KR100864123B1

KR100864123B1 - 이식용 세포의 생산방법

Info

Publication number: KR100864123B1
Application number: KR1020067022303A
Authority: KR
Inventors: 아이크 더블유. 리; 구이쩬 리우; 제임스 햄프; 제프리 디. 크로센트
Original assignee: (주)안트로젠
Priority date: 2001-04-13
Filing date: 2002-04-12
Publication date: 2008-10-16
Also published as: NO20034580D0; KR20030089511A; CN1533431A; KR20060124791A; WO2002083864A3; IL158368A0; JP2005522979A; EP1390473A2; JP4083024B2; NO20034580L; US20030031651A1; JP2007143554A; CA2443993A1; EP1390473A4; WO2002083864A2; BR0209083A; AU2002303343A1; KR100694963B1

Abstract

본 발명은 포유류(예를 들어, 인간)의 심근 조직으로 이식하기 위한 세포의 생산 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 (a) 골수 줄기 세포의 군집을 공급하는 단계; (b) 이 세포를 심근 아세포로 분화시키도록 유도하는 조건 하에서 이 세포를 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 세포의 분화 상태를 모니터링하는 단계; 및 (d) 이 세포의 적어도 약 10%에서 많게는 100%가 심근 아세포일 때 단계 (b)의 세포를 수집하는 단계를 포함한다. 골수 줄기 세포는, 예를 들어 인간 골수 줄기 세포일 수 있다. 하나의 실시예에서, 본 방법은 분화된 줄기 세포를 포유류로 이식하는 단계를 포함한다.

Description

이식용 세포의 생산방법{METHODS FOR PRODUCING CELLS FOR TRANSPLANTATION}

본 발명은 세포 이식에 관한 것이다.

골수가 순환하는(circulating) 심근세포 전구체(progenitor)의 in vivo source라는 가능성이 제시되었다. 실험을 통하여 이식된 골수 유래 세포가 이영양증(dytrophic) 쥐의 심장에 골고루 퍼지는 것을 관찰하였다. 비록 이들 세포의 분자적 특징을 규명하지는 못하였으나, 이식된 세포가 심장 조직 내에 존재한다는 것은 이 세포가 심근 세포임을 나타낸다. 5-아자사이티딘(5-azacytidine)과 같은 유도 물질을 이용하여 박동하는 심근 세포를 유도할 수 있는 것으로 알려져 있는 등, 골수 줄기 세포의 분화능력은 이미 알려져 있다. 이러한 결과에 근거하여, 골수 줄기 세포가 심장 이상이나 심장 질환 치료시 세포의 자원으로 사용될 수 있다.

골수 줄기 세포의 치료제로서의 가능성에도 불구하고, 현재 심장 조직에 세포를 이식하는 방법에 있어서는 환자 조직에의 생착률이 낮아 임상적으로 아직 적당하지 못하다. 그 예로, 골수 줄기 세포를 이식한 쥐 중 40%에서만 심근 조직이 회복되었다고 Orlic 등이 발표하였다(Orlic et al., Nature 410: 701~705, 2001).

따라서, 높은 생착률과 높은 세포 생존률을 갖는 세포 이식 방법이 요구되고 있다.

본 발명자들은 in vitro에서 줄기 세포의 분화 유도를 모니터링할 수 있는 방법과 이식을 위해 줄기 세포를 수집하는 방법을 발명하였다.

따라서, 본 발명은 포유류 심장 조직에 이식하기 위한 세포를 생산하는 방법을 다루고 있다. 이 방법은 (a) 불멸화(immortalized) 되지 않는 줄기 세포를 공급하는 단계; (b) 심근 아세포 즉, 심근세포 전구체로 유도하는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계; (c) (b)의 세포의 분화 상태를 모니터링하는 단계; 및 (d) 수집된 세포의 적어도 약 10%에서 많게는 약 100%가 심근 아세포일 때 단계 (b)의 세포를 수집하는 단계를 포함하고 있다. 세포는 인간, 돼지, 비비의 골수 줄기 세포(BMSCs)일 수 있다. 하나의 실시예에서 본 발명의 방법은 (e) 인간과 같은 포유류로 (d) 단계의 세포를 이식하는 방법을 더욱 포함한다. 이식은 자가 이식으로, 다시 말해 치료할 포유류로부터 세포를 얻은 후 이를 이식하는 것을 말한다. 수집한 세포 중 적어도 약 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50%가 심근세포 전구체와 같은 심근 아세포인 것이 바람직하고, 수집한 세포 중 많으면 60%, 70%, 80%, 95% 또는 99%가 심근 아세포인 것이 바람직하다. 가장 바람직한 것은 수집한 세포 중 적어도 약 50%에서 많으면 약 80%가 심근 아세포인 것이다.

본 발명자들은 또한 심근 세포를 이식한 심근층 부위에서 혈관과 심근 조직이 함께 재생되는 세포 이식 치료 방법을 개발하였다.

심근 경색으로 인해 경색된 부위로 혈액 공급이 감소하게 되면 내인성 (endogenous) 심근 세포가 손상을 입게 된다. 이식된 세포의 생존률을 높이기 위해서는 세포가 이식된 포유류가 세포 생존에 필요한 영양분과 산소를 공급하는 혈관 망을 발생하는 것이 바람직하다.

심장 외막에서 심근층으로 이동한 혈관 평활근 세포 전구체와 내피 세포 전구체로부터 심근층의 관상혈관구조가 형성된다는 것에 근거하여, 심근 세포 전구체 또는 심근 세포와 함께 내피 세포 전구체와 혈관 평활근 세포 전구체를 이식하는 것이, 치료학적으로 중요한 심근 세포의 생존에 요구되는 혈관 망 형성을 용이하게 할 것으로 판단된다. 경색된 심근층은 심근 세포 전구체, 내피 세포 전구체와 혈관 평활근 세포 전구체가 조합하여 새로운 혈관을 형성하면서 새로운 심근 세포를 재생함으로써 치유된다. 한 예로, 세포 전구체는 ex vivo에서 줄기 세포로부터 유래되어진다.

두 번째 특징으로, 본 발명은 포유류(예를 들어, 인간)의 심근 조직에 이식하기 위해 내피 세포로 분화되도록 유도된 세포를 생산하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 (a) 불멸화 되지 않는 줄기 세포 군집을 공급하는 단계; (b) 줄기 세포가 내피 세포로 되어지는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계; 그리고 (c) 세포 중 적어도 약 10%에서 많으면 약 100%가 내피 세포 전구체일 때 (b) 단계의 세포를 수집하는 단계를 포함한다.

세 번째 특징으로, 본 발명은 줄기 세포를 인간과 같은 포유류의 심근 조직에 이식하기 위해 혈관 평활근 세포로 분화되도록 유도된 세포를 생산하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 (a) 불멸화되지 않은 줄기 세포 군집을 제공하는 단계; (b) 줄기 세포가 혈관 평활근 세포로 되어지는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계; 그리고 (c) 세포 중 적어도 약 10%에서 많으면 약 100%가 혈관 평활근 세포 전구체일 때 (b) 단계의 세포를 수집하는 단계를 포함한다.

네 번째 특징으로, 본 발명은 불완전한 심장 기능 질환이 있는 인간과 같은 포유류를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 다음 세 가지 형태의 세포를 포유류의 심근 조직에 이식하는 단계를 포함한다: 심장 기능을 향상시키기 위한 충분한 양의 (1) 심근 세포 또는 심근 세포 전구체; (2) 내피 세포 또는 내피 세포 전구체; 및 (3) 혈관 평활근 세포 또는 혈관 평활근 세포 전구체. 예를 들어, 약 10:1:1(심근 세포 전구체:내피 세포 전구체:혈관 평활근 세포 전구체)의 비율로 심근 세포 전구체(1×10⁶)와 다른 두 세포를 심근층에 이식한다. 다른 비율로도 사용할 수 있다. 예를 들어, 심근 세포 전구체와 내피 세포 전구체 또는 혈관 평활근 세포 전구체의 비율이 1:1 내지 50:1, 또는 그 이상일 수도 있다(예를 들어, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 12:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 또는 그 이상). 하나의 예로서, 심근 세포 전구체:내피 세포 전구체:혈관 평활근 세포 전구체의 비율이 10:2:1로도 사용된다. 세포가 이식된 후, 각 세포 타입에 따라 내피 세포 전구체는 심장 내막에 가깝게, 혈관 평활근 세포 전구체는 중간에, 심근 세포 전구체는 심장 외막에 가깝게 층을 이루게 될 것이다. 다른 방법으로, 이식하기 전에 세 가지 세포를, 예를 들어 10:1:1(심근 세포 전구체:내피 세포 전구체:혈관 평활근 세포 전구체), 세포수 비율로 혼합할 수 있고, 이 혼합액을 심근층에 이식할 수 있다. 혈관 생성을 향상시키기 위해, VEGF(예를 들어 1-10 μM로)와 같은 혈관 생성 물질을 이식되는 세포와 혼합할 수 있다.

심근 아세포가 되도록 세포를 유도하는 기술은 매우 많다. 예를 들어 골수 줄기 세포를 심근 아세포로 유도하는 BMP2나 bFGF를 함유한 배지에서 배양할 수 있다. 이들 방법은 본 발명의 실시예에서 사용된다.

유사 분열하는 세포가 유사분열이 끝난 세포보다 심근층에 좀 더 쉽게 융합될 수 있기 때문에, (c) 단계의 이식하는 세포 중 적어도 25%, 50%, 75%, 90%, 95%나 그 이상이 유사 분열 세포 전구체인 것이 바람직하다.

또 다른 특징으로, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 운반체나 부형제에 주입되는 세포가 적어도 약 10%에서 많으면 100%의 내피 세포 전구체로 이루어지는 줄기 세포 유래 세포 군집을 포함하는 약제학적 조성을 특징으로 한다.

또 다른 특징으로, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 운반체나 부형제에 주입되는 세포가 적어도 약 10%에서 많으면 100%의 혈관 평활근 세포 전구체로 이루어지는 줄기 세포 유래 세포 군집을 포함하는 약제학적 조성을 특징으로 한다.

또 다른 특징으로, 본 발명은 다음과 같은 세 가지의 세포를 포함하는 약제학적 조성을 특징으로 한다: 심장 기능을 향상시키기 위한 충분한 양의 (1) 심근 세포 또는 심근 세포 전구체; (2) 내피 세포 또는 내피 세포 전구체; 및 (3) 혈관 평활근 세포 또는 혈관 평활근 세포 전구체. 세포는 줄기 세포(즉, 골수 줄기 세포)에서 유래하는 것이 바람직하다. 혈관 생성을 향상시키기 위해, 1~10 μM의 VEGF와 같은 혈관생성 물질이 포함되는 것이 바람직하다. 덧붙여, 본 발명의 이식 세포의 생존률을 높이기 위해서 캐스페이스 억제제(caspase inhibitor: zVADfmk)와 같은 항 괴사 물질(anti-apoptotic agent)을 이식할 때 같이 주입할 수 있다.

또한 본 발명은 포유류(예를 들어, 인간)에 이식하는 세포를 생산하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 (a) 골수 줄기 세포 군집을 공급하는 단계; (b) 혈관 평활근 세포, 내피 세포, 심장 외막 세포, 지방세포, 파골 세포, 골 모세포, 대식 세포, 신경 세포 전구체, 신경세포, 성상세포, 골 근육 세포, 평활근 세포, 췌장 세포 전구체, 췌장 베타 세포 및 간(肝)세포로 구성되는 그룹으로부터 선택된 세포 형태로 세포를 유도할 수 있는 조건에서 세포를 배양하는 단계; (c) (b) 단계에서 세포의 분화 단계를 모니터링하는 단계; 그리고 (d) 유도된 세포에서 특이적으로 발현하는 단백질을 확인할 수 있는 세포가 적어도 약 10%에서 많으면 100%일 때 세포를 수집하는 단계를 포함한다. 적당한 마커(marker)는 여기에서 서술되어진다. 골수 줄기 세포는 인간이나 돼지, 비비의 골수 줄기 세포일 수 있다. 하나의 실시예에서, 본 방법은 (e) 포유류(예를 들어, 인간)에 (d) 단계의 세포를 이식하는 단계를 포함한다. 이식은 자가 이식이 될 수 있다, 즉, 골수 줄기 세포를 추출한 포유류에 다시 세포를 이식한다. (b), (c) 단계인 배양과 모니터링은 원하는 분화 계통(lineage)에서의 검출 가능한 양의 마커가 발현되는 세포가 적어도 약 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50%에서 많으면 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%일 때까지 수행되어진다. 바람직하게는, (b), (c) 단계인 배양과 모니터링(monitoring)은 원하는 분화 계통에서 검출 가능한 양의 마커가 발현되는 세포가 적어도 약 50%에서 많으면 80%일 때까지 수행한다.

본 발명은 또한 불완전한 심장 기능 질환이 있는 포유류, 바람직하게는 인간을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 (a) 치료를 위해 포유류로부터 골수 줄기 세포를 분리하는 단계; (b) 골수 줄기 세포를 심근 아세포로 분화시키는 조건에서 배양하는 단계; (c) (b) 단계의 세포가 분화하는 단계를 모니터링하는 단계; (d) 심근 아세포가 적어도 약 10%에서 많으면 약 100%일 때, (b) 단계의 세포를 수집하는 단계; 그리고 (e) 심근 아세포를 포유류에게 이식하는 단계를 포함한다.

전술한 방법 중에서 (c) 단계의 모니터링은 리포터 유전자(report gene construct)를 세포에 주입시킨 인캡슐(encapsulated) 골수 줄기 세포의 분화를 모니터링하는 것이 바람직하다. 모니터링에 사용되는 골수 줄기 세포는 배양한 골수 줄기 세포와 자가, 동종, 이종일 수 있다.

"줄기 세포"는 (i) 자가 증식할 수 있고, (ii) 심근 세포, 내피 세포, 및 혈관 평활근 세포 중에서 원하는 한 형태를 포함하는 여러 형태로 분화할 수 있는 세포를 의미한다.

"골수 줄기 세포(BMSC)"는 CD45가 없는 골수 유래 줄기 세포를 의미한다. BMSC는 또한 골수 줄기 세포나 골수 유래 다잠재성 세포 전구체라고도 언급된다.

여기에서 "핵산"은 DNA 또는 RNA를 의미한다. "핵산 분자"는 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 가닥 또는 이중 가닥 중합체이다. 특별히 언급하지 않았다면, 단일가닥 핵산 분자 서열의 왼손방향은 5' 말단 (5' end)이고 이중가닥 핵산 분자의 왼손방향은 5' 방향(5' direction)으로 한다.

"Csx/Nkx2.5"는 마우스나 인간의 Csx/Nkx2.5 cDNA 또는 Csx/Nkx2.5 폴리펩티드와 사실상 동일한 핵산이나 폴리펩티드를 의미하고, 골수 줄기 세포에서 발현되면 세포가 심근 아세포로 유도된 것을 의미한다. 핵산은 50개의 연속적인 뉴클레오티드에서 마우스나 인간의 Csx/Nkx2.5와 적어도 80% 동일한 것이 바람직하고, 85%인 것이 보다 바람직하며, 적어도 90%에서 95%까지 동일한 것이 더욱 바람직하다. 10%까지의 차이는 한쪽 또는 양쪽의 염기서열에 포함될 수 있다. 폴리펩티드는 25개의 연속적인 아미노산에서 마우스나 인간의 Csx/Nkx2.5와 적어도 80% 동일한 것이 바람직하고, 85%인 것이 보다 바람직하며, 적어도 90%에서 95%까지 동일한 것이 더욱 바람직하다. 10%까지의 차이는 한쪽 또는 양쪽의 아미노산 서열에 포함될 수 있다.

"치료(treating)"는 적어도 하나의 이상 반응이나 불완전한 심장 기능을 나타내는 비정상적인 증후를 경감시키거나 감소시키는 것을 의미한다. 이상 반응이나 심장 기능 이상 증상은 여러 가지이고 잘 정의되어 있다. 이상 반응이나 심장 기능 이상 증상의 예에는 호흡 곤란, 가슴 통증, 심계항진, 현기증, 기절, 부종, 청색증, 창백, 피로, 사망 등이 포함된다. 이상 반응이나 매우 다양한 심장 기능 이상 증상의 예는 Robbins, S.L. 등의 문헌(Robbins, S.L. et al., 1984, Pathological Basis of Disease, p547-609, W.B. Saunders Company, Philadelphia)과 Schroeder, S.A. 등의 문헌(Schroeder, S.A. et al., 1992, Current Medical Diagnosis & treatment, p257-356, Appleton & Lange, Connecticut)에 추가적으로 기재되어 있다.

"불완전한 심장 기능에 의한 이상 질환"은 정상적인 심장 기능의 결함이나 장애 또는 비정상적 심장 기능의 존재를 의미한다. 비정상적 심장 기능은 질병, 상해 및/또는 노화의 결과일 수 있다. 여기에서 정의되는 비정상적 심장 기능은 심근 세포나 심근 세포 군집의 형태학적 및/또는 기능적인 비정상을 포함한다. 형태학적 및 기능적 비정상의 몇 가지 예로는 심근 세포의 사멸 및/또는 물리적 저하, 심근 세포의 비정상적인 증식 형태, 심근 세포 사이에 물리적 결합의 비정상, 심근 세포에 의한 구성물질의 과소 또는 과잉 생산, 정상적으로 생산하는 구성 물질의 생산 결여, 전기적 자극 전달의 비정상적 형태나 비정상적 횟수, 및 전술한 비정상에 의한 결과인 심장압의 변화 등을 포함한다. 비정상적 심장 기능은 허혈성 심장 질환, 예로 협심증, 심근 경색, 만성 허혈성 심장 질환, 고혈압성 심장 질환, 폐질환성 심장 질환(폐질환), 심장 판막성 심장 질환, 예로 류머티스성 발열, 승모판 탈출, 승모판륜(mitral annulus)의 석회화, 악성 종양성 심장 질환, 감염성 심장내막염, 선천성 심장 질환, 심근 질환, 예로 심근염, 심근증, 울혈성 심장 결함에 의한 심장 질환, 그리고 심장암, 예로 일차 육종, 이차 종양 등을 포함하는 많은 결함과 함께 나타난다.

"적용(administering)", "주입(introducing)", "이식(transplanting)"은 혼용되며, 원하는 곳에 세포가 생착할 수 있는 방법으로 인간 환자와 같은 피실험자에 본 발명에 따른 심근 세포를 넣는 것을 의미한다.

"프로모터"는 해독 개시 코돈의 상위(upstream) 단계의 핵산 부위를 의미하고, RNA 중합효소와 전사를 개시하는 여러 단백질들의 인식과 결합이 일어나는 부위이다. "인간 프로모터"는 인간 세포에서 전사를 개시하는 프로모터로, 인간 세포로부터 유래되거나 유래되지 않을 수도 있다. "Csx/Nkx2.5 프로모터"는 Csx/Nkx2.5 유전자의 프로모터 부위로부터 유래된 것으로, 이종 핵산 분자와 기능적으로 연계되어 있을 경우 심장세포 내의 해당 분자의 전사를 개시할 수 있다(전사를 지원할 수 있는 전사배지(transcription medium) 상태 하에서).

"인핸서(enhancer) 인자" 또는 "인핸서(enhancer)"는 프로모터의 인접 부위에 위치하고 전사를 지원할 수 있는 전사 배지 상태 하에 있을 경우 인핸서 도메인 (enhancer domain)이 없을 때 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 염기서열을 의미한다. "Csx/Nkx2.5 인핸서"는 Csx/Nkx2.5 유전자의 프로모터 지역으로부터 유래된 유전자이고, 다른 핵산 분자와 기능적으로 연계되었을 때 심근 세포에서 해당 분자의 전사를 개시할 수 있다(전사를 지원할 수 있는 전사배지(transcription medium) 상태 하에서). "Tie-2 인핸서"는 Tie-2 유전자의 프로모터 지역으로부터 유래된 유전자이고, 다른 핵산 분자와 기능적으로 연계되었을 때 내피 세포에서 해당 분자의 전사를 개시할 수 있다(전사를 지원할 수 있는 전사배지(transcription medium) 상태 하에서). "Bves 인핸서"는 Bves 유전자의 프로모터 지역으로부터 유래된 유전자이고, 다른 핵산 분자와 기능적으로 연계되었을 때, 혈관 평활근 세포에서 해당 분자의 전사를 개시할 수 있다(전사를 지원할 수 있는 전사배지(transcription medium) 상태 하에서).

"기능적으로 연계된"은 적합한 전사 배지에서 핵산 분자의 전사를 유도하기 위한 방식으로 두 개 이상의 핵산 분자가 연결되어 있는 것(예로 전사될 핵산 분자, 프로모터, 인핸서 인자)을 의미한다.

"유래된"은 핵산 분자로부터 이차적으로 만들어지거나 또는 형성된 경우를 의미하고, 유도체로 만들어지거나 형성된 원래 핵산 분자의 중요한 기능적 특징을 유지하고 있다.

"발현 construct"은 전사를 수행할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서의 발현 construct은 적어도 심장 특이적 인핸서 인자와 프로모터를 포함한다. 여기서 기술한 대로 전사 종결 신호 같은 부가적인 인자들이 더 포함될 수 있다.

"벡터" 또는 "발현 벡터"는 발현 시스템, 핵산 매개체(vehicle), 핵산 수송에 적합한 핵산 분자, 자율적인 자가-복제 원형 DNA(예를 들어, 플라스미드)를 의미한다. 벡터가 숙주 세포 내에 있을 경우 벡터는 자율적인 구조로써 세포 분열 주기 동안 안정적으로 세포에 의해 복제되거나, 숙주세포 게놈 내로 통합되거나 또는 숙주세포의 핵 또는 세포질 내에 존재할 수 있다.

"심장 세포"는 분화된 심장 세포(예를 들어, 심근 세포) 또는 심장 세포를 생성하거나 심장 세포로 분화되도록 결정된 세포(예를 들어, 심근 모세포 또는 심근 아세포)를 의미한다.

"심근 세포(cardiomyocyte)"는 심장에서 검출 가능한 양의 심장 마커(예를 들어, 알파 미오신 heavy chain, cTnI, MLC2v, 알파 심장 액틴, in vivo에서 Cx43)를 발현하고, 수축하며, 증식은 하지 않는 근육 세포를 의미한다.

"심근 모세포(cardiomyoblast)"는 심장에서 검출 가능한 양의 심장 마커를 발현하고, 수축하고, 증식하는 세포를 의미한다.

"심근 아세포(cadiomyogenic cell)"는 검출 가능한 양의 Csx/Nkx2.5 RNA 또는 단백질을 발현하고, 조직화된 육종 구조나 수축이 보이지 않고, 검출 가능한 양의 미오신 heavy chain 단백질이 발현되지는 않는 세포를 의미한다.

"심장 외막 세포(epicardial cell)"는 검출 가능한 양의 Flk-1 및/또는 ICAM-2를 발현하고, 내피 세포가 될 수 있는 세포를 의미한다.

"심장 내막 세포(endocardial cell)"는 검출 가능한 양의 Tie-2 및/또는 von Willebrand Factor를 발현하는 심장 세포를 의미한다.

"내피 세포(endothelial cell)"는 검출 가능한 양의 다음 RNA 또는 단백질을 적어도 하나 이상 발현하는 세포를 의미한다: MUC18, VE-cadherin, N-cadherin, alpha- 및 beta-catenins, Flk-1, Tie-2, 및 CD34.

"내피 세포로 분화하도록 유도된 세포"는 줄기 세포가 내피 세포로 유도되는 조건에서 배양된 불멸화되지 않는 줄기 세포를 의미하며, 그 세포 중에 적어도 약 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%까지가 내피 세포이다.

"혈관 평활근 세포로 분화하도록 유도된 세포"는 세포가 혈관 평활근 세포로 유도되는 조건에서 배양된 불멸화되지 않는 줄기 세포를 의미하며, 그 세포 중에 적어도 약 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%까지가 혈관 평활근 세포이다.

배양된 골수 줄기 세포의 분화를 언급할 때 "하나의 세포 형태로의 특이적인 유도"는 적어도 50% 이상의 줄기세포가 원하는 세포 형태(즉, 심근 세포)로 분화되는 배양을 의미한다.

단백질의 "검출 가능한 양"은 다음과 같이 여기에 제공된 방법을 사용한 면역세포화학법에 의해 검출되는 단백질의 양을 의미한다. 세포가 CsX/Nkx2.5 또는 미오신 heavy chain으로 표지되어 있는지를 확인하는 방법 한 가지가 다음에 제공된다. 배양된 세포를 얼음에서 20 분간 4% 포름알데히드를 가지고 고정시킨다. 그 다음 0.2% triton-X100이 들어있는 PBS에서 15 분간 방치한다. PBS로 세 번 세척한 후, 세포를 15 분간 blotting 용액(PBS에 1% BSA 와 0.2% Tween 20를 첨가)에 방치한다. 이 시료를 다음 항체 중 하나를 가지고 처리한다: anti-Csx (1:100~1:200, from S. Izumo, Harvard Medical School, Boston MA), MF-20 (1:50~1:200, from Developmental Studies Hybridoma bank, University of Iowa, Iowa City Iowa). anti-desmin (1:100~1:200, from Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis MO). 필요에 따라, 같은 농도의 동종 대조군(Csx는 normal rabbit serum, MF-20는 mouse IgG2b, desmin는 mouse IgG1)과 함께 4 ℃ 항습조에서 밤새도록 반응시킨다. 시료 슬라이드를 세척 용액(PBS에 0.5% Tween 20 첨가)으로 세 번 세척한 다음, 이차 항체와 함께 배양한다(Csx는 donkey anti-rabbit IgG, MF-20과 anti-desmin는 donkey anti-mouse IgG, from Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). 세 번 세척한 후 형광 현미경(예를 들어, 형광 부속물이 부착된 Nikon TS100 현미경)으로 관찰하여 형광을 띠는 세포의 수를 세었다.

"심장 특이적 인핸서 인자"는 프로모터와 기능적으로 연계되어 심장 세포 내에서 유전자 발현을 유도하지만, 모든 조직이나 모든 세포 형태에서 유전자 발현을 유도하지는 않는 인자를 의미한다. 예를 들어 Csx/Nkx 2.5로부터 클로닝된 어떤 심장 특이적 인핸서 인자는 혀 및 배아 위에서 뿐 아니라 심장 세포에서 유전자를 발현시킨다. 본 발명의 심장 특이적 인핸서는 자연적으로 또는 비자연적으로 생성될 수 있다.

"이종의"는 핵산 분자가 외부 source로부터 기원하는 경우 또는 같은 source라면 원래 형태로부터 변형된 것을 의미한다. 따라서 "이종 프로모터"는 본 발명의 복제된 인핸서 도메인과 정상적으로 연계되지 않은 프로모터이다. 마찬가지로 원래 형태로부터 변형되었거나 이와 기능적으로 연계된 프로모터가 유래된 source와는 다른 source으로부터 유래된 이종 핵산 분자가 유도되었다.

"실질적으로 정제된 핵산"은 본 발명에서 핵산이 유도된 유기체에서 자연적으로 나타나는 게놈 중에서 해당 핵산의 flank에 유전자가 없는 핵산을 의미한다. 따라서 이 용어는 벡터 내로; 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스 내로; 또는 원핵 세포 또는 진핵 세포의 게놈 핵산 내로 통합되거나; 또는 다른 염기서열과는 독립적으로 분리된 분자(예를 들어, cDNA 또는 PCR이나 제한 효소 절단에 의해 생성된 게놈 절편 또는 cDNA 절편)로 존재하는 재조합 핵산을 그 예로 포함한다. 또한 이것은 폴리펩티드 서열을 암호화하는 혼성 유전자의 일부인 재조합 핵산을 포함한다.

"형질전환 유전자(transgene)"는 일시적 또는 영구적으로 세포 내로 삽입되고, 게놈 내로 통합되거나 염색체 외에 존재할 경우 유기체의 일부가 되는 핵산 분자(예로 DNA)의 단편을 의미한다. 그러한 형질전환 유전자는 형질전환 유기체와 부분적으로 또는 완전히 이종(예를 들어, 이물질)인 유전자를 포함하기도 하며 그 유기체의 내부 유전자와 동종의 유전자를 나타내기도 한다.

"형질 전환 세포(transgenic cell)"는 형질전환 유전자를 포함하는 세포를 의미한다. 예를 들어, 본 발명에서 이종 핵산 분자와 기능적으로 연계된 발현 벡터를 포함하는 벡터로 형질 전환된 줄기 세포는 형질적인 특징이 바뀐 세포군을 형성하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 특징과 장점은 다음 바람직한 실시예의 설명 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.

본 발명자들은 발생학적으로 커미티드(committed)된 상태이지만 분화되지는 않은 세포의 이식이 목표 조직에서 이식세포의 생존과 생착력, 적응력을 증가시킨다는 것을 발견하였다.

척추동물의 발생에서 초기 심장 발생은 Csx/Nkx2.5의 발현으로 정의된다. 이러한 발생단계에서 Csx/Nkx2.5 발현 세포는 계속적인 증식시기에 있다. 본 발명자들은 증식시기에 있는 Csx/Nkx2.5 발현 세포를 이식함으로써 심장에 생착되고 기능을 나타내는 심근 세포의 수가 증가할 것이라고 믿고 있다.

또한, 본 발명자들은 심근층 부위에서 새로운 혈관의 형성과 심근 조직이 동시에 재생되는 세포이식 치료법을 발견하였다. 이러한 방법은 심근 세포, 내피 세포, 또는 혈관 평활근 세포 등 세 가지 세 포형태 중 한 가지로 되기 시작한 미분화된 세포의 이식을 포함한다.

세포 이식을 위하여 충분한 양의 세포를 공급하는 것이 바람직하다. 따라서, 이식되는 세포는 줄기 세포에서 유래된다는 것이 한 가지 특징이다. 적절한 줄기 세포 중 하나는 골수 줄기 세포로 이는 성인의 골수에서 채취할 수 있다. 일단 채취된 골수 줄기 세포는 아래 설명처럼 성장인자를 처리하여(여기서 priming으로 언급) 심근 세포 계통으로 유도할 수 있다. 다른 한편으로, 골수 줄기 세포는 내피 세포 계통 또는 혈관 평활근 세포 계통으로 유도할 수도 있다. 구체적으로 골수 줄기 세포의 계통의 전환을 특정 세포 인식 인디케이터 시스템을 이용하여 모니터링할 수 있다. 이러한 내용은 U.S. Provisional Application Serial No. 60/283,837 에 기술되어 있어 이를 참조하였다. 세포 종류 특이적 인디케이터 시스템을 형성하기 위해, 계통 특이적 인핸서/프로모터(enhancer/promoter)-유도 마커를 포함하는 유전자 콘스트럭트(construct)를 이용하여 형질전환 마우스 계대는 확립되었다. 예를 들어, 심근 세포 전구체의 변환은 hCsx-LacZ 형질전환 마우스의 인캡슐 골수 줄기 세포를 이용하여 모니터링할 수 있다. 적당한 마커 유전자 발현이 세포 집단에서 발견되면, 이러한 세포를 수집하여 숙주 심근층에 주사하였다.

하나의 실시예에서, 심근 세포 전구체, 내피 세포 전구체, 혈관 평활근 세포는 동시에 숙주 심근층에 주입한다. 특정 위치에 각 세포 종류를 적당한 분포로 주입하기 위하여 여러 종류 세포를 주사하도록 고안된 멀티채널(multi-channeled) 주사기를 사용할 수 있다. 각 바늘의 길이와 바늘간의 거리는 심근층에 주입될 각 세포들의 최적 위치에 따라 조절될 수 있다.

세포 이식 성공을 위해서는 줄기 세포와 줄기 세포 유도체 준비의 최적화가 아주 중요하다. 세포 이식의 이식률을 극대화하기 위해서는 이식되는 세포가 시작 (commitment)과 분화 중 적절한 단계에 있는 것이 바람직하다. 현재 여러 동물 세포에 대한 커미트먼트와 분화 마커가 알려져 있으나 in vitro 배양시 적절한 세포 수집 시기를 결정하기 위해서는 분자생물학적인 방법으로 마커 발현을 확인하는 일로 시간을 낭비할 수 밖에 없다. 본 발명자들은 세포 배양시 세포의 분화 단계를 실시간적으로 결정하는 생물학적으로 유용한 인디케이터 시스템을 개발하였다. 이러한 인디케이터 시스템을 사용하여 세포 성장 또는 세포 사멸 과정 동안 단백질의 발현량을 결정할 수 있다.

대부분의 조직 특이적 유전자 발현은 전사 단계에서 인핸서와 억제인자 (repressor)에 의하여 조절된다. 일반적으로 발현을 정확하게 조절하기 위해서, 인핸서는 다양한 전사인자의 협력을 요구하는 혼합 조절 메커니즘을 채택해야 한다. 전사인자의 결합부위는 유전자 프로모터에서 수 킬로베이스(kilobases, kb) 떨어져 있으며 서로서로가 떨어져 있다.

마우스에서 형질전환 유전자의 발현을 유도하기 위해 사용될 때 hCsx/Nkx2.5와 mCsx/Nkx2.5의 심장 인핸서는 내생의 mCsx/Nkx2.5의 발현양상을 재생한다(US Patent Application Publication No. 2002022259 참조, 참고문헌에 명기). 포유류의 심장 인핸서로 알려진 것 중 하나인 이 인핸서(7.5kb 인핸서)는 4개의 심실과 심방에서 발현되는 가장 초기의 인핸서이다. 더욱이 이 인핸서는 장소를 벗어난 곳에서 발현되지 않는다. 7.5kb 안에서 두 개의 지역(A1과 A2로 불리는 도메인(domain))이 함께 동정되었다. 이것이 hsp68 promoter-lacZ 카세트와 연결되면 심장-특이적으로 유전자 발현을 향상시킬 수 있다. 이 두 개의 지역은 본 발명에서 리포터를 구성할 때 이용할 수 있다.

실시예 1: 골수 줄기 세포로부터 심근 아세포의 유도

골수는 마우스와 개의 성체에서 분리하였다. 골수 줄기 세포를 분리하여 10% 우혈청, 100M L-ascorbic acid-2-PO₄, 5-15 ng/㎖ LIF(leukemia inhibitory factor, 마우스 세포 배양에서는 마우스 LIF를 사용하였고, 개 세포 배양에서는 인간 LIF를 사용하였다.) 및 20 nM 덱사메타손과 함께 배양하였다. 이러한 in vitro 조건에서 골수　줄기 세포는 자가 증식 성질을 유지하고 성장인자와 같은 분화 시약에 반응성을 잃지 않으면서 계대배양을 통해 증식된다. 또한, 여러 계대 배양을 통해 배양된 줄기세포는　줄기세포 형태(mesenchymal morphology)와 정상 핵형(karyotype)을 유지한다(도 1). 성장인자(50 ng/㎖ BMP2, 100 ng/㎖ bFGF)와 함께 14 일간 배양 후 약 80%의 골수 줄기 세포가 Csx/Nkx2.5, MF-20(sarcomeric myosin 특이 단일 클론성 항체)와 desmin 항체에 의하여 염색되었는데, 이것은 세포가 심근 세포로 분화되었다는 것을 보여준다(도 3 및 도 4).

이식되는 골수 줄기 세포가 노출되는 성체 심근층과 비슷한 환경을 조성하기 위하여 혼합 배양(co-culture) 시스템을 이용하였다. 이 시스템에서 골수　줄기 세포를 동정하기 위하여 형광 태그(Vybrant TM)로 표지하였고 닭 배아 심근세포와 1:40의 비율로 5 ng/㎖의 콜라겐으로 코팅된 유리 슬라이드 위에서 일차 혼합 배양 하였다. 이러한 혼합 배양에서는 25 ng/㎖ BMP2만 첨가하거나 또는 25 ng/㎖ bFGF만 첨가하였다. 그 후에 세포는 항-Csx/Nkx2.5, MF-20(sarcomeric myosin의 단일 클론성 항체)와 desmin 항체로 염색하였다. 개시 5일 후 적은 수(0.1∼1%)의 세포가 BMP2 또는 bFGF 존재 하의 혼합 배양에서 미오신 양성 반응을 나타내었다. 그러나, 성장인자 없이 2 주 동안 혼합 배양한 후에도 많은 골수　줄기　세포가 MF-20에 대하여 양성을 보였는데, 이는 이 세포가 근육아세포 계통으로 바뀌었다는 것을 보여준다(도 2). 따라서, 골수　줄기　세포는 BMP2 및 bFGF와 같은 성장인자를 사용하거나, 또는 분화된 심근 세포와 혼합 배양을 함으로서 근육아세포 계통으로 분화 될 수 있다.

전술한 결과에 의하면 세포가 배양되는 환경을 조절함으로써 골수 줄기 세포가 심근 아세포로 분화될 수 있는 비율과 양을 조절할 수 있다. 고안된 이식 방법에 따라 이식한 세포 중 최소한 10%는 심근 아세포인 것이 바람직하다(즉, 유사 분열 세포는 Csx/Nkx2.5를 발현하나 sarcomeric 구조나 근 수축 등은 볼 수 없고 미오신 heavy chain RNA 또는 단백질의 발현을 검출 가능한 양만큼 발현하지 않는다). 심근 아세포가 고함량으로 함유되어 있으면 이식된 세포의 생착률이 높아진다. 최소한 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90% 또는 95%나 그 이상의 세포가 심근 아세포인 것이 바람직하다. 실시간 커미트먼트의 측정은 아래의 실시예 5에서 기술되어진 세포 인디케이터 시스템을 이용하여 실시된다.

실시예 2: 인간과 다른 포유류에서의 골수 줄기 세포

앞의 실시예는 시범 목적으로 쥐 골수 줄기 세포를 사용한다. 인간 골수 줄기　세포 또한 심근 세포를 생성할 수 있는 것으로 알려져 있다(Pittenger et al., Science 284: 143-147, 1999). 다른 포유류의 골수　줄기　세포(예를 들면, humanized pig 골수　줄기　세포)도 본 발명의 방법에 이용될 수 있다(Levy et al., Transplantation 69: 272-280, 2000).

실시예 3: 골수 줄기 세포를 심근 아세포로 유도하는 방법

전술한 바와 같이 BMP2 및/또는 bFGF 존재하에서 심근 세포와 골수 줄기 세포를 함께 혼합 배양하면 심근세포로 분화될 수 있는 심근 아세포를 유도한다. 골수 줄기 세포와 유도 세포의 비율, 그리고 성장 인자의 농도를 조절하여 심근 아세포 분화의 정도와 양을 조절할 수 있다. 예를 들어, 골수 줄기 세포와 유도 세포의 비율은 1:1 내지 1:1000, 또는 그 이상도 가능하다. BMP2의 농도 범위는 약 0.5 ng/㎖ 내지 1 g/㎖가 가능하고, 그리고 bFGF는 1 ng/㎖ 내지 5 g/㎖까지 가능하다. BMP/TGF 및 FGF 패밀리는 BMP2 및/또는 bFGF 대신 사용할 수 있다.

골수 줄기 세포를 심근 아세포로 만드는 이미 알려진 다른 방법도 본 발명에 사용될 수 있다. 그러나 심근 세포를 유도하는 모든 방법이 사용될 수는 없다. 예를 들어, 5-아자사이티딘은 심근 세포 유도 물질로 알려져 있으나(Makino et al., J. Clin . Invest., 103: 697-705, 1999), 이것은 본 특허 방법에는 적합하지 않다. 5-아자사이티딘은 임의로 유전자 서열을 디메틸화(demethylate)시키기 때문에(비 발현 유전자의 발현 촉진), 골수 줄기 세포에 이것을 처리하게 되면 심근 세포 (cardiac troponin I 양성)(Wakitani et al., Muscle Nerve, 18: 1417-1426, 1995; Tomita et al., Circulation, 100 suppl II: 247-256, 1999) 외에도 여러 종류의 세포(예를 들어 근세포(MyoD 양성), 골모세포(osteocalin 양성), 지방세포(PPAR-γ 양성))로 분화된다. 골수 줄기 세포를 5-아자사이티딘에 노출시키면 c-abl과 인터류킨-6의 발현이 빠르게 증가하고 이로 인해 콜라겐 I과 같은 주요 주형물(matrix) 단백질의 발현이 감소한다(Andrews et al., Mol . Cell. Biol ., 9: 2748-2751, 1989). 본 발명의 방법에서 적절한 인자 또는 조건은 특이적으로 한 가지의 세포로만 유도한다(예를 들어, 심근 세포).

실시예 4: 다른 세포 종류의 유도

심근층에 이식하기 위해서 혈관 근육 세포 및 내피 세포(또는 그들의 세포 전구체)와 같은 세포를 유도하는 것이 바람직하다. 그 이유는 이러한 세포들이 이식된 심근 아세포의 주위에 새로운 혈관을 형성하기 때문이다. 세포들을 한 가지만 이식할 수도 있지만, 적당한 심근 아세포와 함께 이식하는 것이 바람직하다.

혈관 근육 세포의 분화는 Bves 유전자 인핸서를 이용하여 결정할 수 있다 (Reese et al., Dev . Biol . 209: 159-171, 1999). 내피 세포의 분화는 Tie-2 또는 클로닝된 von Willebrand 인자 인핸서를 이용하여 결정할 수 있다(Schnurch and Risau, Development 119: 957-968, 1993; Coffin et al., Dev . Biol . 148: 51-62, 1991). 배아 심근 외피세포(즉, 내피　세포의 세포 전구체)의 분화는 Flk-1 또는 ICAM-2 인핸서에 의하여 결정되어진다(Shalaby et al., Nature 376: 62-66, 1995; Tevosian et al., Cell 101: 729-739, 2000, respectively).

골수 줄기 세포는 이전에 기술된 방법으로 분리하고, 배아 발생 시기에 내피세포의 발생인자로 알려진 생물학적 인자와 함께 배양하였다(2% 우혈청, 20 ng/㎖ VEGF, 1 ng/㎖ bFGF, 그리고 2 ng/ml IGF-I). 내피 세포 특이적 수용체 타이로신 키나아제(tyrosine kinase)인 Flk-1은 배양 14일 후, 80% 가까운 골수 줄기 세포에서 강하게 발현되었느데, 이는 내피 세포 계통으로 바뀌었다는 것을 의미한다(도 5).

실시예 5: 세포 인디케이터 시스템

도 16A에 서술한 바와 같이, 인디케이터 시스템은 3가지로 구성되어 있다: 인디케이터 세포 2, 세포 인캡슐 시스템(CES) 4, 및 인디케이터 세포를 CES에 잔류할 수 있도록 하고 인디케이터 세포 2를 이식되어질 세포 8과 구별시켜 주는 침투성의 외막 또는 그물 6.

하나의 실시예에서, 인디케이터 시스템은 줄기 세포(예를 들어 골수 줄기 세포)의 세포 커미트먼트와 분화시기를 결정하는데 유용하다. 여기에 기술된 바와 같이 인간 골수　줄기 세포의 약 5∼100% 정도(바람직하게는 약 80%)는 심근 아세포 (Csx/Nkx2.5 발현, 조직화된 sarcomeric 구조 또는 근 수축의 결핍, 미오신 heavy chain RNA 또는 단백질의 결핍으로 결정)가 되도록 인간 골수 줄기 세포를 준비하는 것이 바람직하다. 따라서 분석을 신속히 함으로서 분석을 위한 세포 수집과 이식을 위한 세포 수집 간의 시간적 차이를 줄일 수 있다. 그러므로 신속한 분석은 최종적으로 이식되어질 세포가 Csx/Nkx2.5 발현 세포임을 보장한다. 본 발명은 이러한 분석 방법을 제공한다. 리포터 유전자와 기능적으로 연계된 Csx 인핸서를 포함하는 형질전환 마우스의 골수　줄기 세포가 인디케이터 세포로 이용된다. 예를 들어, 참고문헌으로 기입한 U.S. Patent Application Publication No. 2002022259에 적절한 Csx 인핸서를 설명한다. 인디케이터 세포는 생물학적 물질(예를 들어, 알기네이트, 콜라겐, 젤라틴 또는 키토산)에 인캡슐되거나 또는 생물학적으로 분해될 수 있는 중합체(예를 들어, non-porous microspheres of polylactic acid(PLA), polyglycolic acid(PGA), 또는 polylactide/glycolide copolymer(PLGA))에 부착된다. 인캡슐된 또는 미세 구체에 부착된 세포는 산소, 영양물질, 및 다른 생물학적 분자들에 대하여 투과성인 막에 의해 둘러싸여있다. 적절한 막의 예로서 다공성 투명 PET(porous transparent polyethylene terephthalate) 멤브레인, 투명 나일론 메쉬(transparent nylon mesh), 투명 다공성 나일론 멤브레인(transparent porous nylon membrane), 그리고 다공성 투명 PEFE(porous transparent polytetrafluoroethylene (PEFE/Teflon) 등이 있다.

인디케이터 세포를 캡슐 안에 보유하는 것에 더하여, 바깥 막은 시스템에 물리적으로 완전한 상태를 제공한다. 인간 골수 줄기 세포를 심근 아세포로 유도하는 과정에서 Csx 인핸서와 기능적으로 연계된 리포터 유전자(즉, 인간 Csx 인핸서)가 인디케이터 세포에서 발현될 것이다. 리포터 유전자 발현의 비독성 검사는 인간 세포의 분화 단계를 알려준다. 적절한 리포터 유전자에는 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제, 그리고 루시퍼라제(luciferase) 등이 포함된다. 세포가 원하는 분화 단계에 이르렀다고 결정된 후 전체 인디케이터 시스템(인디케이터 세포, 인캡슐 물질, 투과막을 포함한)은 제거된다. 이식될 세포는 이식을 위해 수집되고 준비된다. 경우에 따라 세포는 냉동하여 이식 전까지 보관될 수 있다.

본 발명의 세포 인디케이터 시스템에서는 인디케이터 세포로 어떤 종류의 세포도 사용할 수 있고 인핸서 물질/리포터 유전자 construct이 세포가 분화될 때 조작할 수 있는 어떤 형태의 세포일 수 있다. 하나의 실시예에서, 리포터 construct으로는 형질전환된 골수 줄기 세포가 사용된다. 이 세포는 어떤 동물의 골수 줄기 세포, 또는 인핸서 물질/리포터 유전자로 형질 전환된 배아 줄기 세포나 인핸서 물질/리포터 유전자로 형질 전환된 동물의 골수 줄기 세포도 가능하다.

본 발명자들은 전술한 인캡슐 세포 인디케이터 시스템의 원리를 hCsx-lacZ 형질전환 마우스에서 유래된 쥐의 골수 줄기 세포를 이용하여 증명하였다. 본 발명자들은 심근 아세포 계통으로 분화를 유도하지 않은 골수 줄기 세포는 β-갈락토시다제 방법으로 전혀 염색되지 않거나 미약하게 염색된다는 것을 알아내었다(도 15). 반대로 전술한 방법을 이용하여 심근 아세포로 분화를 유도한 골수 줄기 세포는 강력한 양성반응을 보였다(도 15). 따라서, 쥐 hCsx-lacZ 골수 줄기 세포는 근육아세포 분화의 전개과정을 모니터링하는데 사용될 수 있는 시스템으로서의 인캡슐을 위한 훌륭한 후보 물질이다(도 16A 및 도 16B). 이러한 인디케이터 시스템은 이전에 사용되던 세포 분화 측정 방법보다 몇 가지 장점이 있다. 특별히 캡슐은 배양액에서 쉽게 분리(recover)되고 빠르고 확실하게 분석된다. 더욱이 캡슐은 모든 배양 관(vessel)에 혼합되고 분리(recover)될 수 있어 plate-by-plate로 모니터링할 수 있다. 모니터링하기 위해 이전 방법처럼 전체 배양액을 파괴할 필요가 없다. 특히 사람의 골수 샘플이 얻기도 힘들고 배양하고 이식할 수 있는 줄기 세포의 양도 적기 때문에, 이는 골수 줄기 세포를 이용할 때 아주 중요한 의미를 갖는다.

쥐의 hCsx-lacZ 골수 줄기 세포는 전술된 특성을 포함하는 적절한 물질로 인캡슐할 수 있다. 예를 들어 알기네이트(alginate)에 세포를 끼워 넣고, 그리고 예를 들어 밀리포아 회사(메사추세스주 베드포드)의 11m 또는 30m 나일론 메쉬 안에 알기네이트-embedding 세포를 포함함으로써 캡슐을 만들 수 있는데, 이것은 튼튼하며 배양액과 성장인자, 산소, β-galactosidase assay에 사용되는 화학 물질에 대하여 투과적이다. 여기에 기술된 방법을 사용하면 캡슐은 바람직하게는 1 ㎖당 최소한 약 10⁶ 개의 hCsx-lacZ 골수 줄기 세포를 포함할 수 있다. 그러나 최소한 약 10⁷ cell/㎖가 더 바람직하다. 물론 조건이 변화됨에 따라 통상의 기술을 가진 사람이 캡슐 시스템의 인디케이터 세포의 적절한 농도를 결정할 수도 있다.

본 발명에서 인캡슐 모니터 시스템을 만드는데 사용되는 특이적 인디케이터 세포가 쥐 세포일 필요는 없다. 인디케이터 세포는 이식 수용체에 대해서 이종이거나 자가이어도 된다. 골수 줄기 세포가 비교적 풍부한 경우에는 전술한 바와 같이 리포터 construct을 가지는 숙주 골수 줄기 세포를 형질전환하는 것이 선호된다. 이러한 자가 골수 줄기 세포가 인캡슐되고, 그리고 모니터링 목적으로 사용될 수 있다. 골수 줄기 세포의 공급이 제한적이라면 대안으로 비-자가(이종 또는 동종) 인디케이터 골수 줄기 세포를 이용할 수도 있다.

실시예 6: 이식 방법

본 발명은 자가 유래 또는 이종 유래의 심장 세포를 이식함으로써 불충분한 심장 기능으로 인한 피험자의 장애를 치료하는 방법과 관련된다. 이 방법에는 본 발명의 줄기 세포에서 유래된 심장 세포 전구체, 내피 세포 전구체, 그리고 혈관 평활근 세포 전구체를 피험자에게 투여하는 방법이 포함되며 이하에서 자세히 설명된다. 심장 질환을 가진 피험자의 심장에 본 발명의 세포를 이식함으로써, 기능을 못하거나(hybernating) 소실된 심장세포를 대체할 수 있다. 심장 질환을 가진 환자에게 기능을 못하거나 소실된 심장 세포를 대신해서 적당한 양의 세포를 삽입하는 것으로 적어도 한 가지 이상의 심장 질환의 징후나 부작용을 완화시키거나 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있다. 세포들은 어떠한 적당한 루트를 통해서 환자에게 주입될 수 있고, 환자의 요망되는 부위에 세포를 전달한 결과 적어도 한 부위에서는 세포가 살아남아 있다. 적어도 약 5%, 바람직하게는 적어도 약 10%, 더 바람직하게는 적어도 약 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 50% 또는 그 이상의 세포가 환자에게 주입된 후 살아 남아 있는 것이다. 환자에게 주입된 후 세포가 살아 있는 기간은 짧게는 몇 시간, 예를 들면, 24시간에서 몇 일, 길게는 몇 주에서 몇 달이다. 본 발명의 세포를 환자에게 전달할 수 있는 방법 한 가지는 환자 심실의 심근층에 직접 세포를 주입하는 것이다(예를 들어, Soonpaa et al., Science 264: 98-101, 1994;Koh et al., Am. J. Physiol . 33: H1727-1733, 1993). 세포들은 완충된 염수 용액(buffered saline solution)과 같은 생리적으로 적합한 운반체를 타고 투여될 수 있다. 인간 환자의 불완전한 심장 기능으로 인한 병을 치료하기 위해서는 약 10⁴∼10⁹개의 세포가 인간에게, 예를 들어 심근층 안으로 삽입되어야 한다.

이러한 투여 방법을 달성하기 위해, 본 발명의 세포는 환자 내부로의 세포 이식이나 주입을 용이하게 하는 운반 장치 내로 삽입될 수 있다. 이식 대상 환자의 몸 안으로 세포와 유액을 주입하기 위한 운반 장치에는 튜브, 예를 들어 카테터가 포함된다. 구체적으로, 튜브는 바늘이나 여러 개의 바늘을 통하여 환자의 원하는 부위로 세포를 주입할 수 있다. 주입하는 동안에 서로 다른 상태의(다른 배양액에서와 같은) 각각의 세포 형태는 유지되는 것이 바람직하다. 그런 경우에 하나, 둘, 또는 세 개의 바늘을 갖는 다-원통형 주사기가 주입을 위해 사용될 수 있다(도 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 및 22b). 만약 3-원통형/2-바늘 주사기가 사용된다면, 내피 세포 전구체와 평활근 세포 전구체가 주입되는 동안 혼합되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 세포는 다른 형태로 운반 장치 안으로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 세포는 운반 장치 내로 포함될 때 용액으로 현탁시키거나 지지체 주형물 (support matrix) 내로 끼워넣을 수 있다. 바람직하게는, 용액이 약제학적으로 적합한 운반체나 희석액을 포함하며 그 안에 본 발명의 세포가 살아 있어야 한다. 약제학적으로 적합한 운반체나 희석액으로는 염수, 수성 완충 용액, 용매 및/또는 분산 배양액이 포함된다. 운반체와 희석액의 사용은 논문에서 잘 알려져 있다. 용액은 바람직하게는 살균한 것이고 유동체이다. 바람직하게는, 용액은 제조 및 보관시 안정해야 하고 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 혹은 티메로살을 사용해 박테리아나 곰팡이와 같은 미생물에 오염되지 않도록 저장된다. 본 발명의 용액은 여기에서 기술된 세포를 약제학적으로 적합한 운반체나 희석액, 그리고 필요에 따라 다른 성분에 주입하는 것에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에서 지지체는 세포를 안으로 혼합하거나 끼워넣을 수 있는 것으로, 피실험자에 적합하고 피실험자에게 유해하지 않은 물질로 분해되는 주형물을 포함한다. 주형물은 천연적인 것 및/또는 합성된 것으로 생물 분해성이 있는 것이다. 천연적인 것이면서 생물 분해성이 있는 것으로는, 예를 들어, 콜라겐 주형물 (collagen matrix)과 알기내이트 비드가 포함된다. 합성된 것으로 생물 분해성이 있는 것으로는 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters), 폴리락트산(polylactic acid)과 같은 중합체가 포함된다. 이들 주형물은 in vivo에서 세포의 지지와 보호를 위한 것이다.

환자 내로 주입하기 전에 세포는 면역 거부 반응을 억제하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 이식되는 세포의 거부 반응을 억제하고 이식 피실험자의 면역 비-거부 반응을 달성하기 위해, 본 발명의 방법은 환자에게 주입하기 전 세포 표면에 면역성 항원의 변형을 포함할 수 있다. 세포에서 한 가지 또는 그 이상의 면역성 항원을 변형하는 방법은, 이 방법 하나만 수행하거나 환자에게 T-세포의 활성을 억제하는 약물 투여를 병행하여 수행될 수 있다. 다른 방법으로, 이식되는 세포의 거부 반응 억제는 이식되는 세포 표면에 먼저 면역성 항원의 변형 없이 환자의 T-세포 활성을 억제하는 약물을 환자에게 투여함으로써 수행될 수 있다. T-세포 활성을 억제하는 약물은 환자 내부에서 T-세포 기능을 억제하거나 환자 내부에서 T-세포를 파괴하거나 제거(예를 들어, sequestration)할 수 있는 물질로 정의한다. T-세포는 여전히 환자 내부에 존재할 수도 있으나 기능을 할 수 없는 상태로 증식할 수 없거나 유도할 수 없거나 효과기 기능(예를 들어, cytokine production, cytotoxicity)을 수행할 수 없다. T-세포 활성을 억제하는 약제는 또한 미숙한 T-세포의 성숙이나 활성화를 억제할 수도 있다(예: 흉선 세포). 이식받는 환자에서 T-세포 활성을 억제하기 위해 사용하는 약제로는 정상적인 면역 작용을 방해하거나 억제하는 면역 억제 약물이 선호된다. 선호되는 면역 억제 약물로는 사이클로스포린 A(cyclosporin A)가 있다. 다른 면역 억제 약물에는 예를 들어, FK506과 RS-61443이 포함된다. 하나의 실시예에서, 면역 억제 약물은 적어도 하나의 다른 치료 약물과 함께 동시에 투여된다. 추가적인 치료 약물에는 스테로이드(예를 들어, prednisone, methyl prednisolone, dexamethasone과 같은 glcocorticoid)와 화학요법제(예를 들어, azathioprine과 cyclosphamide)가 포함된다. 다른 실시예에서, 면역 억제 약물은 스테로이드 및 화학요법제와 함께 동시에 투여될 수 있다. 적당한 면역 억제 약물은 상업적으로 입수 가능하다.

심장과 관련된 병을 치료하는 것 이외에도 세포 이식 치료는 넓은 범위의 질환에 적용할 수 있다(예를 들어, 파킨슨씨 병, 당뇨병, 척수 손상, 다발성 경화증). 심근층 내부로의 이식에 있어서, 요망되는 세포의 운명을 우선적으로 받아들이고 유사 분열을 할 수 있는 능력을 가지고 있는 세포를 이식하는 것이, 이식되는 세포의 조화를 도와 숙주 조직으로 요망되는 세포가 더 많이 생착되고 살아남을 수 있도록 한다. 세포 계통의 분화, 커미트먼트, 또는 능력의 검출을 위해 유용한 인핸서는 아래 표 1에 설명되어 있다.

상기 각 참고문헌은 여기에 참고로 도입되어 있다.

실시예 7: 개의 심근 경색 모델

In vitro에서 심근 아세포 계통으로 분화되는 골수 줄기 세포가 경색된 개의 심근 조직으로 이식된다. 개 심근 경색은 왼쪽 관상 동맥을 영구적으로 폐색함으로써 만들어졌다. 경색은 골수 줄기 세포 이식 전에 적어도 두 달 동안 안정화되었다. 이식에 의한 면역 거부 반응을 방지하기 위해 골수는 다음과 같이 각각 이식 수용체인 개에서 분리하여 준비했다. 결찰 후 대략 4 주 후에, 심장 초음파 조영술을 이용하여 심근 경색을 확인한 후, 골수를 추출하기 위해 장골 뼈에 구멍을 뚫었다. 골수를 즉시 헤파린과 혼합하고, 냉동하여 드라이 아이스 상태에서 조직 배양실로 운반하였으며, 여기에서 골수는 37 ℃에서 녹여 현탁시킨 후, 보통 사용되는 DMEM으로 1 회 세척하고, 배양액(10% 우혈청, 100M L-ascorbic acid-2-PO₄, 5∼15 ng/㎖ LIF, 20 nM 덱사메타손)이 담겨 있는 조직 배양 플라스크에 접종했다. 수집할 때, 이식 후 세포의 생존과 진행을 추적하기 위해서 붉은 색 형광 마커인 DiI를 가지고 BMSC를 표지했다. 표지된 골수 줄기 세포는 4∼7 일 동안 100 ng/㎖ bFGF를 첨가하여 배양하였다. 1.5∼250x10⁶ 개의 세포를 수집하고 심장의 경색 부위로 주입하였다.

이식 후에 골수 줄기 세포의 생존 여부는 사후에 DiI 형광을 시각화 함으로써 측정할 수 있다. 이식 15 일 후에 심근층에서 DiI 양성인 큰 세포 집합체가 관찰되었고, 이것은 골수 줄기 세포가 장기간 생존해 있음을 시사한다(도 6). 특히 DiI로 표지된 줄기 세포가 MF-20 양성인 심근 세포를 포함하고 있는 심근층 내부 부위와 MF-20 양성 심근 세포가 결여된 경색 부위에서 관찰되었다(도 6). 게다가 DiI 양성인 줄기 세포가 경색 부위의 경계 부근에서도 관찰되며 또한 심장 근육 특이 마커인 MHC α/β을 발현한다(도 7 내지 도 9). 이러한 데이터들은 in vitro에서 조절된 이식된 골수 줄기 세포가 숙주 심근층에 생착하고 생존하며 심장으로 분화되는 특징을 나타내는 마커를 발현함을 입증한다.

실시예 8: BMSC 이식은 경색 크기를 감소시킨다

실시예 7에서 설명한 심근 경색 개 모델은, 심장 초음파 조영술(ECG)을 이용하여 골수 줄기 세포 이식의 회복 효과를 in vivo에서 판단하기 위해 사용되었다. 심장 초음파 조영술은 골수 줄기 세포 이식 후 3.5, 4.5, 및 5 주에 수행하였으며(각각 도 19, 17, 및 18), 이식 전 심장 초음파 조영술 결과와 비교하였다. 각 동물에서, 경색부위의 수축력이 개선되어 심근층의 인접 부위와 조화를 이루게 되었다. 따라서, 심장 초음파 조영술 결과는 실시예 7의 조직 면역 염색 결과를 확실하게 하며 배양된 골수 줄기 세포의 이식이 경색 이후의 심장 조직을 부분적으로 회복시킨다는 것을 증명한다.

실시예 9: 설치류의 심근 경색 모델

이식된 골수 줄기 세포의 장기간 생존능력을 또한 설치류의 심근 경색 모델 시스템을 이용하여 연구하였다. 면역 거부 반응을 방지하기 위하여 골수 줄기 세포는 이식에 사용될 마우스와 같은 유전자 종에서 추출한 골수로부터 분리하였다. 위에 설명한 것과 같이, 골수 줄기 세포는 4∼7 일 동안 100 ng/㎖의 bFGF 존재 하에서 배양하고 DiI로 형광을 띌 수 있도록 표지하여 다시 수집하였다. 경색은 왼쪽 심장 동맥을 묶어 만들었다. 처리된 골수 줄기 세포는 다음과 같이 경색 부위에 주사하였다. 골수 줄기 세포(100,000 내지 500,000 개 세포를 10 ㎕ PBS 또는 HBSS에 현탁시킨 것)를 29G나 30G 해밀턴(Hamilton) 바늘을 끼운 50 ㎕ 해밀턴 주사기를 이용하여 비스듬하게 앞 격막 좌심실 심근에 주입하였다. 수술하는 동안, 마우스는 피드백 온도 조절기를 이용하여 37 ℃가 유지되는 침대 위에 놓여 있었고, 마우스 호흡기(부피: 200 ㎕, 속도: 110/min rate)를 이용하여 호흡을 도왔다. 이식 후 36 일에, DiI로 표지된 세포의 존재와 심근 세포 생존 능력을 측정하기 위해 경색 부위를 분석하였다. 개 모델에서 관찰된 것과 같이, 표지된 골수 줄기 세포가 설치류의 심근 경색 부분 내에 생착되었다. 또한, DiI로 표지된 세포가 심근층에 존재하였고 심근 세포의 형태학적 특징을 나타내었다. 이 부위를 헤마톡실린과 에오신으로 염색하면 경색 내부에서 심장 근육의 특징을 나타내는 줄무늬, 나사 모양 핵, 그리고 가늘고 기다란 섬유질이 보인다(도 10). 본 발명자들은 또한 심근층의 경색된 부위에 인접해 있는 DiI에 양성인 세포를 관찰하였다. 심근 세포를 시각화하기 위해 α-MHC, MF-20, 및 cardiac troponin 항체를 이용하여 염색한 결과는 DiI로 표지된 세포(이식된 골수 줄기 세포)가 심장 근원섬유 내에 존재함을 보인다(도 11, 12, 및 14). 또한, 이식된 골수 줄기 세포는 심근층의 인접 부위에 생착되었다 (도 13). 따라서 이식되고, 자극된 골수 줄기 세포는 정상적인 심장 조직과 경색된 심장 조직 두 부분 모두에 완전히 생착되며 계속해서 심근 세포로 분화된다; 분화는 이미 이식 전에 in vitro 에서 자극되는 동안 시작되었다.

실시예 10: 줄기세포를 내피 세포 전구체로 유도하는 방법

내피 세포 전구체를 만들기 위해서는, 동정된 줄기세포(예를 들어, 인간의 골수 간세포)를 VEGF(10 ng/㎖), bFGF(1 ng/㎖), IGF-I(2 ng/㎖)로 4∼7 일 동안 처리한다(Shi et al., Blood 92: 362-367, 1998). 세포 인디케이터 시스템에서 변환 인디케이터로, 리포터 유전자가 기능적으로 연계된 Tie 인핸서가 내재된 줄기 세포를 사용할 수 있다(Schlaeger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94: 3058-3063,1997).

실시예 11: 줄기세포를 혈관 평활근 세포 전구체로 유도하는 방법

혈관 평활근 세포 전구체를 만들기 위해서는, 분리된 줄기세포(예를 들어, 인간의 골수 줄기세포)를 PDGF(1∼10 ng/㎖)와 TGF-β(1∼10 ng/㎖)로 4∼7 일 동안 처리한다(Hirschi et al., J. Cell Biol . 141: 805-814, 2000). 세포 인디케이터 시스템에서 변환 인디케이터로, 리포터 유전자가 기능적으로 연계된 Bves 인핸서가 내재된 줄기 세포를 사용할 수 있다(Reese et al, Dev . Biol . 209: 159-171, 1999).

본 발명에서 인용된 모든 공보와 특허 출원은, 개개의 공보나 특허 출원에 대한 기록과 함께 참고로써 여기에 도입된다. 본 발명의 이해를 명확하게 하기 위해 보기와 실시예에 의해 구체적으로 설명을 하였지만, 본 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자들에게는 본 발명의 교시에 비추어 첨부된 청구의 범위의 정수 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 어떠한 변경 및 변형을 하는 것이 자명할 것이다.

도 1은 마우스와 개로부터 얻은 골수 줄기 세포를 분리, 배양한 것을 위상차 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 2는 마우스 유래 골수 줄기 세포를 닭 심근 세포와 14일간 혼합 배양한 것을 현미경으로 연속하여 관찰한 사진이다.

도 3은 sarcomeric myosin 또는 desmin 특이적 MF-20 항체를 사용한, 쥐 심근세포, 미분화 골수 줄기 세포(BMSCs), 및 분화된 골수　줄기 세포의 염색과 형태학적 사진을 보여주는 것이다.

도 4는 개의 골수 줄기 세포를 in vitro에서 분화시킨 후 형태와 Csx/Nkx2.5 발현을 조사한 현미경 사진이다.

도 5는 in vitro에서 쥐 골수 줄기 세포로부터의 내피 세포 분화를 보여주는 현미경 사진이다.

도 6은 이식 15 일 후 심근 경색 개의 심근층에서 이식된 골수 줄기 세포의 위치를 보여주는 현미경 사진이다.

도 7a는 이식된 주사 부위에서 DiI 형광을 나타내는 이식된 골수 줄기세포와 항-MHC α/β 형광을 나타내는 심근 세포의 co-localization을 보여주는 현미경 사진이다.

도 7b는 처리하지 않은 골수 줄기 세포와 caspase inhibitor를 처리한 골수 줄기 세포를 비교할 때 생존률이 증가하는 것을 보여주는 현미경 사진이다.

도 8은 주사 부위에서 떨어진 부위에서 DiI 형광을 나타내는 이식된 골수 줄기세포와 항-MHC α/β 형광을 나타내는 심근 세포의 co-localization을 보여주는 현미경 사진이다.

도 9는 주사 부위에서 떨어진 부위에서 DiI 형광을 나타내는 이식된 골수 줄기세포와 항-MHC α/β 형광을 나타내는 심근 세포의 co-localization을 보여주는 현미경 사진이다.

도 10은 쥐의 골수 줄기 세포를 이식한지 36일 후 쥐 심근괴사 부위의 조직병리 현미경 사진이다.

도 11 내지 도 14는 이식 36일 후 쥐의 심근 조직(myocardial tissue)에 쥐 골수　줄기　세포가 생착되었음을 보여주는 현미경 사진이다.

도 15는 hCsx-lacZ 쥐 골수줄기세포를 심근 아세포로 유도하는 성장인자와 함께(오른쪽), 또는 성장인자 없이(왼쪽) 배양하였을 때 β-갈락토시다제의 발현 강도를 비교한 현미경 사진이다.

도 16A는 인캡슐(encapsulated) 세포 인디케이터 시스템의 예시로서, 인디케이터 세포 2는 alginate bead와 같은 인캡슐 물질 4에 인캡슐되어 있고, 인디케이터 세포 2와 인캡슐 물질 4는 투과막 또는 그물 6에 포함되어 배양관 10에서 세포 8과 공동 배양한다.

도 16B는 배양시 심근아세포 분화를 모니터링하기 위해 인캡슐 (encapsulated) 인디케이터 세포를 사용하는 것을 보여주는데, 세포 인캡슐화에 적당한 11m 와 30m 나일론 메쉬의 현미경 사진과 다양한 세포 수를 포함하는 hCSx-lacZ 쥐 골수 줄기 세포 인디케이터 캡슐의 β-galactosidase 반응의 결과를 보여주는 현미경 사진이다.

도 17 내지 도 19는 심근 경색 모델 개에 유도된 골수 줄기 세포를 이식하기 전(왼쪽)과 이식한 후(오른쪽)의 심장초음파 사진이다.

도 20a는 전형적인 3 배럴의 1 주사바늘 모형도이다. 이 예에서 정확한 부위에 주사하기 위해 각 배럴은 하나의 주사 바늘에 연결된 저장고 아답타로 동시에 그리고 균등하게 주사된다. 3개 주사기 배럴은 끝에서 연결되어 있고 하나의 플런저 디프레서에 의하여 조절된다.

도 20b는 도 20a에서 보여준 3 배럴 1 주사바늘의 단면도이다.

도 21a는 한 가지 세포형태를 이식하기 위한 하나의 큰 배럴을 가지고 있는 전형적인 3 배럴 2 주사바늘의 그림이다. 두 개의 작은 배럴은 바늘 하나에 연결된 리저버 아답타와 연결되어 있다. 큰 배럴은 주사를 위한 별도의 바늘을 가지고 있다. 큰 배럴에 연결되어 있는 주사기의 구멍은 작은 배럴의 배럴/바늘 구멍 비율을 유지하기 위하여 증가시킬 것이 요망된다. 그러므로 세 개의 배럴의 주입 압력이 동일하게 유지된다. 또한 3 배럴의 삼각 모양 정렬은 두 개의 바늘이 주입 각도가 평행하게 근접할 수 있게 한다. 3개 주사기 배럴은 끝에서 연결되어 있고 하나의 플런저 디프레서에 의해 조절되어 고른 압력을 유지해준다.

도 21b는 도 21a의 3 배럴 1 주사바늘의 단면도식이다.

도 22a는 전형적인 3 배럴 3 주사바늘의 그림이다. 각각의 주사기 배럴은 주입을 위한 1개의 바늘을 가지고 있다. 필요에 따라, 3 배럴의 삼각 모양 정렬은 세 개의 바늘이 주입 각도가 평행하게 근접할 수 있게 한다. 3개의 주사기 배럴은 끝에서 연결되어 있고 하나의 플런저 디프레서에 의해 조절되어 고른 압력을 유지해준다.

도 22b는 도 22a의 3 배럴 1 주사바늘의 단면도이다.

Claims

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(a) 심근 세포 또는 심근 세포 전구체;

(b) 내피 세포 또는 내피 세포 전구체; 및

(c) 혈관 평활근 세포 또는 혈관 평활근 세포 전구체를 포함하는, 심근경색 치료용으로 심근 조직에 이식하기 위한 약제학적 조성물.