DE60129007T2 - Vermehrung des weich- sowie des knochengewebes anhand von aus muskeln stammenden vorläuferzellen, sowie damit verbundene zusammensetzungen und behandlungsformen - Google Patents

Vermehrung des weich- sowie des knochengewebes anhand von aus muskeln stammenden vorläuferzellen, sowie damit verbundene zusammensetzungen und behandlungsformen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft muskelderivierte Vorläufer-(oder Stamm-)Zellen (MDC oder MDSC) und Zusammensetzungen von MDC und ihre Verwendung bei der Verstärkung von Körpergeweben, besonders von Weichteilgeweben und Knochen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung muskelderivierte Vorläuferzellen, die nach der Einführung in Weichteilgewebe und Knochen eine Langzeitüberlebensfähigkeit zeigen, Verfahren zum Isolieren von MDC und Verfahren unter Verwendung von MDC-enthaltenden Zusammensetzungen zur Verstärkung von menschlichen oder tierischen Weichteilgeweben und Knochen, die Epithel-, Fett-, Nerven-, Organ-, Muskel-, Ligament- und Knorpelgewebe umfassen. Die Erfindung betrifft auch neue Verwendungen muskelderivierter Vorläuferzellen zur Behandlung von kosmetischen und funktionellen Zuständen wie beispielsweise dermatologischen Zuständen, gastroösophagialem Rückfluss, vesikoureteralem Rückfluss, Harninkontinenz, Stuhlinkontinenz, Skelettmuskelschwäche, Herzversagen und mit Myokardinfarkt verbundene Verletzung oder Schwache.
  • Die Verstärkung von Weichteilgewebe unter Verwendung von synthetischen Materialien, wie beispielsweise Silikon oder Polytetrafluorethylen (PTFE), ist auf dem Gebiet wohlbekannt. Das Arnett erteilte US-Patent Nr. 5,876,447 offenbart die Verwendung von Silikonimplantaten zur plastischen Gesichtschirurgie. Solche synthetischen Materialien sind für das Wirtsgewebe jedoch fremd und verursachen eine immunologische Reaktion, die zur Einkapselung des Implantates und zum Vernarben der umgebenden Gewebe führt. Somit kann das Implantat zusätzliche funktionelle oder ästhetische Probleme hervorrufen.
  • Die Verstärkung von Weichteilgewebe unter Verwendung von Biopolymeren wie beispielsweise Kollagen oder Hyaluronsäure wurde ebenfalls beschrieben. Zum Beispiel offenbart das Wallace et al. erteilte US-Patent Nr. 4,424,208 Verfahren zum Verstärken von Weichteilgewebe unter Verwendung von Implantatmaterialien aus Kollagen. Darüber hinaus offenbart das della Valle et al. erteilte US-Patent Nr. 4,965,353 Ester von Hyaluronsäure, die bei der kosmetischen Chirurgie verwendet werden können. Diese Biopolymere sind für das Wirtsgewebe jedoch ebenfalls fremd und verursachen eine immunologische Reaktion, die zur Reabsorption des injizierten Materials führt. Biopolymere sind daher nicht in der Lage, eine langfristige Gewebeverstärkung bereitzustellen. Insgesamt war die Verwendung von Biopolymeren oder synthetischen Materialien zum Zwecke des Verstärkens von Weichteilgewebe völlig unzufriedenstellend.
  • Die Weichteilgewebeverstärkung unter Verwendung von zellbasierten Zusammensetzungen wurde ebenfalls entwickelt. Das Boss, Jr. erteilte US-Patent Nr. 5,858,390 offenbart die Verwendung von autologen Hautfibroblasten für die Behandlung von kosmetischen und ästhetischen Hautdefekten. Obwohl diese Behandlung die bei der Implantation oder Injektion von synthetischen Materialien oder Biopolymeren inhärenten Probleme vermeidet, führt sie zu anderen Komplikationen. Weil Fibroblasten Kollagen produzieren, können die Zellen das Versteifen und die Verzerrung der die Implantatstelle umgebenden Gewebe verursachen.
  • Die Verwendung von autologen Fettzellen als injizierbares Verdickungsagens wurde ebenfalls beschrieben (als Übersichtsartikel siehe K. Mak et al., 1994, Otolaryngol. Clin. North. Am. 27:211-22; American Society of Plastic and Reconstructive Surgery: Report an autologous fat transplantation by the ad hoc committee an new procedures, 1987, Chicago: American Society of Plastic and Reconstructive Surgery; A. Chaichir et al., 1989, Plast. Reconstr. Surg. 84: 921-935; R. A. Ersek, 1991, Plast. Reconstr. Surg. 87:219-228; H. W. Hori et al., 1991, Ann. Plast. Surg. 26:248-258; A. Nguyen et al., 1990, Plast. Reconstr. Surg. 85:378-389; J. Sartynski et al., 1990, Otolaryngol. Head Neck Surg. 102:314-321). Die Fetttransplantationsprozedur stellt jedoch nur eine vorläufige Verstärkung bereit, weil injiziertes Fett im Wirt reabsorbiert wird. Darüber hinaus kann das Fetttransplantieren zur Bildung von Knötchen und zu einer Asymmetrie von Gewebe führen.
  • Myoblasten, die Vorläufer von Muskelfasern, sind einkernige Muskelzellen, die fusionieren, um post-mitotische vielkernige Myotubuli zu bilden, die eine Langzeitexpression und -abgabe von bioaktiven Proteinen bereitstellen können (T. A. Partridge und K. E. Davies, 1995, Brit. Med. Bulletin 51:123-137; J. Dhawan et al., 1992, Science 254:1509-12; A. D. Grinnell, 1994, Myology 2. Ausg., A. G. Engel und C. F. Armstrong, McGraw-Rill, Inc., 303-304; S. Jiao und J. A. Wolff, 1992, Brain Research 575:143-7; H. Vandenburgh, 1996, Human Gene Therapy 7:2195-2200).
  • Kultivierte Myoblasten enthalten eine Subpopulation von Zellen, die einige der Selbsterneuerungseigenschaften von Stammzellen zeigen (A. Baroffio et al., 1996, Diifferentiation 60:47-57). Solchen Zellen misslingt es, Myotubuli zu bilden, und sie teilen sich nicht, wenn sie nicht separat kultiviert werden (A. Baroffio et al., oben). Untersuchungen über die Myoblastentransplantation (siehe unten) zeigten, dass die Mehrzahl der transplantierten Zellen schnell abstirbt, während eine Minderheit überlebt und die Bildung neuer Muskeln vermittelt (J. R. Beuchamp et al., 1999, J. Cell Biol. 144:1113-1122). Diese Minderheit von Zellen zeigt ein distinktes Verhalten, einschließlich des langsamen Wachstums in einer Gewebekultur und des schnellen Wachstums nach einer Transplantation, was nahe legt, dass diese Zellen Myoblasten-Stammzellen darstellen können (J. R. Beauchamp et al., oben).
  • Myoblasten wurden in der Gentherapie als Vehikel bei der Behandlung von verschiedenen Muskel- und nicht Muskeln betreffenden Störungen verwendet. Zum Beispiel wurde die Transplantation genetisch modifizierter oder nicht modifizierter Myoblasten zur Behandlung von Duchenne'scher Muskeldystrophie verwendet (E. Gussoni et al., 1992, Nature, 356:435-8; J. Huard et al., 1992, Muscle & Nerve, 15:550-60; G. Karpati et al., 1993, Ann. Neurol., 34:8-17; J. P. Tremblay et al., 1993, Cell Transplantation, 2:99-112; P. A. Moisset et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 247:94-9; P. A. Moisset et al., 1998, Gene Ther. 5:1340-46). Zusätzlich wurden Myoblasten genetisch verändert, um Proinsulin zur Behandlung von Typ 1-Diabetes (L. Gros et al., 1999, Hum. Gen. Ther. 10:1207-17); Faktor IX zur Behandlung von Hämophilie B (M. Roman et al., 1992, Somat. Cell. Mol. Genet. 18:247-58; S. N. Yao et al., 1994, Gen. Ther. 1:99-107; J. M. Wang et al., 1997, Blood 90:1075-82; G. Hortelano et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10:1281-8), Adenosindeaminase zur Behandlung des Adenosindeaminasemangel-Syndroms (C. M. Lynch et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1138-42), Erythropoietin zur Behandlung von chronischer Anämie (E. Regulier et al., 1998, Gene Ther. 5:1014-22; B. Dalle et al., 1999, Gene Ther. 6:157-61) und menschliches Wachstumhormon zur Behandlung von Wachstumsverzögerung herzustellen (K. Anwer et al., 1998, Hum. Gen. Ther. 9:659-70).
  • Myoblasten wurden auch verwendet, um Schäden oder Krankheiten des Muskelgewebes zu behandeln, wie in dem Law et al. erteilten US-Patent Nr. 5,130,141 , in dem Blau et al. erteilten US-Patent Nr. 5,538,722 und der von Chancellor et al. am 30. April 1999 eingereichten Anmeldung mit der US-Seriennummer 09/302,896 offenbart ist. Darüber hinaus wurde die Myoblastentransplantation zur Reparatur von myokardialer Funktionsstörung verwendet (C. E. Murry et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:2512-23; B. Z. Atkins et al., 1999, Ann. Thorac. Surg. 67:124-129; B. Z. Atkins et al., 1999, J. Heart Lung Transplant. 18:1173-80).
  • Trotz des Vorstehenden waren primäre myoblastenderivierte Behandlungen in den meisten Fällen aufgrund von Migration und/oder Phagozytose mit geringen Überlebensraten der Zellen nach einer Transplantation verbunden. Um dieses Problem zu umgehen, offenbart das Atala erteilte US-Patent 5,667,778 die Verwendung von in einem flüssigen Polymer wie beispielsweise Alginat suspendierten Myoblasten. Die Polymerlösung wirkt wie eine Matrix, um zu verhindern, dass die Myoblasten nach der Injektion migrieren und/oder Phagozytose durchlaufen. Jedoch zeigt die Polymerlösung die gleichen Probleme wie die oben diskutierten Biopolymere. Weiterhin ist das Atala-Patent auf die Verwendungen von Myoblasten ausschließlich in Muskelgewebe beschränkt, aber in keinem anderen Gewebe.
  • Daher besteht ein Bedarf nach weiteren, anderen Materialien zur Verstärkung von Weichteilgewebe, die langlebig und mit einer großen Bandbreite an Wirtsgeweben kompatibel sind, und eine minimale Entzündung, Vernarbung und/oder ein minimales Versteifen der die Implantatstelle umgebenden Gewebe bewirken. Dementsprechend werden die muskelderivierte Vorläuferzellen enthaltenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als verbesserte und neue Materialien zum Verstärken von Weichteilgeweben bereitgestellt. Weiterhin werden Verfahren zum Herstellen von Zusammensetzungen muskelderivierter Progenitorzellen bereitgestellt, die nach der Transplantation ein Langzeitüberleben zeigen, sowie Verfahren, die MDC und MDC enthaltenden Zusammensetzungen verwenden, um verschiedene ästhetische und/oder funktionelle Defekte zu behandeln, einschließlich, z. B., dermatologische Zustände oder Verletzungen, und Muskelschwäche, -verletzungen, -krankheit oder -funktionsstörungen.
  • Es ist bemerkenswert, dass frühere Versuche, Myoblasten zur Verstärkung von anderem Gewebe als Muskelteilweichgewebe zu verwenden, erfolglos blieben (das Atala erteilte US-Patent Nr. 5,667,778 ). Daher sind die hierin offenbarten Erkenntnisse unerwartet, weil sie zeigen, dass die muskelderivierten Vorläuferzellen gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgreich in Muskelweichteilgewebe und in Nicht-Muskelteilweichgewebe, einschließlich Epithelgewebe, transplantiert werden können und ein Langzeitüberleben zeigen. Als Ergebnis können MDC und MDC umfassende Zusammensetzungen als allgemeines Verstärkungsmaterial zur Verstärkung für Muskelweichteilgewebe und Nicht-Muskelweichteilgewebe genauso wie zur Knochenherstellung verwendet werden. Da die muskelderivierten Vorläuferzellen und die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung aus autologen Quellen stammen können, tragen sie darüber hinaus ein verringertes Risiko von immunologischen Komplikationen im Wirt in sich, einschließlich der Reabsorption von Verstärkungsmaterialien, und der Entzündung und/oder des Vernarbens des die Implantationsstelle umgebenden Gewebes.
  • Obwohl mesenchymale Stammzellen in verschiedenen Bindegeweben des Körpers gefunden werden können, einschließlich Muskel, Knochen, Knorpel etc. (H. E. Young et al., 1993, In Vitro Cell Dev. Biol. 29A:723-736; H. E. Young et al., 1995, Dev. Dynam. 202:137-144), wurde der Begriff mesenchymal historisch verwendet, um eine Klasse von Stammzellen zu bezeichnen, die aus Knochenmark, und nicht aus Muskel, gereinigt wurden. Somit unterscheiden sich mesenchymale Stammzellen von den muskelderivierten Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung. Darüber hinaus exprimieren mesenchymale Zellen nicht den CD34-Zell-Marker (M. F. Pittenger et al., 1999, Science 284:143-147), der von den hierin beschriebenen muskelderivierten Vorläuferzellen exprimiert wird.
  • Ein wesentliches Problem bei der Zelltherapie ist das geringe Überleben und die beschränkte Ausbreitung der injizierten Zellen, genau so wie die Immunabstoßung von Spenderzellen durch Empfänger (Y. Fan et al., 1996, Muscle & Nerve, 19:853-860). Muskelderivierte Stammzellen (MDSC oder MDC), wie sie von der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, zeigen die Fähigkeit der Selbsterneuerung und Langzeitproliferation, wenn sie bei Zelltransplantationstherapien verwendet werden, um Massenweichteilgewebe und Knochen zu verstärken und zu verdicken. Sowohl autologe als auch allogene Zellen dieser Erfindung können wirkungsvolle Zelltherapien für die beschriebenen Störungen oder Zustände bereitstellen. Zusätzlich können solche Zellen die Effizienz einer Zelltherapie bei schwer erkrankten Muskeln verbessern.
  • In einem ersten Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben, und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken des ösophagealen Muskelgewebes oder gastroösophagealen Muskelgewebes in einem Säuger, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um das ösophageale oder gastroösophageale Muskelgewebe zu verstärken oder zu verdicken.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine Verwendung einer Zusammensetzung bereitgestellt umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben, und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken des Sphinktermuskelgewebes bei einem Säugetier, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um das Sphinktermuskelgewebe zu verstärken oder zu verdicken.
  • In einem dritten Aspekt der Erfindung wird eine Verwendung einer Zusammensetzung bereitgestellt umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben, und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken von Gewebe ausgewählt aus Blasen-, Harnröhren- oder Harnröhrenmuskelgewebe bei einem Säuger, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um das Blasen-, Harnröhren- oder Harnröhrenmuskelgewebe zu verstärken oder zu verdicken.
  • Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung wird eine Verwendung einer Zusammensetzung bereitgestellt umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben, und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken einer kosmetischen oder ästhetischen Weichteilgewebedefektstelle bei einem Säugetier, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um die kosmetische oder ästhetische Defektstelle zu verstärken oder zu verdicken.
  • In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung eine Verwendung einer Zusammensetzung bereit umfassend (i) isolierte, Demsin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben, und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken von Gewebe umfassend eine oder mehrere Hautvertiefungen, Wunden, Risse oder Öffnungen bei einem Säuger, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um die Hautvertiefung, Wunde, den Riss oder die Öffnung zu verstärken oder zu verdicken.
  • Gemäß einem sechsten Aspekt der Erfindung wird eine Verwendung einer Zusammensetzung bereitgestellt umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskeldervierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben, und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken von Muskelgewebe bei einem Säuger, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um das Muskelgewebe zu verstärken oder zu verdicken, wobei das Muskelgewebe ausgewählt ist aus (a) Verdauungsgewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Magen-, Darm-, Zungen-, Speiseröhren-, Magenkranz- und Analgewebe; (b) Geschlechtsorgangewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gebärmutter-, Vaginal-, Klitoris-, Eileiter-, Gebärmutterhals-, Penis- und Samenleitergewebe; (c) urologischem Gewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Niere, Blase, Harnröhre, ureterischem und Sphinktergewebe; oder (d) Atemwegsgewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Luftröhren- oder Lungengewebe.
  • In einem siebten Aspekt der Erfindung wird eine Verwendung einer Zusammensetzung bereitgestellt umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben, und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken von (a) Nicht-Muskelweichteilgewebe oder (b) Nicht-Muskel-Nichtknochenweichteilgewebe bei einem Säuger, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um (a) das Nicht-Muskelgewebe oder (b) das Nichtknochen-Nichtmuskelgewebe zu verstärken oder zu verdicken.
  • Gemäß einem achten Aspekt der Erfindung wird eine Verwendung einer Zusammensetzung bereitgestellt umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben, und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Wiederherstellen oder Verbessern der Kontraktilität glatter Muskeln, wobei der glatte Muskel ein Magen-Darm-Muskel ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem glatten Speiseröhrenmuskel, glatten Magenmuskel, glatten Magenkranzmuskel und glatten Darmmuskel; und wobei des weiteren die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um die Kontraktilität des glatten Muskels wiederherzustellen oder zu verbessern.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung in einem jeden ihrer verschiedenen Aspekte sind wie unten beschrieben oder wie in den Unteransprüchen definiert.
  • Die 1A-1F veranschaulichen die Ergebnisse einer Weichteilgewebeverstärkung bei Verwendung von Injektionen von MDC-Zusammensetzungen verglichen mit einer Injektion von herkömmlichem Rinderkollagen. Bei den 1A-1F wurde entweder MDC (1D-1F) oder Kollagen (1A-1C) in die Haut der Bauchwand injiziert. Der Bereich der Injektion war der Grenzbereich zwischen der Dermis und dem subkutanen Bindegewebe, das die Haut ist. Die 1A-1F zeigen Trichromfärbung bei 40-facher Vergrößerung nach der Injektion von entweder Kollagen oder MDC in die Haut. 5 Tage, 2 Wochen oder 4 Wochen nach der Injektion wurden Gewebeproben erhalten und zur Analyse vorbereitet. Die 1A und 1D zeigen die Ergebnisse der MDC-Injektion verglichen mit der Kollagen-Injektion in die Haut 5 Tage nach der Injektion; die 1B und 1E zeigen die Ergebnisse 2 Wochen nach der Injektion, und die 1C und 1F zeigen die Ergebnisse 4 Wochen nach der Injektion. Die Pfeilspitzen in den 1D-1F zeigen die Gegenwart von MDC in den injizierten Gebieten (tiefrosa Farbe). Die 1A-1F zeigen, dass nach der Injektion in den subkutanen Bereich MDC überdauerten und das subkutane Gewebe der Abdominalwand für bis zu mindestens 4 Wochen aufrechterhielten/verstärkten, während Kollagen nicht 2 Wochen nach der Injektion in die Haut überdauerte (Beispiel 3).
  • Die 2A und 2B veranschaulichen die Ergebnisse der Verstärkung des Weichteilgewebes des unteren Ösophagus (2A) und des Analsphinkters (2B) unter Verwendung der Injektionen von MDC-Zusammensetzungen. Die Injektionen wurden in die gastroösophagiale Verbindung oder in den analen Sphinkter vorgenommen. 3 Tage nach der Injektion wurden Gewebeproben erhalten und zur Analyse vorbereitet. MDC sind durch β-Galactosidase-Färbung angezeigt. 2A zeigt injizierte Gewebe bei 100-facher Vergrößerung; 2B zeigt injizierte Gewebe bei 40-facher Vergrößerung. Die 2A und 2B zeigen, dass MDC-Injektionen die Weichteilgewebeverstärkung des unteren ösophagialen Sphinkters und des Analsphinkters für bis zu 3 Tage nach der Injektion aufrechterhielten.
  • Die 3A und 3B veranschaulichen die Ergebnisse der Weichteilgewebeverstärkung der Blasen-Harnleiter-Verbindung unter Verwendung von Injektionen von MDC-Zusammensetzungen. Die Injektionen wurden in die vesico-ureterale Verbindung vorgenommen. 3 Tage nach der Injektion wurden Gewebeproben erhalten und zur Analyse vorbereitet. MDC sind durch β-Galactosidase-Färbung angezeigt, wie nahe dem Pfeil gesehen. 3A zeigt injizierte Gewebe bei niedriger (40-facher) Vergrößerung; 3B zeigt injizierte Gewebe bei hoher (100-facher) Vergrößerung. Die 3A und 3B zeigen, dass MDC-Injektionen die Weichteilgewebeverstärkung der Blasen-Harnleiter-Verbindung für bis zu 3 Tage nach der Injektion aufrechterhielten.
  • Die 4A und 4B veranschaulichen die Behandlung einer Kälteverletzung der Blase unter Verwendung von Weichteilgewebeinjektionen von MDC-Zusammensetzungen. Die Injektionen wurden in die Blasenwand an der Stelle der Kälteverletzung vorgenommen. 30 Tage nach der Injektion wurden Gewebeproben erhalten und für die Färbung vorbereitet. Die Pfeile zeigen die Stelle der Kälteverletzung und der MDC-Injektion. Die Vergrößerung ist 100-fach. 4A zeigt unbehandeltes kältegeschädigtes Blasengewebe. Die 4B zeigt kältegeschädigtes Blasengewebe, das mit MDC-Injektionen behandelt ist; MDC werden durch β-Galactosidase-Färbung angezeigt. Die 4A und 4B zeigen, dass MDC-Injektionen die Weichteilgewebeverstärkung des kältegeschädigten Blasengewebes bis zu 30 Tage nach der Injektion aufrechterhielten.
  • Die 5A-5I veranschaulichen die zelluläre Differenzierung von MDC nach der Injektion in kältegeschädigtes Blasengewebe. Injektionen wurden in die Blasenwand an der Stelle der Kälteverletzung vorgenommen, und Gewebeproben wurden 5, 35 oder 70 Tage nach der Injektion erhalten und für eine Analyse vorbereitet. Injizierte MDC sind durch Färbung auf β-Galactosidase angezeigt, und undifferenzierte MDC werden durch Färbung des α-Aktins des glatten Muskels (α-SM-Aktin-Färbung) angezeigt. MDC, die zu Myotubuli oder Muskelfasern differenzierten, sind durch die Färbung der schweren Kette des schnellen Myosins (schnelle MyHC) angezeigt. Pfeile zeigen schnelle MyHC. 5 Tage nach der Injektion werden zahlreiche MDC im Bereich der Injektion beobachtet, und nur einige MDC sind zu Myotubuli differenziert, wie durch die hohen Konzentrationen von β-Galactosidase(5A) und α-SM-Aktin (5B)-Färbung gezeigt ist, und die vergleichsweise geringen Konzentrationen von schneller MyHC (5G)-Färbung. 35 Tage nach der Injektion werden zahlreiche MDC im Bereich der Injektion beobachtet, und viele differenzierten zu Myotubuli, wie durch die hohen Konzentrationen von β-Galactosidase-Färbung (5B), die Abnahme der α-SM-Aktin (5E)-Färbung; und die Zunahme der schnellen MyHC (5H)-Färbung gezeigt ist. 70 Tage nach der Injektion werden MDC im Bereich der Injektion beobachtet, und nahezu alle MDC differenzierten zu Muskelfasern, wie durch die hohen Konzentrationen von β-Galactosidase (5C), die Abnahme der α-SM-Aktin (5F)-Färbung und die hohen Konzentrationen der schnellen MyHC (5I)-Färbung gezeigt ist. Die Vergrößerung beträgt 200-fach. Die 5A-5I zeigen, dass die MDC lebensfähig bleiben und mit der Differenzierung bis zu 70 Tage nach der Injektion in Blasenweichteilgewebe beginnen.
  • Die 6A-6D veranschaulichen die Reinnervation von ins Weichteilgewebe der Harnblase injizierten MDC. Die Innervation wird durch Acetylcholin (Ach)-Färbung angezeigt, die die motorische Endplatte anzeigt. 3 Tage nach der Injektion werden wenige Innervationen beobachtet, wie durch Ach-Färbung gezeigt ist (6A). 15 Tage nach der Injektion werden mehrere Innervationen beobachtet (6B). 30 Tage nach der Injektion werden mehr Innervationen beobachtet (6C). 6 Monate nach der Injektion werden zahlreiche Innervationen bei geringer (100-facher) Vergrößerung beobachtet (6D). Die 6A-6C zeigen injiziertes Gewebe bei hoher (200-facher) Vergrößerung. Die 6A-6D zeigen, dass MDC Innervation bis zu 6 Monate lang nach der Injektion in kältegeschädigtes Blasengewebe induzieren.
  • Die 7A und 7B veranschaulichen die Ergebnisse einer Weichteilgewebeverstärkung des myokardialen glatten Muskels unter Verwendung von Injektionen von MDC- Zusammensetzungen. Die Injektionen wurden in die Ventrikelwand vorgenommen, und Gewebeproben wurden 3 Tage nach der Injektion vorbereitet. MDCs sind durch β-Galactosidase-Färbung angezeigt. 7A zeigt injiziertes Gewebe bei geringer (100-facher) Vergrößerung; 7B zeigt injiziertes Gewebe bei hoher (200-facher) Vergrößerung.
  • Die 8A und 8B veranschaulichen die Ergebnisse von MDC-Injektionen in Lebergewebe. Injektionen wurden ins Lebergewebe in den unteren linken Lappen vorgenommen, und Gewebeproben wurden 4 Tage nach der Injektion vorbereitet. MDC sind durch β-Galactosidase-Färbung angezeigt. 8A zeigt eine geringe (100-fache) Vergrößerung; 8B zeigt eine hohe (200-fache) Vergrößerung.
  • Die 9A und 9B veranschaulichen die Ergebnisse von MDC-Injektionen in Milzgewebe. Die Injektionen wurden in Milzgewebe in die innenliegenden Seite vorgenommen, und Gewebeproben wurden 4 Tage nach der Injektion vorbereitet. MDC sind durch β-Galactosidase-Färbung angezeigt. 9A zeigt bei niedriger (100-facher) Vergrößerung betrachtete injizierte Gewebe; 9B zeigt bei hoher (200-facher) Vergrößerung betrachtete injizierte Gewebe.
  • Die 10A und 10B veranschaulichen die Ergebnisse von MDC-Injektionen ins Rückenmarkgewebe. Die Injektionen wurden ins Rückenmarkgewebe vorgenommen, und Gewebeproben wurden 4 Tage nach der Injektion vorbereitet. MDC sind durch β-Galactosidase-Färbung angezeigt. 10A zeigt injizierte Gewebe, betrachtet bei geringer (100-facher) Vergrößerung; 10B zeigt bei hoher (200-facher) Vergrößerung betrachtete injizierte Gewebe. Die 7A-7B, 8A-8B, 9A-9B und 10A-10B zeigen, dass die MDC nach der Injektion in eine Vielzahl von verschiedenen Gewebetypen lebensfähig bleiben, ohne die Wirtsgewebe zu beschädigen.
  • Die 11A-11L veranschaulichen eine immunhistochemische Analyse von PP1-4- und PP6-Zellpopulationen aus mdx-Mäusen, die eine Expression von Zellmarkern aufweisen, die Desmin, MyoD und Myogenin (für myogene Linien spezifische Marker), M-Cadherin (für Satellitenzellen spezifischer Marker), Bcl-2 (Marker für frühe Myogenese), CD34 (Marker für hämatopoetische oder Stromazellen) umfassen. Die 11A-11L zeigen, dass PP1-4- und PP6-Zellpopulationen vergleichbare Prozentanteile von Zellen zeigen, die Desmin (11A und 11G), MyoD (11E und 11K) und Myogenin (11F und 11L) exprimieren, während die PP6-Population einen geringeren Prozentanteil an Zellen zeigt, die M-Cadherin (11D und 11J) exprimieren, aber einen höheren Anteil an Zellen, die Bcl-2 (11C und 11I) und CD34 (11B und 11H) exprimieren, verglichen mit der PP1-4-Population.
  • Die 12A-12I veranschaulichen die intrazelluläre Co-Lokalisation von CD34- oder Bcl-2-Färbung mit Desminfärbung in Muskelzellen und vaskulären Endothelzellen von Mäusen. 12A zeigt normale Muskelzellen (siehe Pfeil) und vaskuläre Endothelzellen (siehe Pfeilspitze) von Mäusen, die mit anti-CD34-Antikörpern gefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert sind. 12B zeigt die gleichen Zellen, die gleichzeitig mit Desmin- und Kollagen-Typ IV-Antikörpern gefärbt sind. 12C zeigt die gleichen Zellen, die gleichzeitig mit Hoechst gefärbt sind, um die Kerne zu zeigen. 12D zeigt eine Mischung der Zellen, die gleichzeitig auf CD34, Desmin, Kollagen Typ IV und Hoechst gefärbt sind. 12E zeigt normale Mausmuskelzellen (siehe Pfeil), die mit anti-Bcl-2-Antikörpern gefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert sind. 12F zeigt die gleichen Zellen, die gleichzeitig mit Desmin- und Kollagen-Typ-IV-Antikörpern gefärbt sind. 12G zeigt die gleichen Zellen, die gleichzeitig mit Hoechst gefärbt sind, um die Kerne zu zeigen. 12H zeigt eine Mischung der Zellen, die gleichzeitig auf CD34, Desmin, Kollagen Typ IV und Hoechst gefärbt sind. 12I zeigt Satellitenzellen, die mit anti-M-Cadherin-Antikörpern gefärbt sind (siehe Pfeil). Die Zellen wurden bei 40-facher Vergrößerung betrachtet. Die 12A-12D zeigen die Co-Lokalisation von CD34 und Desmin, während die 12E-12H die Co-Lokalisation von Bcl-2 und Desmin zeigen.
  • Die 13A-13E veranschaulichen die morphologischen Veränderungen und die Expression von Osteocalcin, die sich aus der Exponierung von mcl3-Zellen gegen rhBMP-2 ergeben. Mcl3-Zellen wurden in Wachstumsmedien mit oder ohne rhBMP-2 6 Tage lang inkubiert. 13A zeigt Zellen, die man bis zu > 50 % Zellkonfluenz in Abwesenheit von rhBMP-2 wachsen lies. Die 13B zeigt bis zu > 50 % Zellkonfluenz in der Anwesenheit von 200 ng/ml rhBMP-2 gewachsene Zellen. Die 13C zeigt Zellen, die man bis zu > 90 % Zellkonfluenz in der Abwesenheit von rhBMP-2 wachsen lies. Die 13D zeigt Zellen, die man bis zu > 90 % Konfluenz in der Gegenwart von 200 ng/ml rhBMP-2 wachsen lies. Die 13E zeigt Zellen, die auf Osteocalcin-Expression gefärbt wurden (Osteoblastenzellmarker; siehe Pfeile). Die Zellen wurden bei 10-facher Vergrößerung betrachtet. Die 13A-13E zeigen, dass mcl3-Zellen in der Lage sind, nach Exponierung gegenüber rhBMP-2 zu Osteoblasten zu differenzieren.
  • Die 14A-14D veranschaulichen die Wirkungen auf den Prozentanteil von mcl3-Zellen, die als Reaktion auf rhBMP-2-Behandlung Desmin und alkalische Phosphatase exprimieren. 14A zeigt eine Desmin-Färbung von frisch isolierten mcl3-Klonen. 14B zeigt eine Phasenkontrastansicht der gleichen Zellen. 14C zeigt den Umfang der Desmin-Färbung in mcl3-Zellen nach 6 Tagen Inkubation in Wachstumsmedien mit oder ohne 200 ng/ml rhBMP-2. 14D zeigt den Umfang von alkalischer Phosphatase-Färbung in PP1-4-Zellen und mcl3-Zellen nach 6 Tagen Inkubation in Wachstumsmedien mit oder ohne 200 ng/ml rhBMP-2. * zeigt ein statistisch signifikantes Ergebnis an (Student-t-Test). 14C zeigt, dass eine abnehmende Anzahl von m13-Zellen in der Gegenwart von rhBMP-2 Desmin exprimieren, während 14D zeigt, dass eine zunehmende Anzahl von mcl3-Zellen alkalische Phosphatase in der Gegenwart von rhBMP-2 exprimieren, was ein Abnehmen myogener Merkmale und ein Zunehmen osteogener Merkmale der Zellen in der Gegenwart von rhBMP-2 nahe legt.
  • Die 15A-15G veranschaulichen die in vivo-Differenzienrng von mcl3-Zellen zu myogenen und osteogenen Linien. Die mcl3-Zellen wurden stabil mit einem Konstrukt transfiziert, das LacZ und das Dystrophingen enthält, und wurden durch intramuskuläre oder intravenöse Injektionen in die hinteren Extremitäten von mdx-Mäusen eingeführt. Nach 15 Tagen wurden die Tiere geopfert, und die Muskulatur der hinteren Gliedmaßen wurde für eine histologische Untersuchung isoliert. 15A zeigt mcl3-Zellen an der Stelle der intramuskulären Injektion, die auf LacZ gefärbt sind. 15B zeigt die gleichen Zellen, die gleichzeitig auf Dystrophin gefärbt sind. 15C zeigt mcl3-Zellen in dem Bereich der intravenösen Injektion, die auf lacZ gefärbt sind. 15D zeigt die gleichen Zellen, die gleichzeitig auf Dystrophin gefärbt sind. In einem getrennten Experiment wurden mcl3-Zellen mit adBMP-2 transduziert, und 0,5-1,0 × 106-Zellen wurden in die hinteren Gliedmaßen von SCID-Mäusen injiziert. Nach 14 Tagen wurden die Tiere geopfert, und die Muskelgewebe der hinteren Gliedmaßen wurden analysiert. 15E zeigt eine radiographische Analyse der hinteren Gliedmaßen, um die Knochenbildung zu bestimmen. 15F zeigt die aus den hinteren Gliedmaßen stammenden Zellen, die auf LacZ gefärbt sind. 15G zeigt auf Dystrophin gefärbte Zellen. Die 15A-15D zeigen, dass mcl3-Zellen die Dystrophin-Expression durch intramuskuläre oder intravenöse Abgabe retten können. Die 15E-15G zeigen, dass mcl3-Zellen an der ektopischen Knochenbildung beteiligt sind. Die Zellen wurden bei den folgenden Vergrößerungen betrachtet: 40-fach (15A-15D), 10-fach (15F-15G).
  • Die 16A-16E veranschaulichen die Verstärkung der Knochenheilung durch rhBMP-2-produzierende primäre Muskelzellen. Ein 5 mm-Schädeldefekt wurde bei weiblichen SCID-Mäusen unter Verwendung eines zahnmedizinischen Bohrers erzeugt, und der Defekt wurde mit einem Kollagenschwamm gefüllt, der mit mcl3-Zellen mit oder ohne adBMP-2 eingesät war. Die Tiere wurden nach 14 Tagen geopfert, untersucht und mikroskopisch auf Anzeichen einer Knochenheilung analysiert. Die 16A zeigt einen mit mcl3-Zellen ohne adBMP-2 behandelten Schädel. 16B zeigt einen mit mcl3-Zellen behandelten Schädel, die adBMP-2 transduziert waren. 16C zeigt eine histologische Probe des Schädels, der mit mcl3-Zellen ohne adBMP-2 behandelt war und durch von Kossa-Färbung analysiert ist. 16D zeigt eine histologische Probe des mit mcl3-Zellen behandelten Schädels, die mit adBMP-2 transduziert waren, analysiert durch von Kossa-Färbung. 16E zeigt eine histologische Probe des Schädels, der mit den mit adBMP-2 transduzierten mcl3-Zellen behandelt war, und durch Hybridisierung mit einer für das Y-Chromosom spezifischen Sonde analysiert wurde, um die injizierten Zellen zu identifizieren (durch Pfeile gezeigte grüne Fluoreszenz), und mit Ethidiumbromid gefärbt wurden, um die Kerne zu identifizieren (durch rote Fluoreszenz angezeigt). Die 16A-16E zeigen, dass rhBMP-2 exprimierende mcl3-Zellen zum Heilen von Knochendefekten beitragen können.
  • Die 17A-17F zeigen Transplantateinwachsungen, die das Ergebnis der Injektion von MDSC sind, entweder der späten Vorplatte (LP) (d. h. MDSC [LP] – PP5 oder PP6), oder der frühen Vorplatte (EP) (d. h. MDSC [EP]) – PP1-2). Wie in den 17C und 17D gezeigt ist, wurde eine große Transplantateinwachsung mit einer erheblichen Anzahl von Dystrophin-positiven (Dystrophin+)-Muskelfasern in den MDSC [LP]-injizierten mdx-Muskel zehn Tage nach der Injektion beobachtet (Beispiel 10). Ein Vergleich des MDSC [LP]-injizierten Muskels mit MDSC [EP]-injizierten Muskel (17A und 17B) zeigt, dass die MDSC [LP]-Transplantateinwachsung vielmehr kleine Muskelfasern enthält, was somit nahe legt, dass die injizierten MDSC [LP]-Zellen in vivo eine hohe proliferative Fähigkeit besitzen. Bei beiden Muskeln wurde die gleiche Anzahl von Muskelzellen eines jeden Typs injiziert. Die Anzahl von Dystrophin+-Muskelfasern in dem mit MDSC [LP] injizierten Muskel war 5 Mal so hoch wie die in mit MDSC [EP] injizierten Muskel gefundene (2,798 +/– 1,114, n = 4 in mdsc gegenüber 430 +/– 148, n = 6 in EP; Mittel +/– SD).
  • Es ist wichtig, dass viele Dystrophin+-Muskelfasern in Muskel 30 Tage nach der Injektion vorhanden waren, wenn MDSC [LP] verwendet wurden (17E und 17F). Ein Vergleich von 17C mit 17E zeigt an, dass beide Transplantateinwachsungen ähnliche Bereiche aufwiesen; für den 30-Tage-Muskel (17E) wurde jedoch nur die halbe Menge der Menge an Zellen injiziert, die für den 10-Tage-Muskel injiziert wurde (17C). Darüber hinaus waren die Muskelfasern bei der 30-Tage-Transplantateinwachsung viel größer als bei der 10-Tage-Transplantateinwachsung, was somit zeigt, dass die meisten der Dystrophin+-Muskelfasern, die sich 10 Tage nach der Injektion gebildet hatten, 20 Tage später immer noch überlebt hatten. Im Gegensatz dazu wurde ein dramatischer Anstieg der Anzahl von Dystrophin+-Muskelfasern in Muskeln beobachtet, in die MDSC [EP] 30 Tage nach der Injektion injiziert wurden, was zu einem mehr als 10-fachen Unterschied an Dystrophin+-Muskelfasern zwischen der MDSC [EP]-Gruppe (134 +/– 42, n = 3) und der MDSC [LP]-Gruppe (2.000 +/– 658, n = 3) führt.
  • Die 18A und 18B zeigen die Machbarkeit der Verwendung von menschlichen fötalen MDSC bei den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Bei solchen Zellen wurde festgestellt, dass sie immuntolerant sind und in SCID-Mäusen über > 2 Wochen überdauerten. 1 × 108 menschliche fötale MDSC [LP], die das LacZ-Gen in einem Expressionsvektor enthielten, wurden in die Blasenwand von SCID-Mäusen injiziert. Eine LacZ-Färbung wurde am Tag 5 (18A) und am Tag 15 (18B) nach der Injektion beobachtet, wodurch ein hervorragendes Überleben der MDSC demonstriert wurde.
  • Die 19A und 19B zeigen eine Desmin-Färbung von normalen und MDSC [LP]-injizierten Tieren. 3 × 105 MDSC aus normalen Mäusen wurden intravenös in nicht immunologisch geschwächte normale Mäuse injiziert. Zwei Wochen später wurde der Thymus aus den injizierten Mäusen geerntet und auf Skelettmuskel-spezifisches Desmin gefärbt. 19A zeigt, dass die normale Thymuskontrolle negativ auf Desmin färbt. 2 Wochen nach der peripheren Injektion von MDSC aus einem anderen Tier ist der Thymus hinsichtlich Desmin-Färbung jedoch positiv (19B).
  • Die 20A und 20B veranschaulichen die Ergebnisse der Injektion von MDSC-Zusammensetzungen in die Bandscheiben von Kaninchen. Die MDSC enthielten Expressionsvektoren mit LacZ zur β-Galactosidase-Expression wie beschrieben. Injektionen von von Mäusen erhaltenen MDSC wurden in die T6-Bandscheiben der von dem Kaninchen injiziert. 10 Tage nach der Injektion wurden Gewebeproben erhalten und zur Analyse vorbereitet. Die Anwesenheit von injizierten MDSC wurde durch β-Galactosidase-Färbung angezeigt. 20A zeigt injizierte Gewebe bei 100-facher (hoher) Vergrößerung; 20B zeigt injizierte Gewebe bei 40-facher (geringer) Vergrößerung. Die in den 20A und 20B gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die MDC-Injektionen in der Wirbelscheibe wenigstens 10 Tage lang überdauern und die Größe und Funktion von normalen und funktionsgestörten Scheiben verstärken können.
  • Muskelderivierte Zellen und Zusammensetzungen
  • Die vorliegende Erfindung stellt MDC bereit, die aus frühen Progenitorzellen (hierin auch als muskelderivierte Vorläuferzellen oder muskelderivierte Stammzellen (MDSC) bezeichnet) bestehen, die nach Transplantation in Körpergewebe, bevorzugterweise Weichteilgewebe, Langzeitüberlebensraten zeigen. Um die MDC dieser Erfindung zu erhalten, wird ein Muskelexplantat, bevorzugterweise aus Skelettmuskel, aus einem tierischen Spender erhalten, bevorzugterweise aus einem Säugetier, einschließlich des Menschen. Dieses Explantat dient als strukturelles und funktionelles Synzytium, das „Reste" von Muskelvorläuferzellen enthält (T. A. Partridge et al., 1978, Nature 73:306-8; B. H. Lipton et al., 1979, Science 205:1292-4). Die zur Transplantation oder als Zelltherapien gemäß der Erfindung verwendeten MDC können entweder aus autologen oder nicht autologen (d. h. allogenen) Spender erhalten werden, die menschliche adulte, fötale, embryonische oder plazentale Spenderzellen umfassen.
  • Aus primärem Muskelgewebe isolierte Zellen enthalten eine Mischung von Fibroblasten, Myoblasten, Adipozyten, hämatopoietischen und muskelderivierten Vorläuferzellen. Die Vorläuferzellen einer muskelderivierten Population können unter Verwendung von Differentialadhärierungsmerkmalen von primären Muskelzellen auf mit Kollagen beschichteten Gewebeflaschen angereichert werden, wie beispielsweise den in der Patentanmeldung mit der US-Seriennummer 09/302,896 von Chancellor et al. beschriebenen.
  • Zellen, die beim Adhärieren langsam sind, neigen dazu, morphologisch rund zu sein, hohe Konzentrationen an Desmin zu exprimieren und die Fähigkeit aufzuweisen, zu fusionieren und zu vielkernigen Myotubuli zu differenzieren ( US-Seriennummer 09/302,896 von Chancellor et al.). Von einer Subpopulation dieser Zellen wurde gezeigt, dass sie auf rekombinantes menschliches knochengestaltbildendes Protein 2 (rhBMP-2) in vitro durch das Exprimieren zunehmender Konzentrationen von alkalischer Phosphatase, Parathormon-abhängigem 3',5'-cAMP und Osteocalcin reagieren, was ihre Fähigkeit anzeigt, durch sowohl osteogene Linien als auch myogene Linien zu differenzieren ( US-Seriennummer 09/302,896 von Chancellor et al.; T. Katagiri et al., 1994,1 Cell. Biol. 127:1755-1766).
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden Populationen schnell adhärierender MDC (PP1-4) und langsam adhärierender, runder MDC (PP6) isoliert und aus Skelettmuskelexplantaten angereichert und auf die Expression verschiedener Marker unter Verwendung von Immunhistochemie überprüft, um die Anwesenheit pluripotenter Zellen unter den langsam adhärierenden Zellen festzustellen (Beispiel 1; Patentanmeldung US-Seriennummer 09/302,896 von Chancellor et al.). Wie in Tabelle 3, Beispiel 9 hierin gezeigt, exprimierten die PP6-Zellen myogene Marker, einschließlich Desmin, MyoD und Myogenin. Die PP6-Zellen exprimierten auch c-met und MNF, zwei Gene, die in einer frühen Phase der Myogenese exprimiert werden (J. B. Miller et al., 1999, Curr. Top. Dev. Biol. 43:191-219; siehe Tabelle 3). Das PP6 zeigte einen geringeren Prozentanteil an Zellen, die M-Cadherin exprimieren, einen Satellitenzellen-spezifischen Marker (A. Irintchev et al., 1994, Development Dynamics 199:326-337), aber einen höheren Prozentanteil an Zellen, die Bcl-2 exprimieren, einen Marker, der auf Zellen in den frühen Phasen der Myogenese beschränkt ist (J. A. Dominov et al., 1998, 1 Cell. Biol. 142:537-544). Die PP6-Zellen exprimierten auch CD34, einen bei menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen identifizierten Marker, genauso wie Stromazellenvorläufer im Knochenmark (R. G. Andrews et al., 1986, Blood 67:842-845; C. I. Civin et al., 1984, J. Immunol. 133:157-165; L. Fina et al., 1990, Blood 75:2417-2426; P. J. Simmons et al., 1991, Blood 78:2848-2853; siehe Tabelle 3).
  • Die PP6-Zellen exprimierten auch Flk-1, ein Maushomolog des menschlichen KDR-Gens, das kürzlich als ein Marker von hämatopoetischen Zellen mit Stammzell-artigen Merkmalen identifiziert wurde (B. L. Ziegler et al., 1999, Science 285:1553-1558; siehe Tabelle 3). In ähnlicher Weise exprimierten die PP6-Zellen Sca-1, einen in hämatopoetischen Zellen mit stammzellartigen Merkmalen vorhandenen Marker (M. van de Rijn et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4634-8; M. Osawa et al., 1996, J. Immunol. 156:3207-14; siehe Tabelle 3). Die PP6-Zellen exprimierten jedoch nicht die CD45- oder c-Kit-Marker hämatopoetischer Stammzellen (Überblick gegeben in LK. Astiman, 1999, Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31:1037-51; G. A. Koretzky, 1993, FASER J. 7:420-426; siehe Tabelle 3).
  • Bei der vorliegenden Erfindung ist die PP6-Population muskelderivierter Vorläuferzellen bevorzugt, die die hierin beschriebenen Merkmale aufweisen. Diese muskelderivierten Vorläuferzellen exprimieren das Desmin, CD34 und die Bcl-2-Zell-Marker. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die PP6-Zellen durch die hierin beschriebenen Techniken (Beispiel 1) isoliert, um eine Population von muskelderivierten Vorläuferzellen zu erhalten, die eine Langzeitlebensfähigkeit nach Transplantation aufweisen. Die PP6-muskelderivierteVorläuferzellpopulation umfasst einen erheblichen Prozentanteil an Zellen, die Vorläuferzellmarker wie beispielsweise Desmin, CD34 und Bcl-2 exprimieren. Darüber hinaus exprimieren PP6-Zellen die Flk-1- und Sca-1-Zellmarker, exprimieren aber nicht die CD45- oder cKit-Marker. Bevorzugterweise exprimieren mehr als 95 % der PP6-Zellen die Desmin-, Sca-1- und Flk-1-Marker, exprimieren aber nicht die CD45- oder c-Kit-Marker. Es ist bevorzugt, dass die PP6-Zellen innerhalb etwa 1 Tages oder etwa 24 Stunden nach dem letzten Ausplattieren verwendet werden.
  • Als Alternative zum Vorplattierungsverfahren können die MDC der vorliegenden Erfindung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierungs-(FACS)-Analyse isoliert werden unter Verwendung markierter Antikörper gegen einen oder mehrere der durch die MDC exprimierten Zelloberflächenmarker (C. Webster et al., 1988, Exp. Cell. Res. 174:252-65; J. R. Blanton et al., 1999, Muscle Nerve 22:43-50). Zum Beispiel kann die FACS-Analyse unter Verwendung von markierten Antikörpern durchgeführt werden, die gegen CD34, Flk-1, Sca-1 und/oder die anderen hierin beschriebenen Zelloberflächenmarker gerichtet sind, um eine Population PP6-artiger Zellen zu selektieren, die eine Langzeitüberlebensfähigkeit zeigen, wenn sie in das Wirtsgewebe eingeführt werden. Von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfasst ist die Verwendung von einer oder mehr als einer Fluoreszenznachweismarkierung, zum Beispiel Fluorescein oder Rhodamin, zum Antikörpernachweis von verschiedenen Zellmarkerproteinen.
  • Auf muskelderivierten Zellen basierende Behandlungen
  • Bei der vorliegenden Erfindung können die MDC aus einer Skelettmuskelquelle isoliert werden und in eine interessierende Muskel- oder Nicht-Muskel-Weichteilgewebestelle, oder in Knochenstrukturen eingeführt oder transplantiert werden. Vorteilhafterweise sind die MDC der vorliegenden Erfindung so isoliert und angereichert, dass sie eine große Anzahl der Vorläuferzellen enthalten, die nach einer Transplantation ein Langzeitüberleben zeigen. Zusätzlich exprimieren die muskelderivierten Vorläuferzellen dieser Erfindung eine Anzahl charakteristischer Zellmarker wie Desmin, CD34 und Bcl-2. Darüber hinaus exprimieren die muskelderivierten Vorläuferzellen dieser Erfindung die Sca-1- und Flk-1-Zellmarker, exprimieren aber nicht die CD45- oder cKit-Zellmarker (siehe Beispiel 1).
  • MDC und Zusammensetzungen, die MDC der vorliegenden Erfindung umfassen, können verwendet werden, um verschiedene ästhetische oder funktionale Zustände (z. B. Defekte) durch die Verstärkung von Muskel- oder Nicht-Muskel-Weichteilgeweben zu reparieren, behandeln oder zu lindern. Insbesondere können solche Zusammensetzungen als Massenweichteilgewebeverdickungsagenzien verwendet werden für die Behandlung von: 1) kosmetischen und ästhetischen Zuständen der Haut; 2) Zuständen des Lumens; 3) gastroösophagialen Rückfluss-Symptomen oder -Zuständen; 4) Stuhlinkontinenz; 5) Skelettmuskelschwäche, -krankheit, -verletzung oder -funktionsstörung; 6) Schwäche, Krankheit, Verletzung oder Funktionsstörung von glatten Muskeln; und 7) kongenitalen, degenerativen oder traumatischen Bandscheibensymptomen oder -zuständen, einschließlich Rückenschmerzen oder Mangel der Scheiben. Zusätzlich können MDC und Zusammensetzungen davon für das Verstärken von Weichteilgewebe verwendet werden, das nicht mit einer Verletzung zusammenhängt, durch Hinzufügen von Stärke zu einem Weichteilgewebebereich, einer Öffnung oder Lücke bei Abwesenheit von Krankheit oder Trauma wie beispielsweise zum „Glätten" oder Entfernen einer Falte. Mehrfache und aufeinanderfolgende Anwendungen von MDC sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Für MDC-basierte Behandlungen wird ein Skelettmuskelexplantat bevorzugterweise aus einer autologen oder heterologen, d. h. allogenen, menschlichen oder tierischen Quelle erhalten. Eine autologe tierische oder menschliche Quelle ist bevorzugt, obwohl in vielen Fällen allogene muskelderivierte Stammzellen zur Verwendung in hohem Maße geeignet sind.
  • MDC-Zusammensetzungen werden dann hergestellt und isoliert wie hierin beschrieben. Um MDC und/oder MDC umfassende Zusammensetzungen gemäß der Erfindung in einen menschlichen oder tierischen Empfänger einzuführen oder zu transplantieren, wird eine Suspension von einkernigen Muskelzellen hergestellt. Solche Suspensionen enthalten Konzentrationen der muskelderivierten Vorläuferzellen der Erfindung in einem physiologisch akzeptablen Träger, Vehikel oder Verdünnungsmittel. Zum Beispiel können Suspensionen von MDC zum Verabreichen an ein Lebewesen 108 bis 109 Zellen/ml in einer sterilen Lösung von vollständigem Medium umfassen, das derart modifiziert ist, dass es das Serum des Lebewesens als Alternative zu fötalem Rinderserum enthält. Alternativ können sich MDC-Suspensionen in serumfreien, sterilen Lösungen befinden, wie beispielsweise Kryokonservierungslösungen (Celox Laboratories, St. Paul, MN). Die MDC-Suspensionen können dann z. B. über Injektion in eine oder mehr als eine Stelle des Spendergewebes eingeführt werden.
  • Die beschriebenen Zellen können als pharmazeutisch oder physiologisch akzeptable Zubereitung oder Zusammensetzung verabreicht werden, die einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder ein physiologisch akzeptables Verdünnungsmittel enthalten und können an die Gewebe des interessierenden Empfängerorganismus verabreicht werden, einschließlich Menschen und nicht-menschliche Tiere. Die MDC-enthaltende Zusammensetzung kann durch das Resuspendieren der Zellen in einer geeigneten Flüssigkeit oder Lösung wie beispielsweise steriler physiologischer Saline oder anderen physiologisch akzeptablen injizierbaren wässrigen Lösungen zubereitet werden. Die Mengen der bei solchen Zusammensetzungen zu verwendenden Bestandteile können routinegemäß durch Fachleute auf dem Gebiet bestimmt werden.
  • Die MDC oder Zusammensetzungen davon können durch Platzierung der MDC-Suspensionen auf absorbierende oder adhärierende Materialien, z. B. eine Kollagenschwammmatrix, und durch das Einführen des MDC-enthaltenden Materials in oder auf die interessierende Stelle verabreicht werden. Alternativ können die MDC über parenterale Injektionsrouten verabreicht werden, einschließlich subkutan, intravenös, intramuskulär und intrasternal. Andere Verabreichungsmodi umfassen, sind aber nicht beschränkt auf intranasal, intrathecal, intracutan, percutan, enteral und sublingual. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Verabreichung der MDC durch endoskopische Chirurgie vermittelt werden.
  • Zur injizierbaren Verabreichung befindet sich die Zusammensetzung in einer sterilen Lösung oder Suspension oder kann in pharmazeutisch und physiologisch akzeptablen wässrigen oder ölhaltigen Vehikeln resuspendiert sein, die Konservierungsmittel, Stabilisatoren und Material enthalten können, um die Lösung oder die Suspension relativ zu Körperflüssigkeiten des Empfängers (d. h. Blut) isotonisch zu machen. Nicht beschränkende Beispiele von Vehikeln, die zur Verwendung geeignet sind, umfassen Wasser, Phosphat-gepufferte Saline, pH 7,4, 0,15 M wässrige Natriumchloridlösung, Dextrose, Glycerol, verdünnten Ethanol und dergleichen, und Mischungen davon. Beispielhafte Stabilisatoren sind Polyethylenglycol, Proteine, Saccharide, Aminosäuren, anorganische Säuren und organische Säuren, die entweder alleine oder als Beimengungen verwendet werden können. Die Mengen oder Quantitäten, genauso wie die verwendeten Wege der Verabreichung, werden auf individueller Basis bestimmt, und entsprechen den Mengen, die bei ähnlichen Arten von Anwendungen oder Indikationen verwendet werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
  • Um den Transplantationserfolg zu optimieren ist das höchstmögliche immunologische Zusammenpassen zwischen Spender und Empfänger erwünscht. Wenn eine autologe Quelle nicht verfügbar ist, können die Klasse I- und Klasse II-Histokompatibilitätsantigene von Spender und Empfänger analysiert werden, um die stärkste zur Verfügung stehende Übereinstimmung zu bestimmen. Dies minimiert oder beseitigt die Immunabstoßung und verringert die Notwendigkeit einer immunsuppressiven oder immunmodulatorischen Therapie. Wenn nötig kann eine immunsuppressive oder immunmodulatorische Therapie vorher, während und/oder nach der Transplationsprozedur begonnen werden. Zum Beispiel können Cycosporin A oder andere immunsuppressive Wirkstoffe an den Transplantatempfänger verabreicht werden. Eine immunologische Toleranz kann auch vor der Transplantation durch alternative Verfahren induziert werden, die auf dem Gebiet bekannt sind (D. J Watt et al., 1984, Clin. Exp. Immunol. 55:419; D. Faustman et al., 1991, Science 252:1701).
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, können die MDC an Körpergewebe verabreicht werden, einschließlich Knochen, Epithelgewebe (d. h. Haut, Lumen, etc.), Bindegewebe (d. h. Fett-, Knorpel-, Ligament-, Lymph- etc.), Muskelgewebe (d. h. Skelett-/gestreifter oder glatter Muskel) und verschiedene Organgewebe wie beispielsweise diejenigen Organe, die mit dem Verdauungssystem (d. h. Mund, Zunge, Ösophagus, Magen, Leber, Pankreas, Gallenblase, Dünndarm, Anus etc.), dem Herz-Kreislauf-System (d. h. Herz, Venen, Arterien, Kapillaren etc.), Atemsystem (d. h. Lungen, Trachea etc.), Reproduktionssystem (d. h. Samenleiter, Hodensack, Hoden, Penis, Eileiter, Vagina, Klitoris, Uterus, Brüsten, Ovarien, Vulva etc.), urologischem System (d. h. Blase, Harnröhre, Harnleiter, Nieren etc.) und dem Nervensystem (d. h. Gehirn, Rückenmark, Nerven etc.) verbunden sind.
  • Die Anzahl von Zellen in einer MDC-Suspension und die Art der Verabreichung kann sich in Abhängigkeit von der zu behandelnden Stelle und dem zu behandelnden Zustand ändern. Als nicht beschränkende Beispiele gemäß der vorliegenden Erfindung werden etwa 1-1,5 × 106 MDC zur Behandlung eines Bereiches mit Kryoverletzung mit einem Durchmesser von ungefähr 8 mm in glattem Muskelgewebe der Blase (siehe Beispiel 6) injiziert, während etwa 0,5-1,0 × 106 MDC über eine Kollagenschwammmatrix zur Behandlung eines ungefähr 5 mm großen Schädeldefektbereiches verabreicht werden (siehe Beispiel 9). In Übereinstimmung mit den hierin offenbarten Beispielen kann ein versierter Kliniker die Mengen und Verfahren der MDC-basierten Behandlungen gemäß den Erfordernissen, Beschränkungen und/oder Optimierungen modulieren, die für jeden Fall bestimmt werden.
  • Dermatologische Zustände
  • Die MDC und Zusammensetzungen davon gemäß der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich als Materialien für die Verstärkung von Weichteilgewebe bei kosmetischen Eingriffen, z. B. plastischer Chirurgie oder Anti-Alterungs-Prozeduren. Insbesondere können solche MDC und MDC-enthaltenden Zusammensetzungen verwendet werden, um verschiedene dermatologische Zustände bei einem menschlichen oder tierischen Lebewesen zu behandeln, einschließlich Wunden, Runzeln, Rhytiden, Hautvertiefungen nicht-traumatischen Ursprungs, Schwangerschaftsstreifen, eingedrückte Narben, durch Akne vulgaris verursachte Narben und Unterentwicklung der Lippe umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Spezifischer können die MDC und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Runzeln, Rhytiden oder kutane Vertiefungen des Gesichtes und besonders des Bereiches, der das Auge/die Augen umgibt, zu behandeln. Um dermatologische Zustände zu behandeln, werden die MDC wie hierin offenbart zubereitet und dann, z. B. über eine Injektion, an die Haut, subkutan oder intradermal verabreicht, um den Defekt aufzufüllen, aufzupolstern oder zu reparieren. Die Anzahl der eingeführten MDC wird moduliert, um tiefe Hautvertiefungen oder Defekte genauso wie oberflächliche Oberflächenvertiefungen oder Defekte zu reparieren, wie erforderlich. Zum Beispiel werden etwa 1-1,5 × 106 MDC für die Verstärkung einer etwa 5 mm großen Region der Haut verwendet (siehe Beispiel 3).
  • Zustände des Lumens
  • Die MDC und Zusammensetzungen davon gemäß der vorliegenden Erfindung sind weiter nützlich bei der Behandlung von Zuständen des Lumens in einem tierischen oder menschlichen Lebewesen, einschließlich Menschen. Insbesondere werden die muskelderivierten Vorläuferzellen verwendet, um verschiedene biologische Lumen oder Lücken innerhalb des Körpers teilweise zu blockieren, zu verstärken, zu vergrößern, zu versiegeln, zu reparieren, aufzupolstern oder zu füllen. Lumen umfassen, ohne Beschränkung, Blutgefäße, Dünndarm, Magen, Ösophagus, Harnröhre, Vagina, Eileiter, Samenleiter und Trachea. Lücken können, ohne Beschränkung, verschiedene Gewebewunden (d. h. Verlust von Muskel- oder Weichteilgewebestärke aufgrund von Trauma; Zerstörung von Weichteilgewebe aufgrund von eindringenden Projektilen wie beispielsweise einer Stichwunde oder Schusswunde; Verlust von Weichteilgewebe wegen Krankheit oder Gewebetod aufgrund von chirurgischer Entfernung des Gewebes einschließlich Verlust von Brustgewebe nach einer Mastektomie wegen Brustkrebs oder Verlust von Muskelgewebe nach chirurgischem Eingriff, um Sarkoma etc. zu behandeln), Läsionen, Spalten, Divertikel, Zysten, Fisteln, Aneurysmen und andere unerwünschte oder nicht gewollte Vertiefungen oder Öffnungen, die innerhalb des Körpers eines Tieres oder Säugetieres, einschließlich Menschen, vorhanden sein können, umfassen. Für die Behandlung von Zuständen des Lumens werden MDC wie hierin offenbart hergestellt und dann z. B. über Injektion oder intravenöse Abgabe an das luminale Gewebe verabreicht, um die Lücke zu füllen oder zu reparieren. Die Anzahl der eingeführten MDC wird moduliert, um große oder kleine Lücken in einer Weichteilgewebeumgebung wie erforderlich zu reparieren.
  • Zustände des Sphinkters
  • Die MDC und Zusammensetzungen davon gemäß der vorliegenden Erfindung können auch für die Behandlung einer Sphinkterverletzung, -schwache, -krankheit oder -funktionsstörung in einem Tier oder Säugetier, einschließlich Menschen, verwendet werden. Insbesondere werden die MDC verwendet, um Gewebe der ösophagialen, analen, kardialen, Magen- und Harnsphinkter zu verstärken. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Weichteilgewebeverstärkungsbehandlungen bei gaströsophagealen Rückflusssymptomen und Harn- oder Stuhlinkontinenz bereit. Zur Behandlung von Sphinkterdefekten werden die MDC wie hierin beschrieben hergestellt und dann an das Sphinktergewebe verabreicht, z. B. über eine Injektion, um eine zusätzliche Masse, Füllung oder Stütze bereitzustellen. Die Anzahl der eingeführten MDC wird moduliert, um verschiedene Mengen an Massenmaterial wie erforderlich bereitzustellen. Zum Beispiel werden etwa 1-1,5 × 106 MDC verwendet, um eine Verstärkung für eine ungefähr 5 mm große Region der gastroösophagiale Verbindung oder eine ungefähr 5-10 mm großen Region des Analsphinkters bereitzustellen (siehe Beispiel 4).
  • Muskelverstärkung und -kontraktionsfähigkeit
  • Bei der vorliegenden Erfindung können die MDC und Zusammensetzungen davon für die Behandlung von Muskelzuständen in einem menschlichen oder tierischen Lebewesen verwendet werden. Insbesondere können die MDC verwendet werden, um die Skelett- oder glatten Muskeln zu verstärken, um eine Schwäche oder Funktionsstörung zu behandeln, die durch Verletzung, Krankheit, Inaktivität oder anoxie- oder operationsinduziertes Trauma verursacht sind. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Behandlungen für Skelettmuskelschwäche und/oder -funktionsstörungen wie beispielsweise eine sportbedingte Verletzung bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch Behandlungen für eine Erkrankung des glatten Muskels oder eine Funktionsstörung des glatten Muskels, wie beispielsweise Herzversagen, oder eine mit einem Myokardinfarkt assoziierte Verletzung bereit.
  • Zur Muskelverstärkung oder Behandlung von die Muskel betreffenden verwandten Zuständen werden die MDC wie oben beschrieben hergestellt und z. B. über eine Injektion in Muskelgewebe verabreicht, um zusätzliche Masse, Füllmittel oder Stütze bereitzustellen. Wie von dem versierten Kliniker anerkannt werden wird, wird die Anzahl der eingeführten MDC moduliert, um schwankende Mengen von Verdickungsmaterial bereitzustellen, wie benötigt wird oder erforderlich ist. Zum Beispiel werden 1-1,5 × 106 MDC zur Verstärkung einer ungefähr 5 mm großen Region des Herzgewebes injiziert (siehe Beispiel 7).
  • Zusätzlich können die MDC und Zusammensetzungen davon verwendet werden, um die Kontraktilität in glattem Muskelgewebe zu beeinflussen, wie zum Beispiel beispielsweise gastrointestinalem Gewebe, ösophagealem Gewebe und Blasengewebe. Tatsächlich wurde beobachtet, dass die Muskelkontraktilität in kryogeschädigtem Blasengewebe nach der Einführung von muskelderivierten Progenitorzellen, d. h. MDC, wieder hergestellt wurde, wie in Beispiel 6 gezeigt wurde. Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von MDC der Erfindung zum Wiederherstellen der Muskelkontraktion und/oder zur Linderung oder Lösung von Kontraktilitätsproblemen der glatten Muskulatur, wie beispielsweise verringerter Motilität, einschließlich des glatten Muskels des Ösophagus, Magens und des Dünndarms. Ein spezifisches aber nicht beschränkendes Beispiel eines Zustandes, den die MDC der Erfindung verbessern, verringern oder korrigieren können, ist Gastroparese, d. h. eine schwache Motilität und ein schwaches Entleeren des Magens.
  • Genetisch veränderte muskelderivierte Zellen
  • Die MDC dieser Erfindung können genetisch verändert sein, so dass sie eine Nukleinsäuresequenz oder Nukleinsäuresequenzen enthalten, die eine oder mehr als ein aktives Biomolekül codieren, und diese Biomoleküle exprimieren, einschließlich Proteine, Polypeptide, Peptide, Hormone, Metabolite, Wirkstoffe, Enzyme und dergleichen umfassen. Solche MDC können histokompatibel (autolog) oder nicht-histokompatibel (allogen) mit Hinblick auf den Empfänger, einschließlich des Menschen, sein. Diese Zellen können als lokale Langzeitabgabesysteme für eine Vielzahl von Behandlung dienen, z. B. für die Behandlung von solchen Krankheiten und Krankheitserscheinungen wie Krebs, Transplantatabstoßung und die Regenerierung von Muskel- und Nervengeweben, Diabetes, Leberversagen, Nierenversagen, neurale Defekte und Krankheiten, wie beispielsweise die Parkinson'sche Krankheit, und um ein Genprodukt an eine Stelle einer Gewebeverstärkung oder Lückenauffüllung zu geben, wie beispielsweise ein therapeutisches Agens, wie hierin beschrieben.
  • Bevorzugt bei der vorliegenden Erfindung sind autologe muskelderivierte Vorläuferzellen, die durch den Empfänger nicht als fremd erkannt werden. In dieser Hinsicht werden die für die zellvermittelte Genübertragung oder -abgabe verwendeten MDC wünschenswerter Weise hinsichtlich des Haupthistokompatibilitätslokus (MHC oder HLA bei Menschen) ausgesucht werden. Solche nach MHC oder HLA-übereinstimmende Zellen könne autolog sein.
  • Alternativ können die Zellen von einer Person sein, die das gleiche oder ein ähnliches MHC- oder HLA-Antigenprofil aufweist. Der Patient kann auch hinsichtlich der allogenen MHC-Antigene tolerant gemacht werden. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Zellen, denen MHC-Klasse-I und/oder -II-Antigene fehlen, wie beispielsweise diejenigen, die in dem US-Patent Nr. 5,538,722 beschrieben sind.
  • Die MDC können durch eine Vielzahl von molekularen Techniken und Verfahren genetisch verändert werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, z. B. Transfektion, Infektion oder Transduktion. Wie hierin verwendet, bedeutet Transduktion üblicherweise Zellen, die genetisch verändert wurden, um ein fremdes oder heterologes Gen vermittels der Einführung eines viralen oder nicht-viralen Vektors in die Zellen zu enthalten. Transfektion bedeutet üblichererweise Zellen, die genetisch verändert worden sind, so dass sie ein fremdes Gen, das in einem Plasmid eingefügt ist, oder einen nicht-viralen Vektor enthalten. MDC können durch verschiedene Vektoren transfiziert oder transduziert werden und können somit als Genabgabevehikel dienen, um die exprimierten Produkte in den Muskel zu übertragen.
  • Obwohl virale Vektoren bevorzugt sind, werden Fachleute auf dem Gebiet anerkennen, dass das genetische Verändern von Zellen, so dass sie Nukleinsäuresequenzen enthalten, die für erwünschte Proteine oder Polypeptide, Zytokine und dergleichen codieren, durch auf dem Gebiet wohlbekannte Verfahren ausgeführt werden kann, wie z. B. beschrieben in dem US-Patent Nr. 5,538,722 , einschließlich Fusion, Transfektion, Lipofektion vermittelt durch die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Präzipitation mit DEAE-Dextran oder Kalziumphosphat, Partikelbombardierung (Biolistika) mit mit Nukleinsäure beschichteten Partikeln (z. B. Goldpartikeln), Mikroinjektion und dergleichen.
  • Vektoren zum Einführen heterologer (d. h. fremder) Nukleinsäure (DNA oder RNA) in Muskelzellen für die Expression bioaktiver Produkte sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Solche Vektoren besitzen eine Promotorsequenz, bevorzugterweise einen Promotor, der zellspezifisch und stromaufwärts zu der zu exprimierenden Sequenz angeordnet ist. Der Vektor kann auch optional ein oder mehr als ein exprimierbares Markergen für die Expression als Anzeichen einer erfolgreichen Transfektion und Expression von den in dem Vektor enthaltenen Nukleinsäuresequenzen enthalten.
  • Veranschaulichende Beispiele für Vehikel oder Vektorkonstrukte für die Transfektion oder Infektion der muskelderivierten Zellen der vorliegenden Erfindung umfassen replikations-defekte virale Vektoren, DNA-Virus- oder RNA-Virus (Retrovirus)-Vektoren, wie beispielsweise Adenvirus, Herpes simplex-Virus und Adeno-assoziierte virale Vektoren. Adeno-assoziierte Virus-Vektoren sind einzelsträngig und erlauben die effiziente Abgabe von zahlreichen Nukleinsäurekopien an den Nukleus der Zelle. Adenvirus-Vektoren sind bevorzugt. Die Vektoren werden normalerweise im Wesentlichen frei von jeglicher prokaryontischer DNA sein und können eine Anzahl von verschiedenen funktionellen Nukleinsäuresequenzen umfassen. Beispiele für solche funktionelle Sequenzen umfassen Polynukleotid-, z. B. DNA- oder RNA-Sequenzen, die Transkription- oder Translations-Initiations- und Terminations-regulatorische Sequenzen umfassen, einschließlich Promotoren (z. B. starke Promotoren, induzierbare Promotoren und dergleichen) und Enhancer, die in Muskelzellen aktiv sind.
  • Ebenfalls umfasst als Teil der funktionalen Sequenzen ist ein offener Leserahmen (Polynukleotidsequenz), der für ein interessierendes Protein codiert; flankierende Sequenzen können ebenfalls zur ortsgerichtete Integration umfasst sein. In einigen Situationen wird die 5'-flankierende Sequenz eine homologe Rekombination erlauben, und somit die Natur der Initiierungsregion der Transkription verändern, um eine induzierbare oder nicht-induzierbare Transkription bereitzustellen, um beispielsweise das Ausmaß der Transkription zu erhöhen oder zu verringern.
  • Im Allgemeinen ist die Nukleinsäuresequenz, von der erwünscht ist, dass sie durch die muskelderivierte Vorläuferzelle exprimiert wird, die eines Strukturgens oder eines funktionellen Fragmentes, Segmentes oder Teils des Genes, das heterolog zur muskelderivierten Vorläuferzelle ist und z. B. für ein erwünschtes Protein- oder Polypeptidprodukt codiert. Das codierte und exprimiert Produkt kann intrazellulär sein, d. h. im Zytoplasma, Nukleus oder einem Organell einer Zelle zurückgehalten werden, oder es kann durch die Zelle sekretiert werden. Für die Sekretion kann die natürliche Signalsequenz, die in dem Strukturgen vorhanden ist, beibehalten werden, oder es kann eine Signalsequenz, die nicht natürlicherweise in dem Strukturgen vorhanden ist, verwendet werden. Wenn das Polypeptid oder Peptid ein Fragment eines Proteins ist, das größer ist, kann eine Signalsequenz bereitgestellt werden, so dass das erwünschte Protein nach der Sekretion und nach dem Prozessieren der Prozessierungsstelle die natürliche Sequenz aufweisen wird.
  • Beispiele für interessierende Gene zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Gene, die für Zellwachstumsfaktoren, Zelldifferenzierungsfaktoren, Zellsignalfaktoren und Faktoren codieren, die mit dem programmierten Zelltod zusammenhängen. Spezifische Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Gene, die für BMP-2 (rhBMP-2), IL-1Ra, Faktor IX und Connexin 43 codieren.
  • Wie oben erwähnt kann zur Selektion von Zellen, die das Vektorkonstrukt enthalten, ein Marker vorhanden sein. Der Marker kann ein induzierbares oder nicht induzierbares Gen sein und wird im Allgemeinen eine positive Selektion unter Induktion bzw. ohne Induktion erlauben. Beispiele üblicherweise verwendeter Markergene umfassen Neomycin, Dihydrofolatreduktase, Glutaminsynthetase und dergleichen.
  • Der verwendete Vektor wird im Allgemeinen auch einen Replikationsursprung und andere Gene enthalten, die für die Replikation in den Wirtszellen notwendig sind, wie sie routinemäßig von Fachleuten auf dem Gebiet verwendet werden. Zum Beispiel kann das Replikationssystem, das den Replikationsursprung und jegliche mit der Replikation assoziierte Proteine enthält, die von einem bestimmten Virus codiert werden, als Teil des Konstruktes umfasst sein. Das Replikationssystem muss so ausgewählt werden, dass die die für die Replikation notwendigen Produkte codierenden Gene die muskelderivierten Zellen letztendlich nicht transformieren. Solche Replikationssysteme stellen replikationsdefekte Adenviren, die wie in G. Acsadi et al., 1994, Hum. Mol. Genet. 3:579-584 beschrieben konstruiert sind, und Epstein-Barr-Virus dar. Beispiele für replikationsdefekte Vektoren, insbesondere retrovirale Vektoren, die replikationsdefekt sind, sind BAG, beschrieben von Price et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:156; und Safes et al., 1986, EMBO J., 5:3133. Es wird verstanden werden, dass das letztendliche Genkonstrukt ein oder mehr als ein interessierendes Gen enthalten kann, z. B. ein Gen, das für ein bioaktives Stoffwechselmolekül codiert. Zusätzlich kann cDNA, synthetisch produzierte DNA oder chromosomale DNA unter Verwendung von Verfahren und Protokollen verwendet werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind und von ihnen angewandt werden.
  • Wenn dies erwünscht ist, können infektiöse replikationsdefekte virale Vektoren verwendet werden, um die Zellen vor der in vivo-Injektion der Zellen genetisch zu verändern. Zu diesem Zweck können Vektoren in Zellen, die Produzentenzellen für Retroviren sind, zum amphotrophen Verpacken eingeführt werden. Die natürliche Expansion von muskelderivierten Vorläuferzellen in benachbarte Regionen macht eine große Anzahl von Injektionen in oder bei der oder den interessierenden Stelle(n) unnötig.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine ex vivo-Genabgabe an Zellen und Geweben eines aufnehmenden Säugetierwirtes, einschließlich des Menschen, durch die Verwendung von MDC bereit, z. B. von frühen Vorläufermuskelzellen, die viral transduziert wurden unter Verwendung eines adenoviralen Vektors, der so verändert ist, dass er ein heterologes Gen enthält, das für ein erwünschtes Genprodukt codiert. Solch ein ex vivo-Ansatz liefert den Vorteil eines effizienten viralen Gentransfers, der den Ansätzen des direkten Gentransfers überlegen ist. Die ex vivo-Vorgehensweise umfasst die Verwendung von muskelderivierten Vorläuferzellen aus isolierten Zellen aus Muskelgewebe. Die Muskelbiopsie, die als die Quelle für die muskelderivierten Vorläuferzellen dienen wird, kann aus einer Verletzungsstelle oder aus einem anderen Bereich erhalten werden, der von einem klinischen Chirurg leichter erhältlich ist.
  • Es wird anerkannt werden, dass gemäß der vorliegenden Erfindung klonale Isolate aus der Population von muskelderivierten Vorläuferzellen (d.h. PP6-Zellen) abgeleitet werden können unter Verwendung verschiedener Vorgehensweisen, die auf dem Gebiet bekannt sind, zum Beispiel durch das Grenzverdünnungsausplattieren in Gewebekulturmedium. Klonale Isolate umfassen genetisch identische Zellen, die aus einer einzelnen solitären Zelle stammen. Zusätzlich können klonale Isolate unter Verwendung von FACS-Analyse, wie oben beschrieben, gewonnen werden, gefolgt von Grenzverdünnung, um eine einzige Zelle pro Reaktionsnapf zu erhalten, um eine klonal isolierte Zelllinie zu etablieren. Ein Beispiel eines klonalen Isolates, das aus einer PP6-Zellpopulation abgeleitet wurde, ist mcl3, das in Beispiel 9 beschrieben ist. Bevorzugterweise werden klonale Isolate von MDC bei den vorliegenden Verfahren genauso wie für das genetische Verändern der Expression von einem oder mehr als einem bioaktiven Molekül, oder bei Genersatztherapien verwendet.
  • Die MDC werden zunächst mit veränderten viralen Vektoren infiziert, die mindestens ein heterologes Gen enthalten, das für ein erwünschtes Genprodukt codiert, in einem physiologisch akzeptablen Träger oder Vehikel wie beispielsweise Saline oder Phosphat-gepufferte Saline suspendiert, und dann an eine geeignete Stelle im Wirt verabreicht. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können die MDC an Körpergewebe verabreicht werden, einschließlich Knochen, Epithelgewebe, Bindegewebe, Muskelgewebe und die Gewebe verschiedener Organe wie beispielsweise diejenigen Organe, die mit dem Verdauungssystem, dem Herz-Kreislauf-System, dem Atemwegsystem, dem Reproduktionssystem, dem urologischen System und dem Nervensystem verbunden sind, wie oben beschrieben. Das erwünschte Genprodukt wird durch die injizierten Zellen exprimiert, die somit das Genprodukt in den Wirt einführen. Die eingeführten exprimierten Genprodukte können, aufgrund der Tatsache, dass sie über lange Zeitspannen durch die MDC der Erfindung, die ein Langzeitüberleben im Wirt aufweisen, exprimiert werden, dadurch verwendet werden, um die Verletzung, Funktionsstörung oder Krankheit zu behandeln, zu reparieren oder zu lindern.
  • In Studien mit einem Tiermodell der myoblastenvermittelten Gentherapie wurde die Implantation von 106 Myoblasten pro 100 mg Muskel zur teilweisen Behebung der Muskelenzymdefekte benötigt (siehe J. E. Morgan et al., 1988, J. Neural. Sci. 86:137; T. A. Partridge et al., 1989, Nature 337:176). Extrapolierend von diesen Daten können ungefähr 1012 MDC, die in einem physiologisch kompatiblen Medium suspendiert sind, in Muskelgewebe zur Gentherapie eines Menschen mit einem Geweicht von 70 kg implantiert werden. Diese Anzahl von MDC der Erfindung kann aus einer einzelnen Biopsie von 100 mg Skelettmuskel aus einer menschlichen Quelle produziert werden (siehe unten). Für die Behandlung einer spezifischen Verletzungsstelle umfasst eine Injektion genetisch veränderter MDC in ein gegebenes Gewebe oder eine gegebene Verletzungsstelle eine therapeutisch wirksame Menge von Zellen in Lösung oder Suspension, bevorzugterweise, ungefähr 105 bis 106 Zellen pro cm3 von zu behandelndem Gewebe in einem physiologisch akzeptablen Medium.
  • Allogene muskelderivierte Stammzellen stellen eine wirksame Zelltransplantation bereit
  • Eine effiziente Zelltransplantation wurde durch das Injizieren der MDSC von späten Vorplatten, z. B. PP5-6, wie beschrieben, in einen nicht autologen (allogenen) Wirt erhalten. Zum Beispiel konnten große Anzahlen von Zellen in den Muskeln des Wirtes 30 Tage nach der Injektion beobachtet werden, die allogene Transplantate umfassen (z. B. wurden > 2000 Dystrophin+-Muskelfasern in Wirtsmuskeln nach Injektion von 3 × 105 muskelderivierten Stammzellen, die nicht vom Wirt stammten, gefunden). (Beispiel 10). Dieses Ergebnis zeigt, dass die injizierten MDSC nicht nur die allgemein schwache Verbreitung und das schwache Überleben nach der Injektion überwinden, sondern dass die injizierten Zellen auch die Immunabstoßung in Wirtsmuskeln umgehen, die oft bei der Zelltransplantation zwischen verschiedenen Transplantatspender-MDSC beobachtet wird, die einen anderen Ursprung haben als vom Wirt, z. B. wie bei verschiedenen Mäusestämmen. Die Ergebnisse zeigten, dass nicht-autologe muskelderivierte Stammzellen die Effizienz der Zelltherapie in erkrankten Muskeln des Wirtes erheblich verbesserten. Zusätzlich können MDSC als immunoprivilegiert betrachtet werden. Allogene MDSC-Zellen aus spätem Vorplattieren (z. B. PP5 oder 6) überlebten mehr als 10 Mal länger als Nicht-Stammzellen aus frühen Vorplatten, z. B. PP1-2 oder PP1-4, wenn sie in ein Wirtstier eines anderen Stammes injiziert oder transplantiert wurden.
  • Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse, die in Beispiel 10 und den 17A-17F beschrieben sind, die die Verwendung von normalen MDSC [EP]- und MDSC [LP]-Zellen vergleichen, die in mdx-Wirtsmäuse transplantiert waren. Die Daten in Tabelle 1 stellen die Zahl von Dystrophin-positiven (Dystrophin+)-Muskelfasern dar, die in mdx-Muskel gefunden wurden, in den entweder MDSC [EP]- oder MDSC [LP]-Stammzellen injiziert wurden. TABELLE
    MDSC [EP] MDSC [LP]
    M SD M SD
    Tag 10 430,7 147,9 2798,0 1141,6
    Tag 30 134,0 41,6 2000,1 657,6
    • 3-6 Muskeln pro Gruppe; M = Mittel; SD = Standardabweichung
  • Die immunprivilegierte Natur der MDSC aus Zellen der späten Vorplatten wird durch die immunhistochemischen Ergebnisse (Desmin-Färbung) gestützt, die zeigt, dass, wenn MDSC peripher injiziert werden, sie in den Thymus migrieren können und es auch tun. Danach können injizierte MDSC zu T-Lymphozyten differenzieren und chimäre Toleranz induzieren. (z. B. 19 – positive Desmin-Thymus-Färbung nach peripherer MDSC-Injektion).
  • Verglichen mit MDSC [EP] können einige MDSC [LP] zusätzlich nicht nur zu reifen Zellen des Muskels oder zu anderen Linien nach der Injektion in ein Wirtstier differenzieren, sondern auch zu Satellitenzellen, wenn sie in Wirtsmuskel injiziert werden. In solchen Fällen lokalisiert sich eine Population von MDSC [LP]-Zellen in dem Muskel ebenso wie in der Basallamina von Muskelfasern, die ein Ort von Satellitenzellen ist. Aus den MDSC [LP] derivierte und in der Basallamina von Muskelfasern lokalisierte Zellen werden mit der Zeit M-Cadherin-positiv. Neu an diesen Stellen erzeugte Satellitenzellen können neue Muskelfasern bilden, z. B. wenn die Muskelfasern des Wirts absterben. Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, können die MDSC [LP], die in die Bassallamina von Muskelfasern wandern, auf Signale oder Faktoren bei oder um diese Stelle reagieren, was bewirkt, dass sie sich zu Satellitenzellen entwickeln. Dementsprechend stellt die MDSC [LP]-Injektion ein Mittel zum Bereitstellen einer zukünftigen aufrechterhaltenden Population von Muskelvorläuferzellen dar, die an den Wirtsmuskelstellen Satellitenzellen bilden, wo Satellitenzellen vorhanden sind und sich entwickeln.
  • Die Erfindung stellt auch die Fähigkeit bereit, menschliche fötale oder embryonische MDSC bei Transplantationsverfahrensweisen und -behandlungen, unter geeigneten Richtlinien und zugelassenen Bedingungen und Regularien, mit geringen oder keinen Problemen hinsichtlich der Abstoßung aufgrund von Spender-Wirts-Inkompatiblitäten anzuwenden. Zum Beispiel wurde von menschlichen MDSC aus fötalem Gliedmaßenmuskel festgestellt, dass sie immuntolerant sind und ein hohes Ausmaß an Überlebensfähigkeit zeigen, da sie in der Lage waren, in SCID-Mäusen mehr als 2 Wochen lang nach der Injektion zu überdauern (18A und 18B). Somit können gemäß der Erfindung und unter den geeigneten Richtlinien, Regularien und Bedingungen aus Banken erhaltene menschliche fötale MDSC zum Beispiel verwendet und in jegliche Gewebe oder Organe eines Patienten für Behandlungen injiziert werden, die einer MDSC-Injektion oder einem MDSC-Transplantat wie hierin beschrieben zugänglich sind.
  • BEISPIEL 1: MDC-Anreicherung, -Isolierung und -Analyse
  • Anreicherung und Isolierung von MDC
  • MDC wurden hergestellt wie beschrieben (Patentanmeldung mit der US-Seriennummer 09/302,896 von Chancellor et al.). Muskelexplantate wurden aus den Hintergliedmaßen aus einer Anzahl von Quellen erhalten, nämlich aus 3 Wochen alten mdx (dystrophischen)-Mäusen (C57BL/10ScSn mdx/mdx, Jackson Laboratories), 4-6 Wochen alten normalen weiblichen SD (Sprague Dawley)-Ratten oder SCID (schwere kombinierte Immundefizienz)-Mäusen. Das Muskelgewebe von einer jeden der Tierquellen wurde seziert, um jegliche Knochen zu entfernen und zu einer Aufschlämmung zerkleinert. Die Aufschlämmung wurde dann durch 1-stündige Inkubation mit 0,2 % Typ XI-Kollagenase, Dispase (Grad II, 240 Einheiten) und 0,1 % Trypsin bei 37 °C verdaut. Die sich dabei ergebende Zellsuspension wurde durch 18, 20 und 22 Gauge-Nadeln durchgeführt und 5 Minuten lang bei 3000 Upm zentrifugiert. Nachfolgend wurden die Zellen in Wachstumsmedium (DMEM, supplementiert mit 10 %-igem fötalem Rinderserum, 10 % Pferdeserum, 0,5 % Hühnerembryoextrakt und 2 % Penizillin/Streptomycin) suspendiert. Die Zellen wurden dann in mit Kollagen beschichteten Flaschen (Patentanmeldung mit der US-Seriennummer 09/302,896 von Chancellor et al.) vorplattiert. Nach ungefähr 1 Stunde wurde der Überstand aus der Flasche entfernt und neu in eine frische mit Kollagen beschichtete Flasche ausplattiert. Die Zellen, die innerhalb dieser einstündigen Inkubation schnell adhärierten, waren überwiegend Fibroblasten (Z. Qu et al., oben; US-Seriennummer 09/302,896 von Chancellor et al.). Der Überstand wurde entfernt und nachdem 30-40 % der Zellen jeder Flasche adhäriert hatten, erneut ausplattiert. Nach ungefähr 5-6 seriellen Ausplattierungen war die Kultur hinsichtlich kleiner, runder Zellen angereichert, die als PP6-Zellen bezeichnet wurden und die aus der Anfangszellpopulation isoliert worden waren und für weitere Verbesserungen verwendet wurden. Die adhärierten Zellen, die in den frühen Ausplattierungen isoliert wurden, wurden vereinigt und als PP1-4-Zellen bezeichnet.
  • Die mdx PP1-4-, mdx PP6-, normalen PP6- und Fibroblasten-Zellpopulationen wurden durch immunhistochemische Analyse auf die Expression von Zellmarkern untersucht. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
    mdx PP1-4-Zellen Mdx PP6-Zellen Weder noch PP6-Zellen Fibroblasten
    Desmin +/– + + –
    CD34 – + + –
    Bcl-2 (–) + + –
    Flk-1 na + + –
    Sca-1 na + + –
    M-Cadherin –/+ –/+ –/+ –
    MyoD –/+ +/– +/– –
    Myogenin –/+ +/– +/– –
    Tabelle 2: In PP1-4- und PP6-Zellpopulationen exprimierte Zellmarker. Mdx PP1-4, mdx-PP6, normale PP6 und Fibroblastenzellen wurden durch die Technik des Vorplattierens deriviert und durch immunohistochemische Analyse untersucht. „–„ zeigt an, dass weniger als 2 % der Zellen Expression zeigten; „(–)„; „–/+" zeigt an, dass 5-50 % der Zellen Expression zeigten; „+/–„ zeigt an, dass 40-80 % der Zellen Expression zeigten; „+" zeigt an, dass > 95 % der Zellen Expression zeigten; „weder noch" zeigt normale Zellen an; „na" zeigt, dass die immunhistochemischen Daten nicht zur Verfügung stehen.
  • Es wird festgestellt, dass sowohl mdx- als auch normale Mäuse eine identische Verteilung aller Zellmarker zeigten, die in diesen Tests untersucht wurden. Somit beeinflusst das Vorhandensein der mdx-Mutation die Zellmarkerexpression der isolierten PP6-muskelzellderivierten Population nicht.
  • MDC wurden in Proliferationsmedium angezogen, das DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) mit 10 % FBS (fötales Rinderserum), 10 % HS (Pferdeserum), 0,5 % Hühnerembryoextrakt und 1 % Penicillin/Streptomycin enthielt, oder in Fusionsmedium, das DMEM ergänzt durch 2 % fötales Rinderserum und 1 % antibiotikahaltiger Lösung enthielt. Alle Medienlieferungen wurden von Gibco Laboratories gekauft (Grand Island, NY).
  • BEISPIEL 2: MDC-Vektoren und -Transfektionen
  • Retrovirus- und Adenvirus-Vektoren
  • Der retrovirale Vektor MFG-NB (N. Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-81) wurde für die MDC-Experimente verwendet. Dieser Vektor enthält ein modifiziertes LacZ-Gen (NLS-LacZ), das eine nukleus-lokalisierende Sequenz enthält, die aus dem großen T-Antigen des Affenvirus (SV40) kloniert wurde, das aus der langen Endwiederholung (LTR) transkribiert wird. Das retrovirale Ausgangsmaterial wurde wie zuvor beschrieben angezogen (J. C. van Deutekom et al., 1998 Neuromuscul. Disord. 8:135-48). Das Retrovirus wurde auf 1 × 107-1 × 109 cfu/ml titriert.
  • Es wurde auch ein Adenovirusvektor verwendet. Dieser Vektor enthielt das LacZ-Gen unter der Kontrolle des menschlichen Cytomegalievirus (HuCMV)-Promotors (J. Huard et al., 1994, Hum Gene Ther 5:949-58). Das hinsichtlich E1-E3 deletierte rekombinante Adenvirus wurde von Dr. I. Kovesdi (Gene Vec Inc., Rockville, MD) erhalten.
  • Virale Transduktion der MDC
  • Zur viralen Transduktion wurden MDC mit einer Dichte von 1-1,5 × 106 in T75-Flaschen ausplattiert. PP6-MDC wurden in HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) gewaschen und entweder mit Retrovirus-(1 × 107-1 × 109 cfu/ml) oder Adenvirus-(1 × 109 cfu/ml) Suspension in 5 ml DMEM vier Stunden bei 37°C inkubiert, das 8 μg/ml PolybreneTM (Abbott Laborities, Chicago, IL) enthielt. Viral transduzierte MDE wurden in 10 ml Proliferationsmedium bei 37°C für 24 Stunden angezogen. Die MDC wurden dann mit HBSS abgespült und mit 0,25 % Trypsin eine Minute lang enzymatisch verdaut. Die behandelten, viral transduzierten MDC wurden 5 Minuten lang bei 3500 rpm zentrifugiert, und das Pellet wurde in 20 μl HBSS resuspendiert.
  • BEISPIEL 3: Weichteilgewebeverstärkung der Haut
  • MDC- und Kollagen-Injektion
  • SD-Ratten wurden für den chirurgischen Eingriff durch Betäuben mit Halothan unter Verwendung von Standardverfahren und Waschen der Operationsstelle mit Betadine®-Lösung vorbereitet. In die Haut des unteren Abdomens wurden entweder 10 Mikroliter (μl) MDC-Suspension in HBSS (ungefähr 1-1,5 × 106-Zellen), 10 μl kommerziell erhältliches Rinderkollagen (ContigenTM; C. R. Bard, Covington, BA) oder 10 μl sterile Saline unter Verwendung einer Hamilton-Mikrospritze injiziert. 5 Tage, 2 Wochen und 4 Wochen nach der Injektion wurde der jede Injektionsstelle umgebende Bereich ausgeschnitten, für die histochemische Analyse vorbereitet, mikroskopisch untersucht und fotografiert. Die histochemische Analyse umfasste Hematoxylin-, Eosin- oder Trickrom-Färbung.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass MDC für wenigstens 4 Wochen nach der Injektion in das Hautgewebe lebensfähig waren, ohne Belege für Entzündung des Gewebes an der Injektionsstelle (1C-1F). Im Gegensatz war Kollagen 2 Wochen nach der Injektion im Hautgewebe nicht sichtbar (1B und 1C). Somit können MDC-Zusammensetzungen als Materialien für die Hautverstärkung verwendet werden, zum Beispiel zur Verwendung bei kosmetischen oder ästhetischen Anwendungen oder chirurgischen Eingriffen. Dies ist eine unerwartete Erkenntnis, weil zuvor geglaubt wurde, dass transplantierte Muskelzellen umgebende Wirtsmuskelfasern benötigten, an die sie sich anheften, um zu überleben. Das Überleben der MDC der vorliegenden Erfindung nach der Injektion in anderem Gewebe als Muskelgewebe wird weiter in den Beispielen 8 und 9 gezeigt.
  • BEISPIEL 4: Weichteilgewebeverstärkung der gastroösophagealen Verbindung und des Analsphinkters
  • SD-Ratten wurden für die Operation wie oben beschrieben vorbereitet. Es wurde ein Mittellininenabdomeneinschnitt vorgenommen, um die gastroösophageale Verbindung und den Analsphinkter freizulegen. In das Weichteilgewebe wurden 10 μl einer Suspension von muskelderivierten Vorläuferzellen in HBSS (1-1,5 × 106-Zellen) unter Verwendung einer Hamilton-Mikrospritze injiziert. Drei Tage nach der Injektion wurde der die Injektionsstelle umgebende Bereich ausgeschnitten, für die histochemische Analyse vorbereitet, auf β-Galactosidase gefärbt, um die Stelle und Lebensfähigkeit von den Zellen zu bestimmen, die den LacZ-Marker tragen, mikroskopisch untersucht und fotografiert. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass MDC-Zusammensetzungen als Verdickungsmaterialen für den Ösophagus und den Analsphinkter (2A und 2B) für die Behandlung von gastroösophagealem Rückfluss und Stuhlinkontinenzsyndromen oder -Zuständen verwendet werden können.
  • BEISPIEL 5: Weichteilgewebeverstärkung der vesico-uteralen Verbindung
  • SD-Ratten wurden für die Operation wie oben beschrieben vorbereitet. Es wurde ein Mittellinienabdomeneinschnitt vorgenommen, um die Ureter-Blasen-(vesico-ureterale) Verbindung freizulegen. Dem Gewebe wurden 10 μl einer MDC-Suspension in HBSS (1-1,5 × 106-Zellen) unter Verwendung einer Hamilton-Mikrospritze injiziert. Drei Tage nach der Injektion wurde der jede Injektionsstelle umgebende Bereich ausgeschnitten, für die histologische Analyse vorbereitet, auf β-Galaktosidase gefärbt, um den Ort und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen, die den LacZ-Marker tragen, mikroskopisch untersucht und fotografiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass MDC-basierte Zusammensetzungen als Ureter-Blasen-Verstärkungsmaterialien (3A und 3B) zur Behandlung von vesico-ureteralen Rückflusssymptomen oder -Zuständen verwendet werden können.
  • BEISPIEL 6: MDC-Behandlung von kryoverletztem Blasengewebe
  • Kryoverletzung und MDC-Transplantation
  • SD-Ratten wurden für die Operation wie oben beschrieben vorbereitet. Ein Schnitt an der unteren Mittellinie wurde vorgenommen, um die Blase und Harnröhrenmuskel freizulegen. Die Blase wurde dann mit 1 ml Saline gefüllt. Eine Cryoverletzung wurde mit einem auf Trockeneis gekühlten Aluminiumstab mit einem Durchmesser von 8 mm durchgeführt. Der gekühlte Stab wurde 15 oder 30 Sekunden lang (bezeichnet als „milde" bzw. „schwere" Verletzung) gegen eine Seite der Blasenwand gehalten. Unmittelbar nach der Kryoverletzung wurden einer Gruppe mit schwerer Verletzung muskelderivierte Zellen der Erfindung (1-1,5 × 106 Zellen in 15 μl HBSS) injiziert, während einer Kontrollgruppe mit schwerer Verletzung HBSS (15 μl) (n = 3 pro Gruppe) injiziert wurde. Eine Woche nach der Kryoverletzung erhielten die anderen Gruppen mit milder und schwerer Verletzung eine MDC-Suspension in 50 μl HBSS (2-3 × 106 Zellen) injiziiert, während den Kontrollgruppen mit mildem oder schwerem Schaden 50 μl HBSS injiziert wurden (n = 4 pro Gruppe). Bei jeder Gruppe wurden die Injektionen in das Zentrum der verletzten Region unter Verwendung einer 30-Gauge-Nadel und einer Hamilton-Mikrospritze vorgenommen.
  • Immunhistochemische Färbung auf Aktin von glattem Muskel (α-SM-Aktin) Um Proben für die immunhistochemische Analyse vorzubereiten, wurden Gewebe- oder Zellproben in kaltem Aceton 2 Minuten lang bei –20°C fixiert und 1 Stunde lang mit 5 % HS geblockt. Die Proben wurden in einer Feuchtigkeitskammer über Nacht bei Raumtemperatur mit monoklonalem primären Mausantikörpern gegen Aktin des glatten Muskels (Katalog # F-3777; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (1:400 Verdünnung in PBS pH 7,4) inkubiert. Die Proben wurden anschließend dreimal mit PBS gewaschen und mit sekundären anti-Maus-IgG Antikörpern inkubiert, die mit dem Cy3-Fluorochrom (Sigma Chemical Co.) konjugiert waren (1:200 Verdünnung in PBS pH 7,4).
  • Immunohistochemische Färbung auf schwere Kette von schnellem Myosin (Fast MyHC) Gewebe- oder Zellproben wurden in kaltem Aceton bei –20°C 2 Minuten lang fixiert und 1 Stunde lang mit 5 % HS blockiert. Die Proben wurden dann über Nacht bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer mit monoklonalem primären Maus-Antikörper gegen (schnelles) Skelettmyosin (Katalog # M-4276; Sigma Chemical Co.) inkubiert (1:400 Verdünnung in PBS pH 7,4). Die Proben wurden anschließend dreimal mit PBS gewaschen und mit Cy3-konjugiertem sekundären anti-Maus-IgG Antikörpern (Sigma Chemical Co.) (1:200 Verdünnung in PBS pH 7,4) inkubiert.
  • Zellkultur
  • Muskelderivierte Vorläuferzellen, die wie in Beispiel 1 präpariert worden waren, wurden in 35 mm-Kollagen beschichteten Schalen in Proliferationsmedium ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde das Proliferationsmedium durch Fusionsmedium ersetzt. Die Zellen wurden bei täglichem Wechseln des Mediums im Fusionsmedium gehalten, bis die MDC zu Myotubuli differenzierten.
  • Kontraktilitätsuntersuchungen
  • Zwei Wochen nach der MDC-Injektion wurden die Tiere euthanisiert und verwendet, um Blasenstreifen herzustellen. Aus jeder Blase wurden zwei Streifen präpariert, und beide Streifen wurden so geschnitten, dass sie um den Umfang der Blase reichten. Die Blasenstreifen wurden in einem Gewebebad aufgebaut und neuralen Kontraktionen unterworfen (20 Hz, 10 und 80 Schocks), die aufgezeichnet und wie unten beschrieben analysiert wurden.
  • Gewebeernte und -histologie
  • SD-Ratten wurden euthanisiert, und Proben des Gewebes, das die Injektionsstelle umgibt, wurden entnommen. Die Proben wurden unter Verwendung von in flüssigem Stickstoff vorgekühltem 2-Methylbutan blitzgefroren. Die histochemische Analyse der Proben umfasste Hematoxylin- und Eosin-Färbung. Die Gewebe wurden gefärbt, mikroskopisch untersucht und fotografiert. Jeder Kryostatschnitt wies eine Dicke von 10 um auf.
  • Elektrostimulation des glatten Muskelgewebes der Blase
  • Das Tier wurde euthanisiert und die Blase wurde schnell entfernt. Zwei Streifen, die den Umfang der Blasenwand abdeckten, wurden aus jeder Blase erhalten. Die Streifen wurden in 5 ml Organbädern aufgebaut, die Krebs'sche Lösung enthielten (113 mMol/l NaCl, 4,7 mMol/l KCl, 1,25 mMol/l CaCl2, 1,2 mMol/l MgSO4, 25 mMol/l NaHCO3, 1,2 mMol/l KH2PO4 und 11,5 mMol/l Glukose), die mit 95 % O2 und 5 % CO2 belüftet war. Die anfängliche Spannung wurde auf 10 mN eingestellt, und isometrische Kontraktionen wurden mit Spannungs-Messgerät-Wandlern gemessen, die mit einem TBM4 Spannungs-Messgerät-Verstärker (World Precision Instruments) gekoppelt waren. Kontraktionsmessungen wurden unter Verwendung eines Datenaufnahmeprogrammes (Windaq, DATAQ Instruments, Inc., Akron, OH) zusammengestellt. Die Signalaufnahmegeschwindigkeit pro Kanal wurde auf 100 Hz eingestellt. Die Amplitude der Kontraktion wurde unter Verwendung eines Berechnungsprogrammes (WindaqEx, DATAQ Instruments, Inc.) verarbeitet. Nach einer Äquilibrierungszeitspanne von 20 Minuten wurden Reize in Form von elektrischen Feldern durch zwei Platindrahtelektroden angelegt, die 4 cm voneinander entfernt oben und am Boden des Organbades getrennt waren. Die Temperatur wurde während des Experimentes bei 37° C gehalten.
  • Chemische Stimulation von glattem Muskelgewebe der Blase
  • Die Blasenstreifen wurden mit Rechteckimpulsen mit einer Dauer von 0,25 msec bei einer maximalen Spannung (100 V) stimuliert und eine Frequenzreaktionskurve konstruiert unter Verwendung von 10 oder 80 Schocks mit 1, 2, 5, 10, 20 oder 40 Hz. Nach der Elektrostimulation wurden 5, 10 oder 20 μM Carbachol zu den Blasenstreifen gegeben, um Kontraktionen zu induzieren. In parallelen Experimenten wurde 1 μM Atropin hinzugefügt, die Elektrostimulation wurde wie oben angewandt, und 50 μM Methylen-ATP wurden hinzugefügt, um Kontraktionen zu induzieren.
  • Färbung auf Innervation
  • Acetylcholin (Ach)-Färbung wurde verwendet, um die Reinnervation von MDC in glatten Muskeln abzuschätzen. Ach ist eine Färbung auf die motorische Endplatte, die die Anwesenheit von Nervenenden anzeigt. Nach der MDC-Injektion wurde Gewebe an den Tage 3, 15, 30 oder nach 6 Monate ausgeschnitten, auf Ach gefärbt, durch Mikroskopie beobachtet und fotografiert.
  • Statistische Analyse
  • Die Werte werden als Mittel ± Standardabweichungen angegeben. Ein „P"-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet. Der Student's-Test wurde verwendet.
  • MDC-Differenzierung
  • Muskelderivierte Vorläuferzellen, die wie in Beispiel 1 hergestellt worden waren, wurden hinsichtlich der zellulären Differenzierung untersucht. Alpha-SM-Aktin ist der früheste bekannte Marker des Phänotypen des glatten Muskels (K. M. McHugh, 1995, Dev. Dyn. 204: 278-90), und der Hauptmarker des myofibroblastischen Phänotyps (I. Darby et al., 1990, Lab. Invest. 63:21-9). Während der Muskelzelldifferenzierung nimmt die Expression von α-SM-Aktin ab, wohingegen die Expression von schnellem MyHC zunimmt. Die histochemische Analyse von mit MDC behandelten Blasengeweben unter Verwendung von α-SM-Aktin und schnellen MyHC-Markern zeigt die Differenzierung von MDC nach Injektion in die Stelle der Kryoverletzung. Am Tag 5 nach der Injektion in kryogeschädigtes Blasengewebe zeigen mehrere MDC (mindestens 20 %) eine α-SM-Aktin-Färbung (5B), was anzeigt, dass die Zellen noch undifferenziert sind. Nach 6 Monaten nach der Injektion sind jedoch nahezu alle MDC zu Myotubuli oder Muskelfasern differenziert, durch eine Abnahme der α-SM-Aktin-Färbung (5F) mit einer gleichzeitigen Zunahme der Färbung auf schnelles MyHC (5I) gezeigt wurde.
  • Muskelreinnervation
  • Weil Acetylcholin (Ach) an der motorischen Endplatte vorhanden ist, kann es als Indikator für Muskelinnveration dienen. Eine histochemische Analyse der mit MDC behandelten Blasengewebe unter Verwendung des Ach-Markers zeigt die Reinnervation von MDC nach der Injektion in Stellen mit Kryoschädigung. Am Tag 3 nach der Injektion in kryogeschädigtes Blasengewebe zeigen die injizierten MDC minimale Innervation, wie durch das vergleichsweise geringe Ausmaß der Ach-Färbung gezeigt ist (6A). Am Tag 15 nach der Injektion wird ein erhöhtes Ausmaß an Innervation beobachtet, wie durch das erhöhte Ausmaß der Ach-Färbung gezeigt ist (6B). Am Tag 30 nach der Injektion wird noch mehr Ach-Färbung beobachtet (6C), was ein Anzeichen für eine weitere Zunahme der Innervation ist. 6 Monate nach der Injektion wird eine umfangreiche Innervation beobachtet, wie durch eine ausgeprägte Ach-Färbung in dem Bereich, in den MDC injiziert wurden, angezeigt, bei geringer Vergrößerung betrachtet (6D). Diese Ergebnisse zeigen an, dass der Beckennerv in den Bereich der Blase einwächst, in den MDC injiziert wurden, und legt nahe, dass die MDC die Kontraktilität und die Funktion des Gewebes verbessern können, in das die Injektion vorgenommen wurde.
  • Untersuchungen zur Kontraktilitätsphysiologie
  • Um zu bestimmen, ob injizierte MDC die Funktion der behandelten Blasengewebe verbesserten, wurden mehrere Kontraktilitätsuntersuchungen durchgeführt (siehe oben). Tabelle 3 zeigt die Daten, die die Kontraktilitätsparameter von Blasenmuskel nach Kryoverletzung mit oder ohne MDC-Injektion zeigen. Tabelle 3
    Gruppe Nr. Kontraktionsampli 20 Hz/10 Schocks tude (mN/mg) 20 Hz/80 Schocks Geschwindigkeit (Ko 20 Hz/10 Schocks ntraktion) (mN/s) 20 Hz/80 Schocks Anzahl der Proben
    1 Schein 0,375 ± 0,24 0,697 ± 0,46 18,08 ± 8,15 15,56 ± 8,39 6
    MDC 0,368 ± 0,26 0,812 ± 0,31 16,23 ± 10,3 16,38 ± 7,54 6
    2 Schein 0,427 ± 0,17 0,966 ± 0,31 22,96 ± 8,93 24,56 ± 5,03 8
    MDC 0,539 ± 0,24 1,161 ± 0,55 27,86 ± 14,08 30,59 ± 13,05 8
    3 Schein 0,389 ± 0,14* 0,708 ± 0,26** 25,70 ± 5,87 24,24 ± 6,38 8
    MDC 0,564 ± 0,16* 1,139 ± 0,29** 30,59 ± 17,8 29,31 ± 15,3 8
    4 Normal 0,927 ± 0,23 1,748 ± 0,52 34,23 ± 8,82 29,05 ± 7,06 6
    • * p < 0,05. ** p < 0,01
  • Tabelle 3: Kontraktilitätsparameter von Blasenmuskeln nach Kryoverletzung. Die Werte stellen Mittel ± Standardabweichungen dar. Für die statistische Analyse wurde der Student's-Test für die Kontroll- und MDC-Injektionsgruppen durchgeführt. Gruppe Nr. 1: Gruppe mit schwerem Schaden mit unmittelbarer MDC-Injektion nach Kryoverletzung. Gruppe Nr. 2: Gruppe mit mildem Schaden mit MDC-Injektion 1 Woche nach der Kryoschädigung. Gruppe Nr. 3: Gruppe mit schwerem Schaden mit MDC-Injektion 1 Woche nach der Kryoschädigung. Gruppe Nr. 4: Normales Blasengewebe.
  • Die Gruppe mit schwerer Schädigung, der unmittelbar nach der Kryoverletzung MDC injiziert worden war (Gruppe 1), zeigte eine ähnliche Kontraktilität wie die Kontroll (Schein)-Gruppe (vgl. Kontraktilitätswerte, die in den Schein- und MDC-Reihen in Gruppe 1, Tabelle 3 gezeigt sind). Die Gruppe mit schwerer Schädigung, der eine Woche nach der Kryoschädigung MDC injiziert worden waren (Gruppe 3), zeigte jedoch eine erhöhte Kontraktionsamplitude (145 % und 161 % der Kontrollblase bei 20 Hz/10 Schocks bzw. 20 Hz/80 Schocks), verglichen mit der Kontrollgruppe (vergleiche Kontraktilitätsamplitudenwerte, die in den Schein- und MDC-Reihen und mit * in Tabelle 3 gezeigt sind). In ähnlicher Weise zeigte die Gruppe mit schwerer Schädigung, der eine Woche nach der Kryoschädigung MDC injiziert worden waren (Gruppe 3), eine erhöhte Kontraktionsgeschwindigkeit (119 % und 121 % der des Kontrollstreifens bei 20 Hz/10 Schocks bzw. 20 Hz/80 Schocks) verglichen mit der Kontrollgruppe (vgl. Kontraktilitätsgeschwindigkeitswerte in Schein- und MDC-Reihen in Gruppe 3, Tabelle 3). Die Gruppe mit milder Schädigung, der eine Woche nach der Kryoschädigung MDC injiziert worden waren (Gruppe 2), zeigte ebenfalls eine erhöhte Kontraktionsamplitude und -geschwindigkeit verglichen mit der Kontrollgruppe (vgl. Kontraktilitätsausmaße, die in den Schein- und MDC-Reihen für Gruppe 2, Tabelle 3 gezeigt ist). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass MDC-Injektion die Kontraktilität von kryogeschädigtem Blasenmuskelgewebe wiederherstellen kann und zeigen, dass MDC-basierte Zusammensetzungen zur Behandlung von Harninkontinenz verwendet werden können.
  • BEISPIEL 7: Weichteilgewebeverstärkung des Myokards
  • SD-Ratten wurden für die Operation wie oben beschrieben vorbereitet. Ein Einschnitt in die Brust wurde vorgenommen, um das Herz freizulegen. In die Kammerwand wurden 10 μl MDC-Suspension in HBSS (1-1,5 × 106 Zellen) unter Verwendung einer Hamilton-Mikrospritze injiziert. Am Tag 3 wurde der jede Injektionsstelle umgebende Bereich ausgeschnitten, für die histochemische Analyse vorbereitet, auf β-Galactosidase gefärbt, um den Ort und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen, die den LacZ-Marker tragen, mikroskopisch untersucht und fotografiert. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass MDC-Zusammensetzungen als Myokardweichteilgewebe-Verstärkungsmaterialien (7A und 7B) für die Behandlung einer Verletzung oder einer Schwache nach Herzversagen oder Myokardinfarkt verwendet werden können.
  • BEISPIEL 8: MDC-Injektion in Leber-, Milz- und Rückenmarkgewebe
  • SD-Ratten wurde für die Operation wie oben beschrieben vorbereitet. Ein Einschnitt in das Abdomen entlang der Mittellinie wurde vorgenommen, um die Leber und Milz freizulegen. An beiden Stellen wurden 10 μl MDC-Suspension in HBSS (1-1,5 × 106 Zellen) unter Verwendung einer Hamilton-Mikrospritze injiziert. Gleichzeitig wurden ein Einschnitt in den Rücken entlang der Mittellinie und eine teilweise Wirbelbogenentfernung vorgenommen, um das Rückenmark freizulegen. In das Rückenmarkgewebe der Stufe T10 wurde dann die MDC-Suspension in HBSS injiziert, wie es bei den Leber- und Milzgeweben vorgenommen wurde. Am Tag 4 wurde der jede Injektionsstelle umgebende Bereich ausgeschnitten, für die histochemische Analyse vorbereitet, auf β-Galactosidase gefärbt, um den Ort und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen, die den LacZ-Marker trugen, mikroskopisch untersucht und fotografiert. Diese Experimente zeigen, dass MDC-Zusammensetzungen verwendet werden können als Verstärkungsmaterialien für Leber-, Milz- und Rückenmarkweichteilgewebe (8A-8B, 9A-9B und 10A-10B), um verschiedene Leber-, Milz- und Rückenmarksverletzungen, -krankheiten oder -funktionsstörungen zu behandeln.
  • BEISPIEL 9: MDC-Behandlung von Knochendefekten
  • Isolierung von muskelderivierten Zellen
  • MDC wurden aus mdx-Mäusen erhalten, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Klonale Isolierung von PP6-muskelderivierten Vorläuferzellen
  • Um Klone aus der PP6-Zell-Population zu isolieren, wurden PP6-Zellen mit einem Plasmid transfiziert, das die LacZ-, Mini-Dystrophin- und Neomycin-Resistenz-Gene enthielt. Kurz gesagt wurde ein SmaI/SalI-Fragment, das das Neomycin-Resistenzgen aus pPGK-NEO enthielt, in die SmaI/SalI-Stelle des pIEPlacZ-Plasmids eingefügt, das das LacZ-Gen enthielt, wodurch das Plasmid pNEOlacZ erzeugt wurde. XhoI/SalI-Fragment aus DysM3, das die kurze Version des Dystrophin-Gens (K. Yuasa et al., 1998, FEBS Lett. 425:329-336; Geschenk von Dr. Takeda, Japan) enthält, wurde in die SalI-Stelle des pNEOlacZ eingefügt, um ein Plasmid zu erzeugen, das die Mini-Dystrophin-, LacZ- und Neomycin-Resistenz-Gene enthält. Das Plasmid wurde durch SalI-Verdau vor der Transfektion linearisiert.
  • PP6-Zellen wurden mit 10 μg des linearen Plasmides, das das Minidystrophin, LacZ und das Neomycin-Resistenz-Gen enthält, unter Verwendung des Lipofectaminreagenz (Gibco BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 3000 μg/ml G418 (Gibco BRL) 10 Tage lang selektiert, bis diskrete Kolonien erschienen. Kolonien wurden dann isoliert und expandiert, um eine große Menge der transfizierten Zellen zu erhalten, und anschließend auf die Expression von LacZ untersucht. Einer dieser von PP6 abgeleiteten Klone, mcl3, wurde für weitere Untersuchungen verwendet.
  • Immunhistochemie
  • PP6, mcl3 und Mausfiboblastenzellen wurden in einer Kulturschale mit 6 Reaktionsnäpfen ausplattiert und eine Minute lang mit kaltem Ethanol fixiert. Die Zellen wurden anschließend mit Phosphat gepufferter Saline (PBS) gewaschen und mit 5 % Pferdeserum für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die primären Antikörper wurden wie folgt in PBS verdünnt: anti-Desmin (1:100, Sigma), biotinylierter anti-Maus-CD34 (1:200, Pharmingen), Kanninchen-anti-Maus-Bcl-2 (1:500, Pharmingen), Kanninchen-anti-Maus-M-Cadherin (1:50, geschenkt von Dr. A. Wernig), Maus-anti-Maus-MyoD (1:100, Pharmingen), Maus-anti-Ratten-Myogen (1:100, Pharmingen), Kanninchen-anti-Maus-Flk-1 (1:100, Research Diagnostics) und biotinylierter Sca-1 (1:100, Pharmingen). Die Zellen wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit den primären Antikörpern inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit den geeigneten biotinylierten sekundären Antikörpern eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wurden die Zellen mit PBS abgespült, und dann bei Raumtemperatur mit 1/300-Streptavidin, konjugiert mit Cy3-Fluorochrom, eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Für jeden Marker wurde der Prozentsatz an gefärbten Zellen für 10 zufällig gewählte Felder mit Zellen berechnet.
  • Kryoschnitte von Muskelproben von einer 4 Wochen alten normalen Maus (C-57 BL/6J, Jackson Laborstories) wurden mit kaltem Aceton 2 Minuten lang fixiert und eine Stunde lang in 5 %-igem in PBS verdünntem Pferdeserum vorinkubiert. Für CD34, Bcl-2 und Kollagen Typ IV wurden die folgenden primären Antikörper verwendet: Biotin-anti-Maus-CD34 (1:200 in PBS, Pharmingen), Kanninchen-anti-Maus-Bcl-2 (1:1000, Pharmingen) und Kanninchen-anti-Maus-Kollagen Typ IV (1:100 in PBS, Chemicon). Für die Dystrophin-Färbung wurde Schaf-anti-Mensch-Y10-Antikörper (1:250-Verdünnung in PBS) als der primäre Antikörper verwendet, und das Signal wurde unter Verwendung von anti-Schaf-Biotin (1:250-Verdünnung in PBS) und Streptavidin-FITC (1:250-Verdünnung in PBS) verstärkt.
  • Stimulierung mit rhBMP-2, Osteocalcin-Färbung und Test auf alkalische Phosphatase
  • Die Zellen wurden dreifach mit einer Dichte von 1-2 × 104-Zellen pro Reaktionsnapf in mit Kollagen beschichteten Flaschen mit 12 Reaktionsnäpfen ausplattiert. Die Zellen wurden durch das Hinzufügen von 200 ng/ml rekombinantes menschliches BMP-2 (rhBMP-2) zu dem Wachstumsmedium stimuliert. Das Wachstumsmedium wurde an den Tagen 1, 3 und 5 nach dem anfänglichen Ausplattieren gewechselt. Eine Kontrollgruppe von Zellen wurde parallel ohne hinzugefügtes rhBMP-2 kultiviert. Nach 6 Tagen mit oder ohne rhBMP-2-Stimulierung wurden die Zellen unter Verwendung eines Mikrocytometers gezählt und auf Expression von Osteocalcin- und alkalischer Phosphatase analysiert. Für die Osteocalcin-Färbung wurden die Zellen mit Ziegen-anti-Maus-Osteocalcin-Antikörpern (1:100 in PBS, Chemikon) inkubiert, gefolgt von Inkubation mit anti-Ziegen-Antikörpern, die mit dem Cyo3-Fluorchrom konjugiert waren. Um die Aktivität der alkalischen Phosphatase zu messen, wurden die Zellysate hergestellt und unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits analysiert, das die Farbänderung des Reagens auf Grund der Hydrolyse von anorganischem Phosphat von P-Nitrophenylphosphat (Sigma) verwendet. Die sich ergebende Farbänderung wurde mit einem Spektrophotometer gemessen, und die Daten wurden in Form der internationalen Einheiten ALP-Aktivität pro Liter, normalisiert auf 106-Zellen, ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung des Student's-T-Tests analysiert (P < 0,05).
  • In vivo-Differenzierung von mcl3-Zellen in myogenen und osteogenen Linien
  • Myogen
  • Die mcl3-Zellen (5 × 105-Zellen) wurden intramuskulär in den Hintergliedmaßenmuskel von mdx-Mäusen injiziert. Die Tiere wurden 15 Tage nach der Injektion geopfert und das Muskelgewebe mit der Injektion wurde gefroren, kryomikrotomgeschnitten und auf Dystrophin-(siehe oben) und LacZ-Expression getestet. Um die LacZ-Expression zu testen, wurden die Muskelschnitte mit 1 % Glutaraldehyd fixiert und wurden dann mit X-Gal-Substrat (0,4 mg/ml 5-Bromchlor-3-indolyl-β-D-Galactosid (Boehringer Mannheim), 1 mM MgCl2, 5 mM K4Fe(CN)6 und 5 mM K3FE(CN)6 in Phosphat gepufferter Saline) 1-3 Stunden lang inkubiert. Die Schnitte wurden vor der Analyse mit Eosin gegengefärbt. In parallel geführten Experimenten wurden mcl3-Zellen (5 × 105-Zellen) intravenös in die Schwanzvene von mdx-Mäusen injiziert. Die Mäuse wurden 7 Tage nach der Injektion geopfert, und die Hintergliedmaßen wurden isoliert und auf das Vorhandensein von Dystrophin und β-Galactosidase wie beschrieben getestet.
  • Ostengen
  • Um das Adenvirus BMP-2-Plasmid (adBMP-2) zu konstruieren, wurde die rhBMP-2 codierende Sequenz aus dem BMP-2-125-Plasmid (Genetics Institute, Cambridge, MA), ausgeschnitten und in einen replikationsdefekten (E1- und E3-Gen deletiert) adenoviralen Vektor subkloniert, der den HuCMV-Promoter enthielt. Kurz gesagt wurde das BMP-2-125-Plasmid mit SalI verdaut, was ein 1237-Basenpaar-Fragment ergab, das die rhBMP-2-cDNA enthielt. Die rhBMP-2-cDNA wurde anschließend in die SalI-Stelle des pAd.lox-Plasmides eingefügt, was das Gen unter die Kontrolle eines HuCMV-Promoters stellte. Der rekombinante Adenvirus wurde durch die Co-Transfektion von pAd.lox mit psi-5-viraler-DNA in CRE-8-Zellen erhalten. Das sich dabei ergebende adBMP-2-Plasmid wurde bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.
  • Mcl3-Zellen wurden Trypsin-verdauend und unter Verwendung eines Mikrocytometers vor der Infektion gezählt. Die Zellen wurden mehrere Male unter Verwendung von HBSS (Gibco BRL) gewaschen. Adenviruspartikel, die einer Infektionsmultiplizität von 50 Einheiten entsprachen, wurden in HBSS vorgemischt, dann auf die Zellen geschichtet. Die Zellen wurden 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert und wurden dann mit einer gleichen Menge des Wachstumsmediums inkubiert. Injektion von 0,5-1,0 × 106-Zellen wurden unter Verwendung einer 30-Gange-Nadel auf einer gasdichten Spritze in exponierte Triceps surae von SCID-Mäusen (Jackson Laborstories) vorgenommen. An den Tagen 14-15 wurden die Tiere mit Methoxyfluoran betäubt und durch zervikale Dislokation geopfert. Die hinteren Gliedmaßen wurden durch Radiographie analysiert. Nachfolgend wurden die Triceps surae isoliert und in mit phosphatgepufferter Saline gepuffertem und in flüssigem Stickstoff vorgekühltem 2-Methylbutan blitzgefroren. Die gefrorenen Proben wurden in 5-10 μm Schnitte unter Verwendung eines Kryostaten (Microm, HM 505 E, Fisher Scientific) geschnitten und für die weitere Analyse bei –20°C gelagert.
  • RT-PCR-Analyse
  • Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des TRizol-Reagens (Life Technologies) isoliert. Die reverse Transkription wurde unter Verwendung des SuperScriptTM-Präamplifikationssystems für die Erststrang-cDNA-Synthese (Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Kurz gesagt wurden 100 ng Zufallshexamere an 1 μg Gesamt-RNA 10 Minuten lang bei 70°C annelliert und dann auf Eis gekühlt. Die reverse Transkription wurde mit 2 μl 10 × PCR-Puffer, 2 μl 25 mM MgCl2, 1 μl 10 mM dNTP-Mischung, 2 μl 0,1 M DTT und 200 Einheiten Superscript II-reverse Transkriptase ausgeführt. Die Reaktionsmischung wurde 50 Minuten lang bei 42°C inkubiert.
  • Die Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifikation der Ziele wurde in 50 μl Reaktionsmischung durchgeführt, die 2 μl des Produktes der Reaktion der reversen Transkriptase, 100 μl (5 Einheiten) Taq DNA-Polymerase (Life Technologies) und 1,5 mM MgCl2 enthielt. Die CD34-PCR-Primer wurden unter Verwendung von Oligo-Software konstruiert und wiesen die folgenden Sequenzen auf: CD34 UP: taa ctt gac ttc tgc tac ca (SEQ ID NO: 1); und CD34 DOWN: gtg gtc tta ctg ctg tcc tg (SEQ ID NO: 2). Die anderen Primer wurden gemäß früheren Studien konstruiert (J. Rohwedel et al., 1995, Exp. Cell Res. 220:92-100; D. D. Cornelilson et al., 1997, Dev. Biol. 191:270-283) und wiesen die folgenden Sequenzen auf: C-MET UP: gaa tgt cgt cct aca cgg cc (SEQ ID NO: 3), C-MET DOWN: cac tac aca gtc agg aca ctg c (SEQ ID NO: 4); MNF UP: tac ttc atc aaa gtc cct cgg tc (SEQ ID NO: 5); MNF DOWN: gta ctc tgg aac aga ggc taa ctt (SEQ ID NO: 6); BCL-2 UP: agc cct gtg cca cca tgt gtc (SEQ ID NO: 7); BCL-2 DOWN: ggc agg ttt gtc gac ctc act (SEQ ID NO: 8); MYOGENIN UP: caa cca gga gga gcg cga tct ccg (SEQ ID NO: 9); MYOGENIN DOWN: agg cgc tgt ggg agt tgc att cac t (SEQ ID NO: 10); MYOD UP: gct ctg atg gca tga tgg att aca gcg (SEQ ID NO: 11); and MYOD DOWN: atg ctg gac agg cag tcg agg-c (SEQ ID NO: 12).
  • Die folgenden PCR-Parameter wurden verwendet: 1) 94°C für 45 Sekunden; 2) 50°C für 60 Sekunden (CD34) oder 60°C für 60 Sekunden (für Myogenin und c-met); und 3) 72°C für 90 Sekunden über 40 Zyklen. Die PCR-Produkte wurden durch Agarose-TBE-Ethidiumbromid-Gele untersucht. Die Größen der erwarteten PCR-Produkte sind: 147 bp für CD34; 86 bp für Myogenin; und 370 bp für c-met. Um die Möglichkeit der Kontamination mit genomischer DNA auszuschließen, wurden zwei Kontrollreaktionen vervollständigt: 1) parallele reverse Transkription in Abwesenheit von reverser Transkriptase, und 2) Amplifikation von β-Aktin unter Verwendung eines Intron-umspannenden Primersets (Clonetech).
  • Schädeldefekttest
  • Drei 6-8 Wochen alte weibliche SCID-Mäuse (Jackson Laboratories) wurden in Kontroll- und Experimentgruppen verwendet. Die Tiere wurden mit Methoxyfluoran betäubt und geeignet auf den Operationstisch platziert. Unter Verwendung einer Klinge Nummer 10 wurde die Kopfhaut seziert, um den Schädel freizulegen, und das Periosteum wurde entfernt. Ein ungefähr 5 mm großer kreisförmiger Schädeldefekt über die volle Stärke wurde unter Verwendung eines zahnmedizinischen Bohrers erzeugt, mit minimaler Penetration der Dura. Ein Kollagenschwammmatrix (HelistatTM, Colla-Tec, Inc.) wurde mit 0,5-1,0 × 106 MDC entweder mit oder ohne adBMP-2-Transduktion eingesät und in den Schädeldefekt platziert. Die Kopfhaut wurde unter Verwendung eines 4-0-Nylon-Knochennahtmaterials verschlossen, und den Tieren wurde Nahrung und Aktivität gestattet. Nach 14 Tagen wurden die Tiere geopfert, und die Schädelpräparate beobachtet und dann mikroskopisch analysiert. Für von Kossa-Färbung wurden die Schädelpräparate in 4 % Formaldehyd fixiert und dann in 0,1 M AgNO3-Lösung 15 Minuten lang eingetaucht. Die Präparate wurden mindestens 15 Minuten lang gegenüber Licht exponiert, mit PBS gewaschen und dann mit Hematoxylin und Eosin zum Betrachten gefärbt.
  • Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung unter Verwendung von Y-Sonden
  • Kryoschnitte wurden 10 Minuten lang in 3:1 Methanol/Eisessig (v:v) fixiert und Luft getrocknet. Die Schnitte wurden dann in 70 % Formamid in 2 × SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M NaCitrat) pH 7,0 2 Minuten lang bei 70°C denaturiert. Nachfolgend wurden die Träger mit einer Serie von Ethanolwaschschritten (70 %, 80 % und 95 %) bei jeder Konzentration 2 Minuten lang entwässert. Die Y-Chromosom-spezifische Sonde (Y. Fan et al., 1996, Muscle Nerve 19:853-860) wurde unter Verwendung eines BioNick-Kits (Gibco BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers biotinyliert. Die biotinylierte Sonde wurde dann unter Verwendung einer G-50 Quick Spin-Säule (Boehringer Mannheim) aufgereinigt, und die aufgereinigte Sonde wurde zusammen mit 5 ng/ml sonifizierter Heringssperma-DNA lyophilisiert. Vor Hybridisierung wurde die Sonde in einer Lösung resuspendiert, die 50 % Formamid, 1 × SSC und 10 % Dextransulfat enthielt. Nach der Denaturierung für 10 Minuten bei 75°C wurde die Sonde auf die denaturierten Schnitte platziert und ihr wurde gestattet, bei 37°C über Nacht zu hybridisieren. Nach der Hybridisierung wurden die Schnitte mit 2 × SSC-Lösung pH 7,0 5 Minuten lang bei 72°C gespült. Die Schnitte wurden dann mit BMS-Lösung (0,1 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, 0,5 % NP-40, pH 8,0) abgespült. Die hybridisierte Sonde wurde mit Fluoreszein-markiertem Avidin (ONCOR, Inc.) nachgewiesen. Die Kerne wurden mit 10 ng/ml Ethidiumbromid in Vectashield-Aufstellmedium (Vector, Inc.) gegengefärbt.
  • Markeranalyse von mcl3 -Zellen
  • Die biochemischen Marker, die durch mcl3, PP6 und Fibroblastenzellen exprimiert werden, wurden unter Verwendung von RT-PCR und Immunhistochemie analysiert. Tabelle 4 (unten) zeigt, dass die mcl3-Zellen Flk-1, ein Maushomolog des menschlichen KDR-Genes, exprimierten, das kürzlich als ein Marker hematopoetischer Zellen mit stammzellartigen Merkmalen identifiziert wurde (B. L. Ziegler et al., supra), exprimierten, aber nicht CD34 oder CD45. Jedoch exprimierten andere klonale Isolate, die aus den PP6-MDC der vorliegenden Erfindung abgeleitet waren, CD34, ebenso wie andere PP6-Zell-Marker. Es wird von den Fachleuten auf dem Gebiet anerkannt werden, dass die hierin beschriebenen Vorgehensweisen verwendet werden können, um die PP6-muskelderivierte Vorläuferzellpopulation auszuklonieren und klonale Isolate zu erhalten, die Zellmarker exprimieren, die charakteristisch für die muskelderivierten Vorläuferzellen sind. Solche klonalen Isolate können gemäß den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Z. B. exprimieren die klonalen Isolate Vorläuferzellmarker, einschließlich Desmin, CD34 und Bcl-2. Bevorzugerweise exprimieren die klonalen Isolate auch die Sca-1- und Flk-1-Zellmarker, exprimieren aber nicht die CD45- oder c-Kit-Zellmarker. Tabelle 4
    PP6-Zellen MC13-Zellen Fibroblasten
    Imm RT-PCR Imm RT-PCR Imm RT-PCR
    desmin + na + na – na
    CD34 + + – – – –
    Bcl-2 + na +/– na – na
    Flk-1 + na + na – na
    Sca-1 + na + na – na
    M –/+ na + na – na
    Cadherin
    Myogenin +/– + +/– + – –
    c-met na + na + na –
    MNF na + na + na –
    MyoD –/+ + na + na –
    c-Kit – na – na na na
    CD45 – na – na na na
    Tabelle 4: Durch mdx PP6-, mdx mcl3- und Fibroblastenzellen exprimierte Zellmarker. Die Zellen wurden wie oben beschrieben isoliert und durch immunhistochemische Analyse untersucht. „–" zeigt an, dass 0 % der Zellen Expression zeigten; „+" zeigt an, dass > 98 % der Zellen Expression zeigten; „+/–" zeigt an, dass 40-80 % der Zellen Expression zeigten; „–/+" zeigt an, dass 5-30 % der Zellen Expression zeigten; „na" zeigt an, dass keine Daten verfügbar sind.
  • In vivo-Lokalisation von CD34+- und Bcl-2+-Zellen
  • Um den Ort der CD34+- und Bcl-2+-Zellen in vivo zu identifizieren, wurden Muskelgewebeschnitte der Triceps surae von normalen Mäusen unter Verwendung von anti-CD34- und anti-Bcl-2-Antikörpern gefärbt. Die CD34-positiven Zellen stellten eine kleine Population von muskelderivierten Zellen dar (12A), die auch positiv für Desmin waren (12B). Das gleichzeitige Färben der CD34+-, Desmin+-Zellen mit Antikollagen Typ IV-Antikörper lokalisiert sie innerhalb der Basallamina (12B und 12D). Wie durch die Pfeilspitzen in den 12A-D gezeigt, waren auch kleine Blutgefäße für CD34 und Kollagen Typ IV positiv, aber sie co-lokalisierten nicht mit der Kernfärbung. Die Expression von CD34 durch vaskuläre Endothelzellen wurde in früheren Studien gezeigt (L. Fina et al., supra).
  • Die Bcl-2+-, Desmin+-Zellen wurden in ähnlicher Weise identifiziert (12E-12H) und waren innerhalb der Basallamina lokalisiert (12F und 12H). Die Schnitte wurden auch auf M-Cadherin gefärbt, um den Ort von Satellitenzellen zu identifizieren (12I). Die Satellitenzellen wurden an ähnlichen Stellen wie die CD34+-, Desmin+- oder Bcl-2+-, Desmin+-Zellen identifiziert (Pfeil, 12I). Jedoch waren mehrfache Versuche, CD34 oder Bcl-2 mit M-Cadherin zu lokalisieren, erfolglos, was nahe legt, dass die M-Cadherin exprimierenden Zellen weder Bcl-2 noch CD34 coexprimieren. Dies ist konsistent damit, dass PP6-Zellen hohe Konzentrationen von CD34 und Bcl-2 exprimieren, aber minimale Konzentrationen von M-Cadherin exprimieren, wie hierin offenbart.
  • In vitro-Differenzierung von klonalen Muskelvorläuferzellen zur osteogenen Linie
  • Mcl3-Zellen wurden hinsichtlich ihres osteogenen Differenzierungspotentials durch Stimulierung mit rhBMP-2 beurteilt. Die Zellen wurden auf Kulturschalen mit 6 Reaktionsnäpfen ausplatiert und bis zur Konfluenz in Gegenwart oder Abwesenheit von 200 ng/ml rhBMP-2 angezogen. Innerhalb von 3-4 Tagen zeigten gegenüber rhBMP-2 exponierte mcl3-Zellen dramatische gestaltverändernde Veränderungen verglichen mit Zellen ohne rhBMP-2. Bei Abwesenheit von rhBMP-2 begannen mcl3-Zellen zu vielkernigen Myotubuli zu fusionieren (13A). Wenn sie jedoch gegenüber 200 ng/ml rhBMP-2 exponiert wurden, blieben die Zellen einkernig und fusionierten nicht (13B). Wenn die Dichte eine Konfluenz von > 90 % erreichte, fusionierte die unbehandelte Kultur, um multiple Myotubuli zu bilden (13C), wohingegen die behandelten Zellen rund und hypertroph wurden (13D). Unter Verwendung von Immunhistochemie wurden diese hypertrophen Zellen auf die Expression von Osteocalcin analysiert. Osteocalcin ist ein Matrixprotein, das auf Knochen abgelagert und spezifisch durch Osteoblasten exprimiert wird. Im Gegensatz zu der unbehandelten Gruppe zeigten die rhBMP-2-behandelten hypertrophen Zellen eine erhebliche Expression von Osteocalcin (13E), was somit darauf hindeutet, dass mcl3-Zellen in der Lage sind, nach Exponierung gegenüber rhBMP-2 zu Osteoblasten zu differenzieren.
  • Die Mcl3-Zellen wurden dann auf die Expression von Desmin nach rhBMP-2-Stimulierung analysiert. Neu isolierte mcl3-Zellen zeigten einheitliche Desmin-Färbung (14A und 14B). Innerhalb von 6 Tagen nach Exponierung gegenüber rhBMP-2 zeigten nur 30-40 % der mcl3-Zellen Desmin-Färbung. Bei Abwesenheit von rhBMP-2-Stimulierung zeigten ungefähr 90-100 % der mcl3-Zellen Desmin-Färbung (14C). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Stimulierung von mcl3-Zellen mit rhBMP-2 einen Verlust des myogenen Potentials bei diesen Zellen bewirkt.
  • Zusätzlich wurden mcl3-Zellen auf die Expression von alkalischer Phosphatase nach rhBMP-2-Stimulierung analysiert. Die alkalische Phosphatase wurde als biochemischer Marker für die Osteoblastendifferenzierung verwendet (T. Katagiri et al., 1994, J. Cell. Biol., 127:1755- 1766). Wie in 14D gezeigt, erhöhte sich die Expression der alkalischen Phosphatase durch mcl3-Zellen um mehr als 600-fach in Reaktion auf rhBMP-2. Die als Kontrolle verwendeten PP1-4-Zellen zeigten keine erhöhte Aktivität der alkalischen Phosphatase in Reaktion auf rhBMP-2 (14D). Insgesamt zeigen diese Daten, dass die Zellen eines klonalen PP6 Isolates, z. B. mcl3-Zellen, ihre myogenen Marker verlieren und durch die osteogene Linie in Reaktion auf Exposition gegenüber rhBMP-2 in vitro differenzieren können.
  • In vivo-Differenzierung von mcl3-Zellen zu myogenen und osteogenen Linien
  • Um zu bestimmen, ob mcl3-Zellen in der Lage waren, durch die myogene Linie in vivo zu differenzieren, wurden die Zellen in das Muskelgewebe der hinteren Gliedmaßen von mdx-Mäusen injiziert. Die Tiere wurden 15 Tage nach der Injektion geopfert, und ihre Hintergliedmaßen wurden für die histologische und immunhistochemische Analyse geerntet. Mehrere Muskelfasern zeigten in der die Injektionsstelle umgebenden Region LacZ- und Dystrophin-Färbung (15A und 15B), was anzeigt, dass mcl3-Zellen durch die myogene Linie in vivo differenzieren und die Muskelregeneration erhöhen und Dystrophin im dystrophen Muskel wiederherstellen können.
  • In einem parallelen Experiment wurden mcl3-Zellen intravenös in die Schwanzvene von mdx-Mäusen injiziert. Die Tiere wurden 7 Tage nach der Injektion geopfert, und die Muskeln der Hintergliedmaßen wurden für die histologische und immunhistochemische Analyse geerntet. Mehrere Muskelzellen aus Hintergliedmaßen zeigten eine LacZ- und Dystrophin-Färbung (15C-15D; siehe auch ***), was nahe legt, dass mcl3-Zellen systemisch an das Zielgewebe zur Rettung der Dystrophin-Expression abgegeben werden können.
  • Um die pluripotenten Merkmale von mcl3-Zellen in vivo zu untersuchen, wurden die Zellen mit einem adenoviralen Vektor transduziert, der für rhBMP-2 codiert (adBMP-2). Die mcl3-Zellen mit adBMP-2 wurden anschließend in die hinteren Gliedmaßen von SCID-Mäusen injiziert. Die Tiere wurden 14 Tage nach der Injektion geopfert und die Hintergliedmaßen wurden für die histochemische und immunhistochemische Analyse entfernt. Enzym-verbundene Immunosorbenztest (ELISA)-Analyse von mcl3-Zellen, die mit adBMP-2 transduziert waren, zeigte, dass die infizierten Zellen in der Lage waren, rhBMP-2 herzustellen. Die radiographische Analyse der hinteren Gliedmaßen von SCID-Mäusen, die eine Injektion erhalten hatten, zeigte eine robuste ektopische Knochenbildung innerhalb von 14 Tagen nach der Injektion (15E). Die histologische Analyse unter Verwendung von LacZ-Färbung des ektopischen Knochens zeigt, dass LacZ-positive mcl3-Zellen einheitlich innerhalb der mineralisierten Matrix oder Lücken lokalisiert waren, einer typischen Stelle, wo Osteoblasten und Osteozyten gefunden werden (15F).
  • Um die Rolle der mcl3 bei der Bildung von ektopischen Knochen weiter zu bestätigen, wurden die Muskelschnitte auch auf die Anwesenheit von Dystrophin gefärbt. Wie in 15G gezeigt, enthielt der ektopische Knochen Zellen, die für Dystrophin stark positiv waren, was nahe legt, dass die mcl3-Zellen an der Knochenbildung unmittelbar teilnehmen. Als Kontrolle wurden ähnliche Experimente mit Fibroblasten durchgeführt. Von Fibroblasten wurde festgestellt, dass sie eine robuste ektopische Knochenbildung unterstützen, aber die injizierten Zellen wurden gleichmäßig außerhalb des Knochens gefunden, und es konnten keine innerhalb der mineralisierten Matrix lokalisiert werden. Dies legt nahe, dass die Fibroblasten in der Lage sind, rhBMP-2 abzugeben, um ektopischen Knochen zu bilden, dass sie aber nicht in der Lage sind, zu Osteoblasten zu differenzieren. In diesem Fall stammen die an der Mineralisierung des ektopischen Knochens teilnehmende Zellen mit größter Wahrscheinlichkeit aus dem Wirtsgewebe. Somit zeigen diese Ergebnisse, dass mcl3-Zellen sowohl in vivo als auch in vitro zu Osteoblasten differenzieren können.
  • Verstärkung des Knochenheilens durch genetisch veränderte muskelderivierte Zellen
  • Schädeldefekte (ungefähr 5 mm) wurden bei hinsichtlich des Skeletts ausgereiften (6-8 Wochen alten) weiblichen SCID-Mäusen unter Verwendung eines zahnmedizinischen Bohrers wie oben beschrieben erzeugt. Frühere Experimente haben gezeigt, dass 5 mm-Schädeldefekte „nicht heilend" sind (P. H. Krebsbach et al., 1998, Transplantation 66:1272-1278). Der Schädeldefekt wurde mit einer Kollagenschwammmatrix gefüllt, die mit adBMP-2 transduzierten oder nicht-transduzierten mcl3-Zellen angeimpft war. Diese Mäuse wurden nach 14 Tagen geopfert, und das Heilen des Schädeldefektes wurde analysiert. Wie in 16A gezeigt, zeigte die mit den mcl3-Zellen ohne rhBMP-2 behandelte Kontrollgruppe keine Anzeichen eines Heilen des Defektes. Im Gegensatz dazu zeigte die Experimentalgruppe, die mit den mcl3-Zellen behandelt worden war, die transduziert worden waren, um rhBMP-2 zu exprimieren, eine nahezu vollständige Schließung des Schädeldefektes nach 2 Wochen (16B). Die von Kossa-Färbung, die mineralisierten Knochen färbt, zeigte eine robuste Knochenfärbung in der Gruppe, die mit mcl3-Zellen behandelt worden war, die transduziert worden waren, um rhBMP-2 zu exprimieren (16D), es wurde aber eine minimale Knochenbildung in der Kontrollgruppe beobachtet (16C).
  • Der Bereich des neuen Knochens in der Experimentalgruppe wurde durch Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) mit einer für das Y-Chromosom spezifischen Sonde analysiert, um transplantierte Zellen zu identifizieren. Wie in 16E gezeigt, wurden hinsichtlich des Y-Chromosoms positive Zellen innerhalb des neu gebildeten Knochens identifiziert, was eine aktive Teilnahme der transplantierten Zellen an der Knochenbildung unter dem Einfluss von rhBMP-2 zeigt. Die hinsichtlich des Y-Chromosoms negativen Zellen wurden ebenfalls innerhalb des neu gebildeten Schädels identifiziert, und zeigen somit ebenfalls eine aktive Beteiligung der aus dem Wirt stammenden Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass mcl3-Zellen das Heilen eines „nicht heilenden" Knochendefektes nach der Stimulierung mit rhBMP-2 vermitteln können, und dass die MDC der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von Knochendefekten, -verletzungen oder -traumata verwendet werden können.
  • BEISPIEL 10: Behandlung von Knochendefekten mit nicht-autologen (allogenen) MDSC
  • Verfahren
  • Für die in diesem Beispiel beschriebenen Experimente verwendeten normale Mäuse (C57 BL/6J) oder mdx-Mäuse (C57BL/10ScSn mdx/mdx-Mäuse) wurden von den Jackson Laborstories (Bar Harbor, ME) gekauft und als Spender bzw. Wirte verwendet.
  • Zur Herstellung von Muskel-derivierten Stammzell-(MDSC) und Satellitenzell (scs)-Kulturen wurden die Muskeln der Hintergliedmaßen von neugeborenen (3-5 Tage alten) normalen Mäusen entfernt und die Muskelzellen durch die Zugabe von 0,2 % Kollagenase-Typ XI bei 37 °C 1 Stunde lang enzymatisch abgelöst. 2,4 Einheiten/ml Dispase wurden 45 Minuten lang hinzugegeben und 0,1 % Trypsin 30 Minuten lang. Das Muskelzellextrakt wurde anschließend auf mit Kollagen beschichteten Flaschen in Proliferationsmedium (DMEM enthielt 10 % Pferdeserum, 10 % fötales Rinderserum, 0,5 % Hühnerembryoextrakt und 1 % Penicillin/Streptomycin) vorplatiert. Die scs der frühen Vorplatten hefteten sich an das Flaschensubstrat in 1-4 Tagen an, während die mdsc wie beschrieben 5-7 Tage benötigten (z. B. PP5-6).
  • 0,35-0,74 × 106 Zellen sowohl von den späten Vorplatten (LP), (PP5 oder PP6) und der frühen Vorplatte (EP), (PP1-2) wurden in jeden Hintergliedmaßenmuskel von mdx-Mäusen durch einzelne Punktinjektion injiziert. Muskeln, die eine Injektion enthalten hatten, wurden 10 bzw. 30 Tage nach der Transplantation ausgeschnitten und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Kryoschnitte wurden für die immunhistochemische Analyse aus den Muskeln präpariert, die eine Injektion enthalten hatten. Für die immunhistochemische Analyse von Muskelquerschnitten wurde Dystrophin-Färbung durchgeführt. Die Färbung wurde unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (Nikon Optiphot) beobachtet, und die Anzahl von Dystrophin-positiven (Dystrophin+)-Zellen gezählt.
  • Zehn Tage nach der Injektion wurde eine große Transplantateinwachsung mit einer riesigen Anzahl von Dystrophin+-Muskelfasern in den MDSC [LP]-injizierten Muskeln beobachtet (17C und 17D). Verglichen mit MDSC [EP]-injiziertem Muskel (17A und 17B), enthielt die MDSC [LP]-Transplantateinwachsung viele kleine Muskelfasern, was nahe legt, dass die injizierten MDSC [LP]-Zellen in vivo eine hohe Proliferationsfähigkeit aufweisen. Bei beiden Muskeln wurde die gleiche Anzahl von Muskelzellen injiziert. Die Anzahl von Dystrophin+-Muskelfasern in dem Muskel, in den MDSC [LP] injiziert wurden, war ungefähr 5 Mal höher als die in dem Muskel, in den MDSC [EP] (scs) injiziert wurden (2,798 +/– 1,114, n = 4 in mdsc gegen 430 +/– 148, n = 6 in EP; Mittel +/– SD).
  • Zusätzlich war eine größere Anzahl von Dystrophin+-Muskelfasern in der Transplantateinwachsung 30 Tage nach der Injektion von MDSC [LP] vorhanden (17E und 17F). Wie oben beschrieben überlebten die meisten der Dystrophin+-Muskelfasern, die sich 10 Tage nach der Injektion gebildet hatten, 20 Tage später am Tag 30. Es wurde festgestellt, dass die MDSC der späten Platte (z. B. PP5-6) mehr Satellitenzellen im Wirtsmuskel entstehen ließen, als es die Zellen der frühen Platte (z. B. PP1-2) taten, was zu der großen Anzahl von Dystrophin+-Muskelfasern in dem mit späten Platten injizierten Muskel beitragen könnte. Muskelderivierte Stammzellen verbesserten die Effizienz der Zelltransplantation in dystrophen Muskeln erheblich. Zusätzlich zu der hohen Selbsterneuerungsfähigkeit, die bei Zellen der späten Platte bestätigt wurde, umgehen die MDSC-Zellen eine Immunabstoßung, die wahrscheinlich ein Faktor für die hohe Überlebensrate von Zellen der späten Platte in nicht-autologem Wirtsmuskel ist.
  • BEISPIEL 11: Verstärkung der Wirbelscheibe
  • Weibliche Kaninchen wurden für die Operation in der lateralen Stellung unter Halothanbetäubung vorbereitet. Ein perispinaler Einschnitt wurde im Bereich der T4-L2-Wirbel durchgeführt, um die Scheiben freizulegen. In die Scheiben wurden 10 μl einer Suspension Muskel-derivierter Vorläuferzellen, die den LacZ-Marker trugen, in HBSS (1-1,5 × 106-Zellen) unter Verwendung einer Hamilton-Mikrospritze injiziert. Am Tag 10 nach der Injektion wurde die Scheibe ausgeschnitten, für die histochemische Analyse vorbereitet, auf β-Galactosidase gefärbt, um die Lage und Lebensfähigkeit der den LacZ-Marker tragenden Zellen zu bestimmen, mikroskopisch untersucht und photographiert. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass MDC-Zusammensetzungen als Scheibenverstärkungsmaterialien verwendet werden können (20A und 20B) zur Behandlung von kongenitalen, degenerativen oder traumatischen Scheibensymptomen, Verletzung oder Zuständen, die Rückenschmerzen und Mängel der Scheibe und der Wirbelsäule umfassen. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (22)

  1. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken des ösophagealen Muskelgewebes oder gastroösophagealen Muskelgewebes bei einem Säuger, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um das ösophageale oder gastroösophageale Muskelgewebe zu verstärken oder zu verdicken.
  2. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken des Sphinktermuskelgewebes bei einem Säuger, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um das Sphinktermuskelgewebe zu verstärken oder zu verdicken.
  3. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken von Gewebe ausgewählt unter Blase, Harnröhre oder Harnröhrenmuskelgewebe bei einem Sauger, wobei die Zusammensetzung in eines' Menge vorliegt, die ausreicht, um das Blasen-, Harnröhren- oder Harnröhrenmuskelgewebe zu verstärken oder zu verdicken.
  4. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken einer kosmetischen oder ästhetischen Weichteildefektstelle bei einem Säuger, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um die kosmetische oder ästhetische Defektstelle zu verstärken oder zu verdicken.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die kosmetische oder ästhetische Defektstelle aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Runzeln, Hautvertiefungen nichttraumatischen Ursprungs, Rhytiden, Schwangerschaftsstreifen, eingedrückten Narben, durch Akne vulgaris verursachten Narben, Unterentwicklung der Lippe, Gesichtsvertiefungen, dermatologischen Läsionen und Gesichtsvertiefungen um die Augen.
  6. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken von Gewebe umfassend eine oder mehrere Hautvertiefungen, Wunden, Risse oder Öffnungen bei einem Säuger, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um die Hautvertiefung, Wunde, den Riss oder die Öffnung zu verstärken oder zu verdicken.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Hautvertiefung, Wunde, der Riss oder die Öffnung ausgewählt sind unter Läsionen, Divertikeln, Zysten, Fisteln, Aneurismen und Wunden als Folge von Verletzung, Trauma, operativem Eingriff oder Krankheit.
  8. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken von Muskelgewebe bei einem Säuger, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um das Muskelgewebe zu verstärken oder zu verdicken, wobei das Muskelgewebe ausgewählt ist unter (a) Verdauungsgewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Magen-, Darm-, Zungen-, Speiseröhre-, Magenkranz- und Analgewebe; (b) Geschlechtsorgangewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gebärmutter-, Vaginal-, Klitoris-, Eileiter-, Gebärmutterhals-, Penis- und Samenleitergewebe; (c) urologischem Gewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Niere, Blase, Harnröhre, ureterischem und Sphinktergewebe; oder (d) Atemwegsgewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Luftröhren- oder Lungengewebe.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Verstärken und Verdicken der Behandlung einer Schwäche oder Funktionsstörung dient, die (a) eine Folge einer sportbedingten Verletzung ist; oder (b) aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus vesiko-ureterischem Rückfluss, Harninkontinenz, Stuhlinkontinenz und gastroösophagealem Rückfluss.
  10. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken oder Verdicken (a) von Nichtmuskelweichteil oder (b) Nichtmuskel-Nichtknochenweichteil bei einem Säuger, wobei die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um (a) das Nichtmuskelgewebe oder (b) das Nichtknochen-Nichtmuskelgewebe zu verstärken oder zu verdicken.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Verstärken oder Verdicken zur Reparatur einer Defektstelle führt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Läsionen, Rissen, Divertikeln, Zysten, Fisteln, Aneurismen, Wunden als Folge von Verletzung, Trauma, operativem Eingriff und Krankheit im Nichtmuskelweichteil oder dem Nichtmuskel-Nichtknochenweichteil.
  12. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Nichtmuskel-Nichtknochenweichteil a) Verdauungsgewebe ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mund-, Darm-, Speiseröhre-, Magenkranz-, Pankreas-, Leber-, Gallenblasen- und Analgewebe; (b) Geschlechtsorgangewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gebärmutter-, Vaginal-, Klitoris-, Eileiter-, Vulva-, Gebärmutterhals-, Penis-, Hodensack-, Hoden- und Samenleitergewebe; (c) urologischem Gewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Niere, Blase, Harnröhre, ureterischem und Sphinktergewebe; (d) Atemwegsgewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Luftröhren- und Lungengewebe; (e) Nervengewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nerv, Rückenmark, Wirbelscheibe und Hirngewebe; und (f) Epithelgewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Haut und Lumengewebe.
  13. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend (i) isolierte, Desmin exprimierende, muskelderivierte Vorläuferzellen (MDC), die eine Langzeitüberlebensfähigkeit in situ aufweisen, oder eine klonale Population derselben und (ii) einen physiologisch akzeptablen Träger, ein physiologisch akzeptables Vehikel oder Verdünnungsmittel für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Wiederherstellen oder Verbessern der Kontraktilität glatter Muskeln, wobei der glatte Muskel ein Magen-Darm-Muskel ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem glatten Speiseröhremuskel, glatten Magenmuskel, glatten Magenkranzmuskel und glatten Darmmuskel; und wobei des Weiterem die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um die Kontraktilität des glatten Muskels wiederherzustellen oder zu verbessern.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Wiederherstellen oder Verbessern des Magen-Darm-Muskels zum Bessern oder zur Korrektur von Gastroparese führt.
  15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 oder 13, wobei die MDC in der Zusammensetzung des Medikaments heterologe DNA enthalten, die ein oder mehrere aktive Biomoleküle kodiert und wobei die Biomoleküle durch die Zellen exprimiert werden, wodurch die Behandlung des Gewebes unterstützt wird, wobei das aktive Biomolekül aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einem oder mehreren Zellwachstumsfaktoren, Zelldifferentierungsfaktoren, Zellsignalisierungsfaktoren und programmierten Zelltotfaktoren.
  16. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 oder 13, wobei der Träger ein absorptionsfähiges oder haftendes Material umfasst.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Träger Kollagenschwammmaterial ist.
  18. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Zusammensetzung des Weiteren eine Schwäche oder Funktionsstörung im Gewebe bessert oder behandelt.
  19. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 oder 13, wobei das Medikament in der Lage ist, in das Gewebe eingespritzt oder endoskopisch verabreicht zu werden.
  20. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 oder 13, wobei die Zusammensetzung MDC umfasst, die zum Gewebe autolog sind.
  21. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 oder 13, wobei die Zusammensetzung MDC umfasst, die zum Gewebe allogen sind.
  22. Verwendung nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, wobei die Zusammensetzung MDC umfasst, die aus einer menschlichen Quelle erhalten werden.
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