JP2004532202A - 生存哺乳動物における臨床的に認められた形態の心臓の病状を治療的に処置する方法 - Google Patents

生存哺乳動物における臨床的に認められた形態の心臓の病状を治療的に処置する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物被験体を処置するために、完全に分化した細胞の有無で、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの哺乳動物幹細胞、および／もしくはそれらの前駆子孫細胞、および／もしくはそれらの系列決定済み子孫細胞、および／もしくはそれらの部分的に分化した子孫細胞を用いる治療法を提供する。同定可能な細胞タイプには、胚幹細胞およびそれらの子孫細胞：ならびに成体幹細胞の現在特定されたタイプおよびそれらの様々な子孫細胞が包含され；そしてまた機能性幹細胞特性を有する最近同定された代わりの細胞タイプも包含される。本発明の治療法を用いて効果的に処置することができる心臓の病状の臨床形態の中には、心筋梗塞、心筋炎、心不全および不整脈がある。

Description

【仮特許出願】
【０００１】
本発明は、米国仮特許出願第６０／２７６，１４８号；第６０／２７６，１４７号；第６０／２７６，２４７号；第６０／２７６，２４６号；第６０／２７６，２４５号；第６０／２７６，２４４号；第６０／２７６，２４３号；および第６０／２７６，１７５号としてそれぞれ２００１年３月１５日に米国特許商標庁に最初に出願された。
【クロスリファレンス】
【０００２】
本願は、現在係属中の２０００年９月５日に出願された米国特許出願第０９／６５５，１２４号；および現在係属中の２０００年１０月７日に出願された第０９／６８４，６７９号の一部継続である。
【背景技術】
【０００３】
心機能不全は、突然死および心不全を引き起こし得る生命にかかわる事象である。診断および処置におけるかなりの進歩にもかかわらず、心機能不全および心臓の病状は、罹患率、有病率および総合死亡率が増加している世界的な問題のままである。従って、心機能不全を改善する新しい有効な治療方法を見出すことは、依然として大きな挑戦である。
【０００４】
ここ数年、細胞移植は、損傷を受けた心筋を修復する潜在的に新しい方法として浮上している。移植した心筋細胞は、マウスモデルにおいて生存し、増殖し、そして宿主心筋と結合することが示されている。Ｌｉおよびその共同研究者等により、移植した胎児心筋細胞は、凍結損傷（ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ）によって誘発される心筋瘢痕内に新しい心組織を形成しそして心臓機能を改善できるが［非特許文献１および２］；移植した異質遺伝子型細胞は、免疫拒絶のためにレシピエントの心臓において短期間のみ生存する［非特許文献３］ことが示された。Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ．は、ラットの胚心筋を移植しそしてインオキュロ（ｉｎ ｏｃｕｌｏ）で培養できることを報告し［非特許文献４］、移植した胚心筋細胞が増殖しそして分化することを示した。最近の総説において、Ｈｅｓｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．は、胚体内で培養する全能性胚幹（ＥＳ）細胞が、心組織の高度に特殊化した表現型を再生することを示した［非特許文献５］。心筋特異的イオン電流の生物学的および薬理学的性質の大部分は、多能性ＥＳ細胞からインビトロで発生させる心筋細胞において発現され、それらは成体心筋細胞もしくは新生児哺乳動物心臓細胞において以前に記述されているものと同様であった。しかしながら、心疾患におけるＥＳ細胞移植の意義は、まだ調べられていない。
【０００５】
いくつかの他の研究は、心房腫瘍（ａｒｔｉａｌ ｔｕｍｏｒ）（ＡＴ１）から得られる胎児心筋細胞［非特許文献６］、衛星細胞［非特許文献７］もしくは骨髄細胞［非特許文献８］を包含する、外因的に供給される細胞を宿主心筋に移植することの実現可能性を示している。これらの移植した細胞は、移植後４ヶ月まで正常な心筋において組織学的に同定されている。ギャップ結合もまた、移植した胎児心筋細胞と宿主心筋間で見出されており［非特許文献６］、それにより、移植した細胞と宿主組織間の電気収縮連関の可能性を提起している。最近、心筋細胞移植は、ラットにおいて冠状動脈閉塞で［非特特許文献９］；もしくはラットにおいて［非特許文献１および２］；そしてイヌにおいて［非特許文献７］凍結損傷で虚血的に損傷を受けた心筋に拡大適用されている。
【０００６】
それでもやはり、全てのこれらの研究努力および報告された研究にもかかわらず、現在まで、臨床の心臓の病状の発生後に生存宿主における心臓機能を直接そして著しく改善するかもしれない；もしくは心筋の少なくとも部分的修復をもたらす細胞移植治療技術として役立つかもしれない；もしくは冒された宿主被験体における損傷を受けた心臓組織の可能性がある長期の改善を与えるかもしれない方法および細胞材料の進歩はほとんどない。そのような有効な方法論が生み出されそして実験的に実証されるならば、そのような進展は、心臓学の分野で働く内科医および外科医によって大きな前進および予見できない事象とみなされるであろう。
【非特許文献１】
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７８：２８３−２８８（１９９６）
【非特許文献２】
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：６５４−６６１（１９９６）
【非特許文献３】
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９６（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ）：ＩＩ１７９−ＩＩ１８７（１９９７）
【非特許文献４】
Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．６６：８４−１０２（１９９０）
【非特許文献５】
Ｈｅｓｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓ．Ｒｅｓ．３６：１４９−１６２（１９９７）
【非特許文献６】
Ｓｏｏｎｐａａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９８−１０１（１９９４）
【非特許文献７】
Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６０：１２−１８（１９９５）
【非特許文献８】
Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００（Ｓｕｐｐ．ＩＩ）：ＩＩ２４７−ＩＩ２５６（１９９９）
【非特許文献９】
Ｓｃｏｒｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（Ｓｕｐｐｌ ＩＩ）：ＩＩ３３７−ＩＩ３４０（１９９６）
【発明の要約】
【０００７】
本発明は多数の態様およびインビボ用途を有する。第一の態様は、臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物被験体における心機能不全の重症度を下げる治療法であって：
冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、２つ以上の異なるタイプの細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物であり、該２つの異なるタイプは、少なくとも一つの同定可能なタイプの幹細胞、少なくとも一つの同定可能なタイプの前駆細胞、少なくとも一つの同定可能なタイプの系列決定済み細胞、少なくとも一つの同定可能なタイプの部分的に分化した細胞、および少なくとも一つの同定可能なタイプの完全に分化した細胞よりなる群から選択される。）；ならびに
該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
の工程を含んでなる方法を提供する。
【０００８】
本発明の第二の態様は、臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物被験体における心機能不全の重症度を下げる治療法であって：
冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、２つ以上の異なるタイプの細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物であり、該２つの異なるタイプは、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの幹細胞、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの前駆細胞、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの系列決定済み細胞、および一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの部分的に分化した細胞よりなる群から選択される。）；ならびに
該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
の工程を含んでなる方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法の第三の態様は、臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物における心機能不全の重症度を下げる治療法であって：
冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、３つ以上の異なるタイプの細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物であり、該３つの異なるタイプは、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの幹細胞、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの前駆細胞、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの系列決定済み細胞、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの部分的に分化した細胞、および一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの完全に分化した細胞よりなる群から選択される。）；ならびに
該導入した生存可能な哺乳動物細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
の工程を含んでなる方法を提供する。
【発明の詳細な記述】
【００１０】
本発明は、臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物被験体を処置するために、一つもしくはそれ以上の哺乳動物カテゴリータイプの多能性幹細胞およびそれらの多能性前駆子孫細胞を、それらの系列決定済みであるが未分化の派生子孫細胞を含めてもしくは含めずに用いる治療法である。細胞カテゴリータイプには、胚幹細胞およびそれらの子孫細胞；ならびに成体幹細胞およびそれらの様々な子孫細胞が包含される。治療的に処置することができる心臓の病状の臨床的に現れる形態の中には、心筋梗塞、心筋炎、心不全および不整脈がある。臨床的に認められた心臓の病状形態、個々の細胞タイプ；ならびに治療方法論の詳細な提示および開示を以下に示す。次にこの記述的に書かれる開示は、処置方法の範囲を代表し且つ示す一連のそして様々な実験および実験データによって補強されそして裏付けられる。
Ｉ．臨床的に認められたタイプの心臓の病状
臨床的にそして診断的に区別することができる多数のタイプの心機能不全、病状および心疾患がある。心機能不全および心疾患の兆候は、様々な徴候および症状として現れ、それらの各々は異なる形態の心臓の病状を表す。ヒトにおける最も一般的な症状は、呼吸困難、胸痛、動悸、失神寸前の状態もしくは失神、および疲労である。いずれも特異的ではなく；そして解釈は、全臨床像；および多くの場合において診断テストを評価することに依存する。
【００１１】
これらの理由で、本発明を含んでなる治療法は、特に、４つ以上の異なる形態の哺乳動物心臓障害に関し、これらの各々は認められたタイプの心臓の病状である。各医学上の問題を以下に詳細に記述する。
Ａ．急性心筋梗塞の医学上の問題
定義
心筋死をもたらす冠状動脈の突然の閉塞。
病因
直接の機構は、血栓症および冠状動脈の閉塞および心筋死を引き起こすじゅく状斑の破裂である。安定な斑を不安定な斑に転化する因子には、剪断応力、炎症および自己免疫を包含することができる。
予後
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）は、死亡、心室機能不全、鬱血性心不全、心原性ショック、致命的なおよび致命的でない不整脈、弁機能不全、もしくは心筋断裂を包含する多数の機械的および電気的合併症を引き起こす可能性がある。急性および亜急性心筋機能不全は：
１）壊死（不可逆的損傷；成体哺乳動物における心筋細胞は、細胞周期に入りそして分裂する有意な能力を示さない）；
２）心筋「気絶（ｓｔｕｎｎｉｎｇ）」（適切な心臓機能が残る場合に防御することができる未知の機構の一時的な状態、ここで、減少した収縮能は梗塞周囲組織に存在する）、
による機能性心筋細胞の喪失によって起こり得る。
【００１２】
典型的に、機能は梗塞後数日、数週もしくは数ヶ月のうちに正常に戻る。慢性的に、心臓機能はまた、代償性肥大を包含する、効果のないもしくは病的な代償性反応（すなわち、過度の線維症もしくは不適切な肥大もしくは病的な肥大）と重なると心臓への増大したストレス（大部分は血流力学的）のために起こる心臓の不都合なリモデリングによって低下される可能性もある。不都合なリモデリングは、ポンプ機能にとって次善である心臓構造をもたらす（通常の幅が広い楕円構造は、菲薄化しそしておそらく動脈瘤性の（ａｎｅｒｙｓｍａｌ）心室［筋肉］壁を有して、いっそう球状になる）。
治療法の目的
主要な治療目的は、心筋の壊死を防ぎそして／もしくは診断ストレス試験での成績によって評価する場合に生理的心臓機能を正常に回復させることである。さらなる目的は：痛みを消すこと；心筋への血液供給を回復させること；合併症（上記参照）の発生率を減らすこと；再虚血および再梗塞を防ぐこと；不都合なリモデリングおよび心機能不全を防ぐかもしくは改善すること；および死亡率を下げることである。
有効な結果
主要な心臓血管事象（死亡、再発性ＡＭＩ、難治性虚血および発作を包含する）の割合は、著しく減少される。心臓機能の最大の保全（心臓の働きを増やさずにもしくは気絶の防御効果を破棄せずに）および不都合なリモデリングの防止もまた起こる。
利点および利益
主要な出血および頭蓋内出血（典型的には血管再生術から）の割合は、非常に下げられる。利用する最低限の薬理学的に有効な薬剤および装置がある。
Ｂ．心筋炎の医学上の問題
定義
心筋炎は、心臓の炎症性疾患である。それは急性、亜急性もしくは慢性であることができ；そして心筋の限局性もしくはびまん性関与のいずれかがあり得る。全身および心臓症状の両方を認めることができる。例えば、ウイルス性心筋炎の初期段階において、患者は熱、筋肉痛および筋肉圧痛が認められる可能性がある。筋肉症状は、筋栄養ウイルス（ｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｖｉｒｕｓ）によって誘発される筋炎に起因する。症状のある患者において、心臓位（ｃａｒｄｉａｃ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）は急性心筋症の一つであることができる。
病因：
心筋炎は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物およびぜん虫のような感染性生物によって；もしくはコカインのような毒素によって引き起こされる可能性がある。心筋炎はまた、肉芽腫性疾患、膠原血管病および自己免疫疾患を包含する全身疾患とも関連する可能性がある。
【００１３】
ウイルス感染は、心筋炎の最も一般的な原因である。最も頻繁に関与するウイルスは、コクサッキーウイルスＢ、エコーウイルス、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バーウイルス、および小児期の発疹性疾患のウイルスである。しかしながら、全ての病原性ウイルスは、心臓において複製しそして心筋炎を誘発し得る。
病状
心筋炎は、任意のもしくは全ての心腔に関して、限局性もしくはびまん性であることができる。重いびまん性心筋炎は、全ての心腔の拡大をもたらすことができ；そして任意の心腔における壁性血栓形成があり得る。
【００１４】
組織検査により細胞浸潤物が示され、それらは通常は単核細胞であるが、好中球もしくは時折好酸球であり得る。浸潤物は様々な程度であり；そして心筋細胞壊死および心筋細胞骨格の破壊と関連することが多い。亜急性および慢性心筋炎では、間質の線維化が繊維喪失に取って代わることができ、そして筋線維肥大を認めることができる。
ダラス基準
心内膜心筋生検の解釈における変動性は、現在「ダラス基準」と呼ばれる作業基準を一団の心臓病理学者に開発させた。これらの基準は、現在、疾患を急性もしくは境界域心筋炎と特定するために大部分の研究者により用いられる。
【００１５】
活動性心筋炎は、「冠状動脈性心疾患と関連する虚血性損傷に特有でない隣接する心筋細胞の壊死および／もしくは変性を有する心筋の炎症性浸潤」と定義される。
【００１６】
境界域心筋炎は、炎症性浸潤がまばらすぎるかもしくは心筋細胞損傷が示されない場合に用いられる用語である。境界域心筋炎が認められる場合には反復生検が推奨され；ある報告された研究では、活動性心筋炎が６人の患者のうち４人において反復生検で示された。
【００１７】
また、検死解剖を基準として用いる、心内膜心筋生検の診断効能を評価する研究は、この技術が心筋炎の診断に６３％の特異性および７９％の感度のみを有すると概算している。これは、一つには、最初の生検後わずか４日程度以内に大部分は消散する可能性がある心筋炎の診断に用いる組織学的異常の限局的で且つ一時的な性質のためであり得る。
病原
大部分の症例における心筋炎プロセスは、感染体（通常はウイルス）によって開始されると考えられる。直接ウイルスにより誘発される心筋細胞損傷およびウイルス感染後の免疫炎症反応の両方が、心筋細胞損傷および壊死をもたらす。ウイルスは感染後せいぜい２もしくは３週間心臓において複製するだけであるが、炎症性病変および壊死のプロセスは数ヶ月間続く可能性がある。
【００１８】
様々な研究結果により、免疫もしくは自己免疫プロセスの病因的役割が示される。これらには、優位にＴリンパ球の浸潤；活性化マクロファージ、Ｂ細胞、サイトカインおよび接着分子の存在；ならびに心筋における主要組織適合複合体抗原の発現が包含される。
【００１９】
ウイルス感染により開始される心筋炎の免疫病原論は、最初に実験モデルにおいて示されそして特性化され、次にヒトにおいて確かめられた。循環する自己抗体は、心筋炎にかかっている患者において示されており、そして長期にわたって存続することができる。抗体は、ミトコンドリアおよび収縮性タンパク質ならびにベータ−アドレナリン受容体に向けられる。一例として、ある研究により、拡張型心筋症にかかっている患者の２５％および虚血性心筋症にかかっている患者の１０％は、抗−ベータ−１−アドレナリン受容体抗体を有することが見出された。これらの抗体は、心臓弁膜症もしくは高血圧性心疾患に続発する心筋症にかかっている患者では見出されなかった。
【００２０】
心筋炎の実験モデルからの証拠はまた、一因となる病原性因子としてサイトカイン（インターロイキン−１および腫瘍壊死因子のような）、酸素不含ラジカル、および微小血管変化も原因とみなしている。これらの研究はまた、心筋炎に対する感受性およびその重症度を高めることができる因子も同定している。これらの因子には、無理な運動；妊娠；栄養不足；ならびにエタノール、ステロイド、および非ステロイド性抗炎症薬の摂取が包含される。
治療処置の目的
主要な治療目的は、心筋壊死を防ぎそして／もしくは診断ストレス試験での成績によって評価する場合に生理的心臓機能を正常に回復させることである。方法論のさらなる目的は、心不全、不整脈、および心筋炎と関連する他の病的状態を防ぐかもしくは改善することである。
Ｃ．心不全の医学上の問題
定義
心不全は、心臓機能の異常が、代謝要求に十分な速度で血液を拍出する心臓の機能不全を引き起こすか、もしくは上昇した充満圧でのみ心拍出量を維持する場合におこる。それは臨床的に息切れ、努力不耐性（ｅｆｆｏｒｔ ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、体液鬱滞、および悪い生存率を特徴とする。
病因
冠状動脈疾患が最も一般的な原因である。他の一般的な原因には、高血圧症、心筋炎および弁疾患が包含され；多くの症例は特発性である。
タイプ
心不全は、収縮もしくは拡張機能障害によって引き起こされることができ、そして神経ホルモン変化と関連する。左心室収縮機能障害は、４０％未満の左心室駆出分画率と定義される。それは症候性もしくは無症候性であることができる。
【００２１】
拡張心不全を特定しそして診断することは困難であり得る。基準には：
１）心不全；
２）正常なもしくはやや異常な左心室収縮機能；
３）異常な左心室弛緩、充満、拡張期伸展性、もしくは拡張期スティフネス（ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）、
の証拠が包含される。
【００２２】
三つ全ての基準を満たす人は、明確な拡張心不全にかかっており；第一および第二の基準のみを満たす人は、可能性がある拡張心不全を示す。
【００２３】
拡張および収縮機能障害は、通常、様々な程度で大部分の患者において一緒に存在する。幹細胞および前駆細胞の移植は、収縮機能障害を修正することにおいて最も有用であり得るが、インサイチューでのそのような細胞の導入はまた、（伸展性を改善することにより）拡張機能障害にとっても利益になり得ることが予見される。
治療法の目的
最低限の副作用で、症状を和らげること；生活の質を向上すること；罹患率および死亡率を下げること。
有効な結果
機能的能力は：ＮＹ心臓協会機能分類によって評価することができ；または標準化された運動機能試験プログラム；もしくは６分歩行試験［Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２７０：１７０２−１７０７（１９９３）］を用いることによりさらに客観的に評価することができ；またはアンケートで評価するような生活の質［Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２３：３９３−４００（１９９４）］］；もしくは死亡率によって決定することができる。
Ｄ．不整脈の医学上の問題
定義
不整脈（Ｃａｒｄｉａｃ ｄｙｓｒｈｙｔｈｍｉａｓ）（通俗的に不整脈（ａｒｈｙｔｈｍｉａｓ）と不正確に呼ばれる）は、心臓活性化の速度、規則性もしくは順序における任意の異常である。
病因
心調律の障害は、インパルス形成、インパルス伝導、もしくは両方の改変に起因する。心臓における電気インパルス形成は、特殊化した心臓細胞の固有の自動能から生じる。自動能は、自然活動電位を発生させるように、細胞がそれ自体を律動的に閾値電位に脱分極する能力をさす。心房および心室の心筋細胞は通常の状態でこの性質をもたないが、特殊化した伝導系の細胞は生来の自動能を保有し、そしてそれ故ペースメーカー細胞と呼ばれる。
【００２４】
特殊化した伝導系には、ＳＡ節、ＡＶ節、および心室伝導系が包含される。後者は、ヒス束、脚、およびプルキンエ線維から成る。病的状態において、伝導系以外の心筋細胞もまた自動能の性質を獲得し得る。
【００２５】
不整脈の主な原因は：
１）改変されたインパルス形成；
２）改変されたインパルス伝導
である。
【００２６】
インパルス形成および／もしくは伝導の異常は、心臓に体の代謝要求を満たさせるには速すぎる、遅すぎるもしくは不規則すぎる心調律をもたらす可能性がある。臨床的に、これらの異常は、めまいがするエピソード、動悸、失神寸前の状態もしくは失神として現れることができる。律動不整が起こると、心臓および他の重要臓器の灌流は損なわれ、虚血および梗塞もしくは他の形態の損傷をもたらす可能性がある。
【００２７】
不整脈は、ＥＫＧもしくは２４時間ホルターモニター（心周期の連続的記録）または症状が現れる場合には携帯式モニター（「Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｈｅａｒｔｓ」）で患者によって行われる断続的記録で診断される。正常な心拍数範囲は６０−１００拍動／分である。心拍数（正常もしくは不整）が１００ｂｐｍより大きい場合には、患者は「頻脈」もしくは「頻脈型不整脈」：６０ｂｐｍ未満である場合には、「徐脈」もしくは「徐脈型不整脈」を有するとされる。
従来知られている処置
従来の処置は、薬理学的もしくは機械的であることができる。しばしば、遅い律動が不整脈の主成分としてもしくは速い律動の治療の合併症として起こる。患者が遅い心拍数から症状を示すようになる場合、心拍数を正常な範囲に保つために電気ペースメーカーを埋め込むことが多い。これらは、機械的問題の頻繁な点検、充電および心臓の有効な刺激を必要とする高価な装置である。使用は心臓における針金の配置を必要とし、それは感染する可能性がある。現世代の装置は小型であるが、移植下の移植の部位で美容障害（ｃｏｓｍｅｔｉｃ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅｓ）を引き起こし、そして炎症反応を引き出す可能性がある。
治療処置方法の目的
主要な治療目的は、規則的な心拍数および律動を回復させ、それにより、心電図の短時間および長期間のモニタリングならびに／もしくは進んだ電気物理学的研究により評価する場合に心臓の正常な生理的機能を維持するかもしくは回復させることである。ペースメーカー細胞に分化するようにインサイチューで刺激することができる多能性幹細胞およびそれらの生存子孫の移植は、副作用のいっそう低い発生率を有しそしていっそう少ないフォローアップを必要とする電気ペースメーカーの代わりとなるものを提供する。さらに、そのような幹細胞およびそれらの生存子孫の移植はまた、心臓への正常なインパルス伝導（速度および律動）を回復させることもできる。適切な細胞は、好ましくは、一般的な針注射器もしくはカテーテルを用いて心室もしくは上室部位に直接注入される。
ＩＩ．治療処置方法
臨床的に認識可能な形態の心臓の病状を患っている哺乳動物被験体における心臓活性および機能のある程度の常態を回復させる方法論は、調製細胞接種材料として、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの生存可能な幹細胞、および／もしくは前駆細胞、および／もしくは系列決定済み、および／もしくは部分的に分化した細胞を集合的に、完全に分化した細胞の有無で、混合した組み合わせで利用する。これらの生存可能な細胞は全て、前もって調製されそしてインビトロで維持されており；そして治療法は、細胞の混ぜ合わせた混合物としてこれらの生存可能な幹細胞、前駆細胞および系列決定済みもしくは部分的に分化した細胞のあらかじめ選択した混合物を導入し、それらは次に任意の適当な経路によって投与され、そして移植細胞として宿主レシピエントの心臓もしくは脈管系本体内の前もって選択した特定の解剖学的部位に導入される。
【００２８】
細胞の混ぜ合わせた混合物として生存レシピエントの体の選択した解剖学的部位に導入した後、これらの混合した幹細胞、前駆細胞および系列決定済みもしくは部分的に分化した細胞は、インビボで生存可能であり続けるだけでなく；また（ｉ）病的症状の重症度を下げるようにインサイチューで治療的に作用し；（ｉｉ）以前に損傷を受けたもしくは壊死の細胞の機能性細胞代替品としてインサイチューで健康な生存可能な細胞を提供するのに役立ち；そして（ｉｉｉ）客観的および医学上認められた臨床試験方法によって測定する場合に宿主レシピエントの正常な心臓および脈管機能を増すように治療的に作用する。
幹細胞の異なるカテゴリー
少なくとも５つの異なるカテゴリーもしくは系列（Ｏｒｄｅｒｓ）の同定可能な幹細胞、前駆細胞、系列決定済み細胞および部分的に分化した細胞は、現在、慣例パラダイム（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｐａｒａｄｉｇｍ）の一部であり、そして個々の使用に適していると考えられる。最も好ましい単一細胞カテゴリー（もしくは細胞の系列）は胚幹細胞である。胚幹細胞カテゴリーはその直接のおよび後の世代の子孫（胚幹細胞の直接の子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）および子孫（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔｓ））の両方と一緒に一つの系列を構成する。これらは、一般に、全てのタイプおよび種類の心臓関連疾患および病状の移植細胞としての使用に最も適していると考えられ；そして疾患状態の病状を軽減するためおよび宿主レシピエントの臨床状態および総合的な病状を改善するために生理的に機能性である様々な分化した子孫細胞をインサイチューで提供すると考えられる。
【００２９】
それに対して、４つの個々のおよび異なるカテゴリー（もしくは系列）の成体幹細胞および子孫細胞が、現在、既知である。成体幹細胞のこれらのカテゴリーの各々は、全ての他のものと別個でありそして区別することができ；独特の表面マーカーおよび自己同定細胞特性を提示し；そして直接の子孫細胞および後世代の子孫細胞をもたらすことができると通常認められ、それらは続いて系列決定済み細胞そして次に独特の形態および同定可能な機能特性を有する分化した細胞になる。成体幹細胞のこれら４つのカテゴリーには：間葉幹細胞およびそれらの子孫；造血幹細胞およびそれらの子孫；神経幹細胞およびそれらの子孫；ならびに神経冠幹細胞およびそれらの子孫が包含される。成体幹細胞のこれら４つのカテゴリーの各々は、胚幹細胞、胚前駆細胞、およびそれらの系列決定済みもしくは部分的に分化した子孫細胞を含んでなる最も好ましいカテゴリーの完全な代用品および有効な代替品として治療方法論内で用いることができる。
【００３０】
さらに、幹細胞およびそれらの子孫のこれらのカテゴリーの各々は、細胞の安定な単離された培養物としてインビトロで維持することができ；そして移植および治療用途目的に十分な数の生存可能な細胞を提供するためにインビトロで無限に増殖させることができる。
代わりの方法としての幹細胞カテゴリーの混合
本発明の治療法は幅広い治療技術、単一カテゴリーより多い細胞および１世代期より多い細胞タイプを混合しそして臨床治療目的に細胞の調製接種材料として使用できることを想定しそして認める処置方法である。治療処理方法を実施するこの代わりの方法において、好ましい胚幹細胞および胚前駆細胞は、成体幹細胞の４つのカテゴリー（もしくは系列）の中から選択される一つもしくはそれ以上の他の種類の細胞と故意に組み合わせそして混合することができる。幹細胞系列のそのような混合は、望ましくは、個々のカテゴリータイプの交差汚染を防ぐためにならびに細胞の調製混合物として組み合わせた後に相互に対する異なる細胞系列および世代期によってしばしば引き起こされる初期の交差影響作用を防ぐために意図する宿主レシピエントへの混合細胞［細胞タイプ、直接の起源、および発生の世代細胞期に関して異なる］の実際の投与の直前にのみ行われる。
【００３１】
多数の幹細胞カテゴリー混合物が使用でき；そして任意の混合に用いるカテゴリータイプの数は、一つの混合物においてわずか２つのタイプから５つ全てのタイプを用いることまで多様であることができる。例えば、好ましい胚幹細胞および胚前駆細胞は、レシピエントの意図する細胞接種材料として各種の異なる細胞混合物を生成せしめるために幹細胞の他の４つのカテゴリーのいずれかから選択される任意の一つの他の部分的に分化した細胞と代わりにそして個々に組み合わせることができる。従って、２つの個々の細胞タイプを含んでなる４つ以上の異なる混合種類を調製することができる：（ｉ）間葉派生のもしくは部分的に分化した細胞と胚幹および前駆細胞；（ｉｉ）造血派生のもしくは部分的に分化した細胞と胚幹および前駆細胞；（ｉｉｉ）神経冠派生のもしくは部分的に分化した細胞と胚幹および前駆細胞；ならびに（ｉｖ）神経派生のもしくは部分的に分化した細胞と胚幹および前駆細胞。各２つのカテゴリーの細胞混合物は、混合物として所望に応じた任意の体積量もしくは細胞比で個々に調製し；そして次に２つの異なる系列の細胞の故意に調製した混合物としてレシピエント宿主に投与することができ；それは、治療処置目的に組み合わせて、系列決定済みもしくは部分的に分化した細胞の有無で、幹細胞、前駆細胞を単一の調製接種材料において集合的にそして累積的に与える。
【００３２】
同様に、３つの幹細胞カテゴリー混合物、４つの幹細胞カテゴリー混合物、および５つの幹細胞カテゴリー混合さえ任意に；幹細胞タイプの任意の所望の比率で調製することができ；そして特定の患者の治療処置に好ましい投与形態で利用することができる。これらのより複雑な混合では、１つのカテゴリーより多い幹細胞が示され；そして１つの種類より多い派生のもしくは部分的に分化した細胞が、細胞の調製混合物内に存在すると思われる。
【００３３】
単一の混合調製物において複数の幹細胞混合物、および／もしくは複数の前駆細胞混合物、および／もしくは複数の系統決定済みもしくは部分的に分化した細胞を含んでなるそのような混合物の認められる有用性および利点は、インサイチューで作り出される子孫細胞のいっそう大きい範囲および多様性；継時的にインビボにおけるいっそう大きい治療効果；ならびにインサイチューで生み出される代替細胞としてインビボで分化する細胞種類のいっそう大きい多様性によって果たされる細胞機能のはるかに大きい多様性である。
天然の細胞の遺伝子的に改変された変異体
従来既知でありそして現在利用可能な組換えＤＮＡ技術は、５つの異なる幹細胞カテゴリーの各々の遺伝子的に変えられたおよび改変された幹細胞、および／もしくは前駆細胞、および系列決定済みもしくは部分的に分化した細胞を作製するために任意に用いることができる。従って、任意のカテゴリータイプの幹細胞および／もしくは前駆細胞および系列決定済みもしくは部分的に分化した細胞を、一つもしくはそれ以上のタンパク質もしくはポリペプチドをコードするＤＮＡインサートを含んでなるベクターでトランスフェクションすることができる。インサートをコードするＤＮＡ配列は、異種起源のタンパク質もしくはポリペプチドに相当することができ；またはその改変された細胞によって望ましくは過剰発現されるべき同種のタンパク質もしくはポリペプチドを構成することができる。
【００３４】
典型的に、ベクターは、トランスフェクションした細胞におけるタンパク質もしくはポリペプチドの細胞内発現に必要とされる追加の操作可能に連結されたＤＮＡ配列を含んでなる。「操作可能に連結された」は、実質的なＤＮＡ配列が、核酸配列の細胞内発現を可能にするように一つもしくはそれ以上の調節ＤＮＡ配列に連結されることを意味する。調節ＤＮＡ配列は、当該技術分野で認められており、そして通常、所望の発現結果をもたらすように任意に選択することができる。従って、「調節配列」という用語には、典型的に、プロモーター、エンハンサー、およびこの技術において既知である他の発現制御要素が包含される。例えば、ベクターの天然の調節配列または幹／前駆／系列決定済みもしくは部分的に分化した細胞の調節配列のいずれかを用いることができる。
【００３５】
遺伝子的に改変されたもしくは変えられた幹／前駆／系列決定済みもしくは部分的に分化した細胞は、天然の幹細胞および前駆細胞および部分的に分化した細胞を用いるのと同じように本発明の方法論を用いて治療的に用いることができる。そのような細胞の全ての遺伝子改変および変化は、インビトロでそして治療処置目的にそれらの遺伝子的に改変された細胞を用いる前に行われそして完了されるべきである。
【００３６】
従って、本発明のまさに必要条件から、使用者は、報告されておりそして使用および用途において現在広く知られているヌクレオチドおよびＤＮＡフラグメントを操作しそして改変する多数の技術に少なくとも精通していることは、かくして、必須ではないにしても重要である。遺伝子、ＤＮＡヌクレオチド操作および操作したＤＮＡフラグメントからのタンパク質の発現に関する文献で現在利用可能な多数の権威ある原本および公開論文を単に例示すると以下のとおりである：Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｍａｃａｒｉｏ ａｎｄ Ｄｅ Ｍａｒｃａｒｉｏ，ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，１９９０；Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ｓｃｏｐｅ ａｎｄ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｓ．Ｆｉｃｈａｍ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ＩＩ（Ｒａｙ Ｗｕ，ｅｄｉｔｏｒ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２；ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ），（Ｎｅｗｔｏｎ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９４；およびこれらの公開の各々内に個々の引用される多数の参考文献。全てのこれらの公開原本は、本明細書に引用することにより明白に組み込まれる。
【００３７】
さらに、遺伝子的に改変されたＤＮＡ配列を調製するための多くの基礎をなすＤＮＡ技術ならびに多くの従来の組換え手法および技術を記述する多数の交付済み米国特許および公開特許出願が出されている。この主題の関連特許文献のいくつかを単に例示すると：米国特許第５，４８６，５９９号；第５，４２２，２４３号；第５，６５４，２７３号；第４，３５６，２７０号；第４，３３１，９０１号；第４，２７３，８７５号；第４，３０４，８６３号；第４，４１９，４５０号；第４，３６２，８６７号；第４，４０３，０３６号；第４，３６３，８７７号；ならびに公開第Ｗ０９５３４３１６−Ａ１；第Ｗ０９４１２１６２−Ａ１号；第Ｗ０９３０５１６７−Ａ１号；第Ｗ０９０１２０３３−Ａ１号；第Ｗ０９５００６３３号；第Ｗ０９４１２１６２号；および第Ｒ０９０１２０３３号である。全てのこれらの特許文献公開もまた、本明細書に引用することにより明白に組み込まれる。
ＩＩＩ．幹細胞パラダイムの専門用語および組織
本発明を含んでなる治療処置方法は、この技術分野において働く医師の従来の見解および普通の予想に対して多少一致しない方法および対照的な立場として提示される。本発明は、しばしば、従来の見解および立場と矛盾しそして反対であり；そして以前に認められていないかもしくは認識されていない細胞の性質および細胞特性の相違および差異の多数の際立った例を提供する。これらの理由で、とりわけ、同定可能なタイプの幹細胞およびそれらの子孫が最初に系統決定済み、次に部分的に分化した、そして次に完全に分化した子孫細胞をもたらす様式および方法の基礎になりそして支える細胞発生の幹細胞ファミリーパラダイムおよび組織された系を最初に読者に提供することは有益で且つ有用であると考えられる。
Ａ．細胞発生の幹細胞／前駆細胞モデルおよび系列系
本発明の実質的な価値および実際の意義は、これらの独特な幹細胞および前駆細胞が明白に示しそして具体化する細胞発生のモデルおよび系との関連でのみ正しく認識しそして真に理解することができる。多くの混乱、紛らわしい見解、あいまいさおよび矛盾が科学および特許文献において報告されており；そしてこの難しさは、あいにく、細胞発生の様々な時期を解明しそして特定しようとする異なる研究的試みに関してそして始原幹細胞に端を発しそしてそれに由来する様々な細胞結果に関して現在まで報告される総合的な結果が反映される。これらの理由で、本発明は、幹細胞の子孫の特定の発生時期の組織された系を提示しそして利用し；そして異なる細胞系列経路ならびに多数の部分的に分化したおよび完全に分化した細胞形態を示す。モデル系は、多数の別個のそして個々の細胞系列経路が存在し、各々が単一の幹細胞祖先を共通に有することを示す。各系列はそれ独自の系図を与え；そして各経路は少なくとも一つの分化した細胞結果（および典型的には分化のいくつかの異なる表現型）を与える。
同定可能な幹細胞
幹細胞ならびにそれらの直接のおよび直属の子孫、プレ前駆細胞（ｐｒｅ−ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）は原型細胞である。これらは２つの異なる細胞タイプであり、これらの両方ともそれらの多能性の性質において独特であり；中立で未分化の細胞であり；そしてインビボで明らかに移植することができ；そして次に機能、形態、および表現型細胞特性が異なる各種の完全に分化した特殊化した細胞をもたらしそして与える。このモデルパラダイムにおいて、細胞の全系列の最初の始原源は、原型多能性幹細胞である。全ての真の幹細胞は、その明らかな性質および細胞特性により、（ｉ）中立で未分化の細胞であり；（ｉｉ）無限の増殖能力を有する多能性細胞であり；そして（ｉｉｉ）２つの娘子孫細胞を生成することによって複製する場合にそれらの存在を自己再生しそして自己保持することができ、それらの片方はその親と見分けのつかない自己再生した幹細胞になり、一方、もう片方の娘子孫細胞は、今回「プレ前駆細胞」と称する直接のそして真の第二世代の子孫細胞になる。娘の自己再生した幹細胞は、全ての点でその親幹細胞と同一でありそして同一のままであり、区別できない。この自己再生した娘幹細胞はそれ自体が多能性であり；そしてそれ自体がその親の祖先幹細胞とちょうど同じように２つの異なるタイプの娘子孫細胞を生成する。この自己再生する方法で、幹細胞の総数は継時的に数がゆっくりと増加するが；いかなる時点でも決して真に豊富なもしくは有意に多い数で存在しない。
同定可能な前駆細胞
今回最初に「プレ前駆細胞」と称するもう一方の娘細胞の運命は、祖先の親幹細胞および一方の自己再生した娘細胞と著しく異なるようになる。それ自体の幹細胞親と比較して、プレ前駆細胞の娘は非常に大きいが限定された、すなわち多能性の増殖能力を有する。この直接の子孫娘細胞、真の第二世代の細胞タイプは、それ自体もまた多能性細胞ならびにその生涯にわたってそのようなものとして中立で且つ未分化でありそしてそうあり続ける細胞期である。しかしながら、第二世代、娘のプレ前駆細胞の増殖の速度は、その幹細胞親よりはるかに速い。この場合もやはり、幹細胞は、胚もしくは成体のあらゆる組織において多量に見出されない。しかしながら、プレ前駆細胞娘は、その非常に大きいが限定された生殖寿命にわたって迅速に且つ頻繁に増殖するので、多数の子孫細胞を生じる。単一のプレ前駆細胞娘により子孫として作り出されるこれらの子孫細胞［第三世代の子孫］もまた、それらの特性および能力において有意に改変されるようになり；従って、今回、これらの第三世代の娘細胞を適切に「一次前駆細胞」と称する。時折意外にも多数で、実験的に単離されると考えられ、そして典型的にそうであることが多いのは、単一幹細胞祖先のこの第三世代の細胞もしくは派生した子孫である。
【００３８】
この第三世代の細胞期、「一次前駆細胞」の重要な特徴および主要な特性は、非常に多くの（しかし限られた）数の迅速な増殖および頻繁な再生のそれらの一般に認められた能力ではなく；むしろ一つの事前に設定された細胞系列および細胞発生の単一の固定された経路に不可逆的に決定されるようになるそれらの独特な能力にあり、そしてそれによって代表される。従って、細胞発生プロセスの最終的な意図される結果が何であるべきかそして機能性結果としてどの細胞形態および表現型が存在すべきかに関する本質的な選択および決定は、この第三世代の細胞期を構成する多数の細胞によってそしてそれらを通して起こる。
【００３９】
従って、これらの一次前駆細胞［第三世代期］は、短期間にわたって非常に多数で迅速に生成し；そして細胞発生の固定された系列順序および経路への不可逆的な決定が起こるのは、共通の幹細胞祖先からの子孫のこの第三世代の細胞期によってである。さらに、多能性の特徴および能力（直接の第一および第二祖先細胞によって示される）が現在そして今後永久に失われるようになるのは、この第三世代の細胞期中である。従って、一次前駆細胞は、少なくとも一つの特定の形態の完全に分化した表現型細胞がもたらされるまで続く行程である単一の特定の系列をたどるために不可逆的な細胞決定がなされるように局所的環境において外因的刺激および化学シグナルによって影響を受けるようになる子孫の細胞期および世代である。
【００４０】
一次前駆細胞はまた、個々の細胞系列経路への真の決定の前および後の両方で、それ自体を再生することもできるが；その増殖能力は、特に細胞決定後に、その直接の先立つ祖先およびその単一の幹細胞祖先と比較して著しく限定されそして数が限られると考えられる。
細胞分化の系列決定およびその後の時期
いったん一次前駆細胞において細胞系列決定が起こると、次に細胞の発生は注意深く制御されそして定められた経路制限内で続く。しかしながら、プロセスおよび異なる事象としての細胞分化は、固定された細胞系列経路への事前の不可逆的な決定がなされた後にのみ起こることに留意せよ。従って、分化プロセスの後期の間に起こる細胞の表現型詳細の選択は、特定の系列経路への細胞決定の以前の事象によって設定される固定された制限にいつも従わなければならない。
同定可能な部分的に分化した細胞
部分的に分化した細胞は、細胞系列経路決定を受けているがその最終的な特徴および特定の表現型特性をまだ完全には発生していないものである。その決定済み細胞の特定の形態学的外観、同定可能な機能形態および独特の表現型特性および／もしくは表面マーカーを決定しそして存在に至らせるのは；そしてプロセス中に、最初に部分的に分化した細胞、そして次に完全に分化した細胞が発生し、続いて最終的な細胞態様として現れるのは、細胞分化プロセスの後期もしくは最終期でのみである。
【００４１】
細胞分化の一連の連続する細胞期および発生細胞形質（初期から、中期まで、後期まで）として観察可能な事象の漸進的進行は、従来の科学文献において報告されているように、長い間認められそして実験的に評価されている。この絶えず進む発生系列の事象の一つのよく見られる例は、しばしば「心筋芽細胞」、より一般的には「筋芽細胞」と呼ばれる特定の細胞期であり；そして「鼓動する」もしくは「収縮する」外観および能力を示す細胞培地における特定の細胞であると実験的に認められる。しかしながら、実際、これらの「鼓動する」細胞はそのようなものとして実質的には系列決定済み細胞であり、そして横紋筋細胞もしくは平滑筋細胞もしくは心筋細胞のいずれかをもたらす経路行程にもはや不可逆的に決定された細胞を構成する。従って、定義の目的には、部分的に分化した細胞は、発生の任意の段階、および系列経路決定が起こった後に存在するが分化プロセスの完了は完全な表現型およびイディオタイプの点でまだ起こっていない生存可能な細胞の任意のタイプ、時期もしくはカテゴリーの生存可能な存在を含んでなりそして包含する。
Ｂ．同定可能なタイプの幹細胞の現在発展する概念
しかしながら、多数の最近公開された研究報告は、幹細胞生物学およびパラダイムが、最初に仮定されたより複雑である得ることを示唆し；そして代わりに、発生の別個の細胞存在もしくは時期をさすよりむしろ、「幹細胞」という用語は、より正確には、多数の異なるタイプの細胞、分化した細胞においてさえ誘導することができる生物学的機能をさすことを示唆している。この概念および見解は、Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ，Ｔ．Ｒ．ＢｒａｅｌｔｏｎおよびＪ．Ｍ．Ｗｅｉｍａｎｎによって「Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｖｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｐｔ Ｏｆ Ａ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：Ｅｎｔｉｔｙ Ｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」［Ｃｅｌｌ １０５：８２９−８４１（２００１）］という表題の彼等の公開された総説において説得力をもって提示されており、その原本は本明細書に引用することにより明白に組み込まれる。Ｂｌａｕ ｅｔ ａｌ．の幹細胞の発展する概念の該当する再記述を、読者の利益および検討材料のために以下に複製する。
【００４２】
機能性幹細胞定義および系の発展する概念は、成体における幹細胞が最初に一つの組織に存在しそして次に別の組織の修復もしくは発生に寄与することができるという実験的証拠に基づく。この移動現象および寄与作用は、幹細胞機能における以前に認められていないある程度の柔軟性を示す。さらに、現在、細胞運命の変更は幹細胞の生来の性質であり、そして全生涯を通して組織損傷の進行中の生理的修復に関与し得るようである。報告例の数は依然として比較的少ないが、この意外な結果の証拠は、幹細胞の概念が流動的な状態であること；および組織特異的成体幹細胞の一般に抱かれる見解が拡大される必要があり得ることを示唆する。
【００４３】
この概念の一部として、同定可能な成体幹細胞は、それらがインビボで存在する組織において局所的に作用することができるだけでなく、循環から補充されそして遠位で多様な組織の再生に加わることもできる。ある幹細胞は、循環によって通行することができ、それは、体の全ての臓器へのアクセスを有する「幹細胞ハイウェイ」と想定される。従って、実験的に報告されるように、骨髄由来の細胞は、心臓、脳、骨格筋および肝臓を包含する異なる臓器に入ることができる。「ホーミングシグナル」もまた局所的組織損傷に起因し、そして幹細胞の移動に影響を及ぼすことができる（白血球ホーミングを連想させるように）。次に、局所領域の増殖因子は、それらが入る臓器の機能に関与するように幹細胞を誘導する。従って、周囲の細胞との反応性接触を包含する微環境、細胞外マトリックス、局所環境、ならびに増殖および分化因子は、幹細胞の機能を決定することにおいて重要な役割を果たすと考えられる。
【００４４】
さらに、脳、肝臓および筋肉のような臓器内には、同定可能な幹細胞の固有のプールがあることが周知であり、それらが存在する組織の修復にのみ専念すると長い間考えられている。しかしながら、幹細胞は循環によって臓器に入ることができるので、これらの新たに入った幹細胞は、臓器内にすでに存在する幹細胞の既存のプールに加わるか；もしくは局所環境において分化した細胞自体を直接生成することができる。
【００４５】
従って、極端に見て、最近の実験研究が多核筋肉細胞および分化したＣＮＳ細胞を用いて示しているように、組織における非常に特殊化した細胞タイプでさえそれらの分化した状態を破棄し、そして機能性幹細胞のプールに加わることができる可能性がある。従って、幹細胞の機能性概念によれば、成体組織における少なくともいくつかの同定可能な幹細胞は、組織間の移動をすることができ；そして細胞運命の変更は、少なくとも一部の幹細胞が、適切な微環境があれば非常に柔軟で且つ変化を受けやすいようにそれらの機能を改変できることを明らかにする。これらの理由で、総合的な概念の提示は、幹細胞が、最も正確には、多数の異なるタイプの細胞、分化した細胞においてさえ誘導することができる生物学的機能をさすことである。
【００４６】
さらに、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，４３ｒｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００１年、１２月、「Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ａｄｕｌｔ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｍａｒｒｏｗ ｉｎ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」）によって、そしてＷｅｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，４３ｒｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００１年、１２月、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ」）によって要約形態でのみ提示された最近の結果は、真に多能性である、臍帯血から骨髄および他の成体臓器までに及ぶ、成体組織における細胞があり得ることを示す。これらの同定されたタイプの成体幹細胞は、胚幹細胞のみの性質であると以前には考えられていた、外胚葉、内胚葉および中胚葉に由来する組織を形成することができる。複数の臓器における組織の複雑な再生を引き起こすことができるのは、各臓器におけるこれらの細胞であり、細胞輸送ではない可能性は、まだ完全には立証されていない。これらの細胞はまた、本願に記述する他の系列の前駆体であるようでもあり；そしてそのようなものとして同定可能なタイプの幹細胞として本発明における有用性を有する。
【００４７】
本発明は、それらの機能を柔軟に且つ動的に改変することができる、幹細胞のこれらの概念および代わりの定義の各々を考慮する。Ｂｌａｕ ｅｔ ａｌ．の提示および概念は、実質的な利点およびその見解を裏付ける実験的証拠を有するようである。同様に、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．およびＷｅｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．の研究データは、彼等のそれぞれの考えの実験的裏づけを提供する。これらの理由で、本発明は、古典的なパラダイムおよび系モデルのみに頼らず；そして最終的に分化した細胞に終わる明確な経路に沿った不可逆的な行程よりむしろ、生物学的機能に基づいて本発明の治療処置方法内で幹細胞およびそれらの子孫世代の子孫細胞を同定し、単離しそして用いることができる現在発展する概念および見解を考慮する。
【００４８】
それにもかかわらず、記述の明瞭さ、焦点を合わせた提示のために、ならびに明白な専門用語のために、本明細書における以下の詳細な開示は、現在最も一般に理解され、受け入れられそして用いられる古典的なパラダイムおよび系を記述する。
ＩＶ．同定可能な幹細胞の個々のカテゴリー（系列）
選択したカテゴリー（もしくは系列）の幹細胞の真の供給源もしくは起源は、用いる細胞が意図する宿主レシピエントと生体適合性である限り有意に問題ではない。本発明を実施するのに必要なのは、複数の同定可能な幹細胞（哺乳動物起源の）および／もしくはそれらの直接の子孫および／もしくは子孫派生細胞が移植目的に生存可能な細胞として利用できることだけである。
【００４９】
選択したカテゴリーの幹細胞がインビトロで維持される細胞の安定な培養物であること；共通の細胞祖先を有する細胞の部分的にもしくは完全に精製された培養物であること；および生存の活動期もしくは有糸分裂期であることは、好ましく且つ望ましい。細胞の接種材料と宿主レシピエント間の最もよい生物学的適合性は、両方が同一もしくは非常に同様の種／亜種起源である場合に存在することもまた予想される。従って、ヒト起源の幹細胞は、ヒトレシピエント被験体との使用に好ましく；マウス起源の幹細胞はラットおよびマウスとの使用に望ましく；そして様々な哺乳動物種（例えば、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ、イヌおよびネコ）からの他の起源の幹細胞は、特にこれらの哺乳動物タイプの各々との使用に好ましい。
胚幹細胞およびそれらの子孫：それらの前駆細胞、それらの系列決定済み細胞およびそれらの部分的に分化した細胞
胚幹細胞は、培養において無限の期間にわたって分裂する能力および特殊化した細胞を生じる能力を有する。それらは、精子が卵子を受精させそして全生物体を形成する潜在能力を有する単一細胞を生み出す場合に始まる通常のヒト発生との関連で記述されることが多い。受精卵は全能性であり、その潜在能力が完全であることを意味する。受精後最初の数時間のうちに、この細胞は同一の全能性細胞に分裂する。従って、これらの細胞の任意の一つは、子宮に置くと、胎児に発生する潜在能力を有する。
【００５０】
受精後約４日、そして数周期の細胞分裂後に、これらの全能性細胞は特殊化しそして細胞の中空の球、胚盤胞を形成し始める。胚盤胞は、細胞の外層を有し；そして中空の球の内部には内細胞塊と呼ばれる細胞の別の塊がある。
【００５１】
外層の細胞は、続いて胎盤および子宮における胎児発生に必要な他の外部支持組織を形成する。内細胞塊細胞は、人体の実質的に全ての組織を形成し始める。内細胞塊は、人体に存在する実質的にあらゆるタイプの細胞を形成することができるが、本質的にそれらは胎盤および子宮における発生に必要な支持組織を生じることができないので、それらは全生物体を形成することはできない。
【００５２】
これらの内細胞塊細胞は「多能性」と呼ばれ、それらは多くのタイプの細胞を生じることができるが、胎児発生に必要な全てのタイプの細胞ではない。従って、それらの潜在能力は完全ではないので、それらはそのようなものとして「全能性」ではなく、そしてそれらは生存胚になることはできない。実際、内細胞塊細胞を女性の子宮に置くと、それは胎児に発生することができずそして発生しないであろう。
【００５３】
多能性幹細胞は、数多く増える子孫細胞へのさらなる発生を受け、そして同時に後で系列決定済みになり、そして続いて分化して特定の機能を有する細胞を生じる。この細胞発生系列スキームの例には、赤血球、白血球および血小板を生じる幹細胞；ならびに継時的に様々なタイプの皮膚細胞を生じる幹細胞が包含される。従って、これらのさらに限定された子孫細胞は、しばしば、「多能性」前駆細胞と呼ばれる。
【００５４】
胚幹細胞は、広い範囲の哺乳動物属および種から同定されそして単離されている。現在認められている細胞寄託物および自然源には、マウス、ラットおよび他のげっ歯類；イヌ、ネコおよびウサギ；様々な種類のサル；ならびにヒトが包含される。
【００５５】
ヒト胚盤胞からの胚幹細胞の単離の最初の文書化は１９９４年であった［Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．９：２１１０−２１１７（１９９４）］。それ以来、ヒトＥＳ細胞を得てそして培養する技術は磨かれている［Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：３９９−４０４（２０００）；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７（１９９８）］。胚盤胞からヒトＥＳ細胞を単離しそしてそれらを培養において育てる能力は、大部分、これらの細胞が得られる胚盤胞の完全性および状態により決まると思われる。一般に、大きなそしてはっきり識別できる内細胞塊を有する胚盤胞は、ＥＳ培養物を最も効率よくもたらす傾向がある［Ｂｏｎｇｓｏ Ａ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｌａｓｔｏｃｙｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｙｄｎｅｙ Ｐｒｅｓｓ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，１９９９］。
【００５６】
５日目の胚盤胞は、インビトロでＥＳ細胞培養物を得るために用いられることが多い。インビトロで通常の５日目のヒト胚は、２００〜２５０個の細胞からなる。大部分の細胞は、胚盤胞を取り囲む細胞の外層である栄養外胚葉を含んでなる。ＥＳ細胞培養物を得るために、栄養外胚葉を微小手術もしくは免疫手術のいずれかによって取り除く（ここで、栄養外胚葉に対する抗体は、それを壊すのに役立ち、このようにして内細胞塊を遊離させる）。この段階で、内細胞塊は３０〜３４個の細胞のみから成る［Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．（１９９９）］。
【００５７】
ヒト胚を胚盤胞期まで育てるインビトロ条件は様々であることができる。例えば、Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．１８：１１８１−１１８９（１９９４）；Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓｉｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：１０６−１１４（１９９５）；Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１３：２９２６−２９３２（１９９８）；ＤｅＶｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ．１６６：２２０−２２７（２０００）；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．７０：１０２２−１０２９（１９９８）；Ｓａｔｈａｎａｎｔｈａｎ，Ａ．Ｈ．，Ｈｕｍ．Ｃｅｌｌ．１０：２１−３８（１９９７）；Ｔｒｏｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２０００；Ｔｒｏｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １２１：５１−５７（２００１）を参照。しかしながら、いったん内細胞塊がマウスもしくはヒト胚盤胞のいずれかから得られると、ＥＳ細胞を育てる技術は同様である。
【００５８】
カテゴリーとしての胚幹細胞はまた、意味のある用語において「胚生殖細胞」および「胎児性癌細胞」の両方と比較されそして区別されている。それらを同定しそして分類するために典型的に用いられる細胞マーカーの比較を以下の表１によって示す。
【００５９】
【表１】
Figure 2004532202
【００６０】
胚幹細胞から得られる細胞の系列決定および部分的分化
ＥＳ細胞の子孫は、それらを支持細胞層から取り除きそして非接着性表面上で懸濁培養において増やすと系列決定を受けそして分化し始める。ヒトＥＳ細胞は特徴的に胚様体を形成し、それは初期段階で、単層（ｓｉｍｐｌｅ）もしくは嚢胞性でありそして流動体で満たされていることができる。ヒト胚様体はそれらの細胞内容物が異なるが、多くは、ニューロンおよび心筋細胞のように見える細胞を含む［Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：８８−９５（２０００）；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３９９−４０４（２０００）；Ｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．２３：８２−８７（１９９３）］。
【００６１】
ヒト胚様体が形成した後、それらを解離させそして単層培養において再平板培養することができ、次にそれをさらなる細胞分化に影響を及ぼす特定の増殖因子にさらす。ある増殖因子は、通常は胚の外胚葉から得られる細胞タイプを誘導し；これらには、レチノイン酸、上皮増殖因子（ＥＧＦ）および骨増殖因子（ＢＧＦ）が包含される。アクチビン−Ａおよびトランスフォーミング増殖因子−ベータ１（ＴＧＦ−β−１）のような別の増殖因子は、中胚葉由来の細胞の分化を引き起こす。２つの他の因子、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）は、内胚葉を包含する３つ全ての胚葉への分化を促進する。
【００６２】
胚様体から得られる細胞培養物にこれら８つの増殖因子を個々に加えると、細胞は、３つ全ての胚葉に相当する１１の細胞タイプに分化した。分化したヒト胚様体由来の細胞の同一性は、それらの形態、増殖特性および特異的マーカーのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現によって決定した［Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６−１３７３１（１９９８）］。
【００６３】
ヒト胚様体由来の細胞は、増殖因子の添加なしに多くの種類の細胞に自発的に分化することができそしてそうすることもまた認められている。しかしながら、（多数の異なる増殖因子の）単に一つの添加は、細胞によって発現されるｍＲＮＡ転写産物により測定する場合に、１つもしくは２つのタイプのみの分化した細胞によって占められる可能性が高い培養物をもたらした。例えば、ｂＦＧＦで処理したヒト胚様体由来の培養物は、主として、皮膚におけるタンパク質であるケラチンを発現する表皮上皮細胞に分化した。同様に、アクチビン−Ａで処理した培養培地における細胞は、酵素筋肉特異的エノラーゼを発現する筋肉細胞様の合胞体融合した細胞の多核集団を形成した。また、レチノイン酸で処理した培養物は、ニューロンによく似ておりそして神経フィラメントＨを発現する細胞に分化した。しかしながら、同じ増殖因子は、典型的に、複数のマーカーの発現を誘導し；そして得られる細胞集団のいずれも均質ではなかった［Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６−１３７３１（１９９８）］。
【００６４】
血液細胞の全ての系列を形成する造血細胞へのヒトＥＳ細胞の自然分化は、インビトロにおいてまれである。しかしながら、ウシ胎仔血清を含有するが増殖因子を添加しない増殖培地においてヒトＥＳ細胞をマウス骨髄間質細胞（それらの複製を防ぐために放射線照射する）と共培養することにより、細胞は分化して造血前駆細胞のように見えるものを形成する。部分的に分化した細胞は、血液細胞前駆体のマーカー、ＣＤ３４を発現する。これらの部分的に分化したヒトＥＳ細胞を、それらに造血細胞のコロニーを形成させる条件下で再平板培養すると、それらは赤血球系細胞、マクロファージ、顆粒球および巨核球に分化する［Ｏｄｏｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １９：１９３−２０４（２００１）］。
【００６５】
胚幹細胞、それらの子孫前駆細胞およびそれらの系列決定済み子孫細胞に関する多数のさらなる知識および指針情報は、公開された科学および特許文献によって提供される。これらのいくつかを単に例示すると：「Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒｉｍｅｒ」，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，２０００年、５月；「Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ」，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓにおける第３章，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，２０００；ＮＩＨ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，２００１である。また、特許文献は、胚幹細胞に関する多くの情報、洞察および指針を提供する。これらを例示すると米国特許第５，８４３，７８０号；第６，２００，８０６号；第５，６３９，６１８号；第６，１４６，８８８号；および第６，２８０，７１８号であり、これらの原本は本明細書に引用することにより各々が明白に組み込まれる。
成体幹細胞カテゴリー１：造血幹細胞およびそれらの子孫；それらの前駆細胞、それらの系列決定済み細胞およびそれらの部分的に分化した細胞
造血成体幹細胞は：（１）全ての特定されたヘマトリンパ系列（ｈｅｍａｔｏｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅｓ）における子孫を生じ；そして（２）細胞再生により全ての血液細胞タイプにおいて重度の免疫無防備状態宿主を完全に再構成することができるさらに多数の細胞を提供する多能性細胞と定義することができる。
【００６６】
確かに、分化した哺乳動物血液細胞は、並外れて多様な活性を提供しなければならない。血液細胞は、リンパ系、骨髄系および赤血球系を包含するいくつかの系列に分類される。Ｂ細胞およびＴ細胞を包含するリンパ系列は、抗体の生産、細胞性免疫系の調節、血液における外来因子の検出、宿主にとって外来の細胞の検出などを提供する。単球、顆粒球、巨核球ならびに他の細胞を包含する骨髄系列は、血流における異物の存在をモニターし、新生細胞に対する防御を提供し、血流における異物を取り除き、血小板を生産するなどである。赤血球系列は、酸素運搬体の役目を果たす赤血球を提供する。
【００６７】
血液細胞の性質、形態、特性および機能の多様性にもかかわらず、現在、自己再生することができそして増殖および他の環境因子にさらされた後に細胞分化の特定の系列経路およびパターンしかもたないようになる単一のタイプの造血幹細胞が存在すると考えられる。
【００６８】
哺乳動物血液細胞の高い代謝回転率は、様々な血液細胞系列を生じることができる造血幹細胞のインビボ供給を必要とする。造血幹細胞の直接の子孫は前駆細胞と呼ばれ；そしてこれらの前駆細胞は、一つもしくはそれ以上の特定の系列経路、すなわち、赤血球、骨髄およびリンパ系列内の様々な細胞タイプを生じることができる。総合的に、造血幹細胞およびその前駆細胞集団は、骨髄、胎児肝臓などにおける細胞の総数のほんのわずかなパーセンテージを構成する。しかしながら、これらの集団は、生存哺乳動物における全造血系を再生するそれらの能力のために非常に大きな価値がある。
【００６９】
造血幹細胞および前駆細胞集団の精製もしくは濃縮の多数の方法が公開された文献に記述されている。造血前駆体は多数の臨床用途を有するので、これらの方法にはかなりの関心がある。前駆細胞移植は、現在、白血病、乳癌および他の腫瘍の処置に化学療法および放射線療法とともに用いられる。また、遺伝子治療の手段としての造血前駆細胞の使用にも関心がある。臨床においてまだ証明されていないが、造血幹細胞の長命および脈管構造におけるそれらの子孫の散在性は望ましい特性である。造血幹細胞をトランスフェクションすることができる、いくつかのレトロウイルスおよびアデノウイルスに基づく構築物を包含する、多数のベクターが記述されている。
【００７０】
造血幹細胞および前駆細胞集団上に存在するタンパク質および他の細胞表面マーカーは、これらの集団の同定、分離および単離のための試薬を調製することにおいてそしてこれらの重要な細胞のさらなる特性化において有用であるので、非常に興味深い。現在、幹細胞上に存在するが成熟血液細胞上には存在しない、ＣＤ３４抗原のような、幹細胞の同定および分離（正および負）に用いることができるいくつかのマーカーが既知である。
【００７１】
公開された科学および特許文献は、多量の有用な知識および指針情報を提供する。例えば、米国特許第５，６４３，７４１号；第５，７１６，８２７号、第５，８４３，６３３号および第５，０６１，６２０号は、実質的に均質なヒト造血幹細胞およびそのような細胞を得る方法を記述する。間質細胞に関連する造血は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ ７７：１７２３−１７３３によって記述されている。ローダミン染色での幹細胞の表現型は、Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９９０）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８７：７４３３−７４３７に説明されている。造血における細胞表面抗原発現は、Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｌｏｏｄ ６１：１２２２−１２３１およびＳｉｅｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｂｌｏｏｄ ６０：７０３−７１３に説明されている。多能性造血細胞の記述は、ＭｃＮｉｅｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｌｏｏｄ ７４：６０９−６１２およびＭｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ ５：２９７−３１１に見出される。インビトロで芽細胞含有コロニーを形成することができるヒト造血前駆細胞の特性化は、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３０：１５０−１５６およびＢｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２：１０１７−１０２７に見出される。移植における前駆細胞の使用は、Ｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｉｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ＩＳＢＮ １−８８０８５４ １７−１），ｐｐ．１５−２０に説明されている。全てのこれらの公開は、本明細書に引用することにより明白に組み込まれる。
【００７２】
さらに、米国特許文献は下記のことを提供する：インビトロでヒト造血幹細胞を培養する方法［第５，４３６，１５１号；第５，４６０，９６４号；および第５，６０５，８２２号］；ヒト造血細胞培養において生成される細胞の特定の系列を調節する方法［第５，６３５，３８６号］；造血幹細胞を濃縮した細胞の集団を精製する方法［第５，６６５，５５７号］；ヒト造血幹細胞のエクスビボ複製の方法および組成物［第５，６７０，３５１号］；造血幹細胞の非常に濃縮された集団を生成する方法［第５，８１４，４４０号および第５，６８１，５５９号］；造血幹細胞の末梢化（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）［第５，８４３，４３８号、第５，６９５，７５５号および第５，８２４，３０４号］；ならびに液体培地におけるヒト造血前駆細胞の増殖［第５，７４４，３６１号］。これらの交付済み特許の原本は、本明細書に引用することにより各々が明白に組み込まれる。
造血幹細胞
ヒト造血幹細胞およびその子孫細胞の有用な記述および同定する手段は、米国特許第５，６４３，７４１号によって提供され、その該当個所を以下に再記述する。
【００７３】
造血幹細胞は、抗体により同定される特定のエピトープ部位と関連するマーカーの存在およびある種の抗体の結合の欠如により同定されるようなある種のマーカーの欠如の両方を特徴とする。選択は、幹細胞に特異的なマーカーで行う必要はない。負の選択（細胞の除去）および正の選択（細胞の単離）の組み合わせを用いることにより、実質的に均質な造血幹細胞組成物を得ることができる。
【００７４】
造血幹細胞は、大部分がＣＤ３４＋、ＣＤ３−、ＣＤ７−、ＣＤ８−、ＣＤ１０−、ＣＤ１４−、ＣＤ１５−、ＣＤ１９−、ＣＤ２０−、ＣＤ３３−およびＴｈｙ−１＋であることを特徴とする。高度に幹細胞濃縮した細胞組成物は、ＣＤ３４＋、ＣＤ１０−、ＣＤ１９−およびＣＤ３３−、より特にさらにＣＤ３−およびＣＤ８−、好ましくはさらにＴｈｙ−１＋である。ＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ１０−、ＣＤ１９−、ＣＤ２０−およびＣＤ３３−は、Ｌｉｎ−と呼ばれる。ＣＫ１０／１９／２０マーカーはＢ細胞と関連し、ＣＤ３／４／８マーカーはＴ細胞と関連し、ＣＤ１４／１５／３３細胞マーカーは骨髄系細胞と関連する。Ｔｈｙ−１マーカーはヒトＴ細胞上にはない。また、ヒトＣＤ３４＋では、ローダミン１２３は細胞を高いおよび低いサブセットに分類することができる。［マウス幹細胞でのローダミン１２３の使用の記述は、Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：７４３３を参照。］好ましくは、細胞は低いローダミンである。
造血幹細胞の単離
造血幹細胞を得るためには、骨髄もしくは他の造血源におけるまれな多能性幹細胞を他の細胞から単離することが必要である。最初に、骨髄細胞を骨髄の源、例えば、腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊椎、もしくは他の骨空洞から得ることができる。ヒト造血幹細胞の他の源には、胚卵黄嚢、胎児肝臓、胎児および成体脾臓、成体末梢血および臍帯血を包含する血液が包含される。
【００７５】
胎児骨もしくは他の骨源からの骨髄の単離では、骨を洗うために適切な溶液を用いることができ、この溶液は、低濃度、一般には約５−２５ｍＭの許容しうるバッファーとともに、ウシ胎仔血清もしくは他の天然に存在する因子を都合よく補足した平衡塩類溶液である。都合のよいバッファーには、Ｈｅｐｅｓ、リン酸バッファー、乳酸バッファーなどが包含される。そうでなければ、骨髄を常法に従って骨から吸引することができる。
【００７６】
３４＋Ｔｈｙ＋Ｌｉｎ−細胞の形態学的評価は、多能性幹細胞が中型であることを示す。光散乱評価は、幹細胞が、低い側方散乱を有する芽細胞プロフィールを有することを示す。これらの結果は、幹細胞が独特の密度プロフィールを有することを示す。密度分画したヒト骨髄からの低密度画分はＣＤ３４＋Ｔｈｙ＋Ｌｉｎ−細胞が濃縮されていることが見出されている。
【００７７】
最初に専門系列の細胞を除くことによって細胞を分離するために様々な技術を用いることができる。モノクローナル抗体は、特定の細胞系列および／もしくは分化の時期と関連するマーカー（表面膜タンパク質）を同定するのに特に有用である。抗体は、粗分離を可能にするために固体支持体に結合することができる。用いる分離技術は、集める画分の生存能力の保持を最大にすべきである。「比較的粗い」分離（すなわち、マーカーを有する存在する全細胞の１０％まで、通常は約５％以下、そして好ましくは約１％以下が、保持される細胞集団に残ることができる分離）には、異なる効率の様々な技術を用いることができる。用いる特定の技術は、分離の効率；方法論の細胞傷害性；実行の容易さおよび速度；ならびに最新式の装置および／もしくは技術的熟練の必要性により決まる。
【００７８】
幹細胞分離の方法には、抗体を被覆した磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に連結したもしくはモノクローナル抗体とともに用いる細胞傷害性因子、例えば補体および細胞毒素、ならびに固体マトリックス、例えばプレートに結合した抗体での「パンニング」、または他の都合のよい技術を包含することができる。正確な分離を与える技術には、様々な程度の精巧さ、例えば、複数の色チャンネル、小角および鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなどを有することができる蛍光活性化セルソーターが包含される。
【００７９】
用いることができる一つの方法は、骨髄からの細胞を特定の細胞タイプ、例えばＴ細胞決定基のＣＤ３およびＣＤ８に特異的な飽和レベルの抗体と換算温度、一般に約４℃で短期間インキュベーションした後の第一段階においてである。次に細胞をウシ胎仔血清（ＦＣＳ）クッションで洗浄する。次に細胞を上記のようなバッファー培地に懸濁し、そして抗体もしくは抗体−抗原複合体に特異的な様々なタンパク質を用いて、特定の決定基の抗体によって分離することができる。
【００８０】
抗体は、特定の細胞タイプの分離を容易にするために、直接分離を可能にする磁気ビーズ、支持体に結合したアビジンもしくはストレプトアビジンで取り除くことができるビオチン、蛍光活性化セルソーターで用いることができる蛍光色素などのようなマーカーと都合よく結合することができる。従って、残留する細胞の生存能力にとって過度に有害ではない任意の技術を用いることができる。
【００８１】
成熟細胞マーカーを欠く細胞の実質的な濃縮（一般に少なくとも約５０％そして好ましくは少なくとも約７０％の）後に、細胞を今度は蛍光活性化セルソーター（「ＦＡＣＳ」）もしくは高い特異性を有する他の方法論によって分離することができる。多色分析を特に都合のよいＦＡＣＳで用いることができる。
【００８２】
細胞は、特定の抗原の染色レベルに基づいて分離することができる。第一の分離において、少なくとも約１−３ｘ１０１０個の細胞から出発して、ＣＤ３４の抗体を一つの蛍光色素で標識することができ、一方、様々な専門系列の抗体を異なる蛍光色素に結合することができる。多色分析に用途を見出すことができる蛍光色素には、フィコビリタンパク質、例えばフィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、フルオレセイン、テキサスレッドなどが包含される。系列の各々を別個の工程において分離することができるが、望ましくは、ＣＤ３４もしくは同等のマーカーを正に選択するのと同時に系列を分離する。一般に、得られる細胞の数は最初の細胞の約１％より少なく、一般に約０．５％より少なく、そしてわずか０．２％程度もしくはそれ未満であることができる。
【００８３】
次に細胞をＴｈｙ＋に関して正に選択することによってさらに分離することができ、ここで、細胞は一般に最初の細胞の０．５％より少なく、一般に０．０１−０．５％の範囲である。死亡した細胞と関連する色素（ヨウ化プロピジウム、ＬＤＳ）を用いることにより、細胞を死亡した細胞に対して選択することができる。望ましくは、２％ウシ胎仔血清を含んでなる培地に細胞を集める。アフィニティーカラムなどのような、正確な分離を可能にする正の選択の他の技術を用いることができる。該方法は、約２０％未満、好ましくは約５％未満の非幹細胞集団の残余量までの除去を可能にすべきである。
【００８４】
ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−およびＣＤ３４＋Ｌｉｎ−Ｔｈｙ−１＋は、ＦＡＣＳ分析による低い側方散乱および低い前方散乱プロフィールを有する。ＣＹＴＯＳＰＩＮ調製物は、幹細胞が成熟リンパ系細胞と成熟顆粒球の間のサイズを有することを示した。細胞は、光散乱特性ならびに様々な細胞表面抗原のそれらの発現に基づいて選択することができる。
系列決定済み細胞および部分的に分化した細胞
９０％を越える（通常は約９５％を越える）ヒト造血幹細胞を有する組成物を単離することができ、所望に応じて、ここで、ＣＤ３４＋、Ｌｉｎ−およびＴｈｙ−１＋であることにより所望の幹細胞を同定する。これらの細胞は、細胞再生および様々な造血系列の全てのメンバーの発生を与えることができる。
【００８５】
ヒト造血幹細胞は、適切な培養物において骨髄系細胞およびリンパ系細胞の生成を与え；骨髄系細胞の生成には培養物はヒドロコルチゾンを与え（Ｄｅｘｔｅｒタイプ培養と関連する）；そして培養物におけるＢリンパ球はヒドロコルチゾンを欠く（Ｗｈｉｔｌｏｃｋ−Ｗｉｔｔｅタイプ培養と関連する）。培養の各々において、様々な株由来であることができるマウスもしくはヒト間質細胞を与える。ＡＣ３もしくはＡＣ６、選択によりマウスもしくはヒト胎児骨髄から得られる間質細胞は、ヒト幹細胞を維持することができる。細胞の培養に用いる培地は、都合よく、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）のような特定の濃縮培地、ＩＭＤＭおよびＲＰＭＩの５０：５０混合物であり、そして一般に塩類、アミノ酸、ビタミン、５ｘ１０−５Ｍ ２−ＭＥ、ストレプトマイシ／ペニシリンおよび１０％ウシ胎仔血清から成り、そして時折、一般に週に少なくとも約１〜２回交換することができる。特に、ヒドロコルチゾンを有するある培養物からヒドロコルチゾンなしの別の培養物に細胞を移し、そして異なる培養物における異なる系列のメンバーの生成を示すことによって、幹細胞およびその維持の存在が裏付けられる。このようにして、骨髄系細胞およびＢ細胞の両方の生成を同定することができる。
【００８６】
Ｔ細胞への分化を示すために、胎児胸腺を単離し、そして胎児胸腺のリンパ系集団を実質的に枯渇させるために、胸腺を約２５℃で４−７日間培養することができる。試験する細胞を次に胸腺組織に微量注入し、ここで、注入する集団のＨＬＡは胸腺細胞のＨＬＡと一致しない。次に胸腺組織をＥＰＡ ０ ３２２ ２４０に記述されているようにｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに移植することができ、特に腎被膜に移植することができる。
【００８７】
赤血球には、ＢＦＵ−Ｅ単位を同定するために従来技術、例えば、細胞が赤血球系統を発生することができることを示すメチルセルロース培養（Ｍｅｔｃａｌｆ（１９７７）：Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，ｐｐ．１−２２７）を用いることができる。
【００８８】
骨髄系およびＢ細胞能力を同定することにおいては、都合よく、試験する集団を最初にヒドロコルチゾン含有培養物に導入し、そしてそのような培養物において６週間増殖させる。用いる培地は、１０％ ＦＣＳ、１０％ウマ血清、ストレプトマイシン／ペニシリン、グルタミンおよび５ｘ１０−７Ｍヒドロコルチゾンを含有するＲＰＭＩ１６４０およびＩＭＤＭの５０：５０混合物を含んでなる。６週の期間の間に、前駆細胞がない場合、全ての成熟細胞は死ぬと予想される。６週の終わりに、骨髄系細胞がなお認められる場合、骨髄系細胞への連続的分化を与えている前駆細胞が存在すると結論を下すことができる。この時点で、次に、Ｂ細胞の増殖を促進するために、今度は培地がヒドロコルチゾンを欠くように、培地を交換することができる。３−４週待ち、そしてＦＡＣＳ分析によりＢ細胞の存在を示すことによって、以前に骨髄系細胞を生成することができた前駆細胞がＢ細胞もまた生成することができると結論を下すことができる。ヒドロコルチゾンの存在下で増殖させるヒト造血細胞は、少なくとも４ヶ月間維持することができる。同様に、ヒドロコルチゾンなしに増殖させるヒト造血細胞は、Ｂリンパ球（ＣＤ１９＋）ならびに骨髄単球性細胞を少なくとも４ヶ月間含有する。これらの培養物から、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ＋、Ｔｈｙ＋Ｌｉｎ−もしくはＣＤ３４＋Ｔｈｙ＋Ｌｉｎ−を分類することができ、それは前駆細胞が実質的に濃縮された組成物を与えるはずである。これらの培養物から得られるＣＤ３４＋Ｌｉｎ−、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ＋、Ｔｈｙ＋Ｌｉｎ−もしくはＣＤ３４＋Ｔｈｙ＋Ｌｉｎ−細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄単球性細胞を生じることができる。
成体幹細胞カテゴリー２：間葉幹細胞およびそれらの子孫；それらの前駆細胞、それらの系列決定済み（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞、ならびにそれらの部分的に分化した細胞。
【００８９】
間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、血液、真皮および骨膜で見出される形態発生性の多分化能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）胚様細胞であり；ならびに、特定のタイプの間葉、もしくは脂肪、骨性、軟骨性、弾性、筋および線維性の結合組織を包含する結合組織に分化することが可能である。これらの細胞が進入する特定の系列決定および分化経路は、機械的影響、および／もしくは増殖因子、サイトカインのような内因性の生物活性因子、および／もしくは宿主組織により確立される局所の微小環境条件からの多様な影響に依存する。これらの間葉幹細胞は、通常は非常に低頻度で骨髄中に存在するとは言え、組織培養物中のこれらの細胞の集団の多数の単離、精製および有糸分裂的拡張方法が、現在、慣習的に既知かつ商業的に使用される。
【００９０】
間葉幹細胞は、終末的に分化されていない細胞と定義され；それらは、制限なしに分裂することができ；かつ、分裂して、ちょうどよい時に不可逆的に分化して表現型の細胞を生じる幹細胞もしくは前駆細胞のいずれかである娘細胞を生じることができる。多くの細胞タイプを生じさせる間葉幹細胞は多分化能性細胞と呼ばれる。
【００９１】
軟骨もしくは骨に分化する能力をもつ二能性（ｂｉｐｏｔｅｎｔ）細胞である軟骨／骨前駆細胞は、骨髄から単離することができる（例えば、Ｏｗｅｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．Ｓｕｐｐｌ．１０：６３−７６（１９８８）および米国特許第５，２２６，９１４号明細書に記述されるとおり）。これらの細胞は、Ｏｗｅｎが多分化能性間葉幹細胞の存在を仮定することに導き、その後、筋（Ｐａｔｅら，Ｐｒｏｃ．４９ｔｈ Ａｎｎ．Ｓｅｓｓ．Ｆｏｒｕｍ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｓｕｒｇ．Ｐｒｏｂｌｅｍｓ ５８７−５８９（１９９３年１０月１０〜１５日）；心（Ｄａｌｔｏｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１９：Ｒ２０２（１９９３年３月））；および肉芽組織（Ｌｕｃａｓら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：Ｒ２１２（１９９３年３月））から単離された。多分化能性は、軟骨細胞（軟骨）、骨芽細胞（骨）、筋管（筋）、脂肪細胞（脂肪）および結合組織細胞への幹細胞の分化を導き出す非特異的誘導物質、デキサメサゾン（ＤＭＳＯ）を使用して立証される。
【００９２】
不幸なことに、筋生検により容易に得られ、多数を生じるよう培養されそして結合組織、もしくは骨髄、もしくは軟骨細胞、もしくは骨芽細胞、もしくは筋細胞の供給源として使用することができる幹細胞を有することが、高度に望ましいとは言え；軟骨のみを生じる間葉幹細胞の既知の特異的誘導物質が存在しない。分化が達成されるインビトロ研究は、細胞タイプの混合物を生じる。例えば、細胞を多孔質セラミックブロックに吸収させそして埋植した、米国特許第５，２２６，９１４号および同第５，１９７，９８５号明細書に記述される研究は、主として骨を生じることが示された。インビボで骨形態発生タンパク質−２（ｒｈＢＭＰ−２）を使用する他の研究は、常に軟骨性骨カスケードを生じさせた。すなわち、軟骨が最初に形成されるが、しかしこの軟骨は肥大し；その後脈管構造および骨芽細胞により侵襲され；そしてついには骨髄が完備した骨により置き換えられる（Ｗｏｚｎｅｙ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １：２６７−２８０（１９８９））。インビトロでの間葉幹細胞でｒｈＢＭＰ−２を試験する研究は分化した細胞の混合物を生じさせたが、とは言え軟骨が優勢を占めた（Ｄａｌｔｏｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２７８：ＰＺ２０２（１９９４年２月））。間葉細胞の培養物のインスリンとのインキュベーションは、混合された筋原性および脂肪生成性の応答につながった一方、インスリン様増殖因子ＩもしくはＩＩとのインキュベーションは、主として筋原性応答につながった（Ｙｏｕｎｇら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３６：ＣＤ２０７（１９９２年４月））。米国特許第４，７７４，３２２号および同第４，４３４，０９４号明細書もまた、筋細胞と混合された場合にインビボで骨原性応答、もしくはインビトロで軟骨形成を誘導する因子の単離を報告する。
【００９３】
全体的に、本米国特許文献は、間葉幹細胞、それらの直近の子孫の（ｐｒｏｇｅｎｙ）細胞、およびそれらの子孫の（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）系列の指図（ｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）された分化した細胞に関する広範な情報および知識を提供する。単離された間葉幹細胞，およびそれらの個々の哺乳動物の供給源は、米国特許第５，８２７，７３５号；同第５，４８６，３５９号；同第５，５９１，６２５号；および同第６，２１４，６３９号明細書により完全に記述される。多様な天然に存在する供給源からの間葉幹細胞の単離および精製方法は、米国特許第５，１９７，９８５号；同第５，２２６，９１４号；同第５，９０８，７８２号；同第５，９６５，４３６号；および同第６，２６１，５４９号明細書により記述される。間葉幹細胞の子孫である細胞の系列決定および分化を制御および指図するリガンドおよび方法は、米国特許第５，８１１，０９４号；同第５，８２７，７４０号；同第５，９４２，２２５号；同第６，０２２，５４０号、同第６，１４９，９０６号；同第６，３２２，７８４号；同第５，７１９，０５８号；同第５，８５６，１８６号；同第５，９０８，７８４号；同第６，２１４，６３９号；同第６，２４８，５８７号および同第６，３３８，９４２号明細書により記述される。間葉幹細胞およびそれらの子孫の細胞についての意図された商業的応用および／もしくは治療的用途の範囲および多様性は、米国特許第５，７００，２８９号；同第５，７１６，６１６号；同第５，７１９，０５８号；同第５，８１１，０９４号；同第５，８３７，５３９号；同第６，０１０，６９６号；同第６，１４９，９０６号；同第６，１７４，３３３号；同第６，２２５，１１９号；同第６，２３９，１５７号；同第６，２５５，１１２号；同第６，２８１，０１２号；および同第６３２８９６０号明細書により例示される。これらの交付された米国特許のそれぞれの記述的本文は、引用することにより明らかにかつ個別に本明細書に組み込まれる。
ヒト間葉幹細胞の単離および精製の例
ヒト間葉幹細胞は、例えば骨髄、血液、真皮、骨膜、もしくは脂肪組織からさえ生じられることができる。骨髄から得られる場合、これは：大腿骨頭部海綿骨片の栓子から；股関節もしくは膝置換手術の間に変性性関節疾患を伴う患者から；または、将来の骨髄移植のため骨髄を収穫させた正常ドナーおよび腫瘍学患者から得られた吸引された骨髄から、を包含する、多数の異なる供給源からの骨髄であることができる。
【００９４】
収穫された骨髄は、その後、細胞培養のため準備する。単離方法は、分化を伴わない間葉幹細胞の成長のみならずしかしまた培養容器のプラスチックもしくはガラス表面への間葉幹細胞のみの直接接着も見込む作用物質を含有する、特別に調製された培地の使用を必要とする。非常に微小な量で間葉組織サンプル中に存在した所望の間葉幹細胞の選択的付着を見込む培地を創製することにより、その場合に、元の間葉組織中に存在する他の細胞（すなわち赤血球および白血球、他の分化した間葉細胞など）から間葉幹細胞を分離することが可能になった。
【００９５】
結果として、分化の前に組織からヒト間葉幹細胞を単離かつ精製し；そしてその後間葉幹細胞を培養拡充する（ｃｕｌｔｕｒｅ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）ための多様な方法が開発された。こうした操作の目的は、間葉幹細胞の数を大きく増大させること；ならびに、後に、身体の正常な回復能力を向け直しかつ／増強するためにこれらの細胞を利用することである。間葉幹細胞は、好ましくは多数まで拡張させ、そして、再生および／もしくは修復のためのインビボの成長を高めもしくは刺激して、その後の活性化および分化により多様なプロテーゼ装置への埋植物の接着を向上させるために、結合組織の損傷の領域に適用することができる。
【００９６】
また、多様な処置が、骨欠損の部位で細胞を注入すること、細胞をプロテーゼとともにインキュベートすること、および該プロテーゼを埋植すること、などを包含する、修復、埋植などの部位で、培養拡張された精製された間葉幹細胞を移入、固定および活性化するために企図される。従って、分化前に細胞を単離、精製かつその数を大きく拡張し、そしてその後、組織損傷の部位でそれらを配置することによって、もしくはそれらの移植前にインビトロで前処理することによって分化過程を能動的に制御することにより、培養拡張された間葉幹細胞は、多様な治療目的（細胞、骨格形成異常、軟骨欠損、靭帯および腱の傷害、ならびに他の筋骨格および結合組織の障害を軽減するためのような）上、利用されている。
【００９７】
所望の選択的付着にとりわけ十分に適し、かつ、下述されるところの血清を補充される場合に「完全培地」と本明細書でしばしば称される、いくつかの培地が調製されている。１つのこうした培地は、強化されたバージョンのダルベッコの改変イーグル培地低ブドウ糖（ＤＭＥＭ−ＬＧ）であり、これは公知かつ容易に商業的に入手可能である。他のインビトロ培地処方は、米国特許第５，９４２，２２５号；同第５，９０８，７８２号；同第５，９１９，７０２号；同第５，７９５，７８１号；同第６，１７４，３３３号；同第６，０３０，８３６号；および同第５，４８６，３５９号明細書により記述される。
【００９８】
系列決定済み細胞および部分的に分化した細胞
ここに提示される情報の多くは、米国特許第５，９４２，２２５号明細書により提供される情報の適切な言い換えである。
【００９９】
未分化の前駆細胞の子孫の細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｒｏｇｅｎｙ ｃｅｌｌ）が別個の系列経路に進入する能力は、間葉形成（ｍｅｓｅｎｇｅｎｉｃ）過程と称され、そしてフロースキームＡに図解で表される。間葉形成過程において、ＭＳＣが動員されて特定の多段階系列経路に進入し、それはついには骨、軟骨、腱、筋、真皮、骨髄間質、および他の間葉結合組織のような、機能的に分化した組織を生じる。例えば、骨を形成する細胞の分化経路の詳述されたスキームをフロースキームＢに提示する。この系列経路地図は、ＭＳＣを骨形成系列に動員し；前骨芽細胞の複製を促進し；そして、最終段階の骨細胞への途中ずっと段階的分化を指図する、個別の制御要素の存在を意味する。この複雑な経路の各段階が異なる生物活性因子により制御されるという見方を支持するかなりの研究が発表されている。
【０１００】
類似の系列決定の図が、フロースキームＣにより示されるとおり、軟骨細胞分化について展開されている。再度、各系列経路段階の発達は、限定されるものでないが骨形態発生タンパク質のファミリーを挙げることができる独特の生物活性因子の制御下にある。骨でであれ、軟骨でであれ、筋でであれ、いずれかの他の間葉組織でであれ、分化過程の各調節物質は、系列の発達の速度に影響を及ぼすかもしれず、かつ／もしくは該経路に沿った個々の段階に特異的に影響を及ぼすかもしれない。すなわち、細胞が特定の系列に発生的に決定されるかどうかは生物対称性に（ｂｉｏｓｙｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）活性状態にあるか、もしくは、最後の段階の表現型への発達は局所の環境での生物活性因子の多様性およびタイミングに依存することができる。
【０１０１】
【表２】
Figure 2004532202
【０１０２】
【表３】
Figure 2004532202
【０１０３】
【表４】
Figure 2004532202
【０１０４】
従って、ある条件下で、培養拡張された間葉幹細胞が、骨、もしくは軟骨、またはフロースキームＡにより示される他のタイプのいずれかに分化する能力を有することが、はっきりと示される。骨もしくは軟骨細胞に分化するように間葉幹細胞に影響する環境因子は、部分的に、脈管構造により供給される増殖および栄養因子；もしくは脈管構造と緊密に関連する細胞への、間葉幹細胞の直接的到達可能性であるようである。
【０１０５】
結果として、単離されかつ培養拡張された間葉幹細胞は、ある特定の条件下および／もしくはある因子の影響下で、特定の系列経路に決定し、そして分化しかつ結合組織の修復もしくは再生および／または多様なプロテーゼ装置の埋植に必要とされる所望の細胞表現型を生じさせるように利用することができる。例えば、培養拡張されたヒト間葉幹細胞で満たされた多孔質セラミックキューブを使用して、セラミックスの孔の内側の骨形成が、免疫適合宿主中で皮下インキュベーション後に生成された。
【０１０６】
本発明の単離されたヒト間葉幹細胞からの骨形成を刺激する（すなわち骨誘導性である）因子は：ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３のような骨形態発生タンパク質；塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような増殖因子；デキサメサゾンのような糖質コルチコイド；ならびにプロスタグランジンＥ１のようなプロスタグランジンを包含するいくつかの分類の分子により提供される。さらに、アスコルビン酸および（アスコルビン酸−２−リン酸のような）その類似物、ならびに（β−グリセロリン酸のような）グリセロールリン酸が、進行した分化についての有効な付属因子であるが、とは言え、単独でそれらは骨原性の分化を誘導しない。
【０１０７】
ヒトＭＳＣに対する軟骨誘導活性を有する因子は：（ｉ）ＴＧＦ−β．１、（ｉｉ）インヒビンＡ、（ｉｉｉ）軟骨原性刺激活性因子（ＣＳＡ）、および（ｉｖ）ＢＭＰ−４のような骨形態発生タンパク質、のようなトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリー内の化合物；とりわけゲルとしてのタイプＩコラーゲンを包含する膠質細胞外マトリックス分子；ならびにレチノイン酸のようなビタミンＡ類似物を包含するいくつかの分類の分子中にもまた存在する。
【０１０８】
ヒトＭＳＣに対する間質形成誘導活性を有する因子は、いくつかの分類の分子、とりわけＩＬ−１αおよびＩＬ−２のようなインターロイキン中にもまた存在する。
【０１０９】
ヒトＭＳＣに対する筋形成誘導活性を有する因子は、いくつかの分類の分子、とりわけ５−アザシチジンおよび５−アザ−２’−デオキシシチジンのようなシチジン類似物中にもまた存在する。
【０１１０】
ヒトＭＳＣに対するこれらの調節因子の影響は、ここで単に具体的に説明する例としてのみ開示される。本開示は、特定の系列への分化を誘導するための潜在的に有用な調節因子の包括的な表でなく、しかし単に、特定の経路に沿った哺乳動物の間葉幹細胞の分化の段階的発達を促進するための生物学的活性を示した多様な化合物を具体的に説明する。
成体幹細胞カテゴリー３：神経幹細胞およびそれらの子孫；それらの前駆細胞；それらの系列決定済み細胞ならびにそれらの部分的に分化した細胞
神経幹細胞は、胚および成体の生物体の多くの組織に存在する未決定（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）かつ未分化の細胞である。胚において、胞胚幹細胞は、発達中の胎児の特殊化された組織および器官を形成するよう分化する細胞の供給源である。成体においては、個別の組織中の特殊化された幹細胞が、天然の摩滅、疾患もしくは傷害による細胞死により失われる細胞を置き換える新たな細胞の供給源である。これらの幹細胞は、疾患、障害もしくは異常な身体状態が正常組織を破壊もしくはそれに損傷を与えている健康な組織を生じるための基礎として使用されるかもしれない。
哺乳動物起源の神経幹細胞
神経幹細胞（ＮＳＣ）は発育中のおよび成体の神経系中にさえ存在する原始の未決定細胞であり、そして成熟ＣＮＳのより特殊化された細胞の系列（ａｒｒａｙ）を生じさせる原因である。それらは、（ａ）複数の領域および発育の情況において全部の神経系列（理想的には複数のサブタイプのニューロン、乏突起膠細胞、大膠細胞）の細胞に分化する（すなわち多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）である）；（ｂ）自己再生する（すなわち類似の潜在能力をもつ新たなＮＳＣもまた生じさせる）；（ｃ）発達中かつ／もしくは変性中のＣＮＳ領域を占める、それらの能力により、機能上定義される。
【０１１１】
単一クローンの派生の明確な立証は定義に必須である。すなわち、単一の細胞がこれらの属性を所有しなければならない。幹細胞の特性をもつげっ歯類の神経細胞を培養物中で繁殖しかつ外来遺伝子を安定に発現することができるという最も早期の認識で、遺伝子治療者および回復神経生物学者は、治療上の利点ならびに細胞の発達の機構のより良好な理解のためにこうした細胞をどのように利用することができるかを考慮し始めた。
【０１１２】
神経幹細胞（ＮＳＣ）は、哺乳動物の胚、ヒト新生児および成体げっ歯類のＣＮＳから単離され；そして後成的（例えば上皮増殖因子もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子のような分裂促進剤で）；または遺伝的（例えばｖｍｙｃもしくはＳＶ４０ラージＴ抗原のような繁殖遺伝子で）の双方で、多様な有効かつ安全な手段によりインビトロで繁殖されている。こうしたＮＳＣを培地中で増殖状態で維持することは、移植後にインビボで正常な発達の刺激に応答する；もしくは宿主細胞と相互作用する；もしくは特定の表現型に適切に分化する、それらの能力を覆すようではない。これらの極めて可塑的なＮＳＣは、とりわけ胚領域への埋植後に脳全体に一時的かつ局部的に適切な様式で移動かつ分化する。位置されれば、それらは、中枢神経軸に沿った正常な発達に参画し、内因性の前駆細胞と非破壊的に混ざり、それらの表現型決定のための局所の微小環境の刺激に対して同様に応答し、そして多彩な神経および神経膠の細胞タイプに適切に分化する。加えて、ＮＳＣはインビボで外来遺伝子（レポーター遺伝子および治療遺伝子双方）を発現することができ、かつ、ニューロンおよび／もしくは神経膠の非存在もしくは変性の設定で特異的な神経細胞の置換が可能である。
【０１１３】
ＮＳＣの潜在能力における成長する興味は、成体幹細胞の他の状態（Ｏｒｄｅｒ）におけるものと同様であった。この興味は、ＮＳＣが、単に移植の理論的枠組みでの胎児組織の置換物、もしくは遺伝子送達のための単なる別のベヒクルでないという認識から生じる。少なくとも細胞の検査により示されるところの、それらの基礎的な生物学は、遺伝子治療および修復のための他のベヒクルが所有しない潜在能力をそれらに授けるようである。例えば、それらが移植後に神経構造に組込むかもしれないことは、字義どおりの細胞置換について同様に多様な遺伝子産物の調節された放出を見込むかもしれない（現在利用可能な遺伝子移入ベクターは、通常、実際には変性しておりかつ置換が必要かもしれない確立した神経回路により新たな遺伝情報を中継することに依存する一方、ＮＳＣはこれらの経路の再構成に参画することができる）。
【０１１４】
酵素および細胞の置換は、ＣＮＳの特異的な解剖学的に範囲を定められた領域にのみならず、しかしまた胚領域への埋植によりＣＮＳのより大きな領域にも標的を定められるかもしれない。ＮＣＳは血液脳関門を容易にかつ妨げられずに通過し、そしてそれらの外来遺伝子産物を直ちに、直接かつ散在された様式でＣＮＳに送達させる。加えて、ＮＳＣは神経変性に対し応答性であることができ、それらの分化の特質を不完全な細胞タイプについて補償するように移動させる。これらの特性の根底にある生物学は、実際的に価値があるのみならず、しかしまた、いくつかの基礎的な細胞発達機構も解明するかもしれない。
【０１１５】
公開された特許および学術文献は、ヒトおよび他の哺乳動物の神経幹細胞、それらの子孫の前駆細胞、ならびにそれらの系列決定済みの子孫の細胞に関する知識および情報の豊富な基礎を提供することが、注目されかつ真価を認められることができる。ある範囲の哺乳動物の供給源から得られる神経幹細胞の同定および特徴づけは、それぞれ、米国特許第５，８４９，５５３号；同第５，９２８，９４７号；同第５，９５８，７６７号；同第５，９６８，８２９号；および同第６，１０３，５３０号明細書により提供される。神経幹細胞およびそれらの子孫の細胞の多様な単離、精製およびインビトロの維持方法は、米国特許第５，８５１，８３２号；同第５，７５０，３７６号；同第５，７５３，５０６号；同第５，９５８，７６７号；同第５，４１１，８８３号；同第５，０８２，６７０号；同第６，１０３，５３０号；および同第６，１７１，６１０号明細書内に記述される。一細胞系列への決定を意図的に誘導するため、および特定の種類の細胞になることへの子孫の細胞の分化を指図するための特定の技術および方法は、米国特許第５，９８０，８８５号；同第５，９８１，１６５号；同第６，００１，６５４号；同第６，０３３，９０６号；同第６，０７１，８８９号；同第６，２３８，９２２号；および同第６，３４０，６６８号明細書により提供される。これらの交付された米国特許のそれぞれは、明らかに、引用することにより本明細書に組み込まれる。
系列決定済み細胞および部分的に分化した細胞
ＮＳＣは、インビトロで反復して継代することができ、かつ、外胚葉および中胚葉組織の派生物を包含する身体の多数の細胞タイプに分化したようになることができる、多能性かつ自己新生性の細胞である。ＮＳＣは、ネスチンタンパク質（幹細胞および前駆細胞の免疫学的マーカー）ならびにフィブロネクチンタンパク質について陽性であるが；しかし、免疫組織化学によりアッセイされる場合に、ビメンチンもしくはサイトケラチンについて陰性である。さらに、ＮＳＣは、インビトロで培養される場合に非接着性クラスターとして成長させることができ；そして、当業者は、こうした細胞が、限定されるものでないが被覆されないプラスチックまたはゼラチンもしくはアガーのような中性支持体で被覆されたプラスチックを挙げることができる多様な基層上で培養される場合に非接着性クラスターとして成長することができることを認識するであろう。ＮＳＣはまた神経冠幹細胞マーカーｐ７５についても陰性である。表現型の特徴における差異は、従って、造血幹細胞、間葉幹細胞および神経冠幹細胞を包含する他のタイプの成体幹細胞とＮＳＣを区別する。
【０１１６】
ある条件下で、ＮＳＣの系列決定済みの子孫は、ドーパミン作動性ニューロンとして分化することが可能であり、そして、従って、ドーパミン作動性ニューロンの有用な供給源である。ＮＳＣの子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）細胞はまた、平滑筋細胞、脂肪細胞および骨を包含するいくつかの中胚葉の派生物の細胞タイプを作成することも立証されている。ＮＳＣは、心筋細胞、膵島細胞（例えばα、β、φ、δ細胞）、造血細胞、肝細胞などを包含する、他の中胚葉および外胚葉タイプの分化した細胞を生じることが可能であると考えられている。
【０１１７】
同様に、ＮＳＣの系列決定済み細胞は、ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞、シュヴァン細胞もしくは非神経細胞として完全に分化することができる。いくつかの分化した形態のニューロンは、ドーパミン、ＧＡＢＡ、グリシン、アセチルコリン、グルタミン酸およびセロトニンのような１種もしくはそれ以上の神経伝達物質を発現するニューロンを包含する。比較において、いくつかの分化した形態の非神経細胞は、心筋細胞、膵細胞（例えば島細胞（α、β、φおよびδ細胞））、外分泌細胞、内分泌細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、造血細胞および脂肪細胞として存在する。
【０１１８】
完全に分化した場合、子孫の細胞の大部分はそれらのネスチン陽性の免疫反応性を喪失する。とりわけ、多様なニューロンもしくは神経膠タンパク質に特異的な抗体を使用して、完全に分化した細胞の表現型の特性が同定されるかもしれない。ニューロンは、ニューロン特異的エノラーゼ（「ＮＳＥ」）、神経細糸、τ、ｂ−チューブリン、もしくは他の既知のニューロンマーカーに対する抗体を使用して同定されるかもしれない。星状細胞は、神経膠線維酸性タンパク質（「ＧＦＡＰ」）もしくは他の既知の星状細胞マーカーに対する抗体を使用して同定されるかもしれない。乏突起膠細胞は、ガラクトセレブロシド、Ｏ４、ミエリン塩基性タンパク質（「ＭＢＰ」）もしくは他の既知の乏突起膠細胞マーカーに対する抗体を使用して同定されるかもしれない。
【０１１９】
それらの表現型により特徴的に産生される化合物を同定することにより、細胞の表現型を同定することもまた可能である。例えば、アセチルコリン、ドーパミン、エピネフリン、ノルエピネフリンなどのような神経伝達物質の産生によりニューロンを同定することが可能である。
【０１２０】
特定のニューロンの表現型は、それらのニューロンにより産生される特定の産物に従って同定することができる。例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）もしくはＧＡＢＡのそれらの産生により同定されるかもしれない。ドーパミン作動性ニューロンは、ドーパデカルボキシラーゼ（「ＤＤＣ」）、ドーパミンもしくはチロシン加水分解酵素（「ＴＨ」）のそれらの産生により同定されるかもしれない。コリン作動性ニューロンは、コリンアセチルトランスフェラーゼ（「ＣｈＡＴ」）のそれらの産生により同定されるかもしれない。海馬ニューロンは、ＮｅｕＮで染色することにより同定されるかもしれない。特定のニューロンの表現型を同定するためのいずれかの適する既知のマーカーを使用してよいことが、真価を認められるであろう。
遺伝子的に改変された細胞
加えて、本明細書に記述されるヒトもしくは他の哺乳動物の神経幹細胞は、既知の方法論に従って遺伝子的に工作もしくは改変することができる。目的のいかなる遺伝子（すなわち、生物学的に活性の分子をコードする遺伝子）も、標準的技術を使用することにより適する発現ベクターのクローニング部位に挿入することができる。これらの技術は当業者に公知である。例えば、第ＷＯ ９４／１６７１８号明細書（その本文は引用することにより明らかに本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１２１】
その後、目的の遺伝子を含有する発現ベクターを使用して、所望の細胞系をトランスフェクトしてよい。リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、電気穿孔法、バイオリティックス（ｂｉｏｌｉｔｉｃｓ）もしくはウイルストランスフェクションのような標準的トランスフェクション技術を利用してよい。商業的に入手可能な哺乳動物トランスフェクションキットは、例えばストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から購入してよい。ヒトアデノウイルストランスフェクションは、Ｂｅｒｇら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９２：（１９９１）に記述されるとおり達成してよい。同様に、リポフェクトミンに基づくトランスフェクションは、Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．４２：１６１−６６（１９９６）に記述されるとおり達成してよい。
【０１２２】
広範な宿主／発現ベクターの組合せを使用して、目的の生物学的に活性の分子をコードする遺伝子を発現してよい。適する細胞に基づく産生の発現ベクターについては、米国特許第５，５４５，７２３号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１２３】
生物学的に活性の分子の増大された発現は、当該技術分野で公知の増幅方法を使用してトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）のコピー数を増大もしくは増幅することにより達成することができる。こうした増幅方法は、例えば、ＤＨＦＲ増幅（米国特許第４，４７０，４６１号明細書を参照されたい）もしくはグルタミン合成酵素（「ＧＳ」）増幅（米国特許第５，１２２，４６４号明細書および欧州公開特許出願第ＥＰ ３３８，８４１号明細書（それらの全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を包含する。
【０１２４】
本明細書に記述される神経幹細胞、およびそれらの分化した子孫は、既知の技術、好ましくは幹細胞の条件不死化（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）、および最も好ましくはそれらの分化した子孫の条件不死化を使用して、不死化もしくは条件的に不死化してもまたよい。企図される条件不死化技術は、Ｔｅｔ条件不死化（第ＷＯ ９６／３１２４２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、およびＭｘ−１条件不死化（第ＷＯ ９６／０２６４６号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）などである。
成体幹細胞カテゴリー４：神経冠幹細胞およびそれらの子孫；それらの前駆細胞、それらの系列決定済み細胞ならびにそれらの部分的に分化した細胞。
【０１２５】
神経冠幹細胞は、脊椎動物の神経冠組織内で発しかつその一部を構成する。順に、脊椎動物の胚の神経冠は、末梢神経系（ＰＮＳ）および自律神経系（ＡＮＳ）を形成する細胞の主供給源としてはたらく。神経冠それ自身は、神経原基自律神経系の外側稜から生じる一時的胚構造であり；そして交感神経副腎系列を包含する複数の系列に発達する。
【０１２６】
神経冠から生じている交感神経副腎系列は、主として、副腎および交感ニューロンのクロム親和性細胞を生じさせる。これら２種の細胞タイプは多数のレベルで識別することができる。クロム親和性細胞は有意の突起を伴わない小型の細胞であり、そしてそれらは主としてカテコールアミン、エピネフリンを循環中に分泌する。交感ニューロンは、それぞれシナプス結合を受領しかつ送る樹状および軸索突起を伴うずっとより大型の細胞である。これらのニューロンは主としてノルエピネフリン（カテコールアミン化合物）を分泌する。双方の細胞タイプはそれらの神経伝達物質およびニューロペプチドを小胞中に保存する一方、クロム親和性小胞は直径が約１５０〜３５０ｎｍであり、一方、神経シナプス小胞は直径がわずか約５０ｎｍである。小型強度蛍光（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｎｓｅｌｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）（ＳＩＦ）細胞として知られるこの系列の細胞の第三の見かけ上小さな集団は、特徴がニューロンとクロム親和性細胞との間のいくぶん中間であり、そして直径が７５〜１２０ｎｍの小胞を有する。
【０１２７】
これらの化学的および形態学的特徴に加え、クロム親和性細胞および交感ニューロンは、特異的な細胞骨格、小胞および表面タンパク質をコードする遺伝子；ならびにフェニル−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（クロム親和性細胞特異的である）のような神経伝達物質合成酵素のような多数の分子マーカーにより識別することができる。これらのマーカーは、分化の中間段階の同定、ならびに交感神経副腎前駆細胞の同定および単離の双方で有用と判明している。
【０１２８】
多能性神経冠細胞が交感神経副腎系列に決定済みになる段階は十分に理解されていない。ニューロンもしくはクロム親和性細胞に似ているカテコールアミン産生細胞が、神経冠細胞の培養物中で観察されているが、しかし、これらの可能な交感神経副腎前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）は、さらなる研究のために未だ単離されていない。しかしながら、少なくとも二能性である（クロム親和性細胞もしくは交感ニューロンのいずれかを生じさせる）決定済み交感神経副腎前駆細胞は、胚副腎髄質ならびに胚および新生ラット交感神経節から単離されている。胚前駆細胞は、いくつかの表面膜抗原を使用して、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により単離することができる。細胞培養物中で、これらの前駆細胞は、細胞タイプ特異的抗原もしくは遺伝子、ならびに適切な形態学および超構造を表すニューロンもしくはクロム親和性細胞になるように誘導することができる。
【０１２９】
交感神経副腎系列の系のより詳述された情報、経験的証拠および総説について、読者は、適切かつ代表的刊行物の以下の一覧、すなわちＰａｔｔｅｒｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ６２：１０３５−１０３８（１９９０）；Ｓｔｅｍｐｌｅ，Ｄ．Ｌ．とＤ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：１２９−１５８（１９９３）；Ｌｅ Ｄｏｕａｒｉｎ，Ｎ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：１５１５−１５２２（１９８６）；Ｋｉｍら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２２：５０−５９（１９８９）；Ｌｏら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４５：１３９−１５３（１９９１）；Ｊｅｓｓｅｎら，Ｎｅｕｒｏｎ １２：５０９−５２７（１９９４）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３：８−１３（１９９３）；およびこれらの刊行物のそれぞれ内で引用される参考文献に向けられる。
【０１３０】
トリ胚もまた、神経冠幹細胞の子孫の系列パターン形成のインビボおよびインビトロの実験的研究を介してかなりの情報を提供している。神経冠細胞のトリ系列の分析のより詳述された情報、経験的データおよび総説について、読者は、以下の代表的刊行物、すなわち、Ｌｅ Ｄｏｕａｒｉｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：２４−４９（１９９３）；Ｎ．Ｍ．Ｌｅ Ｄｏｕａｒｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２８６：６６３−６６９（１９８０）；Ｎ．Ｍ．Ｌｅ Ｄｏｕａｒｉｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｒｅｓｔ，ケンブリッジ大学出版局（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、英国ケンブリッジ、１９８２；Ｓｉｅｂｅｒ−Ｂｌｕｍら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８０：９６−１０６（１９８０）；Ｂａｒｏｆｆｉｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５３２５−５３２９（１９８８）；Ｂｒｏｎｎｅｒ−Ｆｒａｓｅｒら，Ｎｅｕｒｏｎ ３：７５５−７６６（１９８９）；Ｃｏｈｅｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４６：２６２−２８０（１９７５）；Ｄｕｐｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１１１９−１１２３（１９９０）；Ｄｕｆｆら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４７：４５１−４５９（１９９１）；Ｂｒｏｎｎｅｒ−Ｆｒａｓｉｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：１６１−１６４（１９８８）に向けられる。
哺乳動物神経冠幹細胞
今日までの神経冠幹細胞の単離および特徴づけは、哺乳動物の神経冠に由来するニューロンおよび神経膠の「幹細胞」を探究、単離および描写するための進行中の努力の結果である。このアプローチの最も具体的な説明は、下に同定されるＤ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎらの学術刊行物および交付された米国特許である。主要部において、これらの刊行物は、細胞表面抗原に対する抗体を使用して哺乳動物の神経冠細胞（主としてラットおよびマウス細胞）を同定し；かつ、サブクローニングを使用して、これらの細胞およびそれらの子孫の発達の潜在性を検査した。
【０１３１】
３つの主要な知見が彼らの分析から現れる。第一に、哺乳動物の神経冠幹細胞は多分化能性細胞である。第二に、多能性神経冠幹細胞は多分化能性の子孫を生成し、これらの子孫が、自己新生が可能でありそして従って幹細胞でもまたあることを示す。第三に、神経冠幹細胞は、ニューロンもしくは神経膠のみを形成する若干の子孫細胞もまた生成し、これらの幹細胞がついには系列決定済み神経芽細胞および膠芽細胞を生じることを示す。経験的データもまた、インビボの神経冠幹細胞が生存哺乳動物中に存在し；それらが増殖を継続するようにそれらの多分化能性を維持すること；および、系列決定済み経路の選択が決定済み芽細胞の生成を介して発達中の神経節内で起こることを示す。
【０１３２】
これらの知見を報告かつ支持する関連する学術刊行物は：Ｄ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｅｕｒｏｎ ３：１−１２（１９８９）；Ｄ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：１２９−１５８（１９９３）；Ｓｔｅｍｐｌｅ，Ｄ．Ｌ．とＤ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：３５０７−３５１９（１９９１）；Ａｎｄｅｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．とＲ．Ａｘｅｌ，Ｃｅｌｌ ４２：６４９−６６２（１９８５）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．とＲ．Ａｘｅｌ，Ｃｅｌｌ ４７：１０７９−１０９０（１９８６）；Ｓｈａｈら，Ｃｅｌｌ ８５；３３１−３４３（１９９６）；Ｌｏら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４５：１３９−１５３（１９９１）などである。
【０１３３】
読者はまた、さらなる情報および手引きについていくつかの交付された米国特許にも向けられる。これらは、米国特許第６，００１，６５４号；同第５，９２８，９４７号；同第５，８４９，５５３号；同第５，６９３，４８２号；同第５，８２４，４８９号；同第５，６５４，１８３号；および同第５，５８９，３７６号明細書である。全部のこれらの交付された米国特許の本文は、個別にかつ集合的に、引用することによりはっきりと本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
ヒト神経冠幹細胞、その単離、インビトロの維持および表現型の特徴づけは、Ｓｅｕｎｇ Ｕ．Ｋｉｍらにより完全に記述され；また、ヒト神経冠幹細胞の安定なクローンが調製かつ徹底的に特徴づけされている。例えば：Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ，ヒューマナ プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州トトワ、２００２中“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ Ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ Ｃｒｅｓｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ”；およびＰＣＴ公開第ＷＯ− 号明細書を参照されたい。
【０１３５】
ヒト神経冠幹のマーカーの表現型の範囲を特徴づけるために、代表的な同定する抗原の表を下の表２により提供する。
【０１３６】
【表５】
Figure 2004532202
【０１３７】
【表６】
Figure 2004532202
【０１３８】
系列決定済み細胞および部分的に分化した細胞
ヒト神経冠細胞およびそれらの前駆細胞の子孫の細胞は、インビトロで培養される場合に少なくとも４つの異なる経路系列に決定されることができ；それらは、順に、多様な部分的に分化した細胞、およびその後終末的に分化した細胞をもたらしかつ生じることができる。これらの経路系列は：神経細胞系；神経膠細胞系；副腎クロム親和性細胞系；および骨格筋細胞系である。
【０１３９】
多様な異なる免疫学的および組織化学的マーカーが、発表された学術文献で同定されており、それは、それにより細胞系列の発達の多様な可能な選択を分離かつ識別するために信頼できる表面抗原の表現型を提供する。特定の細胞系列経路の同定するマーカーの範囲を、下のそれぞれ表３〜６により記述する。
【０１４０】
【表７】
Figure 2004532202
【０１４１】
【表８】
Figure 2004532202
【０１４２】
【表９】
Figure 2004532202
【０１４３】
【表１０】
Figure 2004532202
【０１４４】
Ｖ．実験的および経験的データ
本発明の利点および価値を立証するために、一連の計画された実験および経験的データを下に提示する。しかしながら、記述される実験および提供される結果は、単に、全体として本発明である主題の最良の証拠であること；ならびに、経験的データは、内容および設計において制限される一方、予見されかつ特許請求される本発明の範囲を、ただ具体的に説明しかつ代表するだけであることが明らかに理解されよう。
一連の実験Ｉ
生物医科学のかなりの進歩にもかかわらず、心不全の発生率は心筋梗塞（ＭＩ）後の患者で高いままである。この実験的研究は、梗塞心の機能に対する、血管内皮増殖因子のｃＤＮＡ（ｐｈＶＥＧＦ１６５）のトランスフェクションを伴うもしくは伴わない胚幹細胞（ＥＳＣ）の心筋内移植の影響を検討した。
背景：
心筋梗塞（ＭＩ）後、死亡心筋層は非収縮性の線維瘢痕により置換され、これは心室機能不全につながる。かなりの進歩が過去数十年に心疾患の診断および治療でなされたが、しかし、心不全に対する効果的療法は臨床家にとって大きな挑戦のままである。心不全の罹患率および死亡率は先進諸国で有意により高い。梗塞心筋層における内在性心筋細胞の制限された増殖が報告されているが、しかし、虚血による哺乳動物の心筋細胞の多量の喪失は、残存する筋細胞により再生されない。
【０１４５】
胚幹細胞（ＥＳＣ）由来の心筋原細胞は、ドナー心筋細胞の実現可能な供給源となることができる。マウス埋植前芽細胞の内細胞塊由来のＥＳＣは多分化能性細胞であり、そして自発収縮性心筋細胞を包含する多数の細胞タイプにインビトロで分化する能力を保持する。加えて、心筋原細胞へのＥＳＣの分化は、心α−およびβ−ミオシンＨ鎖、α−トロポミオシン、ホスホランバンならびにタイプＢナトリウム排泄増加因子を包含する、多数の心および筋特異的収縮性タンパク質の発現により付随される。分化するマウスＥＳＣからの培養された心筋細胞の移植が安定な心内移植片を形成したこともまた示されている。従って、ＥＳＣの移植は、傷害された心筋層を修復しかつ心機能を改善する新たな心筋細胞を生じさせるかもしれない。
【０１４６】
内皮の最も重要な増殖および生存因子の１つは血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）である。ＶＥＧＦは脈管形成および内皮細胞増殖を誘導し、また、脈管形成の調節において重要な役割を演じる。ＶＥＧＦは４５ｋＤａのホモ二量体として分泌されるヘパリン結合糖タンパク質である。新たな血管の発生、もしくは脈管形成は、親血管内皮細胞の活性化で開始する。主要動脈閉塞の場合、虚血組織への血流はしばしば側副血管に依存する。ＶＥＧＦが虚血領域中の側副血流を改善すること；および、より最近、ｐｈＶＥＧＦ１６５の直接注入単独が、心筋虚血を伴う患者における心筋の血液灌流を改善したことが、インビボおよび患者で立証されている。
【０１４７】
本一連の実験Ｉは、従って、移植されたＥＳＣが、ＭＩマウスにおいて傷害された心筋層で生き残りかつ心機能を改善することができたかどうかを評価するよう設計された。加えて、該実験は、ＶＥＧＦの過剰発現を伴うＥＳＣの移植が、ＭＩマウスにおける心機能の改善に対するより大きな効果を生じさせたかどうかを決定した。ＥＳＣ単独、もしくはＶＥＧＦの過剰発現を伴うＥＳＣの移植の、虚血心筋層における血管新生に対する影響もまた評価かつ比較した。
材料および方法：
胚幹細胞および前駆細胞の子孫の細胞の培養
マウス細胞系ＥＳ−Ｄ３をアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から得、そして有糸分裂的に不活性のマウス胚線維芽細胞フィーダー細胞（ＡＴＣＣ）上、ＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で維持した。培地は、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび１０３単位／ｍｌの白血病阻害因子（ＬＩＦ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）を補充した。分化を開始させるために、ＥＳＣおよびそれらの前駆細胞の子孫の細胞をトリプシンで分散させ、そして補充するＬＩＦを含まない培地に再懸濁し；そして、Ｗｏｂｕｓら［Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４８：１７７−１８２（１９９１）］の技術を使用して２日間懸滴（２０μｌあたりおよそ４００個の細胞）法で培養した。生じる胚様体を懸滴から１００ｍｍ皿に移し、そして別の５日間培養した。拍動する心筋形成クラスター（系列決定済みのしかし未分化の子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ））を滅菌マイクロピペットの使用［Ｍａｌｔｓｅｒら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．１９１：４２−５０（１９９３）］によりばらばらにし；そして細胞を１００ｍｍ培養皿に培養した。活動電位を、培養された心様幹細胞中で、電流クランプ技術［Ｘｉａｏ，Ｙ．Ｆ．とＪ．Ｐ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８４：１０−１８（１９９８）］により記録し、また、細胞短縮（ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）を縁検出法（ｅｄｇｅ−ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）［Ｘｉａｏら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ）５０８：７７７−７９２（１９９８）］により測定した。
緑色蛍光タンパク質遺伝子のトランスフェクション
細胞移植前に、ＥＳＣを、埋植された細胞の生存を同定するために緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｃＤＮＡでトランスフェクトした。緑色蛍光タンパク質遺伝子を駆動するｈＣＭＶＩＥプロモーター／エンハンサーを含むプラスミド（５．７ｋｂ）、およびＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲＴＭトランスフェクション試薬はジーン セラピー システム インク（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．）（ＧＴＳ Ｉｎｃ．，カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。簡潔には、ＥＳＣを１００ｍｍ皿にプレーティングし、そしてトランスフェクションの日に６０％コンフルエントまで培養した。プラスミドＧＦＰ ＤＮＡ（８μｇ）を、リン酸カルシウム沈殿法［Ｘｉａｏら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７９：Ｈ３５−Ｈ４６（２０００）］を用いて各皿に添加した。ＧＦＰトランスフェクションの２日後に、培養されたＥＳＣをトリプシン処理し、そしてＪｏｋｌｉｋ改変培地（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）に１０７個の細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。安定なＧＦＰ発現が、培養された細胞中で８週間検出された。
プラスミドＶＥＧＦ ＤＮＡ（ｐｈＶＥＧＦ１６５）のトランスフェクション
ＶＥＧＦ ＤＮＡ（ｐｈＶＥＧＦ１６５）のプラスミドは、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｗａｌｓｈ博士（セント エリザベス メディカル センター（Ｓｔ．Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）、タフツ大学医学部、マサチューセッツ州ボストン）からの寛大な贈物であった。それは、ＶＥＧＦ発現を駆動するために７３６ｂｐのＣＭＶプロモーター／エンハンサーを使用する真核生物発現プラスミドである［Ｌｅｕｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３０６−１３０９（１９８９）］。６０〜８０％コンフルエントなＥＳＣを、製造元のプロトコル（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）に従って、１００ｍｍ皿あたり８μｇのｐｈＶＥＧＦ１６５でトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後にトリプシン処理し、そして移植のためＪｏｋｌｉｋ改変培地に再懸濁した。培養されたＥＳＣ中でのＶＥＧＦの過剰発現が免疫蛍光アッセイにより観察された。簡潔には、ｐｈＶＥＧＦ１６５のトランスフェクション４８時間後に、ＥＳＣをリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そしてその後４％パラホルムアルデヒド中で固定した。ウサギ抗ヒトＶＥＧＦ抗体（サンタ クルズ バイオテクノロジー インク（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ）、カリフォルニア州サンタクルズ）を使用してＥＳＣとともにインキュベートした。フルオレセイン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ピアース ケミカル カンパニー（Ｐｉｅｒｅｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イリノイ州ロックフォード）が、蛍光を試験するための二次抗体としてであった。Ｌｅｕｎｇらの方法を用いるＶＥＧＦのウェスタンブロット分析もまた、ＶＥＧＦでトランスフェクトされたＥＳＣにおける有意の増大を示した。
ＭＩの動物モデルおよびＥＳＣの移植
実験は、８〜１２週齢（２４〜３５ｇ体重）の雄性ＦＶＢマウス（チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、マサチューセッツ州ウィルミントン）で実施した。心筋梗塞は、以前に記述された［Ｍｉｃｈａｅｌら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９：Ｈ２１４７−Ｈ２１５４（１９９５）］ところの左前下行冠動脈の結紮により誘導した。簡潔には、動物を４０μｇ体重のペントバルビタールナトリウムの腹腔内注入により麻酔した。正中線頚部皮膚切開を行い、そして気管内チューブを気管中に配置した。第四と第五肋骨との間の側方切開を行って胸部を開放した。げっ歯類呼吸装置（ハーバード アパラトゥス インク（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｃ）、マサチューセッツ州ホリストン）を気管内チューブに接続して、胸部を開放した後の動物の呼吸を維持した。心を、左主冠動脈系をより良好に露出するように向けた。６−０絹縫合糸で進められた結紮を、左冠動脈の左前下行枝の下（正常に位置された左心耳の先端の２ｍｍ下）に、テーパー付き針で進めた。ＥＳＣ懸濁物（３０μｌ中３×１０５個）を、ＭＩ誘導１０ないし１５分後に虚血心筋層中に別個に注入した。別のＭＩ群は、ＶＥＧＦの過剰発現を伴う同一量の細胞を移植した。対照ＭＩ動物は同一のＭＩ手術を受領したが、しかし同等容量の細胞を含まない培地を注入されたのみであった。偽群は、冠動脈の結紮も細胞移植も伴わない同一の外科手術を受けた。実験プロトコルは、ベス イスラエス ディーコネス メディカル センター（Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）の動物管理委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認され、そして米国保健研究所（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により発表された実験動物の管理および使用に関する手引き（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（ＮＩＨ刊行物番号８５−２３、１９９６年改訂）に従って実施した。
血行動態および等尺収縮の測定
ＭＩ手術および細胞移植６週間後に、インビボでの血行動態測定を、以前に記述された［Ｇａｏら，Ｃａｒｄｉｏｖａｃ．Ｒｅｓ．４５：３３０−３３８（２０００）］方法を用いて実施した。測定後に、心を、殺されたマウスから迅速に取り出した。左室乳頭筋細片を切断し、そして列ゲージ（ｔｒａｉｎ−ｇａｕｇｅ）張力変換器に垂直に接続した。筋細片の発生された張力（ＤＴ）をそれらの最大長さで記録した。浴溶液は、改変クレブス−ヘンゼライト溶液および多様な濃度のイソプロテレノール（１０−６、１０−５および１０−４Ｍ）を含有した。ＭＩ心からの切断された心室乳頭筋のβ−アドレナリン作動性刺激に対する変力応答を、ＭＩ対照および細胞移植されたＭＩマウスで評価した。
組織学的および免疫蛍光分析
動物のサブセットをＭＩ誘導の６週間後に殺した。心を迅速に取り出した後に、梗塞および梗塞周囲の領域を包含する左室の自由壁を、組織凍結媒体（フィッシャー サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ニュージャージー州フェアローン）に埋めた。凍結された組織を１０μｍのスライドに薄片に切り、そしてヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）で染色した。移植された細胞の生存は、蛍光顕微鏡検査下でのＧＦＰ陽性の点の同定により確認した。
【０１４８】
移植されたＥＳＣからの再生された筋細胞を同定するために、われわれは免疫蛍光技術を使用して、心筋層の構造マーカーの２つすなわち心トロポニン−Ｉ（ｃＴｎ−Ｉ）およびａ−ミオシンＨ鎖（α−ＭＨＣ）を検出した。凍結された組織切片をアセトン中で１０分間固定し、そしてその後風乾した。非特異的結合は、ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン中でのインキュベーションにより封鎖した。その後、サンプルを、抗トロポニン−Ｉ抗体（ヤギポリクローナルＩｇＧ、サンタ クルズ バイオテクノロジー インク（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ）、カリフォルニア州サンタクルズ）、もしくはマウス抗α−ＭＨＣモノクローナル抗体（バークリー アンティボディ カンパニー（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）、カリフォルニア州リッチモンド）と１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後に、切片を、ｃＴｎ−Ｉについてウサギ抗ヤギローダミン結合ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、もしくはα−ＭＨＣについてヤギ抗マウスフルオレセイン結合ＩｇＧ（ピアース ケミカル カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イリノイ州ロックフォード）とともにインキュベートした。ｃＴｎ−Ｉおよびα−ＭＨＣについての蛍光免疫染色を、蛍光顕微鏡検査下で検査しかつ写真撮影した。
【０１４９】
ＧＦＰ（ザイメッド ラブ インク（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂ，Ｉｎｃ）、カリフォルニア州サンフランシスコ）およびコネキシン４３（ＣＸ−４３、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）についての二重染色を、心筋の凍結された切片でマウス抗ＧＦＰおよびウサギ抗ＣＸ−４３抗体を用いて実施して、細胞移植された心筋層中でのギャップ結合の形成を確認した。ＧＦＰ標識はＦＩＴＣに結合されたヤギ抗マウス抗体（ピアース ケミカル カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イリノイ州ロックフォード）で検出した。ＣＸ−４３標識は、テキサスレッドに結合されたヤギ抗ウサギ抗体（ベクター ラブ インク（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ，Ｉｎｃ）、カリフォルニア州バーリンゲーム）で検出した。共焦点顕微鏡検査を適用して、ＧＦＰおよびＣＸ−４３を認識する抗体での傷害された心筋層中の移植された細胞の免疫蛍光標識を分析した。
脈管形成の評価
毛細血管の密度を、ＥＳＣ移植を伴うもしくは伴わない傷害されたＨＥ染色心筋層で検査した。２０μｍ未満の毛細血管の数を、全群の虚血領域で計数した。各切片を、５個の高倍率野（×４００拡大倍率）で無作為に検出し、そして、各顕微鏡検査野中の毛細血管の数を、単位面積（０．２ｍｍ２）あたりの血管の平均として提示した。加えて、われわれはまた、抗フォン−ウィルブランド因子（ｖＷＦ、ダコー（ＤＡＫＯ）ＬＳＡＢキット、ダコー コーポレーション（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ）、カリフォルニア州カーピンテリア）抗体による血管内皮細胞の免疫組織化学的染色を使用して、梗塞心筋層中のＥＳＣに誘導される脈管形成も評価した。アセトン中で組織固定後に、凍結された切片を３％過酸化水素で５分間処理し、そしてその後ウサギ抗ヒトｖＷＦ ＩｇＧとともにインキュベートした。ＰＢＳ洗浄後に、切片をビオチニル化連結抗体と連結し、そしてストレプトアビジンで標識した。混合された基質−色原体溶液を使用して切片とインキュベートした。最後に、切片をヘマトキシリンで２分間染色した。像をＳｐｏｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン２．１、ディアグノスティック インストゥルメンツ インク（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ）、ミネソタ州スターリングハイツ）で捕捉した。
データ分析
平均されたデータは平均±ＳＥとして表す。二群間の統計学的有意差は両側もしくは片側のスチューデントのｔ検定により決定した。２以上の実験群についての結果は、反復された測定を伴う一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）により評価して、群間の差異を特定した。０．０５未満のＰ値は有意差とみなした。
経験的結果：
実験１：ＥＳＣの分化
自発的に拍動する細胞が、馴化培地からのＩＬＦの使用中止の９ないし１４日後に、培養されたＥＳＣで観察された。ＥＳＣ由来の心筋細胞から記録された活動電位をそれぞれ図１Ａ−１Ｃにより示す。
【０１５０】
ＥＳＣは、培養された培地からのＬＩＦの使用中止後約１０日間培養した。自発的活動電位は、図１Ａにより示されるところの代表的な拍動する細胞中で、ゼロ電流クランプ法を用いて観察した。電気刺激された活動電位が、図１Ｂにより示されるとおり、電流クランプ法により膜電位を脱分極した後に、ＥＳＣ細胞中で導き出された。最後に、図１Ｃは、縁検出法による培養されたＥＳＣ中での細胞外Ｃａ２＋濃度の変化に対する細胞短縮および自発性拍動の応答を示す。
【０１５１】
従って、該データは、拍動する細胞のいくつかがゼロ電流クランプ技術により記録される自発的活動電位を有した（図１Ａ）一方；他者のいくつかは自発的活動電位を有しなかったが、しかし電気的刺激後に活動電位を導き出した（図１Ｂ）ことを示す。また、該データは、細胞外Ｃａ２＋濃度の増大が、培養されたマウスＥＳＣからの分化した細胞中での自発的収縮の速度および細胞短縮の大きさを高めたことも示す（図１Ｃ）。これらの結果は、培養物中で約１０日後に、ＥＳＣが、ＬＩＦの非存在下で少なくともそれらの一部が自発性に拍動する心様細胞に分化することが可能であることを立証する。
実験２：ＥＳＣ移植後の心筋収縮性の改善
ＭＩ誘導の６週間後、血行動態の測定は、細胞を含まない培地を注入されたＭＩマウスが、偽手術されたマウスでのものより低いＬＶ収縮期圧（ＬＶＳＰ、Ｐ＜０．０１）、より高いＬＶ拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ、Ｐ＜０．０１）、およびＬＶ収縮期圧のピークに達するより遅い速度（＋ｄＰ／ｄｔ、Ｐ＜０．０１）を有したことを示した（表Ｅ１を参照されたい）。しかしながら、ＥＳＣの埋植は、ＭＩ誘導および細胞移植後６週間の左室機能を有意に改善した。ＬＶＳＰ、ＬＶＥＤＰおよび＋ｄＰ／ｄｔのパラメータにより反映される心筋収縮性は、細胞を移植されたマウスで有意に増大した（Ｐ＜０．０５、対ＭＩ対照）。これは図２Ａ−２Ｃにより示される。
【０１５２】
図２は、ＭＩマウスにおける血行動態の測定の元の軌跡を示す。図２Ａは偽手術された対照を表し；図２Ｂは細胞を含まない培地の注入を伴うＭＩ対照を表し；そして図２ＣはＥＳＣの心筋内移植を伴うＭＩを表す。測定はＭＩ誘導および細胞移植の６週間後に実施した。ＬＶＰ、左室圧；ｄＰ／ｄｔ、左室圧変化の速度。
【０１５３】
【表１１】
Figure 2004532202
【０１５４】
経験的データはまた、単離された乳頭筋でのβ−アドレナリン作動性刺激に対する変力応答も示した。これは図３により具体的に説明される。イソプロテレノール刺激に対する発生される張力の増大が、偽手術されたマウス（偽、 、ｎ＝８）から単離された乳頭筋で観察された。しかしながら、イソプロテレノール刺激されたに対する陽性の等尺応答がＭＩ＋培地群（ 、ｎ＝７）で鈍らされた。対照的に、β−アドレナリン作動性刺激に対する発生される張力は、ＥＳＣを移植された梗塞後マウスから単離された乳頭筋（ＭＩ＋ＥＳＣ、 、ｎ＝８）で有意に保存された。データは平均±ＳＥとして表す。*、Ｐ＜０．０５、対偽；＃、Ｐ＜０．０５、対ＭＩ＋培地。
【０１５５】
これらの結果は、単離された乳頭筋の発生される張力が、偽手術されたマウス、および細胞移植を伴うもしくは伴わないＭＩマウスについて基礎で同様であったことを立証した（図３、基礎を参照されたい）。異なる濃度のイソプロテレノールでのβ−アドレナリン作動性刺激は、偽手術されたマウスから単離された乳頭筋の発生される張力を有意に増大させた（図３、偽）。対照的に、細胞を含まない培地の心筋内注入を伴うＭＩマウスから単離された乳頭筋は、β−アドレナリン作動性刺激に十分に応答しなかった（図３、ＭＩ＋培地）。しかしながら、ＥＳＣを移植されたＭＩマウスから単離された乳頭筋は、とりわけ１０−４Ｍのβ−アドレナリン作動性アゴニスト（Ｐ＜０．０５、対ＭＩ＋培地）で、イソプロテレノールの刺激に顕著に応答した（図３、ＭＩ＋ＥＳＣ）。この結果は、ＥＳＣの心筋内移植が、左室乳頭筋の収縮性を部分的に保存したことを示す。
実験３：組織学的分析
ＭＩ誘導および細胞移植後の形態学的変化を示すための分析を行った。結果はそれぞれ図４Ａ−４Ｃにより示す。
【０１５６】
図４Ａは偽手術されたマウス心組織中のＨＥ染色を具体的に説明し（偽）；図４Ｂは細胞を含まない培地を注入されたＭＩマウスを示し（ＭＩ＋培地）；そして図４ＣはＥＳＣを注入されたＭＩマウスを表す（ＭＩ＋ＥＳＣ）。元の拡大倍率×２００。
【０１５７】
従って、経験的証拠は、正常心筋層が、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により、偽手術されたマウス中で観察されることを示す（図４Ａ）。しかしながら、壊死性および線維性瘢痕組織が、左前下行冠動脈の結紮の６週間後に、細胞を含まない培地を注入されたＭＩ心筋層ではっきりと形成された（図４Ｂ）。対照的に、移植された細胞が、ＭＩ誘導および細胞移植後６週間の梗塞心で見出された（図４Ｃ）。この結果は、移植されたＥＳＣが傷害された心筋層中で生き残ることを示す。
【０１５８】
埋植された細胞の生存をさらに確認するために、マーカーＧＦＰのｃＤＮＡを、それらが心筋層に移植された前に、培養されたＥＳＣにトランスフェクトした。結果は図５Ａ−５Ｃにより具体的に説明する。
【０１５９】
図５は、培養されたＥＳＣ、および細胞移植を伴う心筋層中でのＧＦＰ発現を立証する。図５Ａは光学対照顕微鏡検査（×２００）下での培養されたＥＳＣを示し；図５Ｂは蛍光顕微鏡検査（×２００）下でのＧＦＰトランスフェクション２日後の培養されたＥＳＣ中でのＧＦＰ発現を具体的に説明し；および、図５ｃは、ＧＦＰでトランスフェクトされたＥＳＣの移植を伴うＭＩ心から薄片にされた心筋層中での蛍光顕微鏡検査（×１００）下で検出されたＧＦＰ陽性の点を同定する。
【０１６０】
従って、この組織学的分析は、位相差光学顕微鏡検査下での培養されたＥＳＣを示す（図５Ａ）。ＧＦＰ遺伝子でのトランスフェクションの４８時間後に、ＥＳＣはトランスフェクトされた細胞の９０％以上で緑色蛍光を表した（図５Ｂ）。加えて、ＧＦＰ陽性の点は、ＭＩ誘導および細胞移植後６週間のＭＩ心から調製された凍結された切片中で、蛍光顕微鏡検査下で検出された（図５Ｃ）。さらに、移植された細胞は傷害された心中で心筋組織を再生することが可能であった。
【０１６１】
その後、マウス心中のｃＴｎ−Ｉおよびα−ＭＨＣの免疫染色を実施し、それは図６Ａ−６Ｆにより示されるとおりである。上図（赤色）：図６Ａは偽手術された心筋層中のα−ＭＨＣについての免疫蛍光染色を示し；図６Ｂは細胞を含まない培地の注入を伴う梗塞心筋層中での染色であり；および、図６ＣはＥＳＣ移植を伴う梗塞心筋層中での染色を示す。下図（緑色）：図６Ｄは偽手術された心筋層中でのｃＴｎ−Ｉについての免疫蛍光染色を示し；図６Ｅは細胞を含まない培地の注入を伴う梗塞心筋層中での染色を示し；および、図６ＦはＥＳＣ移植を伴う梗塞心筋層中での染色を示す。
【０１６２】
全体で、図６は、ｃＴｎ−Ｉおよびα−ＭＨＣの強度の免疫染色が、均一な分布を伴い、正常心筋層中でさえ（図６Ａ）、およびＥＳＣ移植を伴う梗塞心筋層中で（図６Ｃ）同定されたことを示す。対照的に、ｃＴｎ−Ｉおよびα−ＭＨＣ双方についての免疫染色は、細胞を含まない培地を注入されたＭＩ領域中でずっとより低かった。
【０１６３】
加えて、ＧＦＰおよびＣＸ−４３についての陽性二重染色が、図７により示されるとおり、ＥＳＣ移植を伴う傷害された心筋層中で確認された。対照的に、ＧＦＰおよびＣＸ−４３双方は、培地注入を伴う梗塞心筋層中で陰性に染色された（データは示されない）。これらの結果は、移植された細胞が傷害された心筋層中で生き残ったのみならず、しかしまた新たな心組織も形成したことを立証する。
【０１６４】
図７は、ＧＦＰおよびＣＸ−４３を認識する抗体での傷害された心筋層中の移植された細胞の免疫蛍光標識の共焦点顕微鏡検査（１００×）の写真である。ＧＦＰおよびＣＸ−４３についての二重染色を、心筋の凍結された切片中で、マウス抗ＧＦＰおよびウサギ抗ＣＸ−４３抗体を用いて実施した。ＧＦＰ標識はＦＩＴＣに結合されたヤギ抗マウスＩｇＧで検出し、また、ＣＸ−４３標識は、テキサスレッドに結合されたヤギ抗ウサギＩｇＧで検出した。矢印は、ＧＦＰ陽性と陰性細胞との間（白色矢印）およびＧＦＰ陰性細胞間（黄色矢印）の可能な結合を指す。
実験４：ＶＥＧＦをトランスフェクトされたＥＳＣの移植の心機能に対する影響
ＶＥＧＦの適用は、心筋虚血を伴う患者において側副血管の増大により心筋の血液灌流を改善することが知られている。ＶＥＧＦを過剰発現するＥＳＣの傷害された心筋層への移植が心機能をなおより大きく改善したかどうかを試験するために、われわれは、ＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡでＥＳＣをトランスフェクトし、そしてＶＥＧＦの過剰発現を伴うＥＳＣをＭＩ心に埋植した。結果はそれぞれ図８Ａ−８Ｃにより具体的に説明する。
【０１６５】
図８は、全体として、ＶＥＧＦ１６５のトランスフェクションを伴うもしくは伴わない培養されたＥＳＣにおけるＶＥＧＦの発現を示す。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ ｃＤＮＡのトランスフェクションを伴わない培養されたＥＳＣ中で検出された。図８Ａは、蛍光顕微鏡検査（×４００）下で検出されるＶＥＧＦ染色の強度が、ＶＥＧＦ１６５のトランスフェクションの２日後に、培養されたＥＳＣ中で顕著に増大したことを示す。図８Ｃは、培養されたＥＳＣ中でのＶＥＧＦのウェスタンブロット分析である。上図は、ＥＳＣ（左）およびＥＳＣ−ＶＥＧＦ（右）についての元のＶＥＧＦおよび内的対照（シクロフィリンＡ）のブロットを示す。下図はＥＳＣ（ｎ＝４）およびＥＳＣ ＶＥＧＦ（ｎ＝４）についての正規化されたＶＥＧＦレベルである。**、Ｐ＜０．０１、対ＥＳＣ。
【０１６６】
観察された結果は、従って、培養されたＥＳＣが、免疫蛍光染色により検出されるあるレベルのＶＥＧＦを発現したことを示す（図８Ａ）。ヒトＶＥＧＦ１６５遺伝子をＥＳＣ中に２日間トランスフェクトした後に、トランスフェクトされたＥＳＣ中のＶＥＧＦの強度の免疫蛍光が観察され、そして該増殖因子の過剰発現を示した（図８Ｂ）。ウェスタンブロット分析は、ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦのｃＤＮＡをトランスフェクトされた培養されたＥＳＣ中で３倍だけ増大したことをさらに確認した（図８Ｃ）。
【０１６７】
加えて、インビボの実験は、左室機能の改善が、ＥＳＣ単独を移植されたＭＩ動物においてよりも、ＥＳＣおよびＶＥＧＦを移植されたＭＩマウスで有意により大きかったことを示した。ＬＶＳＰ（Ｐ＜０．０５）およびＬＶＥＤＰ（Ｐ＜０．０５）の差異は、図９Ａおよび９Ｂにより示されるとおり、二群間で統計学的に有意であった。
【０１６８】
図９は、全体として、ＭＩマウスにおける左室機能の比較を示す。正規化された左室収縮期圧（ＬＶＳＰ、図９Ａ）および正規化された左室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ、図９Ｂ）がＭＩマウス中で示される。ＥＳＣ単独（ＭＩ＋ＥＳＣ、ｎ＝８）もしくはＥＳＣ−ＶＥＧＦ（ＭＩ＋ＥＳＣ−ＶＥＧＦ、ｎ＝８）の移植は、ＭＩ対照動物（ＭＩ＋培地、ｎ＝７）に比較して左室機能を有意に改善した。該データは、偽手術された動物（偽、ｎ＝８）の値（１００％）に対し正規化した。**、Ｐ＜０．０１、対偽；＃、Ｐ＜０．０５、対ＭＩ＋培地；１．、Ｐ＜０．０５、対ＭＩ＋ＥＳＣ。
【０１６９】
ＶＥＧＦの脈管形成効果を評価するために、われわれは、毛細血管密度を計算し、そして多様な処理を伴う動物間で差異を比較した。ＥＳＣ移植を伴う傷害された心筋層中の毛細血管の数は、ＭＩの未処理の心におけるものより有意により大きかった（Ｐ＜０．０１）。ＥＳＣ−ＶＥＧＦ群における毛細血管密度もまた対照より有意により大きかった（Ｐ＜０．０１）。加えて、毛細血管密度は、ＥＳＣ単独を移植された動物におけるものよりも、ＥＳＣ−ＶＥＧＦ移植されたマウスで有意により大きかった。これは図１０Ａおよび１０Ｂにより示す。
【０１７０】
図１０は、全体として、梗塞心筋層中の毛細血管密度に対するＥＳＣ移植の影響を示す。図１０Ａは、ＶＥＧＦを過剰発現するＥＳＣを移植されたＭＩマウス心からの心筋切片のＨＥ染色を示す。矢印は、梗塞心筋層中の血管を示す（拡大倍率×２００）。図１０Ｂは、偽（ｎ＝８）、ＭＩ＋培地（ｎ＝７）、ＭＩ＋ＥＳＣ（ｎ＝８）およびＭＩ＋ＥＳＣ−ＶＥＧＦ（ｎ＝７）の血管の平均された数をグラフで示す。**、Ｐ＜０．０１、対偽；＃、Ｐ＜０．０５、対ＭＩ＋培地；１．、Ｐ＜０．０５、対ＭＩ＋ＥＳＣ。
【０１７１】
その後、梗塞および梗塞周囲の心筋層中の血管新生に対する移植された細胞の影響を、免疫組織化学的分析によりさらに評価した。抗フォン−ウィルブランド因子（ｖＷＦ、内皮細胞のマーカー）抗体を適用して、梗塞領域中の新たな血管を確認した。結果はそれぞれ図１１Ａ−１１Ｃにより示す。
【０１７２】
図１１は、全体として、マウス心筋切片中での抗フォン−ウィルブランド因子（ｖＷＦ）抗体による血管内皮細胞の陽性の免疫染色を示す。図１１Ａは、正常心筋切片中の豊富なｖＷＦ染色（赤色）が偽手術されたマウス心中の正常な血管分布を立証することを示す。図１１Ｂは、ｖＷＦ染色が、細胞を含まない培地を注入された梗塞心筋層中で有意に低下されたことを立証する。散発性のｖＷＦ染色はＭＩ領域中のわずかな血管を示し；図１１Ｃは、ＶＥＧＦの過剰発現を伴うＥＳＣの移植が、多数の移植された細胞を伴う梗塞心筋層中のｖＷＦ染色を有意に増大させたことを示す。拡大倍率×２００。
【０１７３】
図１１は、ｖＷＦの赤色の陽性染色をはっきりと示す。正常心筋層（図１１Ａ）に比較して、ｖＷＦ染色の密度は、細胞を含まない培地を注入されたＭＩ心から薄片にされた梗塞心筋層中で劇的に減少された（図１１Ｂ）。しかしながら、ＶＥＧＦの過剰発現を伴うＥＳＣの移植は、細胞埋植を伴う梗塞心筋層中のｖＷＦ染色の密度を顕著に増大させた。図１１Ｃは、埋植された細胞の移植物（ｅｎｇｒａｆｔ）を伴う梗塞領域中での血管新生をはっきりと示す。これらの結果は、ＶＥＧＦの過剰発現を伴うＥＳＣの移植がＭＩマウスで心機能のより大きな改善を生じさせたこと；および、より良好な結果がより強い脈管形成効果から生じるかもしれないことを立証する。
一連の実験Ｉの結果から引き出される結論：
１．経験的知見は、移植されたＥＳＣが生き残り、そして傷害された心筋層中で心筋細胞に分化しかつＭＩマウスで左室機能を有意に改善したことを示す。心機能の改善は、過剰発現するＶＥＧＦを移植されたＭＩ心でなおより大きかった。加えて、ＥＳＣそれら自身は十分な量のＶＥＧＦを定量的に発現し、そして、傷害された心筋層中で新たな血管の成長を刺激することが可能であった。脈管形成効果は、移植されたＥＳＣがインサイチューで発現されるべきＶＥＧＦでトランスフェクトされた場合に、梗塞心筋層中でなおより強かった。従って、ＥＳＣおよびそれらの分化した細胞は、将来、ＭＩ誘発性の心不全を伴う患者における細胞治療のための重要な供給源を構成しかつ含んで成る。
２．ＥＳＣ移植は、ＭＩ後マウスにおいて左室機能および等尺収縮性を有意に改善した。心室機能の改善についての１つの臨床的可能性は、移植されたＥＳＣの心筋層の再生による梗塞領域の減少である。梗塞の大きさの減少は、心室の過剰伸展を予防しかつ正常な収縮機能を保存する可能性がある（フランク−スターリング（Ｆｒａｎｋ−Ｓｔａｒｌｉｎｇ）の法則）。
３．移植されたＥＳＣによる心筋の再生は、梗塞心において全体的機能の改善をもたらし、これは乳頭筋の機能を保存する可能性がある。われわれの形態学的データは、移植された細胞が、ＭＩ誘導および細胞移植後６週間の埋植された心内のＧＦＰ陽性細胞の同定により、梗塞心筋層中で生存したことを確認する。細胞移植されたＭＩ心中のｃＴｎ−Ｉおよびα−ＭＨＣについての強度の免疫染色は、傷害された心筋層中での移植された細胞の分化および成熟を示す。対照的に、ｃＴｎ−Ｉおよびα−ＭＨＣ双方は、培地注入を伴う梗塞心筋層中で非常に低レベルで染色された。さらに、ＥＳＣ移植を伴う傷害された心筋層中でのＧＦＰおよびＣＸ−４３についての陽性二重染色は、移植されたおよび宿主心の細胞の間の形態学的および機能的結合の可能な形成を示す。
４．ＥＳＣ移植の別の有益な効果は、移植されたＥＳＣが虚血性に傷害された心筋層中で脈管形成を誘導することである。本研究において、ＥＳＣ単独もしくはＥＳＣおよびＶＥＧＦの移植は、梗塞心筋層中の毛細血管の密度を有意に増大させた。従って、細胞移植後の梗塞後の不全心における左室機能の改善は、心筋層および血管の再生から生じる可能性がある。その後、この再生が梗塞された大きさを減弱させかつ心機能を改善した。
５．治療的脈管形成は、梗塞心筋層でのＥＳＣおよびＶＥＧＦの適用を組合せることにより顕著に増大する。われわれのデータは、ＥＳＣ−ＶＥＧＦ移植が、梗塞後の不全心における心機能を改善するためのなおより有効なアプローチを提供したことを示す。心筋内移植後に、これらの細胞は、それらの周囲の細胞および組織と通信して、それらを養うための血管の形成のシグナルを発する。毛細血管密度は、ＭＩ対照マウスでよりもＥＳＣ処理されたＭＩ動物で有意により高かった。ＥＳＣとＥＳＣ−ＶＥＧＦ群との間の差異は有意であった。この差異は、移植片の生存を高め、かつ、ＥＳＣ単独を埋植されたＭＩ動物でよりも、ＥＳＣ−ＶＥＧＦを移植されたＭＩマウスでの心室機能の有意により大きな改善を説明する。加えて、毛細血管密度のこの増大は、心不全を伴う患者での生活の質および寿命に有意であると思われる。
６．移植された細胞は損傷を与えられた心機能を回復させることができる。本研究は、ＭＩ動物における心機能に対するＥＳＣ移植の有益な影響を立証する。ＥＳＣ移植は傷害された心筋層を再生することが可能であったのみならず、しかしまた梗塞領域中の血管新生を高めることも可能であった。ある種の免疫関連細胞の表面タンパク質はＥＳＣ中で未だ発現されないため、細胞療法にＥＳＣを使用することの別の利点は免疫拒絶の減少である。従って、心機能の改善は、ＥＳＣ単独もしくはＶＥＧＦを過剰発現するＥＳＣを移植されたＭＩマウスにおける心筋細胞および血管の再生から生じる。この新規アプローチは、ＭＩおよび心不全で死亡する患者のための将来の細胞療法の基礎を提供することができる。
一連の実験ＩＩ
心筋細胞の永続的喪失は、心筋梗塞（ＭＩ）に罹った患者において、心機能の不可逆的な損傷をもたらす。損傷を与えられた心の瘢痕組織を、新たな機能的心筋細胞で置き換えることは、心筋の収縮性を改善しかつ心不全の進行を予防すると考えられる。
【０１７４】
多数の最近の研究は、ある範囲の多様な培養された細胞の、損傷を与えられた心筋層への移植が、低温傷害された（ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｅｄ）もしくは梗塞されたのいずれかの心における損なわれた心機能を回復することが可能であったことを立証した。これらの移植された細胞の若干は、生存し、増殖しかつ宿主心筋層とギャップ結合を形成することが示されている。対照的に、他の報告されたデータは、胎児および新生ブタ心筋細胞および心由来細胞系ＨＬ−１が、ブタ心筋層に移植した後に生き残らなかったことを見出した。上の矛盾は、ドナー細胞のタイプもしくは移植の時点での宿主心筋層の状態の差異に由来すると考えられる。
【０１７５】
胚幹（ＥＳ）細胞は、心形成に有用な、制限されないインビトロ増殖の能力を含有する分化全能性細胞である。われわれの最近の研究は、ＥＳ細胞移植が梗塞ラット心筋層中で可能であったこと、および、心機能の改善がＥＳ細胞移植の６週間後のＭＩラット中で観察されたことを示した［Ｍｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２（Ｓｕｐｐｌ）：１５６，Ａｂｓｔｒａｃｔ（２０００）］。しかしながら、梗塞後の不全心に対するＥＳ細胞移植の長期の機能的影響は決定されるべきままである。従って、本研究を、死亡率に対するＥＳ細胞移植の長期の影響、ならびにＭＩ誘導および細胞埋植の３２週間後の梗塞後ラットにおける心機能の改善を検討するために行った。
方法
移植のためのＥＳ細胞調製。
【０１７６】
マウスＥＳ細胞系ＥＳ−Ｄ３は、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から得、そして以前に記述された（１９）ところの方法で維持した。簡潔には、ＥＳ−Ｄ３幹細胞、およびそれらの前駆細胞の子孫の細胞を、有糸分裂的に不活性のマウス胚線維芽細胞フィーダー細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）上で、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。培地は、１５％ウシ胎児血清、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）および分化を抑制するための１０３単位／ｍｌの白血病阻害因子（ＬＩＦ）馴化培地（ＢＲＬ、メリーランド州ゲイタースバーグ）を補充した。系列選択／決定および分化を開始するために、ＥＳ細胞およびそれらの前駆細胞の子孫の細胞をトリプシンで分散させ、そして補充する白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含まない培地に再懸濁し、そして懸滴（２０μｌあたりおよそ４００個の細胞）で５日間培養した。その後、それらを１００ｍｍ細胞培養皿に接種した。その後、生じた系統決定済みのしかし未分化の拍動する心筋形成クラスターを、滅菌マイクロピペットの使用によりばらばらにし、そして５％ＣＯ２を含む加湿された雰囲気中、３７℃で別の２日間再培養した。
【０１７７】
移植前に、細胞を、傷害された心筋層の宿主筋細胞からの移植された細胞の同定のためのマーカー、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でトランスフェクトした。ＧＦＰ遺伝子を駆動するｈＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサーを含むプラスミド（５．７ｋｂ）およびジーン ポーター［Ｇｅｎｅ ＰＯＲＴＥＲ］ＴＭトランスフェクション試薬を、ジーン セラピー システムズ インク（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）（ＧＴＳ インク（ＧＴＳ Ｉｎｃ）、カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。十分な量のＥＳ細胞を、トランスフェクションの日に５０〜６０％コンフルエンスを得るように１００ｍｍ皿にプレーティングした。ＧＦＰトランスフェクション２日後に、培養されたＥＳ細胞をトリプシン処理し、そして細胞移植のため１０７個の細胞／ｍｌの密度でＪｏｋｌｉｋ改変培地（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）に再懸濁した。
実験的心筋梗塞およびＥＳ細胞移植
実験は、約３００ｇの初期体重を伴う雄性ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、マサチューセッツ州ウィルミントン）で実施した。検討は、米国保健研究所（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により発表された実験動物の管理および使用に関する手引き（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（ＮＩＨ刊行物Ｎｏ．８５−２３、１９９６年改訂）に従い、また、プロトコルはわれわれの施設動物管理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。ＭＩは、以前に記述された（１０）とおり、左前下行冠動脈の結紮により創製した。ＭＩの誘導直後に、３×１０５個のＥＳ細胞懸濁物を、ツベルクリンシリンジを用いてＭＩ心の３部位に注入した。２個の注入部位は虚血領域の境界であり、そして１個は梗塞領域の中央にあった。対照動物は同一のＭＩ手術を受領したが、しかし、同等容量の細胞を含まない培地のみを注入した。
【０１７８】
生存率を、実験の全過程、すなわち３２週間の経過観察の間、全群で評価した。該研究は、以下の群、すなわちＥＳ細胞を移植されたＭＩラット（ＭＩ＋ＥＳ細胞、ｎ＝２６）；同等容量の細胞を含まない培地を注入されたＭＩ対照ラット（ＭＩ＋培地、ｎ＝３１）；および冠動脈の結紮もしくは心筋内注入のいずれも伴わない偽手術されたラット（偽、ｎ＝２３）より構成した。
心エコー検査研究および梗塞の大きさの測定。
【０１７９】
移植３２週間後に、動物をペントバルビタールで麻酔した。心エコー検査処置は以前に記述された（８）とおり実施した。１２．５ＭＨｚのプローブを装備された商業的に入手可能な心エコー検査系（アジルジェント ソノス（Ａｇｉｌｇｅｎｔ Ｓｏｎｏｓ）５５００）を全部の研究に使用した。最初に、左室の二次元短軸図を乳頭筋のレベルで得た。利得の設定を至適化しかつ画像が軸上にあったことを確実にした後で、Ｍモード追跡（Ｍ−ｍｏｄｅ ｔｒａｃｉｎｇ）を、１００ｍｍ／ｓの紙速度で、前および後方左室（ＬＶ）壁を通して記録した。この向きは、梗塞および非梗塞領域の壁厚および動きの描写を可能にするよう選んだ。Ｍモード追跡のデータは、光学的ディスクに記録されたデータから分析した。ＬＶ重量（ｍａｓｓ）は標準的立方体式（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｂｅ ｆｏｒｍｕｌａ）を使用して計算した。相対前壁厚、相対後壁厚およびＬＶ内径を、Ｍモードストリップチャート記録で最低３つの連続する心周期から測定した。心内膜分割短縮および中壁分割短縮もまた、ＬＶ収縮機能を推定するための指標として使用した。
【０１８０】
心エコー検査測定後に、ラットを殺して、Ｐｆｅｆｆｅｒら［Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．５７：８４−９５（１９８５）］により記述されるとおり梗塞の大きさを測定した。梗塞の大きさは、梗塞領域の面積測定された心内膜および心外膜の周囲の総和を、左室の心外膜および心内膜の周囲全体の総和により割ることにより、計算した。
血行動態の測定
別の一連の実験において、ラットを再度、ＭＩ手術および細胞移植の３２週間後にペントバルビタールで麻酔した。インビボでの血行動態測定は、以前に記述された［Ｏｒｌｉｃら，Ｎａｔｕｒｅ ４１０：７０１−７０５（２００１）］ところの方法を用いて実施した。血行動態測定後に、ラットを殺しそして心を迅速に摘出した。隔壁を包含する左室を重量測定し、そして体重により正規化した。該比を肥大の指標として計算した。
移植された細胞の同定および組織学的研究。
【０１８１】
動物のサブセットを、ＥＳ細胞移植後３２週で殺して；形態学的特徴を評価しかつ移植された細胞を同定した。心を迅速に取り出し、そして、梗塞および梗塞周囲の領域を包含する左室の自由壁を、ヘマトキシリン−エオシン染色のため組織凍結媒体中に埋めた。移植された細胞の生存を、梗塞ラット心筋層からの凍結された切片を用いてＧＦＰ陽性移植片により立証した。移植されたＥＳ細胞からの再生された心様細胞を、免疫蛍光法を使用して心特異的タンパク質すなわち心ミオシンＨ鎖（ＭＨＣ）およびトロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を同定することにより確認した。簡潔には、凍結された組織切片をアセトン（４℃）中で１０分間固定し、そして、ヤギポリクローナルＩｇＧ抗ＴｎＩ抗体（サンタ クルズ バイオテクノロジー インク（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンタクルズ）、もしくはマウス抗ＭＨＣモノクローナル抗体（バークレー アンティボディ カンパニー（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．）、カリフォルニア州リッチモンド）とともに別個に室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後に、切片を、ウサギ抗ヤギローダミン結合ＩｇＧ（ＴｎＩについて）もしくはヤギ抗マウスフルオレセイン結合ＩｇＧ（ＭＨＣについて）（ピアース ケミカル カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、イリノイ州ロックフォード）とともにインキュベートした。加えて、心筋細胞は、３２週の梗塞後ラット心から、Ｘｉａｏらの方法［Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ）５０８：７７７−７９２（１９９８）］を使用して単離して、移植された細胞の生存をさらに確認した。
毛細血管密度の測定
脈管形成に対するＥＳ細胞移植の影響を、毛細血管（血管径が２０μｍ未満であると定義する）の数を計数することにより評価した［Ｔｏｍｉｔａら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ）：ＩＩ２４７−ＩＩ２５６（１９９９）］。毛細血管の数は、梗塞領域中の５個の無作為の野について顕微鏡検査（×４００拡大倍率）下で計数し、そして単位面積（０．２ｍｍ２）あたりの血管の平均として提示した。
データ分析
全部の値は平均±Ｓ．Ｅ．として提示する。データは、反復された測定を伴う一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）により評価した。２個の別個の群の間の差異は、両側もしくは片側スチューデントｔ検定を使用することにより比較した。３２週間の観察の間の生存率は標準的カプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）分析により分析し、また、生存曲線間の統計学的比較は対数順位検定を使用して行った。統計学的有意差の基準はＰ＜０．０５のレベルに設定した。
経験的結果
実験５：生存率
ＭＩ動物における死亡率に対するＥＳ細胞移植の影響を評価するために、３２週間の観察の間の生存率を３動物群で計算した。結果は図１２によりグラフで具体的に説明する。
【０１８２】
図１２は：３２週間の試験の間の、偽手術されたラット、細胞を含まない培地を注入された梗塞後ラット、およびＥＳ細胞を移植された梗塞後ラットのカプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存曲線を示す。偽、偽手術されたラット；ＭＩ＋培地、細胞を含まない培地の注入を伴う梗塞後ラット；ＭＩ＋ＥＳ細胞、ＥＳ細胞の移植を伴う梗塞後ラット。ＥＳ細胞移植は、３２週間の経過観察の間に、細胞を含まない培地の注入を伴うＭＩラットに比較して、生存率を有意に増大させた。
【０１８３】
図１２は、ＥＳ細胞の移植がＭＩラットにおける生存率を有意に増大させたことを示す。この群の２６匹の動物のうち３匹のみ（１１％）が、実験の全過程の間に死亡した。対照的に、死亡率は、細胞を含まない培地を注入されたＭＩ後ラットでずっとより高かった。３２週間の経過観察の期間の間に、３１匹のラットのうち７匹がＭＩ＋培地群で死亡した（２３％）。カプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）分析は、細胞を含まない培地の心筋内注入を受領した動物より、ＥＳ細胞を移植されたＭＩラットでの生存率の有意の改善（Ｐ＜０．０５）を示した。
実験６：左室機能の改善
左室（ＬＶ）機能および梗塞領域に対するＥＳ細胞移植の効果を、ＭＩ手術および細胞移植の３２週間後のＭＩラットについて、表Ｅ２に示す。ＬＶ重量、および体重に対するＬＶ重量の比は、偽手術されたラットに比較してＭＩ＋培地群で有意に増大した。しかしながら、ＥＳ細胞移植は、３２週間の経過観察で、ＭＩラットにおけるＬＶ肥大の重症度のみならずしかしまた梗塞の大きさも有意に低下させた。
【０１８４】
【表１２】
Figure 2004532202
【０１８５】
加えて、図１３Ａ−１３Ｃにより示されるとおり、ＬＶ収縮期圧（ＬＶＳＰ）および圧の最大発生速度（＋ｄＰ／ｄｔｍａｘ）は、細胞を含まない培地群に比較して、ＥＳ細胞を移植された梗塞後ラットで有意に回復した。ＬＶ拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）は、細胞を含まない培地を注入された梗塞後のラットにおいてよりも、細胞を移植されたＭＩ動物で有意により小さかった。これらの結果は、ＥＳ細胞移植が、ＭＩ誘導および細胞埋植の３２週間後に左室機能を有意に改善したことを示す。
【０１８６】
図１３は、全体として、ＥＳ細胞移植が：偽、偽手術されたラット（ｎ＝１０）；ＭＩ＋培地、細胞を含まない培地を注入された梗塞後ラット（ｎ＝９）；ＭＩ＋ＥＳ細胞、ＥＳ細胞を移植された梗塞後ラット（ｎ＝１０）を使用して、梗塞後ラットにおける左室機能を有意に改善したことを立証する。図１３ＡはＬＶＳＰすなわち左室収縮期圧を提示し；図１３ＢはＬＶＥＤＰすなわち左室拡張末期圧を示し；図１３Ｃは＋ｄＰ／ｄｔｍａｘすなわちピーク左室収縮期圧上昇の速度を同定する。測定はＭＩ手術後３２週間で実施した。* Ｐ＜０．０５、** Ｐ＜０．０１、対偽；＃ Ｐ＜０．０５、対ＭＩ＋培地。
実験７：心エコー検査評価
ＥＳ細胞埋植の３２週間後のＭＩラットにおける心機能に対する心エコー検査評価の結果を表Ｅ３および図１４により示す。ＬＶ腔は、細胞を含まない培地の注入を伴う梗塞ラット心で拡張されたようになった。梗塞心におけるＬＶ腔径の拡大は、前および後壁厚の有意の減少をもたらし、そしてその後、心内膜および中壁の分割短縮の低下を生じさせた。ＥＳ細胞の移植は、ＭＩ後３２週間のＬＶ重量／体重のより低い比を伴い、ＬＶモデリングの発生を有意に減弱させた。ＬＶ前および後壁厚は、ＥＳ細胞を移植されたＭＩラットで部分的に確保された。加えて、ＬＶの拡張期および収縮期径は、細胞移植を伴うＭＩラットにおいて減少した。
【０１８７】
図１４Ａ−１４Ｃは、偽手術されたラット（偽）、細胞を含まない培地の注入を伴う梗塞後ラット（ＭＩ＋培地）、およびＥＳ細胞の移植を伴う梗塞後ラット（ＭＩ＋ＥＳ細胞）における代表的な心エコー図の記録である。前および後壁は薄化されかつ無動性であった一方、左室腔は、細胞を含まない培地を注入された梗塞後ラット心で拡張されたようになった。対照的に、ＥＳ細胞移植は、細胞を含まない培地の注入を伴うＭＩ心に比較して、心室壁の収縮性を改善しかつ左室拡張を低下させた。
【０１８８】
【表１３】
Figure 2004532202
【０１８９】
実験８：損傷を与えられた心筋層中の移植された細胞の生存
損傷を与えられた心筋層中の移植された細胞の生存を同定するために、新鮮凍結された切片を、ＥＳ細胞移植後３２週間の梗塞後心から調製した。これらの切片はそれぞれ図１５Ａ−１５Ｃにより具体的に説明する。
【０１９０】
図１５は、全体として、細胞移植を伴う梗塞心筋層からのＧＦＰ陽性の点および単一細胞を示す。図１５Ａは、蛍光顕微鏡検査（×２００）下で、凍結された切片が、ＭＩ誘導および細胞移植の３２週間後に細胞を埋植された心筋層中で強いＧＦＰ陽性組織を示したことを具体的に説明する。図１５Ｂは、単一のＧＦＰ陽性細胞が、細胞移植３２週間後のＭＩ心から単離された心筋細胞中で、蛍光顕微鏡検査（×２００）で検出されたことを示す。図１５Ｃは図１５Ｂに対応し、そして、ＧＦＰ陰性の宿主心筋細胞を示す。ＧＦＰ陰性および陽性双方の細胞は、光学対照顕微鏡検査（×２００）下で、明瞭な条線を伴う桿形状であった。図１５Ｂおよび１５Ｃの差し込み図は、矢印により指される部分の拡大である。
【０１９１】
図１５Ａは、豊富なＧＦＰ陽性の点が、蛍光顕微鏡検査下で、１個の細胞を移植された心筋スライド中で検出されたことを示すことが注目されるであろう。この結果は、移植された細胞は、少なくともそれらの一部が、ＭＩ誘導およびＥＳ細胞移植の３２週間後に傷害された心筋層中で十分に生き残ったことを示唆する。加えて、ＧＦＰ陽性細胞が、ＥＳ細胞移植の３２週間後に梗塞心から単離された単一の筋細胞中で観察された（図１５Ｂ）。これらのＧＦＰ陽性細胞は、成体哺乳動物の心筋細胞の特徴である、明瞭な条線を伴う桿形状であった（図１５Ｃ）。
【０１９２】
加えて、心筋切片の分析を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて行った。これらの結果はそれぞれ図１６Ａ−１６Ｈにより示す。
【０１９３】
図１６は、全体として、移植後３２週間にヘマトキシリン−エオシン染色で同定された梗塞後ラット心筋層中の移植されたＥＳ細胞を具体的に説明する。図１６Ａおよび１６Ｂは、細胞を含まない培地の注入を伴う梗塞心筋層の対応してより低い（×４０）およびより高い（×２００）拡大倍率を示す。図１６Ｃおよび１６Ｄは、それぞれより低い（×４０）およびより高い（×２００）倍率でのＥＳ細胞の移植を伴う梗塞心筋層を示す。移植された細胞が梗塞領域中ではっきりとみられる。図１６Ｅおよび１６Ｆは、ＥＳ細胞を移植された梗塞心筋層中で観察された、ＭＨＣ（×２００）およびｃＴｎＩ（×２００）についての陽性の免疫染色を示す。対照的に、ＭＨＣ（図１６Ｅ）もしくはｃＴｎＩ（図１６Ｆ）のいずれかについての免疫染色は、細胞を含まない培地の注入を伴うＭＩ心筋層中で陰性であった。
【０１９４】
心筋切片のこのヘマトキシリンおよびエオシン染色は、ＥＳ細胞移植を伴う３２週のＭＩ心の梗塞領域中の移植された細胞をはっきりと示した（図１６Ｃおよび１６Ｄ）。梗塞心筋層中の移植された細胞はＭＨＣおよびｃＴｎＩに対し陽性に染色された（図１６Ｇおよび１６Ｈ）。対照的に、細胞を含まない培地の注入を伴う、ＭＩにより誘導された瘢痕組織は、ＭＨＣ（図１６Ｅ）およびｃＴｎＩ（図１６Ｆ）に対し陰性に染色された。これらのデータは、移植されたＥＳ細胞が細胞移植後３２週間まで梗塞後心筋層中で生き残ったのみならず、しかしまた成熟心筋細胞に分化もしたことを立証する。これらの新たな成熟された心筋細胞は、ＥＳ細胞移植での、ＭＩ動物の心室機能の改善において重要な役割を演じているかもしれない。
実験９：脈管形成効果
移植されたＥＳ細胞が、傷害された心筋層中での脈管形成効果を誘導したかどうかを検査するために、血管の密度を、ＭＩ手術および細胞移植の３２週間後にＭＩ心の梗塞領域中で計算した。図１７により示されるとおり、毛細血管の数は、細胞を含まない培地の注入を伴うＭＩ動物でよりも、ＥＳ細胞移植を伴うＭＩラットの傷害を与えられた心筋層中で有意に増大した（Ｐ＜０．０１）。この結果は、移植されたＥＳ細胞が、傷害された心筋層中で血管新生を引き起こすもしくは高めることが可能であったことを示す。
【０１９５】
図１７は、ＭＩ手術後３２週間の、偽手術されたラット心筋層、細胞を含まない培地の注入を伴う梗塞ラット心筋層、およびＥＳ細胞の移植を伴う梗塞ラット心筋層からの毛細血管の数的密度（血管／０．２ｍｍ２）をグラフで示す。ＥＳ細胞移植は、細胞を含まない培地の注入を伴う梗塞心筋層に比較して、毛細血管密度を有意に増大させた。** Ｐ＜０．０１、対偽；＃＃ Ｐ＜０／０１、対ＭＩ＋対照。
一連の実験ＩＩの経験的データから引き出される結論：
１．本結果は、ＥＳ細胞の移植が、梗塞後ラット心において３２週まで心機能を改善したことを示す。これらの知見は、ＥＳ細胞移植が、ＭＩ後に、延長された時間の期間の間、心の性能に対する有益な効果を提供することを示す。該データはまた、埋植されたＥＳ細胞が安定な移植片を形成しかつ移植された領域中で心様細胞に分化することができることも立証する。
２．本結果は、ＥＳ細胞の移植が、ＭＩ後３２週間までの間、心機能に対する有益な効果を有することを示す。梗塞領域中の安定な移植片は、ＭＩ誘導および細胞移植の３２週間後のＭＩラットにおける強いＧＦＰ陽性の点により明示された。ＥＳ細胞移植を伴う梗塞心から単離された単一のＧＦＰ陽性細胞は細筋がありかつ桿形状であった。加えて、心特異的タンパク質ＭＨＣおよびｃＴｎＩの免疫染色が、ＥＳ細胞移植を伴うＭＩラットの梗塞領域で見出された。該データは、心機能の改善は主として埋植されたＥＳ細胞の心筋形成から生じることを強く支持する。組織学的検査は、細胞移植後３２週のＭＩ心における移植された細胞の免疫拒絶の有意の証拠を示さなかった。これらの実験における弱い免疫拒絶は、ＥＳ細胞が完全に分化した心筋細胞が発現するよりもはるかにより少ない膜表面抗原を発現するという事実によると考えられる。
３．脈管形成もまた、ＭＩ誘導およびＥＳ細胞移植の３２週間後のラットにおける心機能の改善である役割を演じている。濃縮された移植された細胞を伴う損傷を与えられた心筋領域は、われわれの実験で見出された新たな血管で付随された。従って、脈管形成の効果は、移植された細胞の生存に決定的に重要である。損傷を与えられた心筋層への新たな血液供給は、埋植された細胞に栄養を提供しかつまた虚血領域中で傷害された若干の宿主筋細胞を救助するかもしれない。これらの効果は心がその機能を改善することを助けることができる。脈管形成効果の開始はＥＳ細胞により直接引き起こされる。
４．本結果は、ＭＩラットにおけるＥＳ細胞移植後の進行性の心室リモデリングに対する長期の有益な影響、および損傷を与えられた心機能の改善を立証する。移植された細胞からの分化した筋細胞および脈管形成の効果は、細胞埋植の３２週間後のＭＩ心の機能の改善をもたらすかもしれない。従って、この独特のアプローチは、心筋梗塞および心不全の治療に臨床的価値を提供する。
５．一連の実験ＩＩＩ
背景
幹細胞は、伝統的に、胚性もしくは器官特異的のいずれかを特徴としている。いくつかの研究は、後者が、これらの細胞の可能な臨床使用に重大な意味をもつ、筋細胞およびニューロンを包含する他の細胞タイプに分化転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）することができることを示唆している。局所移植後に、心細胞および筋芽細胞は、梗塞心筋層を修復しかつ心機能を改善する大きな潜在能力を示す。幹細胞（骨髄細胞）が梗塞心筋層を再生する潜在能力を有することが最近立証された。他の研究は、ヒト骨髄由来の血管芽細胞が虚血心筋層の血管新生を促進しかつ心筋の機能を改善することを示した。
【０１９６】
心筋炎は、ウイルス感染、免疫活性化および微小血管攣縮を伴う多方面にわたる疾患過程である。それは、急性段階での心筋壊死および炎症、次いで慢性段階での心筋の線維症、石灰化、心拡張、肥大および心不全を特徴とする。いずれかの所定の患者における心筋炎の特定の原因はしばしば不明なままであるとは言え、広範な感染症、全身性疾患、薬物およびトキシンがこの疾患の発症と関連している。
【０１９７】
ウイルスが心筋炎の優勢な原因であるかもしれないという総意もまた存在する。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が、後天的免疫不全症候群を伴う患者からの心組織で検出されている。Ｃ型肝炎はヒト心筋層中で複製することが可能であり、そしてまた、拡張型心筋症の発症にも関与しているかもしれない。インフルエンザＡ型およびＢ型、ポリオ、流行性耳下腺炎および風疹のような他のウイルス病原体が心筋炎を引き起こすことが示されている。
【０１９８】
現在、発生しかつ心筋炎の臨床的症状発現を伴う患者のおよそ１／３の死亡もしくは衰弱を引き起こすかも知れない構造的および機能的変化を予防もしくは反転させるための既知の有効な療法は存在しない。にもかかわらず、われわれは、ＥＳ細胞が、増殖し、損傷を与えられた領域に移動しかつその機能を回復することにより、心筋炎における炎症および壊死の領域からのシグナルに応答することが可能であると考える。この可能性を経験的に立証するために、マウスに尾静脈を介してマウス胚幹細胞を注入し、そして直ちに脳脊髄心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を接種した。その後、これらのマウスの罹患率、死亡率および組織病理学を評価して、ウイルス性心筋炎に対するＥＳ細胞の効果を評価した。
材料および方法：
ＥＳ細胞の調製
マウスＥＳ細胞系ＥＳ−Ｄ３を、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から得、そして以前に記述されたところの方法で幹細胞および前駆細胞の子孫の細胞として維持した。簡潔には、ＥＳ−Ｄ３細胞を、有糸分裂的に不活性のマウス胚線維芽細胞フィーダー細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）上で、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。培地は、１５％ウシ胎児血清、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）および分化を抑制するための１０３単位／ｍｌの白血病阻害因子（ＬＩＦ）馴化培地（ＢＲＬ、メリーランド州ゲイタースバーグ）を補充した。
【０１９９】
しかしながら、細胞移植前に、ＥＳ細胞を、移植されるＥＳ細胞の生存を同定するために使用される増強緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でトランスフェクトした。ＧＦＰ遺伝子を駆動するｈＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサーを含むプラスミド（５．７ｋｂ）およびジーンポーター［ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ］ＴＭトランスフェクション試薬を、ジーン セラピー システムズ インク（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）（ＧＴＳ インク（ＧＴＳ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。十分な量のＥＳ細胞、およびそれらの子孫の細胞を、トランスフェクションの日に５０〜６０％コンフルエントを得るように１００ｍｍ皿にプレーティングした。プラスミドＧＦＰ ＤＮＡ（８μｇ）を、リン酸カルシウム沈殿法を用いて各皿に添加した。ＧＦＰトランスフェクションの２日後に、培養されたＥＳ細胞をトリプシン処理し、そして注入の使用のため、１０７個の細胞／ｍｌの密度でＪｏｋｌｉｋ改変培地（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）に再懸濁した。
ウイルス調製およびマウスの接種
脳脊髄心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＭ変異体（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）を本研究で使用した。ウイルスストックは記述されたとおり調製した。簡潔には、ヒト羊膜（ＦＬ）細胞単層にＥＭＣＶを感染させ、そして細胞変性性の影響が完了した場合に収穫した。ウイルス力価はＦＬ細胞単層上でのプラーク形成により決定した。ウイルスストックは使用まで−８０℃で保存した。マウスに、イーグル最小必須培地中で希釈された１４０プラーク形成単位（０．１ｍｌ）のＥＭＣＶを腹腔内で（ｉｐ）接種した。
実験プロトコル
合計で１００匹の４週齢ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスをチャールズ リバー ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（マサチューセッツ州ウィルミントン）から得た。ＥＳ細胞は尾静脈を介して投与した（マウスあたり１×１０７個の細胞）。マウスに、ＥＳ細胞の投与後にＥＭＣＶを直ちに接種した。動物を５群、すなわち培地対照、ＥＳ細胞、ＥＭＣＶ、ＥＭＣＶ＋培地、およびＥＭＣＶ＋ＥＳに無作為に分割した。ウイルス接種の日を第０日と定義した。動物を、ウイルス接種後１、３、７、１４、２１および３０日に殺して、感染の各段階での病理学的変化を決定した。これらの時間は、急性期（第３日）、初期の心筋の炎症（第７日）、ピークの炎症細胞浸潤（第１４日）、ならびに線維症および拡張型心筋症の開始（第２１および３０日）と一致するように選んだ。
【０２００】
全部の動物実験は、米国保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のガイドラインに従って実施した。プロトコルは、ベス イスラエス ディーコネス メディカル センター（Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）およびハーバード大学医学部（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）の動物管理・使用委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
組織病理学およびＧＦＰ蛍光
各設計された日に、４匹のマウスを犠牲のため無作為に選んだ。心、脾、肝、肺および腎を摘出し、そして組織凍結媒体（トライアングル バイオメディカル サイエンシーズ（Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ノースカロライナ州デュラム）中に埋め、そしてその後液体窒素中で凍結させた。その後、組織を５μｍ厚にクライオスタット薄片にした。それらの切片は、ＧＦＰの検出もしくは病理学スコアをヘマトキシリンおよびエオシン染色により測定するまで−８０℃で保った。各器官の数個の切片を盲検的に評価した。各心筋サンプル（死亡したマウスは剖検を受けなかった）について、心筋炎の組織学的証拠および炎症を、細胞浸潤および心筋細胞壊死の程度に関して分類し、そして０から４＋までの範囲にわたる５点の尺度で等級付けした。０の点数は、各カテゴリーでの損傷の存在なしもしくは疑わしい存在を示した。１＋の点数は、心筋損傷の限定された集中した分布を記述した。２＋ないし３＋の点数は複数の損傷を伴う中間の重症度を記述した一方、４＋の点数は、検査された心組織全体にわたる合同するかつ広範囲の損傷の存在を記述した。
統計学的分析
結果は平均±ＳＥとして提示する。マウスの生存はカプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）法により分析した。群内および群間の比較は一元ＡＮＯＶＡを使用して実施した。個々の群のｐｏｓｔ ｈｏｃ比較は、ニューマン−コイル（Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌ）のサブグループ分析を使用して行った。＜０．０５のＰ値を有意とみなした。
経験的結果
実験番号１０：罹患率および死亡率
ＥＭＣＶへの感染は試験中の全部のマウスで同様の病理学的変化を生じさせた。簡潔には、ウイルス接種３日後に、マウスは不健康に見え、そして数匹は外被の波打ち運動、衰弱および興奮性を発生した。数匹のマウスは後肢の麻痺を発生した。ウイルス対照マウスのなかの死亡率は３６％であった。しかしながら、ＥＳ細胞群においては、心筋炎マウスの死亡率は２０％であった（未処理群に比較してＰ＜０．０５）。これらの結果は図１８によりグラフで具体的に説明する。
【０２０１】
図１８は心筋炎マウスの生存を示す。動物は尾静脈を介してＥＳ細胞で処理した。ＥＳ細胞処理群での生存のパーセントはＶ単独群でのものより有意により高かった。* Ｐ＜０．０５。Ｍ：培地；ＥＭＣＶ：ウイルス；ＥＳ：マウス胚幹細胞；ＥＭＣＶ＋ＥＳ：ウイルスおよび幹細胞。
実験番号１１：組織学的検査
第３日に、炎症細胞を伴う心筋細胞壊死のいくつかの分散された病巣が、ウイルスに感染したマウスからの心筋層で示された。第７、１４および３０日に、筋細胞壊死および付随する炎症が、図１９Ａ−１９Ｉにより示されるとおり、数領域で広範囲に融合性に、また他領域で多病巣性になっていた。ＥＳ細胞群においては、病理学的変化が心筋炎の動物のなかで改善された。壊死および炎症細胞浸潤の組織病理学的スコアは、図２０Ａおよび２０Ｂにより示されるとおり、未処理の動物のものと比較してＥＳ細胞群で有意により低かった。
【０２０２】
図１９は、全体として、ＥＳ細胞で処理された心筋炎マウスからのヘマトキシリンおよびエオシン染色された心筋切片の顕微鏡写真（光学顕微鏡検査）を提供する。ウイルス対照心において、炎症細胞浸潤および壊死が第７日（図１９Ａおよび１９Ｂ；それぞれ低および高倍率の拡大倍率）；第１４日（図１９Ｃおよび１９Ｄ）；ならびに第３０日（図１９Ｅおよび１９Ｆ）で、広範囲の浸潤および壊死、ならびに、線維症および石灰化が存在し；第７日（図１９Ｇ）、第１４日（図１１９Ｈ）および第３０日（図１９Ｉ）の幹細胞処理された心筋炎心の顕微鏡写真。矢印は浸潤および壊死を指す。低拡大倍率：元×４０；高拡大倍率：元×２００。
【０２０３】
図２０は、全体として、感染したマウス心の組織学的等級付けをグラフで具体的に説明する。心の組織学的得点は、炎症および壊死のカテゴリーのそれぞれで０から４＋までの範囲にわたった。* ウイルス群に比較してＰ＜０．０５。白棒：ＥＭＣＶ群、黒棒：ＥＭＣＶおよびＥＳ細胞群。図２０Ａは浸潤を具体的に説明し、また、図２０Ｂは壊死を具体的に説明する。
実験１２：心へのＥＳ細胞の移動
ＥＳ細胞は心筋層に直接移動することが立証される。図２１は、全体として、感染後第１４日の、胚幹細胞で処理されたウイルス性心筋炎の心筋層からの心筋切片（共焦点顕微鏡検査）を提供する。図２１Ａは、ＥＳ細胞で処理された未感染のマウスからの心筋層中の最小の緑色蛍光を示し；図２１Ｂは心筋炎の心筋層の壊死領域中のＧＦＰ（緑色）を示し；図２１ＣはＤＡＰＩ染色（青色）を示し；図２１Ｄは図２１Ｂおよび２１Ｃの重複部分を示し；図２１Ｅおよび２１Ｈは、心筋炎心におけるＧＦＰ（緑色）；α−アクチン（赤色）；ＤＡＰＩ（青色）のより高拡大倍率；ならびに図２１Ｅ、２１Ｆおよび２１Ｇの重複部分である。
【０２０４】
とりわけ、図２１Ａが、ＧＦＰのｃＤＮＡでトランスフェクトされたＥＳ細胞で処理された未感染マウスからの心筋層中で最小限の緑色蛍光が存在することを示すことが注目される。対照的に、図２１Ｂは、ウイルスに感染したマウスからの心筋層でＥＳ細胞の投与１４日後に有意の緑色蛍光が存在することを示し、ＥＳ細胞が心筋炎を伴う動物の心に向かったことを示す。図２１Ｅ−２１Ｈはそれぞれ、ＥＳ細胞が筋細胞に分化する可能性があることを示す。
実験結果から導かれる結論：
１．マウスＥＳ細胞の投与はウイルス性心筋炎の死亡率を有意に減少させた。これはＥＳ細胞移植によるウイルス性心筋炎に対する保護的効果の初めての証明である。この結果は：（ａ）ＥＳ細胞が心筋炎のマウスの生存の有意に上昇させ；（ｂ）ウイルスの侵入はＥＳ細胞の心筋への移動を刺激した；そして（ｃ）ＥＳ細胞は心筋炎の心臓で筋細胞に分化する、ことを明らかに示している。
２．臓器特異的な新しい細胞の再生は、傷害を受けた組織を修復し、そして機能を向上させるために幹細胞により使用される主要なメカニズムの１つである。本実験では尾の静脈を介して投与されたＥＳ細胞が死亡率、壊死および炎症細胞の浸潤を有意に低下させたことを示す。ＧＦＰおよびα−アクチニン蛍光実験では、ＥＳ細胞が心筋炎の心臓に移動し、そして新たな筋細胞に分化したことが示された。すなわち筋細胞の分化はＥＳ細胞がウイルス性心筋炎の壊死、炎症および死亡率を低下させる主な理由の１つであると考えられる。
３．現在の心筋炎の理論は３段階のプロセスが関与すると示唆されている。このプロセスはウイルス感染から０〜３日後の急性期から始まる。心筋傷害の初期病理学的証拠を導き得る遺伝的に感受性の宿主筋細胞の初期ウイルス感染がある。心筋のウイルス侵入後、細胞性免疫が心筋および内皮傷害の亜急性期を活性化する。最後に慢性期はゆっくりとした筋細胞の損失および心筋線維症を特徴とし、これが拡張型心筋症に進行して末期の不全および死に至る。主要な病原的メカニズムには恐らく、直接的なウイルスの組織傷害および心筋炎を拡張型心筋症そして心不全に進行させるために重要な免疫細胞性傷害を含む。
【０２０５】
この病理学的期間中、陽性ＧＦＰ染色が心筋中で実験的に検出可能であるが、処置および非処置群の間に有意な病理学的差異はなかった。したがってＥＳ細胞はこの期に影響を及ぼさないと結論する。免疫Ｔ−細胞浸潤はウイルス接種から７〜１４日後にピークとなり、心筋における最も重篤な急性の病理学的傷害と同時であった。７〜１４日間に死亡率はそのピークに達し、その後下がる。
【０２０６】
さらに７および１４日の心筋壊死および炎症細胞浸潤のスコアは、他の時点よりも高く、そしてＧＦＰおよびα−アクチニンはＥＳ細胞投与およびウイルス接種から７〜３０日後に検出可能であった。これらの結果に基づき、ＥＳ細胞は心筋炎から心臓を保護するために心臓外供給源（ｅｘｔｒａ−ｃａｒｄｉａｃ ｓｏｕｒｃｅ）から心臓に移動するとも結論した。
４．ＥＳ細胞は炎症または傷害組織を救うために：（ａ）死んだまたは傷害を受けた細胞を交換するために新たな筋細胞に分化し、そして（ｂ）薬理学的に活性な物質を影響を受けた心臓の領域に送達する方法を有すると考えられている。心筋損傷または炎症が起こった時、影響を受けた組織はシグナルを発信し、これが幹細胞の心筋への移動を刺激する。しかしこの時点で細胞ホーミングの詳細なメカニズムの決定は未知のままである。
【０２０７】
実験集ＩＶ
背景：
限定された筋細胞再生能の結果として、損傷した心筋は心室機能不全の発症および進展を防ぐことができない。心筋細胞の限定された再生は最近、ヒトの梗塞した心臓で報告されたが、一般に死んだ心筋は非機能的な線維状組織に置き換わることが知られている。虚血性心機能不全の高い罹病率およびドナー心臓の不足は、心不全を処置するための新たな取り組みに関する不断の調査を要求する。ＡＴＩ、胎児または新生児心筋細胞、サテライト細胞および骨髄細胞の使用を含む細胞移植はそれぞれ、動物モデルにおいて傷害した心筋を修復するためにいくらかの治療的価値があることが証明された。
【０２０８】
骨髄は、異なる組織を集め（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）、複製し、そして心臓筋肉を含む多系統細胞に分化させる能力を有する間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）として知られている稀な前駆細胞群を含むことが知られている。ヒトＭＳＣｓは大量に増殖する能力を有し、そしてインビトロで多くの細胞タイプに分化する能力を維持することが報告された。最近の報告では、移植された骨髄細胞が筋細胞および冠状血管に分化して、損傷した心臓の機能を改善することが示された。
【０２０９】
細胞療法の重要な病識を提供するために、本実験はＭＩブタを対象としてｈＭＳＣｓのみの移植またはｈＭＳＣｓにヒト胎児心筋細胞（ｈＦＣｓ）を加えた同時投与（１：１）の可能性を調査した。血管機能の血流学的評価および損傷を受けた心筋に移植された細胞の組織学的証拠を評価し、そして細胞移植を行った、または行わなかったＭＩブタで評価、そして比較した。
【０２１０】
方法
細胞培養および調製
ｈＭＳＣｓおよびｈＦＣｓ（１９週）はバイオウィッタカー社（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｉｎｃ．）（ウォーカーズビレ、メリーランド州、米国）から得、そしてすでに記載した方法［Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｇ．，Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３：８９−９４（１９９１）］で維持した。簡単に説明すると、間葉の成長補助剤を含むバレット（Ｂｕｌｌｅｔ）−キットを細胞を培養するために使用した。移植した細胞の生存を確認するために、細胞移植前にｈＭＳＣｓを強化したＧＦＴ ｃＤＮＡでトランスフェクトした。約３×１０５のｈＭＳＣｓを１００−ｍｍ皿にまき、そして培養してトランスフェクションの日に〜９０％の集密度を得た。ＧＦＴトランスフェクションから２日後、培養したｈＭＳＣｓをトリプシン処理し、そして遠心した。集めたｈＭＳＣｓおよびｈＦＣｓは、１０７細胞／ｍｌの濃度を含む細胞移植用の培養基に再懸濁した。
実験動物および外科的調製
ＭＩはメスの体重〜１５ｋｇのヨークシャーブタで行った。動物はケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）およびチオペンタサル（ｔｈｉｏｐｅｎｔａｔｈａｌ：５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で安静にした。気管挿管後、動物に〜２％イソフルランを１２呼吸／分の速度で通気した（ハロウェル（Ｈａｌｌｏｗｅｌｌ） ＥＭＣモデル２０００、獣医学用麻酔通気器、ピッツフィールド、マサチューセッツ州、米国）。心電図および呼吸はマルチ−チャンネルシコーダー（ポータルシステムズ社（Ｐｏｒｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、ビバートン、オンタリオ州、米国）によりモニターした。右大腿動脈を単離し、そしてシースの導入でカニューレを挿入した。カテーテルのシースを通して、７Ｆｒ．ピッグ−テイルド（ｐｉｇ−ｔａｉｌｅｄ）カテーテルを後退させながら左心室に進めた。カテーテルを圧変換器に繋げ、そして心室内圧をチャート−ストリップ（ｃｈａｒｔ−ｓｔｒｉｐ）レコーダーで記録した。ＬＶＳＰ、ＬＶＥＤＰ、＋ｄＰ／ｄｔおよび−ｄＴ／ｄｔを測定して心室機能を評価した。
【０２１１】
心臓は第４および５肋間空間を通す開胸術により露出した。左前下行冠状動脈の遠位末端（第３対角のすぐ下）を連結した。連結から５分後、ｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えた（１：１、１０７細胞／ｍｌ）またはｈＭＳＣｓのみ（１０７細胞／ｍｌ）のいずれかの７×１０６細胞を虚血性心筋の境界領域に注射した。対照ＭＩ心臓は同じＭＩ術を受けたが、同容量の無細胞培地を注射した。抗生物質（セファゾリン（Ｃｅｆａｚｏｌｉｎ）、３５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）および鎮痛薬（ブプレネックス（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ）、０．０３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）を手術直後に投与した。セファゾリン（３５ｍｇ／ｋｇ）は手術後５日間、毎日維持した。シクロスポリンＡ、１５ｍｇ／ｋｇは動物を屠殺するまで１日置きに経口で与えた。
心機能および心筋血流の評価
心室機能はすでに記載された超音波心臓検査法［Ｌｉｔｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２８：７７３−７８１（１９９６）］により評価した。簡単に説明すると、１２．５−ＭＨｚプローブを備えた市販されている超音波心臓検査システム（Ａｇｉｌｇｅｎｔ Ｓｏｎｏｓ ５５００）を使用し、そして結果を光ディスクで記録したデータから分析した。血流力学の直接的測定は連結前のＭＩブタへの心室内カテーテル挿入（ベースライン値）、１時間、およびＭＩ導入および細胞移植から６時間後に行った。
【０２１２】
細胞移植から６週間後、安定な同位体−標識化微小球（バイオパル社（ＢｉｏＰＡＬ Ｉｎｃ．）、ウスター、マサチューセッツ州、米国）を使用して、安静条件下または電気的刺激によるペーシングストレス（１８０拍／分）下の麻酔をかけたにＭＩブタで、［Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８０：Ｈ１０８−Ｈ１１６（２００１）のように］冠状血流を決定した。簡単に説明すると、１組の微小球（２×１０６）を３ｍｌのｓａｎＳａＬｉｎｅ（商標）塩溶液（バイオパル社、ウスター、マサチューセッツ州、米国）で希釈し、そして３０秒間にわたり左心房に注射した。参照血液サンプルは大腿動脈を通して５ｍｌ／分の一定速度でシリンジポンプを使用することにより抜いて、絶対心筋血流（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）を算出した。最後に心臓を摘出し、そして局所的心筋血流（ｒｅｇｉｏｎａｌ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）をバイオパル社により決定し、ここで集めた心臓組織および血流サンプルを中性子の場に暴露した。
梗塞した心筋の形態学および組織学
動物のサブセットを血流力学およびＭＩから６週間後の血流を評価した後に屠殺した。心臓を迅速に取り出し、そして梗塞および梗塞周辺領域を含む左心室の自由壁（ｆｒｅｅ ｗａｌｌ）から選択した組織を組織凍結培地（フィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、フェア ローン、ニュージャージー州、米国）に包埋した。左心室組織の凍結切片（８μｍ厚）は、移植した細胞の同定および免疫染色用に作成した。他の心臓は１０％ホルマリンに一晩固定した。心臓組織はパラフィンで包埋し、そしてヘマトキシリンおよびエオシン染色用に５μｍ厚の切片とした。蛍光顕微鏡下でのＧＦＰ陽性スポットは損傷を受けた心筋中に移植した細胞の存在を表した。α−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）および心臓トロポニン（ｃＴＮＩ）に関する免疫染色で、移植したｈＭＳＣｓおよびｈＦＣｓの生存および分化を確認した。凍結切片はＰＢＳで３回洗浄し、そしてＣｙ３−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ州、米国）と４５分間インキューベーションした。非特異的結合は残りの切片中で１％ウシ血清とのインキューベーションによりブロックした。異なる凍結切片を免疫組織化学的にマウスモノクローナル抗−ＧＦＰ抗体（ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国）、ヤギポリクローナルＩｇＧ抗−ｃＴｎＩ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，）、サンタクルズ、カリフォルニア州、米国）、またはマウス抗−α−ＭＨＣモノクローナル抗体（バークレーアンチボディ社（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．）、リッチモンド、カリフォルニア州、米国）で６０分間染色した。ＰＢＳで染色した後、切片をウサギ抗−ヤギ結合ローダミンＩｇＧ（ｃＴｎＩ用）またはヤギ抗−マウス結合フルオレセインＩｇＧ（α−ＭＨＣおよびＧＦＰ用）抗体（ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ロックフォード、イリノイ州、米国）とインキューベーションした。最後にα−ＭＨＣおよびｃＴｎＩに関する蛍光染色を検出し、そして蛍光顕微鏡下で写真を取った。
データ分析
すべての値は平均±ＳＥとして表す。細胞移植の前後に集めたデータは、各群でペアードスチューデントｔ検定により比較した。ＡＮＯＶＡは２以上の群から引き出されたデータ間の差異の比較に使用した。Ｐ＜０．０５を有意差と考えた。
【０２１３】
実験結果
実験番号１３：心機能の向上
実験的に２５匹の動物が第３対角枝の直下の左冠状動脈の永久連結を受けた。５匹の動物がＭＩ手術後２４時間以内に致命的な心室不整脈で死亡した。実験は以下の群からなった：ｈＭＳＣｓのみを移植したＭＩブタ（ＭＩ−ｈＭＳＣｓ、ｎ＝６）；ｈＭＳＣｓおよびｈＦＣｓを同時移植したＭＩブタ（ＭＩ−ｈＭＳＣｓ＋ｈＦＣｓ、ｎ＝７）；および等容量の無細胞培養基を注射したＭＩ対照ブタ（ＭＩ−対照、ｎ＝７）。血流測定により評価したＭＩの導入前のベースライン心室機能は、３群間で有意に異なった。心筋梗塞は、左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）、左心室収縮期圧上昇のピーク速度（＋ｄＰ／ｄｔ）、および左心室収縮期圧低下のピーク速度（−ｄＰ／ｄｔ）の減少に反映される心機能を低下させた。さらに左室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）はすべての梗塞した動物についてそれらの前−ＭＩ値と比較して上昇した。
【０２１４】
ＭＩ術から６週間後、細胞移植は表Ｅ４、Ｅ５および図２２に具体的に説明するように、ＬＶＥＤＰを下げ、そしてＬＶＳＰ、＋ｄＰ／ｄｔおよび−ｄＰ／ｄｔを上昇させることにより心室機能を有意に向上させた。さらに心機能に及ぼす細胞移植の有利な効果は、ｈＭＳＣｓに加えてｈＦＣｓを同時移植したＭＩブタでより一層大きかった。同時移植した動物における心機能における上昇した改善は、表Ｅ６およびＥ７に示すようにＭＩ心臓を１８０拍／分の速度で整調（ｐａｃｅｄ）した時、持続的であった。
【０２１５】
【表１４】
Figure 2004532202
【０２１６】
【表１５】
Figure 2004532202
【０２１７】
【表１６】
Figure 2004532202
【０２１８】
【表１７】
Figure 2004532202
【０２１９】
図２２は全体で連結前の（ベースライン）；１時間；およびＭＩから６週間後の梗塞後ブタ心臓の血流力学的測定をグラフで提供する。ｈＭＳＣｓのみ、またはｈＭＳＣｓにｈＦＣを加えた細胞移植により、ＭＩ対照動物に比べて心室機能が向上した。ｈＭＳＣｓのみの移植に比べて、ｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えた同時移植は心室機能により大きい有利な効果を及ぼす傾向がある。ＭＩ−対照、無細胞培地の移植による梗塞後のブタ（ｎ＝７）；ＭＩ−ｈＭＳＣｓ、ｈＭＳＣｓのみを移植した梗塞後のブタ（ｎ＝６）；ＭＩ−ｈＭＳＣｓ＋ｈＦＣｓ、ｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて同時移植した梗塞後のブタ（ｎ＝７）。図２２ＡはＬＶＳＰ、左室収縮期圧を示す；図２２ＢはＬＶＥＤＰ、左室拡張末期圧を具体的に説明する；図２２Ｃは＋ｄＰ／ｄｔ、圧上昇のピーク速度を示し；そして図２２Ｄは−ｄＰ／ｄｔ、圧下降のピーク速度を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＭＩから６週間後のＭＩ−対照；＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＭＩから６週間後のＭＩ−ｈＭＳＣｓ。
【０２２０】
実験番号１４：超音波心臓検査のパラメーター
臨床的に測定したように、ベースラインの超音波心臓検査のパラメーターは細胞を移植した、またはしない動物間で同様であった（データは示さず）。ＭＩ術から６週間後、左心室収縮性は無細胞培地を注射したＭＩブタで減少した。これは表Ｅ８に提示されるデータにより明らかである。
【０２２１】
【表１８】
Figure 2004532202
【０２２２】
表Ｅ８に示すように、細胞移植は心臓内左室内径短縮率、中央−壁左室内径短縮率、一回拍出量および心係数の増加により反映される心室機能を有意に向上させた。この有利な効果はｈＭＳＣｓのみを移植された動物よりも、ｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて同時移植を受けたＭＩ−ブタでより顕著であった。
【０２２３】
実験番号１５：組織学的評価
心筋切片のヘマトキシリンおよびエオシンを用いた組織学的染色により、ＭＩ術および細胞移植から６週間後の梗塞領域で繊維状の瘢痕組織が確認された。これはそれぞれ図２２２３Ａ〜２３Ｆで具体的に説明する染色切片により明らかである。
【０２２４】
図２３は全体として：正常なブタ心筋（図２３Ａ）；および培地注射を含む梗塞した心筋（図２３Ｂおよび２３Ｃ）のＨ＆Ｅ染色の形態学を具体的に説明する。比較して図２３ＤはｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて同時移植したＭＩブタの心臓から切り出したＧＦＰ陽性クラスターを示す。ｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて同時移植した梗塞したブタ心筋のＨ＆Ｅ染色を、図２３Ｅおよび２３Ｆに示す。図２３Ｂおよび２３Ｅの矢印は、図２３Ｃおよび２３Ｆで見られる倍率に対応する領域を指す。
【０２２５】
特に、移植した細胞はｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて（図２３Ｅおよび図２３Ｆ）、およびｈＭＳＣｓのみ（データは示さず）を移植した梗塞領域に多様に分布していたことは注目され、そして評価されるだろう。再生した細胞小島がない線維症が、無細胞培地を注射した梗塞心筋で見られた（図２３Ｂおよび２３Ｃ）。蛍光顕微鏡下で観察された陽性ＧＦＰスポットは、ｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて（図２３Ｄ）、またｈＭＳＣｓのみ（デーたは示さず）を移植した心筋に移植された細胞の生存を証明した。
【０２２６】
さらにα−心臓ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ、図２４、左カラム）および心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ、図２４、右カラム）に関する免疫染色の強さは、無細胞培地を注射した梗塞心筋よりもｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて同時移植した梗塞心筋で一層高かった。ｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて同時移植した損傷心筋のＧＦＰおよびｃＴｎＩに関する二重染色を図２５に示し、これによりさらに移植された幹細胞が心臓−様の細胞へ分化できたことが確認される。
【０２２７】
図２４Ａ〜２４Ｆは、α−ＭＨＣおよびｃＴｎＩに対する陽性免疫蛍光染色を示す写真による具体的説明である。これらは正常な心筋（それぞれ図２４Ａおよび２４Ｂ）、およびｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて同時移植した梗塞後の心筋（それぞれ図２４Ｅおよび２４Ｆ）で見いだされたが；培地を注射した損傷したブタの心筋では見られなかった（それぞれ図２４Ｃおよび２４Ｄ）。結果はαＭＨＣおよびｃＴｎＩの蛍光標識について異なる動物から得た。倍率：ｘ２００。
【０２２８】
図２５Ａ〜２５Ｃは、ｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて同時移植した損傷心筋のＧＦＰおよびｃＴｎＩに関する二重染色を示す写真による具体的説明である。図２５Ａおよび２５Ｂはそれぞれ、モノクローナル抗−ＧＦＰ抗体の染色およびポリクローナル抗−ｃＴｎＩ抗体によるｃＴｎＩの染色を示す。図２５ＣはＧＦＰおよびｃＴｎＩ染色の融合を示し、そして移植したＧＦＰ陽性細胞が心臓の筋細胞に分化したことを証明する。倍率：ｘ２００。
【０２２９】
実験番号．１６：局所的血流の改善
さらに梗塞した心筋の細胞移植による心臓発生を評価するために、心筋の局所的血流を中性子微小球により測定した。結果は図２６Ａ〜２６Ｂによりグラフで、および表Ｅ９により具体的に示す。
【０２３０】
【表１９】
Figure 2004532202
【０２３１】
図２６Ａおよび２６Ｂは、安静時（図２６Ａ）およびペーシングストレス時（図２６Ｂ）の梗塞後のブタ心臓における中性子微小球法を用いて記録された血流測定を示すグラフである。ＭＩ−対照、無細胞培地を移植した梗塞後のブタ（ｎ＝７）；ＭＩ−ｈＭＳＣｓ、ＭＩ−ｈＭＳＣｓを移植した梗塞後のブタ（ｎ＝６）；ＭＩ−ｈＭＳＣｓ＋ｈＦＣｓ、ｈＭＳＣｓに加えてｈＦＣｓを同時移植した梗塞後のブタ（ｎ＝７）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＭＩ−対照；＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＭＩ−ｈＭＳＣｓ。
【０２３２】
実験データはグラフで示すように、ＭＩ誘導から６週間後、無細胞培地を注射した対照ＭＩ心筋では安静時血流が有意に低下した。対照ＭＩ心臓に比べて、細胞移植は梗塞した心筋の血流を上昇させた。この上昇はｈＭＳＣｓのみを移植した動物よりもｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて移植したブタで一層大きかった。加えて、血流に及ぼす有利な効果も細胞を移植したＭＩ心臓のペーシング誘導化ストレス時条件下で観察された。ここでもｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えた同時移植がペーシング中の血流により大きな上昇を生じた。
【０２３３】
実験結果に基づく結論：
１．ヒト成人の幹細胞は臨床的応用のための代替的細胞供給源である。この実験のデータはｈＭＳＣｓの心筋内移植が梗塞した心臓機能を改善し、そしてこの改善はｈＭＳＣｓおよびｈＦＣｓを同時移植したＭＩブタでより一層大きかったことを示す。
２．本実験では、ｈＭＳＣｓのみの移植でＭＩ誘導および細胞移植から６週間後に梗塞したブタの心機能が改善されたが、ｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて同時移植はより大きな機能回復を生じた。移植されたｈＭＳＣｓまたはｈＭＳＣｓに加えたｈＦＣｓは損傷したブタの心筋で生存するだけでなく、α−ＭＨＣおよびｃＴｎＩに関する陽性染色により示される新たな心筋も生じた。
３．本データは心室機能の改善が少なくとも部分的には移植したｈＭＳＣｓ細胞から分化した新たな心筋細胞からもたらされることを示唆している。ｈＭＳＣｓのみを移植したＭＩ心臓における心機能の改善が少ないことに関する１つの説明は、移植されたｈＭＳＣｓが損傷した心筋を修復するために十分な数の筋細胞の生じることができないということである。対照的に、移植したｈＦＣｓは損傷した心筋中で生存し、そしてより多くの新たな心筋を形成して、ｈＭＳＣにｈＦＣｓを加えて同時移植したＭＩブタの心臓機能をさらに向上させる。
４．本実験では、中性子微小球法により評価した時、虚血性範囲（ｔｅｒｒｉｔｏｒｙ）への血液供給がｈＭＳＣｓのみおよびｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えた移植で改善された。移植された細胞はこのように新規血管を形成するための細胞源を提供し、そして新たな毛細管形成および損傷した心筋での成長を誘導するために血管内皮増殖因子を放出する。
５．ｈＭＳＣｓのみまたはｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えた移植は、我々のＭＩブタモデルにおいて損傷した心筋を再生し、そして心機能を改善することができる。しかしこの改善はｈＭＳＣｓにｈＦＣｓを加えて同時移植したＭＩ心臓で一層大きい。同時移植したＭＩ動物のより良い心臓機能は、明らかに移植されたｈＦＣｓにより引き起こされるより多くの心筋の再生および新血管形成に及ぼすより強い効果からもたらされる。
【０２３４】
本発明はここに添付する特許請求の範囲を除き、範囲を限定され、または形態を限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
本発明の治療方法論は、添付の図面と共に解釈するといっそう容易に理解することができ、そしてよりよく認識される。
【図１Ａ−１Ｃ】それぞれ、ＥＳＣ由来の心筋細胞においてゼロ電流クランプ法を用いて認められる自然活動電位を示す図である。
【図２Ａ−２Ｃ】それぞれ、心筋梗塞を起こしたマウスにおける血流力学測定のオリジナルトレース記録を示す図である。
【図３】試験下のマウスの乳頭筋におけるイソプロテレノール刺激に対する発生張力の増加を示すグラフである。
【図４Ａ−４Ｃ】それぞれ、ヘマトキシリンおよびエオシン染色したマウス心臓組織を示す画像である。
【図５Ａ−５Ｃ】それぞれ、培養したＥＳＣにおけるおよび細胞移植後の心筋におけるマーカーＧＦＰ発現を示す画像である。
【図６Ａ−６Ｆ】それぞれ、マウス心臓におけるｃＴｎ−Ｉおよびα−ＭＨＣの免疫染色の画像である。
【図７】損傷を受けた心筋における移植した細胞およびコネキシン４３の免疫蛍光標識を示す画像である。
【図８Ａ−８Ｄ】それぞれ、ｐｈＶＥＧＦ１６５のトランスフェクションの有無で培養したＥＳＣにおけるＶＥＧＦの発現を示す画像である。
【図９Ａ−９Ｂ】それぞれ、心筋梗塞を起こしたマウスにおける左心室機能を比較するグラフである。
【図１０Ａ−１０Ｂ】それぞれ、梗塞を起こした心筋における毛細血管密度に対するＥＳＣ移植の影響を示す図である。
【図１１Ａ−１１Ｃ】それぞれ、マウス心筋切片における抗フォンビルブラント因子抗体による血管内皮細胞の陽性染色を示す画像である。
【図１２】試験下のラットの異なる群の様々なカプラン・マイヤー生存曲線を示すグラフである。
【図１３Ａ−１３Ｃ】それぞれ、ＥＳ細胞移植が、梗塞を起こした後のラットにおける左心室機能を有意に改善したことを示すグラフである。
【図１４Ａ−１４Ｃ】それぞれ、試験下のラットの異なる群の代表的な心エコー検査記録を示す画像である。
【図１５Ａ−１５Ｃ】それぞれ、細胞移植後の梗塞を起こした心筋からのＧＦＰ陽性スポットおよび単一細胞を示す画像である。
【図１６Ａ−１６Ｈ】それぞれ、移植後３２週でヘマトキシリン−エオシン染色によって同定される梗塞を起こした後のラット心筋における移植したＥＳ細胞を示す画像である。
【図１７】ＥＳ細胞移植後の心筋梗塞を起こしたラットの損傷を受けた心筋における毛細血管の有意な増加を示すグラフである。
【図１８】試験下のマウスの異なる群の生存を示すグラフである。
【図１９Ａ−１９Ｉ】それぞれ、ＥＳ細胞で処置した心筋炎マウスからのヘマトキシリンおよびエオシン染色した心筋切片を示す画像である。
【図２０Ａ−２０Ｂ】それぞれ、梗塞を起こしたマウス心臓の組織学的評点を示すグラフである。
【図２１Ａ−２１Ｈ】それぞれ、感染後の１４日目の胚幹細胞およびそれらの前駆子孫細胞で処置したウイルス性心筋炎の心筋からの心筋切片の画像である。
【図２２Ａ−２２Ｄ】それぞれ、様々な試験条件下の梗塞を起こした後のブタ心臓における血流力学測定を示すグラフである。
【図２３Ａ−２３Ｆ】それぞれ、試験下の動物から採取した染色切片としてブタ心筋の形態を示す画像である。
【図２４Ａ−２４Ｆ】それぞれ、試験下の動物の心筋におけるα−心筋ミオシン重鎖および心筋トロポニンＩの免疫染色を示す画像である。
【図２５Ａ−２５Ｃ】それぞれ、ｈＭＳＣおよびｈＦＣを移植した梗塞を起こした心筋におけるＧＦＰおよびｃＴｎＩの免疫染色を示す画像である。
【図２６Ａ−２６Ｂ】休息状態のおよびペーシングストレスを有する梗塞を起こした後のブタ心臓における中性子ミクロスフェア技術での観測血流測定を示すグラフである。

Claims (27)

  1. 臨床的に認められた形態の心臓の病状（ｃａｒｄｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）に冒された生存哺乳動物被験体における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、２つ以上の異なるタイプの細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物であり、該２つの異なるタイプは、少なくとも一つの同定可能なタイプの幹細胞、少なくとも一つの同定可能なタイプの前駆細胞、少なくとも一つの同定可能なタイプの系列決定済み細胞、少なくとも一つの同定可能なタイプの部分的に分化した細胞、および少なくとも一つの同定可能なタイプの完全に分化した細胞よりなる群から選択される。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  2. 臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物被験体における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、２つ以上の異なるタイプの細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物であり、該２つの異なるタイプは、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの幹細胞、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの前駆細胞、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの系列決定済み細胞、および一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの部分的に分化した細胞よりなる群から選択される。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  3. 臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物被験体における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、３つ以上の異なるタイプの細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物であり、該３つの異なるタイプは、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの幹細胞、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの前駆細胞、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの系列決定済み細胞、一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの部分的に分化した細胞、および一つもしくはそれ以上の同定可能なタイプの完全に分化した細胞よりなる群から選択される。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  4. 臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物被験体における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、少なくとも一つの同定可能なタイプの幹細胞および少なくとも一つの同定可能なタイプの前駆細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物である。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  5. 臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、少なくとも一つの同定可能なタイプの前駆細胞および少なくとも一つの同定可能なタイプの系列決定済み細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物である。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  6. 臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、少なくとも一つの同定可能なタイプの系列決定済み細胞および少なくとも一つの同定可能なタイプの部分的に分化した細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物である。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  7. 臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物被験体における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、少なくとも一つの同定可能なタイプの幹細胞および少なくとも一つの同定可能なタイプの部分的に分化した細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物である。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  8. 臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物被験体における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、少なくとも一つの同定可能なタイプの前駆細胞および少なくとも一つの同定可能なタイプの部分的に分化した細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物である。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  9. 該調製接種材料が少なくとも一つのタイプの完全に分化した細胞をさらに含んでなる請求項２、４、５、６、７もしくは８に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  10. 該調製接種材料の該混合物を含んでなる該同定可能なタイプの細胞が同じ由来である請求項１、２、３、４、５、６、７もしくは８に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  11. 該調製接種材料の該混合物を含んでなる該同定可能なタイプの細胞が異なる由来である請求項１、２、３、４、５、６、７もしくは８に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  12. 該同定可能なタイプの幹細胞が胚幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞および神経冠幹細胞よりなる群から選択される請求項４もしくは７に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  13. 該同定可能なタイプの前駆細胞が胚前駆細胞、間葉前駆細胞、造血前駆細胞、神経前駆細胞および神経冠前駆細胞よりなる群から選択される請求項４もしくは８に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  14. 該同定可能なタイプの系列決定済み細胞が胚幹細胞起源の系列決定済み細胞、間葉幹細胞起源の系列決定済み細胞、造血幹細胞起源の系列決定済み細胞、神経幹細胞起源の系列決定済み細胞および神経冠幹細胞起源の系列決定済み細胞よりなる群から選択される請求項５もしくは６に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  15. 該同定可能なタイプの部分的に分化した細胞が胚幹細胞起源の部分的に分化した細胞、間葉幹細胞起源の部分的に分化した細胞、造血幹細胞起源の部分的に分化した細胞、神経幹細胞起源の部分的に分化した細胞および神経冠幹細胞起源の部分的に分化した細胞よりなる群から選択される請求項６、７もしくは８に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  16. 臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物被験体における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、２つ以上の同定可能なタイプの幹細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物である。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  17. 臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、２つ以上の同定可能なタイプの前駆細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物である。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  18. 臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、２つ以上の同定可能なタイプの異なる由来の系列決定済み細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物である。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  19. 臨床的に認められた形態の心臓の病状に冒された生存哺乳動物被験体における心機能不全の重症度を下げる治療法であって、
    冒された生存被験体における心臓の少なくとも一部に生存可能な哺乳動物細胞の調製接種材料を導入すること（ここで、該調製接種材料は、２つ以上の同定可能なタイプの異なる由来の部分的に分化した細胞を組み合わせて含んでなる哺乳動物細胞の混合物である。）；ならびに
    該導入した細胞の接種材料を心臓の内部および周囲で組み込まれた細胞としてインサイチューで発生させること（これにより、心機能不全の重症度は冒された生存被験体において下がるようになる。）、
    の工程を含んでなる方法。
  20. 該調製接種材料が少なくとも一つの同定可能なタイプの分化した細胞をさらに含んでなる請求項１６、１７、１８もしくは１９に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  21. 冒された生存被験体の認められた形態の心臓の病状が心筋梗塞である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８もしくは１９に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  22. 冒された生存被験体の認められた形態の心臓の病状が心不全である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８もしくは１９に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  23. 冒された生存被験体の認められた形態の心臓の病状が心筋炎である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８もしくは１９に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  24. 冒された生存被験体の認められた形態の心臓の病状が不整脈である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８もしくは１９に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  25. 該調製接種材料を含んでなる該細胞が哺乳動物の臓器から得られる請求項１、２、５、６、７、８、１６、１７、１８もしくは１９に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  26. 該調製接種材料を含んでなる該細胞がヒトドナーの臓器から得られる請求項１、２、５、６、７、８、１６、１７、１８もしくは１９に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
  27. 該臓器が骨髄、末梢血、胎盤もしくは臍帯血よりなる群から選択される請求項２５もしくは２６に列挙するとおりの心機能不全の重症度を下げる治療法。
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