with magnetite as a second component for increasing the local concentration of MR-effective particles (Trappmg effect, Fig. 2).
  • an aggregate with a correspondingly high magnetic effectiveness is formed at the destination by multiple interaction between the first and the second component (cluster effect).
  • Magnetites are e.g. 3. a s absorber substances in hyperthermia treatment
  • the magnetites are currently applied experimentally and the therapeutic effect is limited by the fact that the high internal tumor pressure immediately prints a large part of the applied dose out of the tumor, so that only a small part of the applied dose is applied during the subsequent stimulation Dose is actually available in the tumor area as an absorber and induces the desired hyperthermia.
  • a targeted aggregation of the magnetite particles in the tumor opens up the possibility of mechanically retaining the magnetite in the tumor and thus increasing the fraction of the effective dose.
  • the diagnostic agents claimed consist of at least two components.
  • the first two points increase the probability of a specific interaction of the first component with the biological target. From the known relationship between "targetability" and particle size, it can be assumed that only the so-called ultra-small superparamagnetic particles (USPIO) meet the pharmacological requirements; large particles that are quickly absorbed by macrophages stand for accumulation biological production is no longer available
  • USPIO ultra-small superparamagnetic particles
  • the production and (experimental) application of such small particles (USPIO) is state of the art today and is described in detail in scientific and patent law literature [eg Hasegawa M, Ito Y, Yamada H, et al .; WO94 / 03501; Weissleder R; Papisov MI; Reviews of Magnetic Resonance in Medicine 4; 1-20; 1992; Weissleder R, Lee AS, Khaw BA et al.; Radiology 182; 381-385; 1992 or Weissleder R, Lee AS, Fishman A et al.; Radiology 181
  • small MR-effective particles are produced in a first step according to the prior art and then functionalized with known methods (for example by attaching antibodies or fragments, receptor-specific proteins or oligonucleotides). After intravenous injection, the functionalized particles find their target in vivo via the specificity of the ligand. After a corresponding waiting period, the unbound specific particles are eliminated from the vasal cavity by unspecific phagocytosis by the liver and spleen.
  • the specific particles also carry a second marking as a recognition region (e.g. biotin), which in turn is recognized by a second component in a highly specific manner and with high affinity.
  • a recognition region e.g. biotin
  • An essential characteristic of this second component is therefore a specificity for the first component, which is made possible by a complementary pair of molecules (eg first component biotin, second component Avidm or Streptavidm).
  • the second component In a second injection, the second component is now, which interacts via specific interaction only with locally bound particles from the first injection step (trappmg). At the biological goal, the interaction of the particles among themselves becomes the second component of the first (Trappmg), which results in a local increase in concentration. In addition, the interaction of the first and the second component leads to particle aggregation and the cluster effect leads to a physical increase in effectiveness. Surprisingly, it was found in experiments that the contrast agent effect of the aggregated Components in the MRI is significantly larger than the sum of the effects of the individual components. 14
  • a particularly preferred embodiment of the diagnostic agent according to the invention which contains MR-active particles and / or polymers, is characterized in that component 1 has a composition of the general formula (I)
  • component 2 is a composition of the general formula (II)
  • A is a molecule with cell and / or tissue specificity
  • B is a binding partner for C
  • m, n and o are each> 1, where the values for m, n and o can be the same or different
  • M is an MR-effective particle and / or polymer
  • X is a magnetic or non-magnetic iron oxide, metal oxide or mixed metal oxide, metal ferrite or mixed metal ferrite, magnetic or non-magnetic magnetite, a natural or synthetic polymer, a vesicle, particle or C,
  • C is a binding partner for B
  • RNA or DNA em Lectm, an addressee, an integrin, an antigen, an antibody or part of an antibody or a conjugate with an antibody or part of an antibody, a hormone or analogue, a protein, a peptide, folic acid or an analogue or DNA or RNA or a part of a natural or synthetic RNA or DNA
  • Complementary structures are or contain one another, preferably from the groups Lectm and lectin-specific sugar structure
  • metal chelates and metal chelating structures which are preferred, are or contain nickel complexes and 6-histidine-containing molecules,
  • an MR-active particle and / or polymer with particular preference being given to the use of small particles (total diameter ⁇ 50 nm),
  • the particle is a magnetic or non-magnetic iron oxide, a metal oxide, a mixed metal oxide, a metal remote or mixed metal, a natural or synthetic polymer, a vesicle or particle or is equal to C.
  • the particle can be selected from the group of metal colloids, liposomes, cavisomes, niosomes, soli-lipid nanoparticles, nanocapsules, nanopellets, nanosuspensions, microemulsions. and preferably the magnetite particles.
  • X and C are identical, it is a functional molecule C which is optionally connected by a linker (spacer) (general formula IV)
  • a further be v orzugte embodiment of the inventive diagnostic scnen agent is obtainable by a further injection between the first and the second injection of a third Component takes place as a "clearing agent".
  • the clearing agent interacts with the portion of component 1 that is not bound in the target, that is to say freely circulates in the blood stream.
  • the interaction between component 1 and the clearing agent (component 3) results in the Recognition is stimulated by the macrophages of the liver and spleen, thus eliminating component 1 from the vasal space in an accelerated manner. 17
  • component 3 may be caused, or else may be caused by a “macrophage marker” on component 3.
  • the (optional) third component (clearing agent) of the diagnostic agent according to the invention is characterized by a composition of the general formula (V),
  • Z is the binding partner for A or B and i is a macrophage-poor substance, and p is a number between 0 and 1.
  • the Fc part of an antibody, or Fibronectm, or Tuftsm, or molecules which represent or contain a complement factor or parts thereof, are preferably used as molecules which induce the uptake in macrophages.
  • Another object of the invention is the use of the diagnostic means according to the invention m of MR
  • Particle Particle Particle e.g. magne (e.g. magne (e.g. 3. magnetite) tit) tit)
  • Particles e.g. magnetite
  • c Avidm HiS ⁇ peptide optional optional optional z
  • Dextran polymer H ⁇ s 6 peptide Avidm Y CE antigen Fibronectm
  • Biotm-Avidm The Biotm-Avidm system was chosen, because the binding constant Biotm-Avidm is very high 'approx. 10 ⁇ i3 ) and that Avidm has four binding sites for biotin, so that interparticle cross-linking (clustering) is possible.
  • the biotmylation of the dextran magnetites was carried out according to the following scheme:
  • the oxidized magnetite is then reacted with 5 ⁇ 1 mg of biotmamidocaproyl hydrazide (Sigma Chemicals). After a reaction time of 30 mm at room temperature, the reaction is stopped with approx. 50 mg l-Ammo-2, 3-propanediol. 8. The response time is 1 hour. In turn, the cleaning he ⁇ follows over a PD-10 column (m 2 servings;. 9. The eluates are combined, and 0.22 micron filter em Vial m filled.
  • Example 3 Detection of the Cluster Effect
  • Siemens Vision 1.5 ⁇ MR tomograph.
  • spin-echo sequences with Tl and T2 detection used.
  • the signal intensities (SI) were used to quantify the cluster ef ect
  • Tl Spm-lattice relaxation time
  • T2 Spm-Spm relaxation time
  • Tl and T2 or T2 * resolved and the relaxation times determined.
  • the relaxation rates (1 / T1, or 1 / T2 or 1 / T2 * were then plotted against the iron concentrations.
  • the linear adaptation to the measuring points provides a straight line, the slope of which is a measure of the MR effectiveness independent of the concentration (Reiaxivitat.)
  • the results for the FLASH 2D sequence (T2 * -Relax ⁇ v ⁇ tat) for a small magnetite (MRL 97279) and a large magnetite (MRL 97275) are summarized in Figure 10.
  • the samples with Avidm show a reduction in signal intensity compared to samples of the same concentration, but without Avidm - the effectiveness of the contrast medium is thus increased compared to the samples without Avidm and the cluster effect is demonstrated.
  • the observed effects increase with increasing T2 * importance at the longer TE times.
  • the experiments on the influence of the Avidm amount on the signal intensities show that in the concentration range examined (0 - 15 ⁇ g Avidm) the effectiveness increases with the Avidm amount and with longer TE times for the small magnetites (MRL 97272 and MRL 97279). The larger MRL 97275 seems 23
  • the optimal concentration range for the Aviam addition is 100 to 300 ⁇ l; higher avid concentrations lead to a signal increase.
  • the cluster effects observed in the FLASH 2D are also found in the Spm-Echo sequence with the T2 device, whereby the relative reduction in the signal intensity (+ Avidm / -Avidm * 100) for MRL 97272 and MRL 97275 is less than for the T2 * -3 sequence.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel für die MR-Diagnostik, erhältlich durch Anlägerung zell- und/oder gewebespezifischer Verbindungen als Komponente 1 an Gewebe und anschliessender Umsetzung mit einer 2. Komponente, die über ein spezifisches Molekül mit der 1. Komponente interagiert. Gegebenenfalls werden von der Umsetzung mit der 2. Komponente die nichtgebundenen Partikel der Komponente 1 mit einer 3. Komponente umgesetzt. Überraschend wurde festgestellt, dass die Kontrastmittelwirkung der aggregierten Komponenten in der MRT grösser ist als die Summe der Wirkung der Einzelkomponenten.

Description

1
Beschreibung
DIAGNOSTISCHES MITTEL MIT 2 ODER 3 KOMPONENTEN FÜR DIE MR-DIAGNOSTIK
Die vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel für die MR-Diagnostik.
Krankheitsspezifische Veränderungen spiegeln sich auf zellularer Ebene oft in einer gegenüber dem Normalzustand veränderten Rezeptorverteilung oder Expression wieder.
Diese Unterschiede können sowohl quantitativer Art (z. B. Menge der Transfernn-Rezeptoren auf proliferierenden Zellen) oder aber auch qualitativer Art sein (z. B. Expression von vascular endothelial growth factors, VEGF) . Bisher werden Ansätze zur Abbildung einer pathologischen Rezeptorexpression oder -Verteilung wegen der notwendigen Sensitivitat des Detektionsverfahrens hauptsächlich m der Radiodiagnostik verfolgt. Systemimmanente Probleme sind dabei im wesentlichen die begrenzte räumliche Auflo- sung der Szmtigraphie und die Verwendung ionisierender Strahlung .
Alternative Methoden zur Darstellung kleiner Zielstruktu- rer , z. 3. von Rezeptorverteilungen, mit kontrastmitte- lunterstutzten bildgeüenden Verfahren bei hoher Auflosung (CT, MRT) scheitern bisher an der Sensitivitat der Metho¬ den für die verfugbaren Kontrastmittel. Detektierbare Kontrastmittelkonzentrationen liegen für die CT im milli- molaren Bereich, wahrend die MRT Kontrastmittel minde- stens 100-fach sensitiver erfassen kann (mikromolarer Bereich) , so daß die MRT für spezifische Ansätze geeigneter erscheine. Unter den bekannten MR-Kontrastmitteln steigt die physikalische MR- irksamkeit m der Reihenfolge mono- mere, polymere, partikulare Substanzen an, so daß sich besonders die polymeren und partikularen Vertreter für die Verwendung als spezifische Kontrastmittel anbieten. Obwohl schon erste experimentelle Ergeonisse zur Krank- neitsspezifischen Diagnostik mit partikularen Kontrastmitteln, z. B. Magnetiten, publiziert wurden (Entzun- dungsdarstellung, Tumordarstellung, [Weissleder R, Lee AS, Khaw BA et al . ; Radiology 182; 381-385; 1992 oαer Weissleder R, Lee AS, Fishman A et al . ; Radiology 181; 245-249; 1991] stehen einer breiteren Anwendung noch viele Hindernisse im Weg: Ein vom Diagnoseverfahren unab- nangiges Problem ist dabei die Wahl eines geeigneten Targets (z. B. Tumormarker) bzw. die Verfügbarkeit und Spe- zifitat des Liganden. Ein auf die MRT bezogenes Proßlem besteht m der Akkumulation der Kontrastmittel in ausreichender (detektierbarer ) Konzentration im (ublicner- weise) kleinen Zielgebiet (z. B. Tumor) .
^ o
Eine charakteristische Eigenschaft aller MR-Kontrast- mittel ist die starke Beeinflussung der Protonenrelaxati¬ onszeiten und damit die physikalische Wirksamkeit als Kontrastmittel m diesem diagnostischen Verfahren. Gene-
20 rell steigt dabei die MR-Wirksamkeit von monomeren über polymere zu den partikularen Kontrastmitteln an. In der medizinischen Diagnostik wurden als partikulare Substanzen bisher hauptsächlich superparamagnetische Eisenoxide mit "magnetitartiger" Kristallstruktur untersucnt, die z
25 3. im Magnetit oder Maghamit vorliegt (Spinell, nverses Spinell) . In der medizinischen Diagnostik werden diese superpara agnetischen Eisenoxide deshalb auch unter dem Begriff Magnetite zusammengefaßt.
30 Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter der Sammelbezeichnung partikulare Kontrastmittel nicht nur die Eisenoxide mit magnetitartiger Kristallstruktur verstanden, sondern prinzipiell alle (super) paramagneti- scnen kolloidalen Losungen oder Suspensionen para-, fer-
35 ro- oder femmagnetischer Metall-enthaltender Partikel, z. B. Magnetit, Maghamit oder andere Metalloxide oder Miscnmetalloxide, Cobaltfemt oder andere Metallferrite oder Mischmetallferrite, aber auch Remeisenteilcnen und Metali-enthaltende Polymere verstanden.
Es sind zahlreiche Verfahren zur Herstellung Meta l-ent- naltender Kristalle (z. B. Magnetite) mit superparamagne- tiscnen Eigenschaften besenrieben.
Die verscniedenen Verfahren lassen sich unter unter- scniedlichen Gesichtspunkten einteilen. Die Herstellung der superparamagnetischen Metall-enthaltenden Kristalle unterscheidet dabei zwei prinzipielle Verfahren, nämlich aas Sinterverfahren mit hoher Temperatur und anschließender mechanischer Zerkleinerung und die naßchemiscne Syn- these in Losung. Für die medizinische Anwendung wurden bisher nur Partikel untersucht, die auf naßchemiscnem Wege nergestellt worden sind, wahrend das Sinterverfahren zur Herstellung von Partikeln für technische (Tonträger, Farbpigmente und Toner) und biotechnische Anwendungen wie z. B. die Magnetseparationstechnik, beschrieben wurde
[Schostek S, Beer A; DE 3,729,697 AI; Borelli NF, Luderer AA, Panzanno JN; US 4,323,056; Osamu I, Takeshi H, Tos- hihiro M et al . ; JP 60,260,463 A2]. Die naßchemische Her- stel_αng laßt sich weiter unterteilen. Bei der "Zwei- topfsyntnese" erfolgt erst die Herstellung der Partikel (Magnetit) und anschließend die Zugabe eines Stabilisators, um die physikalisch-galenische Qualltat zu gewährleisten [z. B. Lesniak C, Naß R, Schmidt H; DE 196,14,136 AI] . Eine Variante der "ZweitopfSynthese" ist die Her- Stellung der Partikel an Ionenaustauschern [Hasegawa M, Hokukoku S; US 4,101,435]. Bei der "EmtopfSynthese" erfolgt die Herstellung der Partikel m Anwesenheit des Stabilisators, der die Metallkerne schon wahrend der Pra- zipitation der Metallsalze umhüllt und so die Aggregation und Sedimentation der Partikel verhindert. Neben der Unterscheidung nach dem Herstellungsgang in "Eintopf" und "Zweitopf" Synthese kann eine Unterteilung aucn nach der Art des verwendeten Losungsmittels m wäßrige [Hasegawa M, Hokukoku S; US 4,101,435; Fuji Rebio K.K.; JP 59,195,161] und nichtwaßπge Verfahren erfolgen [Porath J, Mats L; EP 179,039 A2 ; Shigeo A, Mikio K, Tos- hikatzu M; J. Mater. Chem. 2(3); 277-280; 1992; Norio H, Saturo 0; JP 05,026,879 A2].
Partikel, die nach einem "Zweitopfverfahren" in nichtwaß- πgen Losungsmitteln hergestellt wurden, werden überwiegend m technischen Bereichen eingesetzt. Magnetische Me- tai.oxiαpartikel, die als Kontrastmittel in der Humandiagnostik verwendet werden sollen, erfordern aus mediz - niscn-toxikologischen Gründen ein wäßriges Dispersionsme- dium. Eine Sonderstellung nehmen bei dieser Einteilung die Partikel ein, die zwar m einem nichtwaßπgen Losungsmittel hergestellt wurden, sich aber nach der Herstellung m einem wäßrigen Medium stabil dispergieren lassen. Solche Partikel werden derzeit im Allgemeinen m der Ex-vivo-Diagnostik, z. B. in der magnetischen Separa- tionstechnik [Chagnon MS, Groman EV, Josephson L, et al . ; US 4,554,088], verwendet, wurden aber auch für die In- vivo-Diagnostik vorgeschlagen [Pilgrimm H; US 5,160,725].
Partikel, die nach dem "Zweitopfverfahren" hergestellt wurden, fanden hauptsächlich bei den frühen experimentellen Untersuchungen bis Mitte der 80er Jahre Verwendung, wahrend z. Zt. nur noch Untersuchungen mit Partikeln be- schrieben werden, die nach einer "Eintopfsynthese" hergestellt sind.
Aucn die Suspensionen/Losungen von Partikeln, die nach dem "Emtopfverfahren" in wäßrigen Medien hergestellt wurden, lassen sich weiter unterteilen in Partikel unterschiedlicher Große. Für die Partikel im Mikrometeroe- reich wurden biotechnische Anwendungen vorgeschlagen [Schröder U, Mosbach K; WO 83/01738 oder Schröder U; WO 83/03426] oder auch schon die In-vivo-Verwendung m der Diagnostik oder Therapie beansprucht [Widder KJ, Senyei AE; US 4,247,406 oder Jacobsen T, Klaveness J; WO
85/04330] . Für diagnostische Ansätze werden jedoch heutzutage nur noch die Partikel im Nanometerbereich oe- scnπeben. Auch der Nanometerbereich laßt sich je nach der bevorzugten Verwendung m "große" (ca. > 50 nm Ge- samtdurchmesser) und "kleine" (ca. < 50 nm Gesamtdurchmesser) Partikel unterteilen.
riauptanwendungsgebiet der großen Nanometerpartikel ist heute die Anwendung in der MR-Diagnostik von Leber und Milz, da Partikel dieser Größenordnung nach intravenöser Injektion schnell und nahezu vollständig von den Makro- phagen dieser Organe aufgenommen werden [z. B. Kresse M, Pfefferer D, Lawaczeck R; EP 516,252 A2 oder Groman EV, Josephson L; US 4,770,183]. Darüber hinaus wurden Vor- schlage für die Verwendung als Verstarkersubstanzen in der klinischen Hyperthermie gemacht [Hasegawa M, Hirose K, Hokukoku S, et al . ; WO 92/22586 AI und Gordon RT; US 4,^31,2391.
Bei vielen derzeit für medizinische Anwendungen vorgeschlagenen Partikeln handelt es sich um Eisenoxide (Magnetite), die n Anwesenheit von Dextran als Stabili- satorsubstanz hergestellt wurden [Bacic G, Niesmann MR, Magin RL et al . ; SMRM - Book of abstracts 328; 1987; Oh- gushi M, Nagayama K, Wada A et al . ; J. Magnetic Resonance 29; 599-601; 1978; Pouliquen D, Le Jeune JJ, Perdrisot R et al . ; Magnetic Resonance Imagmg 9; 275-283; 1991 oder Ferrucci JT und Stark DD; AJR 155; 311-325; 1990], be- schrieoen wurde aber auch die Verwendung anderer Polysac- charide wie Arabmogalactan [Josephson L, Groman EV, Menz E et al; Magnetic Resonance Imagmg 8; 616-637; 1990], Starke [Fahlvik AK, Holtz E, Schröder U et al; luvest. Radiol . 25; 793-797; 1990], Glycosammoglycanen rPfefferer D, Schimpfky C, Lawaczeck R; SMRM - Book of aostracts 773; 1993], oder auch von Proteinen [Widder DJ, Grief WL, Widder KJ et al . ; AJR 148; 399-404; 19871.
Die genauen Synthesebedingungen zur Herstellung von partikularen Kontrastmitteln, w e Art der Metallsalze, Temperatur, Hullpolymer (Stabilisator), Titrationsgeschwm- digkeit, Alkaliwahl, Reinigung usw. beeinflussen die c ie- misch-pnysikalischen Eigenschaften und damit die pharma- zeutisch-galenische Qualltat und letztendlich den medizinischen Nutzen.
Ein wichtiger Schritt m der Entwicklung zu einer zielgerichteteren (spezifischeren) Anwendung der partikularen Kontrastmittel geht auf Weissleder und Papisov [Weissleder R; Papisov MI; Reviews of Magnetic Resonance m Meoicme 4; 1-20; 1992] zurück, die zeigen konnten, daß die "targetability" der magnetischen Metalloxide sich umgekehrt zur Partikelgroße verhalt. Problematisch ist m diesem Zusammenhang, daß zu kleinen Partikelgroßen die Wirksamkeit (MR-Effekt) der Partikel abnimmt [z. 3. Müller RN, et al.; Proc Europ Magn Reson Forum; 1991]. Eine weitere Unterscheidungsmoglichkeit der bekannten Prapara- tionen laßt sich auch über die Komposition der Partikel vornehmen: Unterschieden werden hier monokristallme Partikel [z. B. Hasegawa M, Ito Y, Yamada H, et al.; WO94/03501], wo der Kern nur aus einem Partikel (Kristall) besteht, und polykristallme Zubereitungen [z. 3. Lewis et al. US 5,055, 288], wo jedes Partikel mehrere Kristalle, z. B. Magnetite, enthalt. Die polykristallmen Zubereitungen zeichnen sich durch hydrodynamische Parti- keldurcnmesser > 50 nm und eine hohe magnetische Wirksam- keit aus, sind aber ihrer medizinischen Verwendung bei spezifischen Ansätzen (Indikationen außerhalb von Leber und Milz) durch den Zusammenhang von Partikelgrcße und „targetablity" limitiert.
Die Herstellung besonders kleiner magnetischer Partikel ohne Fraktionierungsschπtte wurde kürzlich beschrieben X-iasegawa M, Ito Y, Yamada H, et al.; WO94/03501:. Für diese besonders kleinen Partikel, z. B. MION's, wurden auch schon Experimente zum "functional imagmg" publiziert, bei denen die Dextran-Hülle der Partikel (magnetische Label) mit Periodat oxidiert und anschließend mit spezifischen Molekülen gekoppelt wurde (Antimyosin; polyklonaler Antikörper) [Weissleder R, Lee A3, Khaw BA et al . ; Radiology 182; 381-385; 1992 oder Weissieαer R, Lee AS, Fishman A et al.; Radiology 181; 245-249; 1991] . Einen anderen Weg gehen Menz et al . Xenz ET, Rothenberg JM, Groman EV, et al . ; WO 90/01295], die große Nanometerpartikel durch Polymere (Arabmogalactan; mit physiologischen Effektorzellen umhüllen und, ebenso wie Gordon, der seine großen Dextran-stabilisierten Par- tikel mit Periodat oxidiert und dann Transferrin durch reduktive Aminierung koppelt [Gordon RT; US 4,735,796], einen spezifischen Aufnahmemechanismus über Rezeptor-ver- m ttelte Endozytose, beanspruchen.
Alle derzeit erfolgreichen Ansätze zur Erhöhung der Targetakkumulation von spezifischen Partikeln versuchen durch pnysiko-chemische Partikeloptimierung, insbesondere eine Verkleinerung hydrodynamischer Durchmesser, eine verbesserte Pharmakologie der Partikel dahingehend zu er- zielen, daß die (schnelle) Aufnahme in die Leber und Milz reduziert wird, oder vice versa, über längere Verweiizei- ten der Partikel im Blut die Wahrscheinlichkeit einer spezifischen Partikel-Rezeptor-Wechselwirkung erhöht wird. Zusätzlich werden bei kleinen Partikeln erheblich mehr Partikel injiziert, als bei einer gleichen Dosis (Masse) großer Partikel, so daß auch unter diesem Ge- Sichtspunkt kleine Partikel die statistische Wahrscheinlichkeit für eine spezifische Wechselwirkung erhohen. Dieser Ansatz muß allerdings immer dann erfolglos sein, wenn das Zieiareal besonders klein ist oder nur wenige Zie strukturen (z. B. Rezeptoren) vorhanden sind, da eine ausreicnend hohe lokale (detektierbare) Partikelkonzentration unerreichbar erscheint.
Zusammengefaßt ist die Anwendung spezifischer Partikel in der MR-Dj.agnostιk dadurch limitiert, daß aus biologischen Gründen möglichst kleine Partikel appliziert werden müssen, die wegen zu geringer lokaler Konzentration und/oder zu geringer Wirksamkeit nicht detektiert werden können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein diagnostisches Mittel zur Verfugung zu stellen, das die vorgenannten Nachteile des Standes der Technik beseitigt.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein partikuläres dia- gnostisches Mittel für die MR-Tomographie, erhältlich durch Anlagerung zell- und/oder gewebespezifischer Verbindungen als Komponente 1 an Gewebe und anschließender Umsetzung m t einer 2. Komponente, die über ein spezifisches Molekül mit der 1. Komponente interagiert .
Um eine sensitivere MR-Detektion von Partikeleffekten zu ermöglichen, stehen grundsätzlich zwei Möglichkeiten zur Ver ugung :
1. Die physikalische Wirksamkeit der partikularen Kontrastmittel (z. B. Magnetite) muß erhöht werden, oder
2. die lokale Konzentration an Kontrastmittel am biolo- gischen Ziel muß erhöht werden. Überraschend wurde nun gefunden, daß sich kleine MR- wirksame Partikel, z. B. Magnetite, gezielt aggregieren lassen und daß diese Aggregate in ihrer MR-Wirksamkeit starker sind, als es der Summe der MR-Effekte der mdivi- duellen kleinen Partikel (z. B. Magnetite) entspricht
(Cluster-Effekt ) . Wenn die Partikelaggregation durch ein zweites MR-wirksames Partikel (z. B. Magnetit) induziert wird, kommt es zusätzlich zu einer lokalen Konzentrati- onserhohung, so daß es mit den beanspruchten Mitteln mog- lieh ist, sowohl eine Wirksamkeitssteigerung der Kontrastmittel als auch eine lokale Konzentrationserhohung einem Schritt zu realisieren. Letztendlich ermöglichen die neuen diagnostischen Mittel über die synergistische Wirkung einer gesteigerten Kontrastmittelwirksamkeit bei gleichzeitiger lokaler Konzentrationserhohung eine sensitivere MR-Detektion der Partikeleffekte als nach dem bekannten Stand der Technik.
Der erste Teilschritt, die Wirksamkeitserhohung wird durch eine kontrollierte Partikelaggregation ermöglicht (Ciαster-Effekt, Abb. 1) .
In einem Volumenelement isoliert vorliegender MR- wirksamer Partikel ergibt sich die magnetische Wirksam- keit (Reiaxivitat) aus der Summe der Effekte der indivi¬ duellen Partikel. Bei einem gleichen Volumenelement iden¬ tischer Partikelkonzentration, aber aggregierter Parti¬ kel, verhalt sich dieser Partikelcluster magnetisch wie ein einziges großes Partikel. Solche großen Partikel bzw. Cluster produzieren starke lokale Magnetfelder, die sich in der MRT als lokale Magnetfeld homogenitaten sehr sen¬ sitiv abbilden lassen. Die Cluster haben dabei im Vergleich mit den homogen verteilten Partikeln - insbesondere bei suszeptibilitatsempfindlichen Meßsequenzen - eine uberproportionale MR-Wirksamkeit (Reiaxivitat). 10
Aus pharmakologischen Überlegungen können sehr große Partikel oder auch entsprechend große Partikelaggregate (Cluster) nicht direkt parenteral appliziert werden. Das erfmdungsgemaße diagnostische Mittel ermöglicht nun so- wohl die pharmakologischen Vorteile kleiner Partikel als auch die hohe physikalische Wirksamkeit großer Partikel (Reiaxivitat) in der spezifischen MR-Diagnostik auszunutzen: Kieme Partikel werden injiziert, und finden über einen spezifischen Liganden ihr biologisches Ziel (Target) . In einem zweiten Schritt erfolgt nun erst Vor- Ort lokal am Target eine gezielte Partikelaggregation. Diese aggregierten Partikel (Cluster) können mit der MRT entsprechend sensitiv abgebildet werden.
Die gezielte Partikelaggregation im biologiscnen Ziel soll dabei über eine zweite Komponente, z. B. ein zweites MR-wirksames Partikel (z. B. Magnetit) induziert werden, die spezifisch nur das erste Partikel (z. B. Magnetit) als Zielstruktur erkennt. Die zweite Komponente wird also vom ersten Partikel am Zielort festgehalten und fuhrt z. B. bei Magnetit als zweiter Komponente zur lokalen Konzentrationserhohung an MR-wirksamen Partikeln (Trappmg- Effekt, Abb. 2) . Gleichzeitig wird am Zielort durch multiple Interaktion zwischen der ersten und der zweiten Komponente e n Aggregat mit entsprechend hoher magnetischer Wirksamkeit gebildet (Cluster-Effekt ) .
Bei anderen Anwendungen, z. B. in der kontrastmittelun- terstutzten MR-Lymphographie [Kresse M, Wagner S, Taupitz M; SPIO-enhanced MR-lymphography; m: Hafeli U, Schutt W, Teller J, Zborowski M; Scientific and Clmical Applicati¬ ons of Magnetic Carriers: An Overview; Plenum Press, New York; 545-559; 1997], die sich im experimentellen Stadium befinden, ist die klinische Anwendung gegenwartig dadurch limitiert, daß nur geringe Mengen kleiner Partikel (z. B. Magnetite) mit niedriger Wirksamkeit ihr biologisches 11
Ziel (Lymphknoten) erreicnen. Eine Wirksamkeitsernohung durch gezielte Partikelaggregation konnte - bei gleicher Dosis - hier den entscheidenden Schritt zur Überführung dieser experimentellen Anwendung in die klinische Routine ermöglichen.
Neben einer erhöhten Wirksamkeit der Partikel mit den resultierenden Vorteilen m der spezifischen Diagnostik, <ann eine gezielte Partikelaggregation aber auch Probleme bei therapeutischen Ansätzen losen. Magnetite werden z. 3. a s Absorbersubstanzen in der Hyperthermiebenandlung
;on Tumoren eingesetzt. Bei dieser z. Zt. noch experimentellen Anwendung werden die Magnetite mtratumoral appli- ziert und die therapeutische Wirkung ist dadurch eingeschränkt, daß der hohe Tumorinnendruck einen großen Te l der applizierten Dosis sofort wieder aus dem Tumor herausdruckt, so daß bei der nachfolgenden Anregung nur em geringer Teil der applizierten Dosis tatsächlich m Tumorareal als Absorber zur Verfugung steht und die gewünschte Hyperthermie induziert. Eine gezielte Aggrega- tion der Magnetitpartikel im Tumor eröffnet hier die Möglichkeit, das Magnetit mechanisch im Tumor zurückzuhalten, und so die Fraktion der wirksamen Dosis zu erhohen.
D_e beanspruchten diagnostischen Mittel bestehen aus ~m- aestens zwei Komponenten.
Die erste Komponente enthalt immer em MR-wirksames Partikel uno/oder Polymer, daß die folgenden Kriterien erfüllen sollte:
1. lange Bluthalbwertszeit
2. hohe Partikelzahl
3. Spezifitat für das biologische Ziel
4. spezifische Erkennungsregion für die zweite Komponente 12
Die ersten beiden Punkte erhöhen die Wahrscheinlichkeit für eine spezifische Interaktion der ersten Komponente mit dem biologischen Ziel. Aus dem bekannten Zusammenhang zwischen „Targetability" und Partikelgröße läßt sich for- dem, das nur die sogenannten ultrakleinen superparama- gnetischen Partikel (USPIO)den pharmakologischen Anforderungen genügen; große Partikel, die schnell von Makro- phagen aufgenommen werden, stehen für eine Akkumulation am biologischen Ziel nicht mehr zur Verfügung. Die Her- Stellung und (experimentelle) Anwendung solcher kleiner Partikel (USPIO) ist heute Stand der Technik und in der wissenschaftlichen und patentrechtlichen Literatur eingehend beschrieben [z. B. Hasegawa M, Ito Y, Yamada H, et al.; WO94/03501; Weissleder R; Papisov MI; Reviews of Ma- gnetic Resonance in Medicine 4; 1-20; 1992; Weissleder R, Lee AS, Khaw BA et al . ; Radiology 182; 381-385; 1992 oder Weissleder R, Lee AS, Fishman A et al . ; Radiology 181; 245-249; 1991; Kresse M, Wagner S, Taupitz M; SPIO-enhan- ced MR-lymphography; in: Häfeli U, Schutt W, Teller J, Zborowski M; Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers : An Overview; Plenum Press, New York; 545-559; 1997] .
Ebenso wie die Herstellung der kleinen Partikel (Magnetite) ist auch die Funktionalisierung von Partikeln durch spezifische Liganden (Forderungen 3 und 4) heute als Stand der Technik anzusehen [z. B. Kresse M, Wagner S, Pfefferer D; Proceedings of the 4th Scientific Meeting of the Society of Magnetic Resonance m Medicine; ab- stract 71; 1996; Weissleder R, Lee AS, Khaw BA et al . ; Radiology 182; 381-385; 1992 oder Weissleder R, Lee AS, Fishman A et al . ; Radiology 181; 245-249; 1991; Gordon RT; US 4,735,796; Kresse M, Lawaczeck R, Pfefferer D; US 5,427,767; Menz ET, Rothenberg JM, Groman EV, et al . ; WO 90/01295; Pfefferer D, Kresse M, Platzek J; US Az 08/4^6, 116] . 13
Für die beanspruchten diagnostischen Mittel werden m einem ersten Schritt kleine MR-wirksame Partikel nach dem Stand der Technik hergestellt und dann mit bekannten Me- thoden funktionalisiert (z. B. durch das Anheften von Antikörpern oder Fragmenten, rezeptorspezifischen Proteinen oder Oligonukleotiden) . Die funktionalisierten Partikel finden nach intravenöser Injektion über die Spezifitat des Liganden in vivo ihr Ziel. Nach entsprechender Warte- zeit sind die nicht gebundenen spezifischen Partikel durch unspezifische Phagozytose durch die Leber und Milz aus dem Vasalraum eliminiert. Die spezifischen Partikel tragen zusätzlich zu ihrer targetspezifischen Komponente noch eine zweite Markierung als Erkennungsregion ( z . B. Biotin) , die wiederum hochspezifisch und mit hoher Affinit t von einer zweiten Komponente erkannt wird. Em essentielles Charakteristikum dieser zweiten Komponente ist also eine Spezifitat für die erste Komponente, die durch em komplementäres Molekulpaar ermöglicht wird (z. B. er- ste Komponente Biotin, zweite Komponente Avidm oder Streptavidm) .
In einer zweiten Injektion wird nun die zweite Komponente ιr.".zιert, die über spezifische Wechselwirkung nur mit vor Ort gebundenen Partikeln aus dem ersten Injektionsschritt interagiert (Trappmg) . Am biologischen Ziel wird durcn die Wechselwirkung der Partikel untereinander die zweite Komponente von der ersten gefangen (Trappmg) , was in einer lokalen Konzentrationserhohung resultiert. Zusätzlich kommt es durch die Wechselwirkung der ersten und der zweiten Komponente zu einer Partikelaggregation uno damit durch den Cluster-Effekt zu einer physikalischen Wirksamkeitssteigerung. Überraschend wurde bei Versuchen estgestellt, daß die Kontrastmittelwirkung der aggregierten Komponenten in der MRT deutlich großer ist als die Summe der Wirkung der Einzelkomponenten. 14
Eine besonders bevorzugte Ausfuhrungsform des erfmdungs- gemaßen diagnostischen Mittels, daß MR-wirksame Partikel und/oder Polymere enthalt, zeichnet sich dadurch aus, daß die Komponente 1 eine Zusammensetzung der allgemeinen Formel (I)
Am-(Lι)-M-(L2)-Bn (I)
und die Komponente 2 eine Zusammensetzung der allgemeinen Formel (II)
X-(L3)-C0 (II)
aufweist, wobei
A ein Molekül mit Zeil- und/oder Gewebespezifität ist , B einen Bindungspartner für C darstellt, m, n und o jeweils > 1 sind, wobei die Werte für m, n und o gleich oder unterschiedlich sein können, M ein MR-wirksames Partikel und/oder Polymer ist, X ein magnetisches oder nichtmagnetisches Eisenoxid, Metalloxid oder Metallmischoxid, Metallferrit oder Mischmetallferπt , magnetisches oder nichtmagnetisches Magnetit, ein natürliches oder synthetisches Poly- mer, ein Vesikel, Partikel oder gleich C ist,
C ein Bindungspartner für B ist,
L,, L J22 und L3 einen üblichen in der Biochemie verwendeten
Linker (Spacer) darstellen, wobei Lx, L-, und L3 gleich oder unterschiedlich sein können. 15
Weitere besonders bevorzugte Ausfuhrungsformen des erfin- dungsgemaßen diagnostischen Mittels zeichnen sich dadurch aus, daß
— der Bestandteil A
em Lectm, ein Adressin, ein Integrin, em Antigen, em Antikörper oder em Teil eines Antikörpers oder ein Kon- jugat mit einem Antikörper oder einem Teil eines Antikörpers, em Hormon oder Analogon, ein Protein, ein Peptid, Folsaure oder ein Analogon oder DNA oder RNA oder em Te l einer naturlichen oder synthetischen RNA oder DNA
der Bestandteil B oder C
zueinander komplementäre Strukturen sind oder enthalten, die bevorzugt aus den Gruppen • Lectm und Lectin-spezifische Zuckerstruktur
• Antigen und Antikörper oder Antikorperteil oder Antikorperkonjugat
• Rezeptor und Rezeptorligand
• naturliche oder synthetische DNA oder RNA oder Teile davon (Sequenzen) und die entsprechende KomplementarStruktur
• Biotin und Avidin oder Streptavidin
od«
Metallchelate und metallchelatbmdende Strukturen sind, die bevorzugt, Nickelkomplexe und 6-Histidin-enthaItende Moleküle sind oder enthalten,
— der Bestandteil M 16
em MR-wirksames Partikel und/oder Polymer ist, wobei besonders bevorzugt die Verwendung kleiner Partikel (Gesamtdurchmesser < 50 nm) ist,
— der Bestandteil X
em magnetisches oder nichtmagnetisches Eisenoxid, em Metalloxid, em Metallmischoxid, em Metallferπt oder Miscnmetallferπt , em natürliches oder synthetisches Po- lymer, em Vesikel oder Partikel oder gleich C ist. Das Partikel kann dabei aus der Gruppe der Metallkolloide, Liposomen, Cavisomen, Niosomen, Solio-Lipid-Nanopartikel, Nanokapseln, Nanopellets, Nanosuspensionen, Mikroemulsio- ner. und vorzugsweise der Magnetitpartikel, gewählt werden. Im Falle, daß X und C identisch sind, handelt es sicn um e r oifunktionales Molekül C, das optional durch einen L_hker (Spacer) verbunden ist (allgemeine Formel IV)
Cn- (L3) -Cn IV)
Um d e Wartezeit zwischen der Injektion der ersten Komponente (Zielfindung) und der zweiten Komponente Partikelaggregation) zu verkurzen, ist eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform des erfmdungsgemaßen diagnosti- scnen Mittels dadurch erhältlich, daß zwischen der ersten und der zweiten Injektion eine weitere Injektion einer dritten Komponente als „Clearing-Agent" erfolgt. Das Clearing Agent interagiert dabei mit dem nicht im Ziel gebundenen, also frei im Blutstrom zirkulierenden, Anteil an Komponente 1. Durch die Wechselwirkung zwischen der Komponente 1 und dem Clearing-Agent (Komponente 3) wird die Erkennung durch die Makrophagen von Leber und Milz stimuliert, und so die Komponente 1 aus dem Vasalraum beschleunigt eliminiert. Die bessere Erkennung durch die Makrophagen der Leber und Milz kann dabei über den Effekt aer Großenzunahme durch Bindung von Komponente 1 und Kom- 17
ponente 3 hervorgerufen sein, oder aber auch durcn einen „Makrophagenmarker" auf der Komponente 3 bedingt sein.
Die (optionale) dritte Komponente (Clearing agent) des erfmdungsgemaßen diagnostischen Mittels ist gekennzeichnet durch eine Zusammensetzung der allgemeinen Formel (V) ,
Z-(Y)P (V)
wobei
Z em Bindungspartner für A oder B ist und i eine makrophagenaffme Substanz ist, und p eine Zahl zwischen 0 und 1 bedeutet.
Als Moleküle, die die Aufnahme m Makrophagen induzieren, werden bevorzugt der Fc-Teil eines Antikörpers, oder Fi- bronectm, oder Tuftsm, oder Moleküle, die einen Komple- mentfaktor oder Teile davon darstellen oder enthalten, verwendet .
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfmdungsgemaßen diagnostischen Mittel m der MR-
Beispiele möglicher Bestandteile der Komponenten 1 bis 3 sind der folgenden Tabelle 1 dargestellt, wobei diese Beispiele nur zur Verdeutlichung dienen und nicht ein¬ schränkend wirken sollen: Tab. 1 Beispiele für Bestandteile der Komponenten 1 bis 3
Bestandteil Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3
M magnetisches magnetisches magnetisches
Partikel Partikel Partikel (z. B. Magne(z. B. Magne(z. 3. Magnetit) tit) tit)
A Anti-CEA-An- Transferrm ohne tikorper
B Biotin NiNTA Biotin
X magnetisches HιS6-Peptιd Avidm
Partikel (z. B. Magnetit) c Avidm HiSδ-Peptid optional optional optional z Dextranpolymer Hιs6-Peptιd Avidm
Figure imgf000020_0001
Y CE-Antigen Fibronectm
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele naher erläutert.
3eιspιel 1 Herstellung eines Modellsystems. Beispiel 2 Nachweis der kontrollierten Partikelaggre gation
Beispiel 3 Nachweis der MR-Wirksamkeitssteigerung durch eine kontrollierte Partikelaggrega tion (Cluster-Effekt)
Beispiel 1 Modellsystem
Für die Demonstration des Cluster-Effekts wurde em Modellsystem aus biotmylierten Dextranmagnetiten und Avi¬ dm gewählt (Abb. 3) . Als Magnetite wurden sogenannte Dextran-stabilisierte Magnetite nach dem Stand der Technik hergestellt [Hasegawa M, Ito Y, Yamada H, et al . ; 19
WO94/03501]. Das Biotm-Avidm-System wurde gewanlt, Λ/eil die Bindungskonstante Biotm-Avidm sehr hoch ist 'ca. 10~i3) und das Avidm vier Bindungsstellen für Biotin besitzt, so daß eine interpartikulare Vernetzung (Clusterung) möglich ist. Die Biotmylierung der Dextran- magnetite erfolgte dabei nach folgendem Schema:
1. 2 ml Magnetit (1 Mol Fe/L) werden in em Packard Vi- al gegeben (mit Magnetruhrer ) 2. Anschließend werden 200 ± 5 mg Natπumpeπcdat (Natπumtetroxoiodat ) als Substanz zugegeben
3. Es wird für 30 mm bei Raumtemperatur gerührt
4. Wahrend der Reaktion wird eine PD-10 Säule
Pharmacia) aquilibπert (mit ca. 25 ml Wasser) 5. Die Periodat-oxidierte Magnetitlosung wird auf die PD-10 Säule aufgetragen und einsickern gelassen. Es wird mit Wasser eluiert, bis kein Magnetit mehr kommt (in em Packard Vial) . Die Chromatographie dient dazu, entstandenes Iodat, überschüssiges Peπ- odat, sowie freies Dextran zu entfernen.
6. Das oxidierte Magnetit wird anschließend mit 5 ± 1 mg Biotmamidocaproyl-hydrazid (Sigma Chemicals) umgesetzt . Nach einer Reaktionszeit von 30 mm bei Raumtempera- tur wird die Reaktion mit ca. 50 mg l-Ammo-2 , 3-pro- pandiol gestoppt. 8. Die Reaktionszeit ist 1 Stunde. Die Reinigung er¬ folgt wiederum über eine PD-10 Säule (m 2 Portionen; . 9. Die Eluate werden vereinigt, und über 0,22 um Filter m em Vial gefüllt.
Analytische Kennzahlen zu den biotmylierten Magnetiten sind m der nachfolgenden Tab. 2 zusammengefaßt. 20
Tab. 2: Analytische Kcnnz-ihlen zu den Modcllpartikeln (Biolin-Magnclile)
Charge: MRL 97272 MRL 97275 MRL 97279
hergestellt aus: DDM 43/34 DDM 128/N422 DDM 3/26
Patenlbeispiel* Example 1 Comparativc Example 10
Fe fmmol/^1
PCS-Größc [nm
Reiaxivitat ((
Bioti
Die Angaben beuchen sich auf die Bezeichnungen in der Patentschrift Hasegaw, M. Ito Y. Yaπiada H. et ■ O94 03S0I
Beispiel 2: Nachweis der Partikelaggregation
Es wurde eine Versuchsreihe hergestellt, bei der die Durchmesser der Ξiot -Magnetite (s. Tab. 2) in An- unα Abwesenheit von Avidm mit der Photonenkorrelat lonsspe k- troskopie (PCS) bestimmt wurden. Zur Kontrolle wurden auch die nichtbic inylierten Dextranmagne ite vermessen. Die Ergebnisse sind in der Abb. 4 dargestellt.
Mit der Photonenkorrelationsspektroskopie kann gezeigt werden, daß der Zusatz von Avidm zu Biotinmagnetiten mit einer dramatischen Partikelvergrößerung einhergeht, die nur durch eine Vernetzung (Clusterung) erklärt werden kann. Avidinzusatz zu Magnetiten ohne Biotmmarkierung fuhrt zu keiner Änderung der Partikelgröße. Eine kontrollierte Partikelaggregation (Clusterung) ist damit nachgewiesen .
In einem zweiten Experiment wurde die Kinetik der avi- iinmαuzierten Aggregation am Beispiel von MRL 97272 un¬ tersucht. Diese Kine kstudien sollen zeigen, nach we - 21
eher Wartezeit (Inkubationszeit) die Partikelaggregation auftritt. Die Zugabe von Avidm erfolgte on-lme wahrend der Messung, wobei als Maß für die Partikelgroße die Si- gnalmtensitat im Photonenkorrelationsspektrometer aufge- zeichnet wurde. Em typisches Ergebnis zeigt Abb. 5.
Die "emetischen Untersuchungen haben gezeigt, daß die Clusterung im Bereich von Sekunden eintritt.
Beispiel 3. Nachweis des Cluster-Effekts Zum Nachweis einer gesteigerten MR-Wirksamkeit der Cluster gegenüber den vereinzelten Partikeln wurden Phantommessungen an einem Siemens Vision (1,5 < MR-Tomographen durchgeführt. Neben einer suszeptibintatsbetonten FLASH 2D Meßtecnni wurden Spin-Echo Seguenzen mit Tl und T2- Wicntung verwendet.
FLASH 2D
Die Ergebnisse zur MR-Tomographie mit der suszeptibili- tatsempfmdlichen FLASH 2D Sequenz [TR = 500 ms, TE = 4 bis 20 ms, FA = 90°] und den Modellsubstanzen sind in der Abbildung 6 zusammengefaßt. Bei diesen Messungen wurde nur die Magnetitkonzentration variiert, wahrend die Avi- ammenge Konstant gehalten wurde (100 ^1, ca. 3 μg Avi- αiπ . In einer zweiten Serie wurde dann bei konstanter Magnetitmenge (0,5 mmol £' 1 ) dιe Avidmkonzentration von 0 bis 500 ul (0 bis ca. 15 μg Avidm) variiert (Abb. 7) .
Spin-Echo Sequenzen
Exemplarische Ergebnisse zu den Spm-Ecno Meßtecnniken fm die Ti-Wichtung [TR = 50 bis 2500 ms, TE = 12 ms) und die T2-Wιchtung [TR = 2500 ms, TE = 22,5 bis 360 ms] sind m den Abbildungen 8 und 9 gezeigt. Abbildung 8 demon¬ striert Tl-Effekte am Beispiel MRL 97272 und Abbildung 9 T2-Ξffekte f r MRL 97279. 22
Reiaxivitat
Zur Quantifi zierung des Cluster-Ef f ekts wurden die Signalmtensitaten ( SI ) nach
( -TE^ ( -TR
SI = N(H) T2 1 - e τι
V J J
S I = Signalmtensitat
N ( H ) = Protonendichte
TR = Repetitions zeit
TE = Echozeit
Tl = Spm-Gitter-Relaxat ons zeit
T2 = Spm-Spm-Relaxations zeit
Tl und T2 bzw. T2* aufgelost und die Relaxationszeiten bestimmt. Die Relaxationsraten (1/T1, bzw. 1/T2 oder 1/T2* wurden dann gegen die Eisenkonzentrationen aufge- tragen. Die lineare Anpassung an die Meßpunkte liefert eine Gerade, deren Steigung em konzentrat onsunabhangi- ges Maß für die MR-Wirksamkeit ist (Reiaxivitat) . Die Ergebnisse für die FLASH 2D Sequenz (T2*-Relaxιvιtat ) für em kleines Magnetit (MRL 97279) und em großes Magnetit (MRL 97275) sind in Abbildung 10 zusammengefaßt.
Insbesondere bei der suszeptibilitatsempfmdlicnen FLASH 2D Sequenz zeigt sich m den Proben mit Avidm gegenüber Proben gleicher Konzentration, aber ohne Avidm, eine Re- duktion der Signalmtensitat - die Wirksamkeit oer Kontrastmittel ist damit gegenüber den Proben ohne Avidm erhöht und der Cluster-Effekt nachgewiesen. Die beobachteten Effekte nehmen dabei mit zunehmender T2*-Wιchtung zu den längeren TE-Zeiten zu. Bei den Experimenten zum Einfluß der Avidmmenge auf die Signalmtensitaten zeigt sich, daß im untersuchten Konzentrationsbereich (0 - 15 μg Avidm) bei den kleinen Magnetiten (MRL 97272 und MRL 97279) die Wirksamkeit mit der Avidmmenge und zu längeren TE-Zeiten zunimmt. Beim größeren MRL 97275 scheint 23
em optimaler Konzentrationsbereich für den Aviamzusatz bei 100 bis 300 μl zu liegen; höhere Avidmkonzentratio- nen fuhren zu einer Signalanhebung. Die bei der FLASH 2D beobachteten Cluster-Effekte werden auch bei der Spm- Echo Sequenz mit der T2-Wιchtung gefunden, wobei aie relative Absenkung der Signalmtensitat (+ Avidm/ -Avidm* 100) für MRL 97272 und MRL 97275 geringer ist als bei der T2*-3equenz. Im Gegensatz dazu ist bei der Charge mit der besonders niedrigen Ausgangsrelaxivitat (MRL 9^2"'9, r2 = 17 f mmol'1 s"1) der relative Signaleffekt bei der T2-
Wichtung großer als bei der T2*-Meßtechnιk . Bei Messungen mit Tl-betonten Meßsequenzen zeigt sich im Bereich geringer Eisenkonzentration em Cluster-Effekt, der aoer bei noneren Konzentrationen nicht mehr beobachtet wird. Im Relaxationsraten-Konzentrations-Diagramm (Abb. 10) spiegeln sich die visuellen Befunde aus der Betrachtung der MRT Bilder wieder: Die Meßpunkte m Anwesenheit -on Avidm liegen über den Werten ohne Avidmzusatz und demonstrieren damit die dramatisch gesteigerte Wirksamkeit (Reiaxivitat steigt von 120 auf 240) .

Claims

24
Patentansprüche
1. Partikel und/oder Polymere enthaltende diagnostische Mittel, erhältlich durch Anlagerung zell- und/oder gewebespezifischer Verbindungen als Komponente 1 an
Gewebe und anschließender Umsetzung mit einer 2. Komponente, die über ein spezifisches Molekül mit der 1. Komponente interagiert .
2. Partikel und/oder Polymere enthaltende diagnostische Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente 1 eine Zusammensetzung der allgemeinen Formel (I)
Am-(L1)-M-(L2)-Bn (I)
und die Komponente 2 eine Zusammensetzung der allgemeinen Formel (II)
X-(L3)-CC (II)
aufweist, wobei
A ein Molekül mit Zeil- und/oder Gewebespezifität ist,
B einen Bindungspartner für C darstellt, m, n und o jeweils > 1 sind, wobei die Werte für m, n und o gleich oder unterschiedlich sein können, M ein magnetisches (MR-wirksames) Partikel und/oder metallenthaltendes Polymer ist, X ein magnetisches oder nichtmagnetisch.es Eisenoxid, Metalloxid, Metallmischoxid, Metallferrit oder Mischmetallferrit, magnetisches oder nicht -magnetisches Magnetit, ein natürliches 25
oder synthetisches Polymer, ein Vesikel, Partikel oder gleich C ist, C ein Bindungspartner für B ist,
_ι: , L2 und L, einen üblichen in der Biochemie verwendeten
Linker (Spacer) darstellen, wobei 17 L2 und L3 gleich oder unterschiedlich sein können.
3. Partikel und/oder Polymere enthaltende diagnostische Mittel nach Anspruch 1 oder 2, erhältlich dadurch, daß vor der Umsetzung mit der 2. Komponente die nicht gebundenen Partikel der Komponente 1 mit einer 3. Komponente umgesetzt werden.
4. Partikel und/oder Polymere enthaltende diagnostische Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente 3 eine Zusammensetzung der allgemeinen Formel (III)
Z-(Y). III
aufweist, wobei
Z einen Bindungspartner für A oder B darstellt, Y eine makrophagenaffine Substanz darstellt und o eine Zahl zwischen 0 bis 1 bedeutet.
Partikel und/oder Polymere enthaltende diagnostische Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß A ein Lectin, ein Adressin, ein Integrin, ein Antigen, ein Antikörper oder einem Teil eines Antikörpers, ein Hormon oder Analogon, ein Protein, ein Peptid, Folsäure oder ein Analogon oder DNA oder RNA 26
oder ein Teil einer natürlichen oder synthetischen RNA oder DNA darstellt.
6. Partikel und/oder Polymere enthaltende diagnostische Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß B und C komplementäre Strukturen sind oder enthalten.
7. Partikel und/oder Polymere enthaltende diagnostische Mittel nach Anspruch 1, 2 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die komplementären Strukturen Lectin, Lectin-spezifische Zuckerstruktur, Antigen, Antikörper, Antikörperteil , Antikörperkonjugat ,
Rezeptor, Rezeptorligand, natürliche oder synthetische DNA oder RNA, Teile davon (Sequenzen) und die entsprechende Komplementärstruktur, Biotin, Avidin, Streptavidin, oder Metallchelate und metallchelatbindende Strukturen sind oder enthalten.
8. Partikel und/oder Polymere enthaltende diagnostische Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die komplementären Strukturen Nickelkomplexe und 6- Histidin-enthaltende Moleküle sind oder enthalten.
9. Partikel und/oder Polymere enthaltende diagnostische Mittel nach Anspruch 1, 2, 5, 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß X magnetische oder nichtmagnetische Eisenoxidpartikel, Metallkolloide, Metalloxide, Mischmetalloxide, Reinmetalle, Liposomen, Cavisomen, Niosomen, Solid-Lipid-Nanopartikel , Nanokapseln, Nanopellets, Nanosuspensionen, andere Nanopartikel oder Mikroemulsionen darstellt. 27
10. Partikel und/oder Polymere enthaltende diagnostische Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Y ein die Aufnahme in Makrophagen induzierendes Molekül darstellt.
11. Partikel und/oder Polymere enthaltende diagnostische Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß Y den Fc-Teil eines Antikörpers, Fibronectin, Tuftsin oder einen Komplementfaktor oder ein Opsonin oder Teile davon darstellt oder enthält.
12. Verwendung der Partikel und/oder Polymere enthaltenen diagnostischen Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in der MR-Diagnostik .
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