JP2005522979A - 細胞移植方法及び試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、(a)不死化しない骨髄幹細胞を供給するステップと、(b)前記細胞を心筋芽細胞に分化させるように誘導する条件下で前記骨髄幹細胞を培養するステップと、(c)ステップ(b)の細胞の分化状態をモニタリングするステップと、(d)前記細胞の約10%〜100%が心筋芽細胞の時、ステップ(b)の細胞を採収するステップを含む、哺乳類心筋組織に移植するための細胞の生産方法に関する。
Description
BMSCsの治療剤としての可能性にも拘わらず、現在心臓組織に細胞を移植する方法においては患者組織への移植物のとり込み率が低く、臨床的にまだ不向きである。その例として、BMSCsを移植したマウスのうち40%についてのみ心筋組織が回復されたとOrlicらによって報告された(非特許文献1)。
従って、高い細胞とり込み率と高い細胞生存率を有する細胞移植方法が求められている。
従って、本発明は哺乳類(例えば、ヒト)心筋組織に移植するための細胞を生産する方法を提供するものである。本方法は(a)不死化しない幹細胞を供給するステップと、(b)心筋芽細胞(例えば、心筋細胞前駆体)に誘導する条件下で細胞を培養するステップと、(c)ステップ(b)の細胞の分化状態をモニタリングするステップと、(d)採収された細胞の約10%〜約100%が心筋芽細胞の時、ステップ(b)の細胞を採収するステップを含んでいる。細胞は、例えばヒト、ブタ、又はヒヒのBMSCsであり得る。実施態様の一つとして、本発明の方法は哺乳類(例えば、ヒト)にステップ(d)の細胞を移植するステップ(e)を更に含む。移植は自家移植、即ち治療する哺乳類から細胞を得た後これを移植するものであり得る。採収した細胞のうち少くとも約15%、20%、30%、40%又は50%が心筋芽細胞(例えば、心筋細胞前駆体)であることが望ましい。採収した細胞のうち多くは約60%、70%、80%、90%、95%又は99%が心筋芽細胞であることが望ましい。最も望ましくは、採収した細胞のうち約50%〜約80%が心筋芽細胞である。
心筋梗塞によって、梗塞した部位への血液供給が減少すれば、内因性心筋細胞が損傷される。移植された細胞の生存率を高めるためには細胞が移植された哺乳類が細胞生存に必要な栄養分と酸素を供給する血管網を創出ことが望ましい。
心外膜から心筋層に移動した血管平滑筋細胞前駆体と内皮細胞前駆体から心筋層の冠状血管構造が形成されるという点に基づき、心筋細胞前駆体又は心筋細胞と共に内皮細胞前駆体と血管平滑筋細胞前駆体を移植することが、治療学的に大事な心筋細胞の生存に求められる血管網形成を容易にすることと判断される。梗塞された心筋層は心筋細胞前駆体、内皮細胞前駆体と血管平滑筋細胞前駆体とを組み合わせて新たな血管を形成しつつ新たな心筋細胞を再生することによって治癒される。一例として、細胞前駆体は生体外(ex vivo)で幹細胞に由来するものである。
従って、第2の特徴として、本発明は、また、哺乳類(例えば、ヒト)の心筋組織に移植するために内皮細胞に分化されるように誘導された細胞を生産する方法を提供する。本方法は(a)不死化しない幹細胞の集団を供給するステップと、(b)幹細胞が内皮細胞になる条件下で細胞を培養するステップと、(c)細胞のうち約10%〜約100%が内皮細胞前駆体の時、ステップ(b)の細胞を採収するステップとを含む。
一例としては、各注射毎に1×106個の心筋細胞前駆体を他の二つの細胞と共に約10:1:1(心筋細胞前駆体:内皮細胞前駆体:血管平滑筋細胞前駆体)の比率で心筋層に注入する。また、他の比率でも使用できる。例えば、心筋細胞前駆体と内皮細胞前駆体又は血管平滑筋細胞前駆体の比率が1:1〜50:1、又はそれ以上にすることが出来る(例えば、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1、又はそれ以上)。一例として、心筋細胞前駆体:内皮細胞前駆体:血管平滑筋細胞前駆体の比率が10:2:1が挙げられる。注入の間に、各細胞型は、内皮細胞前駆体は心臓内膜に近く、血管平滑筋細胞前駆体は中間に、心筋細胞前駆体は心臓外膜に近くと言うように(横に又は垂直に)層状となる。他の方法としては、移植する前に三種の細胞を、例えば10:1:1(心筋細胞前駆体:内皮細胞前駆体:血管平滑筋細胞前駆体)の細胞数比率で混合し、混合物として心筋層に注入することもできる。血管形成を向上させるために、例えばVEGF(例えば1-10μMで)のような血管形成剤を注入した細胞と混合することができる。
分裂細胞は分裂後の細胞よりも心筋層によりとり込まれやすいので、ステップ(c)の移植する細胞のうち少くとも約25%、50%、75%、90%、95%或いはそれ以上が分裂細胞前駆体(例えば、心筋細胞前駆体、内皮細胞前駆体、又は血管平滑筋細胞前駆体)であることが望ましい。
更にもう一つの特徴として、本発明は、その約10%〜100%が血管平滑筋細胞前駆体である幹細胞由来細胞集団が薬剤学的に許容される担体や賦形剤に含有される医薬組成物を提供する。
細胞は幹細胞(例えば、BMSCs)に由来するものであることが望ましい。血管形成を向上させるために、血管形成剤が含まれることが望ましい(例えば、1〜10μMのVEGF)。更に、本発明の移植細胞の生存率を高めるために注入した細胞をカスパーゼ阻害剤(例えばzVADfmk)のような抗細胞壊死剤で処理することも出来る。
前述した方法のうちモニタリングステップ(c)はレポータ遺伝子で形質移入されたカプセル化BMSCsの分化をモニタリングすることが望ましい。モニタリングに使用されるBMSCsは培養したBMSCsに対し、自己由来、同種、又は異種であり得る。
“BMSC”はCD45のない(CD45−)骨髄間充織由来幹細胞を意味する。またBMSCsは“骨髄幹細胞”及び"骨髄多潜在性細胞前駆体"とも呼ばれる。
ここで、“核酸”はDNA又はRNAを意味する。“核酸分子”はデオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖重合体である。特に言及しなければ、一本鎖核酸分子配列の左手方向は5'末端であり、二本鎖核酸分子の左手方向は5'方向とされる。
“プロモータ”は解読開始コドンの上流に位置し、RNAポリメラーゼと転写を開始する他のタンパク質を認識し結合させる核酸領域を意味する。“ヒトプロモータ”はヒト細胞で転写を開始するプロモータであって、ヒト細胞に由来するものと由来しないものとがある。“Csx/Nkx2.5プロモーター”はCsx/Nkx2.5遺伝子のプロモータ部位から由来したもので、異種核酸分子と機能的に連結されている場合、心臓細胞内において該当分子の転写を開始できる(転写を支援できる転写培地中に存在する場合)。
“機能的に連結された”は、適した転写培地で核酸分子の転写を誘導するための方式で二つ以上の核酸分子(例えば、転写される核酸分子、プロモータ、及びエンハンサー因子)が連結されていることを意味する。
“発現コンストラクト(expression construct)”は転写を行なえる核酸分子を意味する。本発明における発現コンストラクトは少くとも心臓特異的エンハンサー因子とプロモータを含む。ここで述べた通り、転写終結信号のような付加的な因子が更に含められる。
“ベクター”又は“発現ベクター”は発現システム、核酸媒介体(vehicle)、核酸輸送に適した核酸分子、自律的な自家-複製原形DNA(例えば、プラスミド)を意味する。ベクターが宿主細胞内に存する場合、ベクターは自律的な構造で細胞分裂周期の間安定的に細胞によって複製されたり、宿主細胞ゲノム内に統合されたり又は宿主細胞の核又は細胞質内に存在する場合もある。
“心筋細胞”は心臓で検出可能な量の心臓マーカー(例えば、α-ミオシン重鎖、cTnI、MLC2v、α-心臓アクチン、及びin vivoでのCx43)を発現し、収縮するが、増殖はしない筋肉細胞を意味する。
“心筋母細胞”は心臓で検出可能な量の心臓マーカーを発現し、収縮し増殖する細胞を意味する。
“心筋芽細胞”は検出可能な量のCsx/Nkx2.5RNA又はタンパク質を発現し、組織化された育種構造や収縮が見られず、検出可能な量のミオシン重鎖タンパク質を発現しない細胞を意味する。
“心外膜細胞”は検出可能な量のFlk−1及び/又はICAM−2を発現し、内皮細胞になれる細胞を意味する。
“心内膜細胞”は検出可能な量のTie-2及び/又はフォンビルブランド因子を発現する心臓細胞を意味する。
“内皮細胞”は検出可能な量の、以下のRNA又はタンパク質を少くとも一つ以上発現する細胞を意味する。
MUC18、VE−カドヘリン、N−カドヘリン、α-及びβ-カテニン、Flk-1、Tie-2、及びCD34。
“血管平滑筋細胞に分化するように誘導された細胞”は細胞が血管平滑筋細胞に誘導される条件で培養された不死化しない幹細胞を意味し、その細胞中の少くとも約10%、25%、50%、75%、90%、95%、99%、又は100%までが血管平滑筋細胞である。
培養されたBMSCsの分化に言及する際“一つの細胞型への特異的な誘導”は少くとも50%のBMSCsが所望の細胞型(例えば、心筋細胞)に分化される培養を意味する。
培養された細胞を氷上で20分間4%ホルムアルデヒドで固定させ、引き続き0.2%トリトンX−100の入っているリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で15分間放置する。PBSで三回洗浄してから、細胞を15分間ブロッティング溶液(PBS中1%BSA及び0.2%ツイーン20)中でインキュベートする。この試料を以下の抗体のうちの一つで処理する。
抗体:抗CSX(1:100〜1:200,from S.Izumo,Harvard Medical School,Boston MA)、MF−20(1:50〜200,from Developmental Studies Hybridoma bank,University of Iowa,Iowa City Iowa)、抗デスミン (1:100〜200,from Sigma-Aldrich,Inc.,St.Louis MO)
そして、要すれば、同じ濃度の同種対照群(Csxは正常ウサギ血清;MF-20はマウスIgG2b; デスミンはマウスIgG1)と共に4℃恒湿槽で一晩中反応させた。試料スライドを洗浄溶液(0.5%ツイーン20含有PBS)で三回洗浄した後、二次抗体と共に培養した(Csxはロバ抗ウサギIgG、MF-20と抗デスミンはロバ抗マウスIgG、これら全てはJackson Immuno Research Laboratories、Inc.から入手)。三回洗浄した後、蛍光顕微鏡(例えば、蛍光付属品が装着されたNikon TS100顕微鏡)で観察して蛍光を呈する細胞数を肉眼で数えた。
“異種の”は核酸分子が外部ソースから由来する場合、又は同じソースなら元の形態から変形されることを意味する。従って、"異種プロモータ"は本発明の複製されたエンハンサードメインと正常的に連結されないプロモータである。同じく、異種核酸分子は元の形態から変形されたり、これと機能的に連結されたプロモータが由来するソースとは違うソースから誘導される。
“導入遺伝子”は一時的又は永久的に細胞内に人工的に挿入され、ゲノム内に組み込まれたり染色体外に存在する場合、有機体の一部になる核酸分子(例えば、DNA)の断片を意味する。このような形質転換遺伝子は形質転換有機体と部分的に又は全く異種の(即ち、外来の)遺伝子を含む場合があり、また、その有機体の内部遺伝子と同種の遺伝子を示す場合もある。
本発明の他の特徴と長所は、以下の、好ましい実施態様の記載及び特許請求の範囲の記載から明らかになるであろう。
脊椎動物の発生において初期心臓発生はCsx/Nkx2.5の発現と定義される。このような発生段階でCsx/Nkx2.5発現細胞は継続的な増殖時期にある。本発明者らは増殖時期にあるCsx/Nkx2.5発現細胞を移植することによって心臓にとり込まれ機能を示す心筋細胞の数が増加することと確信している。
マウスで形質転換遺伝子の発現を誘導するために使用される際、hCsx/Nkx2.5とmCsx/Nkx2.5の心臓エンハンサーは内因性のmCsx/Nkx2.5の発現パターンを反復する(米国特許出願公開第2002/022259号参照、参考文献として提示。)。哺乳類の心臓エンハンサーと知られているものの一つであるこのエンハンサー(7.5kbエンハンサー)は四つの心室と心房で発現される最初のエンハンサーである。更にこのエンハンサーは場所を外れたところからは発現されない。7.5kb内で二つの領域(A1とA2と呼ばれるドメイン(domain))が共に同定された。これがhsp68promoter-lacZカセットと連結されれば心臓特異的に遺伝子発現を向上させ得る。この二つの領域は本発明でレポータを構築する際に利用できる。
骨髄はマウスと犬の成体から分離した。 BMSCsを分離して10%牛血清、100μMのL−アスコルビン酸−2−PO4、5−15ng/mlの白血病阻害因子(LIF)(マウス細胞培養ではマウスLIFを使用し、犬細胞培養ではヒトLIFを使用した)及び20nMデキサメサゾンと共に培養した。このようなin vitro条件下で骨髄幹細胞は自家増殖性を維持し、成長因子のような分化試薬に反応性を失われず継代培養を通して増殖される。また、種々の継代培養を通して培養された幹細胞は間充織形態(mesenchymal morphology)と核型(karyotype)を維持する(図1)。成長因子(50ng/ml BMP2、100ng/ml bFGF)と共に14日間培養後約80%の骨髄幹細胞がCsx/Nkx2.5、MF−20(筋節ミオシン特異モノクローナル抗体)とデスミン抗体によって染色されたが、これは細胞が心筋細胞に分化されたことを示している(図3及び図4)。
前述した実施例は示範目的としてマウスBMSCsを使用している。ヒトBMSCsもまた心筋細胞を生成できることが知られている(Pittenger et al.,Science 284: 143−147,1999)。他の哺乳類のBMSCs(例えば、humanized pig BMSCs)もまた本発明の方法に用いることが出来る(Levy et al.,Transplantation 69: 272−280,2000)。
前述したようにBMP2及び/又はbFGF存在下で心筋細胞と骨髄幹細胞を共存培養すれば心筋細胞に分化できる心筋芽細胞を誘導する。骨髄幹細胞と誘導細胞の比率、及び成長因子の濃度を調節して心筋芽細胞分化の程度と量を調節することができる。例えば、骨髄幹細胞と誘導細胞の比率は1:1〜1:1000、又はそれ以上も可能である。BMP2の濃度範囲は約0.5ng/ml〜1μg/mlが可能であり、bFGFは1ng/ml〜5μg/mlまで可能である。BMP/TGF及びFGFファミリはBMP2及び/又はbFGFの代りに使用できる。
骨髄幹細胞を心筋芽細胞に誘導する公知の他の方法も本発明に使用できる。しかし、心筋細胞に誘導する方法は全て使用できない。例えば、5−アザシチジンは心筋細胞誘導物質として知られているが(Makino et al.,J.Clin.Invest.,103: 697−705,1999)、これは本特許の方法には不向きである。5−アザシチジンは任意に遺伝子配列をジメチル化させるため(非発現遺伝子の発現促進)、5−アザシチジンで骨髄幹細胞を処理すれば、心筋細胞(cardiac troponinI陽性)(Wakitani et al.,Muscle Nerve,18: 1417−1426,1995; Tomita et al.,Circulation,100 suppl II: 247−256,1999)以外にも種々の細胞型(例えば筋細胞(MyoD陽性)、骨芽細胞(osteocalin陽性)、脂肪細胞(PPAR−γ陽性))に分化することが出来る。骨髄幹細胞を5−アザシチジンに暴露すれば、c−ablとインターロイキン−6の発現が早く増加し、それによりコラーゲンIのような主要マトリックス(matrix)タンパク質の発現が減少する(Andrews et al.,Mol.Cell.Biol.,9:2748−2751,1989)。本発明の方法においては、適切な因子又は条件は特異的にある種の細胞型(例えば、心筋細胞)に誘導する。
心筋層に移植するために血管筋肉細胞及び内皮細胞(又はそれらの前駆体)のような細胞を誘導することが望ましい。それは、このような細胞が移植された心筋芽細胞の周囲に新たな血管を形成するからである。細胞を一種だけ移植することもできるが、適当な心筋芽細胞と共に移植することが望ましい。
血管筋肉細胞の分化はBves遺伝子エンハンサーを用いて決定することができる(Reese et al.,Dev.Biol.209:159−171,1999)。内皮細胞の分化はTie−2又はクローニングされたフォンビルブランド因子エンハンサーを用いて決定することができる(Schnurch and Risau,Development 119: 957−968,1993; Coffin et al.,Dev.Biol.148:51−62,1991)。胚芽心筋外皮細胞(即ち、内皮細胞の前駆体)の分化はFlk−1又はICAM−2エンハンサーによって決定される(それぞれ、Shalaby et al.,Nature 376: 62−66,1995; Tevosian et al.,Cell 101:729−739,2000)。
骨髄幹細胞は前述した方法で分離し、胚芽発生時期に内皮細胞の発生因子として知られている生物学的因子と共に培養した(2%牛血清、20ng/ml VEGF、1ng/mlbFGF、及び2ng/ml IGF−I)。内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼであるFlk−1は培養14日後、80%近くの骨髄幹細胞で強く発現されたが、これは内皮細胞系統に変ったことを意味する(図5)。
図16Aに示した通り、インジケーターシステムは三種で構成されている。インジケーター細胞2、細胞カプセル化システム(CES)4、及びインジケーター細胞をCESに残留できるようにし、インジケーター細胞2を移植される細胞8と区別してくれる透過性の外膜又はメッシュ6。
一例として、インジケーター システムは幹細胞(例えば骨髄幹細胞)の細胞の拘束と分化時期を決定するのに有用である。ここに記述された通り、ヒト骨髄幹細胞の約5〜100%程度(望ましくは約80%)が心筋芽細胞(Csx/Nkx2.5発現、組織化された筋節構造又は筋収縮の欠乏、及び望ましくはミオシン重鎖RNA又はタンパク質の欠乏により測定されたもの)になるようにヒト骨髄幹細胞を用意することが望ましい。かくして、分析のための細胞採収と移植のための細胞採収との間の時間的差異を短縮するために、分析を迅速にすることが望ましい。迅速な分析は、分析結果が最終的に移植される細胞がCsx/Nkx2.5発現細胞であることを示すことを保障する。本発明はこのような分析方法を提供する。レポータ遺伝子と機能的に連結されたCsxエンハンサーを含む形質転換マウスの骨髄幹細胞がインジケーター細胞として利用される。例えば、参考文献として記入した米国特許出願公開第2002/022259号で適切なCsxエンハンサーを説明している。インジケーター細胞は生物学的物質(例えば、アルギン酸塩、コラーゲン、ゼラチン又はキトサン)中にカプセル化させるか、又は生分解性の重合体[例えば、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)、又はポリ(乳酸/グリコール酸)共重合体(PLGA)の非多孔性細粒]の上に付着させる。カプセル化された又は細粒に付着された細胞は酸素、栄養物質、及び他の生物学的分子透過性の膜によって取り囲まれている。適切な膜の例として多孔性透明ポリエチレンテレフタレート(PET)メンブラン、透明ナイロンメッシュ、透明多孔性ナイロンメンブラン、及び多孔性透明ポリテトラフルオロエチレン(PTFE/テフロン)などがある。
本発明は自家由来又は異種由来の心臓細胞を移植することによって不十分な心臓機能による被験者の障害を治療する方法に関する。本方法には本発明の幹細胞から由来された心臓細胞前駆体、内皮細胞前駆体、そして血管平滑筋細胞前駆体を被験者に投与する方法が含まれ、以下に詳述する。心臓疾患を有する被験者の心臓に本発明の細胞を移植することによって、機能できないか(hybernating)消失された心臓細胞と置き換えることが出来る。 機能できないか消失された心臓細胞の代りに、少くとも一種以上の心臓疾患の症状や副作用を緩和させたり少くとも部分的に軽減させ得る適当な量の細胞が、心臓疾患を有する患者に導入される。細胞は何れか適当なルートを通して患者に導入でき、患者の所望の領域に細胞を伝達した結果少くとも何れかの部位では細胞が生き残っている。少くとも約5%、望ましくは少くとも約10%、より望ましくは少くとも約20%、更に望ましくは少くとも約30%、更に、より望ましくは少くとも約40%、そして最も望ましくは少くとも約50%又はそれ以上の細胞が患者に導入された後、生き残っていることが望ましい。 患者に導入された後細胞が生きている期間は短くは数時間、例えば、24時間から数日、長くは数週から数ヵ月である。本発明の細胞を患者に伝達できる方法の一つは患者心室の心筋層に直接に細胞を注入することである(例えば、Soonpaa et al.,Science 264:98-101,1994; Koh et al.,Am.J.Physiol.33: H1727-1733,1993)。細胞は緩衝食塩水溶液のような生理的に適したキャリアーと共に投与できる。 ヒト患者の不完全な心臓機能による病気を治療するためには約104〜109個の細胞がヒトに、即ち、心筋層内に導入されるべきである。
心臓と関連する病を治療すること以外にも細胞移植治療は広範囲の疾患に適用できる(例えば、パーキンソン氏病、糖尿病、脊髄損傷、多発性硬化症)。心筋層内部への移植において、望まれる細胞の運命を優先的に受け入れ、類似分裂を行なえる能力を有する細胞を移植することが、移植される細胞の調和を助けて宿主組織に望まれる細胞が更に多量にとり込まれ生き残れることにつながる。細胞系統の分化、拘束、又は能力の検出のために有用なエンハンサーは以下の表1に詳細に示される。
In vitroにおいて心筋芽細胞系統に分化される骨髄幹細胞を梗塞された犬の心筋組織に移植した。犬心筋梗塞は左側冠状動脈を永久的に閉塞することによって作られた。梗塞は骨髄幹細胞移植前に少くとも二ヶ月間安定化させた。移植による免疫拒否反応を防止するため、骨髄は次のようにそれぞれ移植受容体である犬から分離して用意した。結紮後約4週後に、心エコー図を用いて心筋梗塞を確認した後、骨髄を抽出するために長骨に孔あけを施した。骨髄を直ちにヘパリンと混合し、冷凍してドライアイスに入れて組織培養室に運搬した。ここで骨髄は37℃で解凍し、懸濁させ、通常使用されるDMEM培地で1回洗浄して、培養液(10%牛血清、100μM L-アルコルビン酸-2-PO4、5〜15ng/ml LIF、20nMデキサメサゾン)が入っている組織培養フラスコに入れた。採収する際、移植後の細胞の生存と進行を追跡するため、赤色蛍光マーカーであるDiIで骨髄幹細胞を標識した。標識された骨髄幹細胞は4〜7日間100ng/mlのbFGFを添加して培養した。1.5〜250×106個の細胞を採収し、心臓の梗塞部位に注入した。
実施例7に記載した心筋梗塞犬モデルを、心エコー図(ECG)を用いて骨髄幹細胞移植の回復効果をin vivoで判断するために使用した。心エコー図は骨髄幹細胞移植後3.5、4.5、及び5週に行なって(それぞれ図19、図17、及び図18)、移植前の心臓心エコー図と比較した。各動物において、梗塞部位の収縮力が改善され心筋層の隣接部位と調和をなすようになった。従って、心エコー図の結果は実施例7の組織免疫染色結果を確実にし、培養された骨髄幹細胞の移植が梗塞以後の心臓組織を部分的に回復させることを証明している。
移植された骨髄幹細胞の長期間生存能力を齧歯類の心筋梗塞モデルシステムを用いて検討した。免疫拒否反応を防止するため、骨髄幹細胞は移植に使用されるマウスと同種同形のマウスから採収した骨髄から分離した。前述したように、骨髄幹細胞は4〜7日間100ng/mlのbFGF存在下で培養しDiIで蛍光を呈するよう標識して再び採収した。 梗塞は左側心臓動脈を縛ることにより作製した。処理された骨髄幹細胞は次のように梗塞部位に注射した。骨髄幹細胞(10μlのPBS又はHBSS中、100、000〜500、000個)を29G又は30Gハミルトン針を装着した50μlのハミルトン注射器を用いて斜めに前膈膜左心室心筋に注入した。手術中、マウスはフィードバック温度調節器を用いて37℃が維持されるベッド上に置かれており、マウス人工呼吸器(設定容積:200μl、速度:110μl/min)を用いて呼吸を助けた。移植後36日に、DiIで標識された細胞の存在と心筋細胞生存能力を測定するため梗塞部位を分析した。犬モデルにおいて観察された通り、標識された骨髄幹細胞が齧歯類の心筋梗塞部位内にとり込まれた。また、心筋層に存在する、DiIで標識された細胞が、心筋細胞の形態学的特徴を示した。この部位をヘマトキシリンとエオシンで染色すれば、梗塞内部で心臓筋肉の特徴を示す縞模様、螺旋状の核、及び細長い繊維質が見える(図10)。また、本発明者らは、心筋層の梗塞された部位に隣接している、DiIに陽性の細胞を観察した。心筋細胞を視覚化するためα-MHC、MF-20、及び心臓性トロポニン抗体を用いて染色した結果はDiIで標識された細胞(移植された骨髄幹細胞)が心臓筋原繊維内に存在することを示している(図11、図12、及び図14)。また、移植された骨髄幹細胞は心筋層の隣接部位にとり込まれた(図13)。従って、移植され刺激された骨髄幹細胞は正常な心臓組織と梗塞された心臓組織の両方に完全にとり込まれ、続いて心筋細胞に分化された。分化は移植前にin vitroで刺激される間に始まった。
内皮細胞前駆体を産生させるためには、単離された幹細胞(例えば、ヒトの骨髄肝細胞)をVEGF(10ng/ml)、bFGF(1ng/ml)、IGF-I(2ng/ml)を用いて4〜7日間前処理を施す(Shi et al.,Blood 92:362-367,1998)。細胞インジケーターシステムにおける変換インジケーターとして、レポータ遺伝子に機能的に連結されたTieエンハンサーが内在された幹細胞を使用することができる(Schlaeger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94: 3058-3063,1997)。
血管平滑筋細胞前駆体を産生させるためには、単離された幹細胞(例えば、ヒトの骨髄幹細胞)をPDGF(1〜10ng/ml)とTGF-β(1〜10ng/ml)を用いて4〜7日間前処理を施す(Hirschi et al.,J.Cell Biol.141:805-814,2000)。 細胞インジケーターシステムにおける変換インジケーターとして、レポータ遺伝子に機能的に連結されたBvesエンハンサーが内在された幹細胞を使用することができる(Reese et al,Dev.Biol.209: 159-171,1999)。
Claims (29)
- 以下のステップを含む、哺乳類心筋組織に移植するための細胞の生産方法:
(a) 不死化しない骨髄幹細胞を供給するステップと、
(b) 前記細胞を心筋芽細胞に分化させるように誘導する条件下で前記骨髄幹細胞を培養するステップと、
(c) ステップ(b)の細胞の分化状態をモニタリングするステップと、
(d) 前記細胞の約10%〜100%が心筋芽細胞の時、ステップ(b)の細胞を採収するステップ。 - 前記哺乳類に前記心筋芽細胞を移植するステップ(e) を更に含む請求項1に記載の方法。
- 前記骨髄幹細胞が前記哺乳類に由来するものである、請求項2に記載の方法。
- 前記哺乳類がヒトである、請求項1に記載の方法。
- 前記採収ステップ(d)が、ステップ(b)の前記細胞の約50%〜80%が心筋芽細胞のときに行なわれる、請求項1に記載の方法。
- 前記培養ステップ(b)が、培養液がBMP−2及びbFGFの少くとも一つを前記細胞の心筋芽細胞への分化を誘導するのに十分な量として含有する培養条件を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記モニタリングステップ(c)が、ステップ(b)の前記骨髄幹細胞と共存培養された自家骨髄幹細胞の分化状態を決定することを含み、該自家骨髄幹細胞の分化状態がステップ(b)の前記骨髄幹細胞の分化状態と相関がある、請求項1に記載の方法。
- 前記モニタリングステップ(c)が、ステップ(b)の前記骨髄幹細胞と共存培養された同型又は異型骨髄幹細胞の分化を評価することを含み、該同型又は異型骨髄幹細胞の分化状態がステップ(b)の前記骨髄幹細胞の分化状態と相関がある請求項1に記載の方法。
- 以下のステップを含む、哺乳類に移植するための細胞の生産方法:
(a) 不死化しない骨髄幹細胞を供給するステップと、
(b) 前記細胞を血管平滑筋細胞、内皮細胞、心外膜細胞、脂肪細胞、破骨細胞、骨芽細胞、心臓繊維芽細胞、マクロファージ、神経細胞前駆体、神経細胞、星状細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、膵臓細胞前駆体、膵臓β−細胞、又は肝細胞に分化させるよう誘導する条件下で前記骨髄幹細胞を培養するステップと、
(c) ステップ(b)の細胞の分化状態をモニタリングするステップと、
(d) 前記細胞の約10%〜100%が、前記細胞タイプに特異的なタンパク質の検出可能な量を発現する際にステップ(b)の細胞を採収するステップ。 - ステップ(d)からの前記細胞を前記哺乳類に移植するステップ(e)を更に含む請求項9に記載の方法。
- 前記骨髄幹細胞が前記哺乳類から由来されるものである、請求項9に記載の方法。
- 前記哺乳類がヒトである、請求項9に記載の方法。
- 前記採収ステップ(d)が、ステップ(b)の前記細胞の約50%〜80%が前記細胞型に分化されるときに行なわれる、請求項9に記載の方法。
- 前記モニタリングステップ(c)が、ステップ(b)の前記骨髄幹細胞と共存培養された自家骨髄幹細胞の分化を評価することを含み、該自家骨髄幹細胞の分化状態がステップ(b)の前記骨髄幹細胞の分化状態と相関がある、請求項9に記載の方法。
- 前記モニタリングステップ(c)が、ステップ(b)の前記骨髄幹細胞と共存培養された同種又は異種骨髄幹細胞の分化を評価することを含み、該同種又は異種骨髄幹細胞の分化状態がステップ(b)の前記骨髄幹細胞の分化状態と相関がある請求項9に記載の方法。
- 哺乳類において不完全な心臓機能による障害を治療する方法であって、以下のステップを含む方法:
(a) 前記哺乳類から骨髄幹細胞を分離するステップと、
(b) 前記細胞を心筋芽細胞に分化させるよう誘導する条件下で前記骨髄幹細胞を培養するステップと、
(c) ステップ(b)の細胞の分化状態をモニタリングするステップと、
(d) 前記細胞の約10%〜100%が心筋芽細胞のときにステップ(b)の細胞を採収するステップと、
(e) 前記心筋芽細胞を前記哺乳類に移植するステップ。 - 前記哺乳類がヒトである、請求項16に記載の方法。
- 前記採収ステップ(d)が、ステップ(b)の前記細胞の約50%〜80%が前記細胞タイプに分化されるときに行なわれる、請求項16に記載の方法。
- 前記モニタリングステップ(c)が、自家骨髄幹細胞の分化を評価することを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記モニタリングステップ(c)が、同種又は異種骨髄幹細胞の分化を評価することを含む、請求項16に記載の方法。
- 哺乳類に移植する際に内皮細胞に分化されるように誘導された細胞の生産方法であって、以下のステップを含む方法:
(a) 不死化しない幹細胞の集団を供給するステップと、
(b) 前記細胞を内皮細胞前駆体に分化させるように誘導する条件下でステップ(a)の前記細胞を培養するステップと、
(c) 細胞の約10%〜100%が内皮細胞前駆体のときにステップ(b)の細胞を採収するステップであって、該細胞は哺乳類に移植したときに内皮細胞に分化されるように誘導されるものである。 - ステップ(b)と(c)の間に、ステップ(b)の細胞の分化状態をモニタリングするステップを更に含む、請求項21に記載の方法。
- 哺乳類に移植する際に血管平滑筋細胞に分化されるように誘導された細胞の生産方法であって、以下のステップを含む方法:
(a) 不死化しない幹細胞の集団を供給するステップと、
(b) 前記細胞を血管平滑筋細胞前駆体に分化されるように誘導する条件下でステップ(a)の前記細胞を培養するステップと、
(c) 細胞の約10%〜100%が血管平滑筋細胞前駆体のときにステップ(b)の細胞を採収するステップであって、該細胞は哺乳類に移植したときに血管平滑筋細胞に分化されるように誘導されるものである。 - ステップ(b)と(c)との間に、ステップ(b)の細胞の分化状態をモニタリングするステップを更に含む、請求項23に記載の方法。
- 不完全な心臓機能により特徴付けられる疾患を有すると診断された哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類の心筋組織に以下のものを導入することを含む方法:
(a) 心筋細胞又は心筋細胞前駆体と、
(b) 内皮細胞又は内皮細胞前駆体と、
(c) 血管平滑筋細胞又は血管平滑筋細胞前駆体
(但し、これらの細胞は心臓機能を向上させるのに十分な量が導入される。) - 心筋細胞前駆体:内皮細胞前駆体:血管平滑筋細胞前駆体=約10:1:1の比率で、少くとも百万個の心筋細胞前駆体が別の二種の細胞型と共に前記心筋層に注入される請求項25に記載の方法。
- 前記心筋層にカスパーゼ阻害剤を導入することを更に含む請求項25に記載の方法。
- 前記哺乳類はヒトである請求項25に記載の方法。
- 以下のものを含んでなる医薬組成物:
(a) 心筋細胞又は心筋細胞前駆体と、
(b) 内皮細胞又は内皮細胞前駆体と、
(c) 血管平滑筋細胞又は血管平滑筋細胞前駆体
(但し、これらの細胞はヒトに導入する際、心臓機能を向上させるのに十分な量である。)
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