CN101072867A - 新颖的多能性干细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明是揭示一种分离的骨髓干细胞(BMSC)，其在包括内皮细胞、神经细胞与平滑肌细胞的该类型的受选细胞中具有无法侦测的含量或低含量，亦揭示包括该细胞的移植医药产物。亦提供产生该骨髓干细胞(SCs)的方法。本发明具有广泛的实用性应用，包括应用于心血管疾病的预防与治疗。

Description

新颖的多能性干细胞及其用途
技术领域
本发明是有关于分离的骨髓干细胞(BMSCs)，其在受选细胞中具有无法侦测的含量或低含量。重要的是该细胞为多能性(multipotent)且可用于产生各种期望的细胞类型。本发明具有广泛的实用性应用，包括应用于心血管疾病的预防与治疗。
发明背景
逐渐意识到充血性心力衰竭(CHF)是为一种日益增加且广布于世界各地的疾病，已有报告指出某些病因，例如，心肌梗塞(MI)所造成的不可逆伤害。
梗塞面积是为充血性心力衰竭发病率与致死率的主因。举例而言，影响左心室(LV)40％或40％以上的梗塞面积通常与难治愈的心因性休克与病程发展迅速的充血性心力衰竭有关。心肌具有有限的自我修复或再生的能力，与肌肉不可逆的损失，以及伴随收缩与心肌瘢痕的纤维化，该为已熟知的原则，是在一连串的事件中占有一席的地，意即非缺血性心肌的渐进式心室重建(progressive ventricular remodeling)，最后导致渐近式心力衰竭(HF)。
已努力朝更了解心力衰竭的方向着手，举例而言，心肌细胞(CMC)损失的幸存暗示被认为与心力衰竭有关。此项给予设法治疗上一些重要性暗示，即在心力衰竭病程期间帮助维持可生存的心肌细胞。目前，临床所使用的医药与手段并未显示在以有功能的收缩性组织置换心肌瘢痕的功效。因此，有鉴于与心肌梗塞和心力衰竭相关的主要发病率与致死率，新颖的方法已在找寻该病症的主要病理性缺陷，例如，血管与心肌细胞的损失。
众所皆知特定组织干细胞(tissue specific stem cell)仅能分化成起源组织的细胞。然而，逐渐意识到至少某些成人的特定组织干细胞可分化成不同于起源组织的株系，该可塑性(plasticity)被认为是转分化(trans-differentiation)。骨髓细胞被发现具有再生许多非造血组织(例如神经外胚层细胞、骨胳肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、肝管与胆管的内皮细胞，及肺、消化道与皮肤内皮细胞)的能力。近年来，涉及多能性成人祖细胞(MAPCs)的骨髓细胞(BM)所衍生的所有干细胞已经以骨髓间质细胞(MSCs)共纯化。MAPCs被认为广泛地增殖，且分化成全部三种胚层细胞。
已企图将骨髓细胞所衍生的干细胞做治疗性的应用。研究显示将转植成缺血性心肌层的内皮祖细胞(EPC)、血管细胞(angioblast)、或CD34(+)细胞纳入至新生血管的病灶，并且对心肌梗塞(MI)后的左心室(LV)的功能具有有利的影响。在其它研究中已证明出有愈来愈多各方面功能的骨髓所衍生的造血干细胞(HSCs)。
被发掘可用在心脏再生的成人干细胞的其它来源为非造血性间叶(mesenchymal)干细胞(或骨髓间质细胞，MSCs)。骨髓间质细胞可衍生自成人骨髓，并具有分化成多株系的能力。在细胞培养中，骨髓间质细胞在超过许多世代仍可维持在一个不分化且稳定的表现型(phenotype)。在具有心肌梗塞的动物模型中，亦证明出鼠、牛及人类的骨髓间质细胞可进行心肌增生(cardiomyogenic)的分化。
虽然已有报告指出衍生自骨髓的间质细胞具有使心肌组织再生的功能，但是对于该未成熟细胞是具有许多临床功能仍不明确。
举例而言，当有愈来愈多的证据显示骨髓包含具有可塑性细胞群，这并无法确定来自单一细胞阶段的高度未分化间质细胞的分离或增殖是否成功。间质细胞的纯系增殖做为增强治疗的可靠度与功效而言相当重要。再者，过去企图培养一些骨髓细胞(例如，多能性成人祖细胞)，需要以增殖性细胞激素处理使其减少对临床使用的吸引力。更重要地，多能性成人祖细胞已显示在注入至囊胚后有最小移植至心肌的能力。有些骨髓细胞(例如，Lin-c-KIT+细胞或血管细胞)已显示具有使活体内分化成心肌组织的重要组群再生的能力。然而，该细胞相当烯少且欠缺已被接受的培养方法。
特别在治疗应用上，有关使用骨髓细胞的其它缺点。举例而言，在受伤的心肌模型中并未建立是否单一人类骨髓细胞参与新生血管与心肌增生。尚未使用人类的多能性干细胞来证实骨髓细胞的分化。藉由免疫组织化学染色法(immunohistochemical staining)利用多能性干细胞的研究证明分化成心肌增生的表现型，然而经合并细胞的数量并不多，且型态上的特征与成熟的心肌细胞不同。
因此，该与其它的缺点限制了骨髓细胞作为可预防、治疗或降低与心脏疾病(例如心肌梗塞)相关病症严重性的来源的应用。
期望能有适合在组织培养中分离与维持以作为克隆分离物技术的骨髓细胞。尤其期望是否有该骨髓细胞可维持以作为多能性纯系，特别是作为用于至少一种(优选为内皮细胞、骨胳肌细胞与心肌细胞全部三种)的来源。甚至更期望是否可将该骨髓细胞转植至患病或受伤的心肌组织，以有助于预防、治疗或降低相关的病症。
发明内容
我们发现可从一种或仅少数种的骨髓细胞培养(增殖(expanded))一种新种类的多能性骨髓干细胞(BMSCs)。优选的多能性骨髓干细胞可长时期的增殖，与至少分化为三种株系的能力。来自多能性骨髓干细胞的该细胞的形成可受控制，并可用于提供一种非受限多能性来源的分化细胞与组织(包括移植物)。本发明具有广泛的重要应用，包括涉及多能性骨髓干细胞(或其所衍生的细胞)移植至需要该治疗的接受体。
更特而言的，我们已经从骨髓分离出一种新颖的多能性(即可塑性)干细胞群，可在细胞培养中增殖而不需要可侦测的标记物，或用于至少约50群体倍增(population doublings)的可塑性的损失，更典型为至少约100群体倍增，通常约140群体倍增或更多。一方面，我们发现从人类骨髓以无性生殖的方式所增殖的多能性骨髓干细胞(亦称为hBMSCs)不属于习知的由骨髓所衍生的干细胞群，例如造血干细胞、间质干细胞或多能性成人祖细胞(例如内皮祖细胞)。重要地，本发明优选的多能性骨髓干细胞当其在合适的限制条件期间，具有分化成至少三种分化细胞类型的能力，特别是内皮细胞、骨胳肌细胞与心肌细胞。在此具体实施例中，本发明为适当地提供一种所需要的非受限多能性来源的分化细胞与组织(包括移植物)，例如，用以预防、治疗或降低罹患与心血管疾病相关的病症(包括与梗塞相关的病症)。
因此，一方面，本发明提供一种骨髓干细胞的分离株，是通过标准细胞标记检测分析法予以测定具有下列至少一种无法检测到的或低水平的细胞标记物及优选为具有所有下列细胞标记物标记物标记物优选标记物：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCI类受体(MHC class Ireceptor)与MHC II类受体(MHC class II receptor)。
该骨髓干细胞(BMSC)具有重要的用途与优点。举例而言，该骨髓干细胞有高的可塑性，以及可用来提供一种非受限多能性来源的细胞与组织以着手心血管疾病，尤其是被指示要以再生治疗的心血管疾病。虽然曾企图使用其它干细胞来着手此类疾病，但是相较于本文所述的骨髓干细胞，该细胞相对地有较小的可塑性。患病而要治疗的病患可提供各种心血管细胞和组织。第一次，本发明着手提供此需要，骨髓干细胞可快速地转变成为一种或多种心血管细胞，尤其是干细胞、平滑肌细胞、心肌细胞。从灵长目动物(例如人类病患，即hBMSC)分离出骨髓干细胞的具体实例中，该细胞可于活体外维持与/或治疗(例如以一或多种有丝分裂素(mitogen))，以及放回(移植)至病患(或免疫上相关的个体，例如家族成员)以治疗该心血管疾病。本发明的特征有助于降低病毒所引发的不必要感染的风险，例如，受体细胞的免疫排斥。或者/再者，该骨髓干细胞可从病患分离出，并于活体外处理(使用或不使用有丝分裂素)以产生组织移植物，特别是病患至少为同种异体(allogeneic)及优选为异体免疫兼容(syngeneic)的具体实例。与例而言，可使用该移植物以着手心血管疾病，其中需要相对大量的骨髓干细胞或其衍生的细胞。
本发明进一步提供产生本文所述的分离骨髓干细胞的方法(例如hBMSC)。在一具体实例中，该方法包括下列至少一步骤，及优选为下列全部步骤：
a)收集来自哺乳动物的骨髓干细胞，其细胞的尺寸小于约100微米，优选为小于约50微米，优选为约40微米或40微米以下，
b)在为贴壁细胞(adherent cell)所选择的条件下，将所收集的细胞于培养基中培养(增殖)，
c)选择贴壁细胞，并于培养基中增殖该细胞至半融合状态(semi-vonfluency)，
d)以调配好的培养基将该经培养的细胞进行连续稀释(serial dilution)至孔室(chamber)中，该稀释足以产生小于1细胞/孔室的密度，以使该经增殖的细胞为克隆分离物(clonal isolate)，
e)将各克隆分离物进行培养(增殖)，以及选择具有产生分离骨髓干细胞群的经增殖细胞的孔室。
在其它方面，本发明是提供包括本文所述的分离骨髓干细胞(例如，但不限于hBMSC)的组织或移植物，进一步提供一种包含该移植物的细胞、组织或器官的培养。
本发明的又其它方面，是提供用于预防、治疗或降低心血管(心脏)疾病的严重性的方法。在一具体实例中，该方法包括对需要该治疗的哺乳动物投予至少一种如本文所述的分离骨髓干细胞(例如，hBMSC)。优选地，该投予为足以预防、治疗或降低哺乳动物中此类疾病的严重性。或者/再者，在可帮助提高该心脏疾病的条件下，该方法包括投予该哺乳动物至少一种本发明的移植物。
本发明进一步提供一种用于预防、治疗或降低心脏疾病的严重性医药产物。在一具体实例中，该产物包括至少一种下述的成份：如本文所述的分离骨髓干细胞群(例如，hBMSC)，及/或视需要用于分离该哺乳动物的细胞的说明书；本发明的移植物及/或视需要用于制备、维持与/或使用该移植物的说明书；本发明的细胞、组织或器官的培养，与/或视需要用于制备哺乳动物的细胞、组织或器官的说明书。
本发明亦提供藉由下列至少一步骤，及优选为下列全部步骤，以获得分离的骨髓干细胞：
a)收集来自哺乳动物的骨髓干细胞，其细胞的尺寸小于约100微米，优选为小于约50微米，优选为约40微米或40微米以下，
b)在为贴壁细胞所选择的条件下，将所收集的细胞于培养基中培养(增殖)，
c)选择贴壁细胞，并于培养基中增殖该细胞至半融合状态，
d)以调配好的培养基将该经培养的细胞进行连续稀释至孔室中，该稀释足以产生小于1细胞/孔室的密度，以使该经增殖的细胞为克隆分离物，
e)将各克隆分离物进行培养(增殖)，以及选择具有产生分离骨髓干细胞群的经增殖细胞的孔室。
本发明的其它特征、用途与优点如下所述。
附图说明
第1A至1E图显示本发明的人类骨髓干细胞(hBMSC)的特征。
第2A至2D图显示hBMSC在活体外分化成内皮细胞(EC)与平滑肌细胞(SMC)株系。
第3A至3M图显示hBMSC在活体外分化成神经中枢与内胚层株系。
第4A至4X图显示hBMSC在活体外转分化与融合成心肌细胞、内皮细胞(EC)与平滑肌细胞(SMC)。
第5A至5F图显示hBMSC的移植减低心肌梗塞鼠模型中有害的心脏重建。
第6A至6T图显示在心肌梗塞中经移植的hBMSC的移植与多株系分化。
第7A至7U图显示hBMSC的移植提高心肌细胞的分化，并降低心肌坏死。
第8A至8B图显示hBMSC的移植正调控血管新生细胞激素与心脏移植的mRNA的表现。
第9A至9L图显示hBMSC增加微血管与心肌细胞的密度，并增进心肌纤维化。
第10图显示使用多表面抗原决定位置(epitope)的FACS分析结果。
具体实施方式
如上所讨论，本发明是提供一种新颖的多能性骨髓干细胞分离株，是通过标准细胞标记检测分析法予以测定具有下列至少一种无法检测到的或低水平的细胞标记物及优选为具有所有下列细胞标记物标记物优选标记物：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHC I类受体(MHC class I receptor)与MHC II类受体(MHC class II receptor)。该标记物可藉由本文所指称的标准细胞标记物侦测分析法予以快速测定。本发明的骨髓干细胞具有广泛的重要用途，包括用于与心血管疾病相关病症的预防、治疗或缓解，尤其是与缺血(心肌缺血)、梗塞(心肌梗塞)、充血性心力衰竭(CHF)与冠状动脉相关的迹象直接或间接相关的冠状动脉疾病。
「标准细胞标记物侦测分析法」的术语意指设计用来侦测与视需要定量下述其中一种细胞标记物(即CD90、CD117、CD34等)的传统免疫或分子分析法。该传统免疫分析法的例子包括西方墨点法、ELISA与RIA。用在该分析法的优选抗体如下述所提供。一般来说请参见，Harlow andLane的Antibodies：ALaboratory Manual，CSH Publications，N.Y.(1988)，用于揭示相关的该与其它合适的分析法。特定适用于该用途的分子分析法，包括利用本文所揭示的寡核酸引子的聚合链反应(PCR)型分析法(例如，请参见表1)。请参见WO92/07075是用于有关重组PCR与相关方法的一般性揭示。亦请参见Sambrook等人的Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第二版，1989)；以及Ausubel等人的CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1989；是有关可用于侦测此细胞标记物的公认的免疫与分子分析法。
「分离」用于所涉及的骨髓干细胞意指从骨髓与其它自然伴随骨髓的细胞取代物(substituent)中分离的细胞。优选地，本发明的骨髓干细胞为至少80％或90％至95％的纯度(w/w)。骨髓干细胞，尤其是hBMSC在许多医药、临床与研究应用上的最佳条件为具有至少98至99％的同构型(w/w)。一旦进行实质上的纯化或分离，该骨髓干细胞将实质上不具有不想要的骨髓污染物。只要部分地纯化或实质地纯化，该骨髓干细胞将适合用于治疗或其它如本文所述的用途。纯化可藉由各种标准技术，例如细胞培养、显微镜与离心技术(例如Ficoll梯度)而予以测定。
可发现特别有关于分离与调节内皮细胞(ECs)的揭示，尤其是内皮祖细胞(EPCs)，例如美国专利案第5,980,887号与PCT-US99/05130(WO99/45775)。
术语「哺乳动物」意指灵长目动物、经驯养的动物，或其它哺乳动物，例如啮齿类动物或兔类。优选的灵长目动物有黑猩猩、猴子或需要治疗的人类病患。合适的经驯养的动物包括沙鼠、马、狗、猫、山羊、绵羊、猪、鸡等。优选的啮齿类动物为大鼠或老鼠。优选的骨髓干细胞为从灵长目动物分离出，尤其是从需要心血管治疗的人类个体分离出。
本发明的骨髓干细胞更特指如藉由观察(通常为显微镜)基本上呈圆形者，且具有直径为小于约25至35微米，优选为小于约15微米。本发明的其它特定细胞的端粒  限制片段(TRF)长度为小于约30至40千碱基(kilobase)，优选为小于约20千碱基，例如约17千碱基。用于量测骨髓干细胞直径与测定TRF的优选方法如下文所述。
本发明其它特定的骨髓干细胞基本上为整倍体(euploidy)，其中于细胞培养中整倍体基本上维持至少10代(passage)，优选为约20至约200代。用来测定细胞染色体套数的方法是为已知且如下文所提供。
本发明更特定的骨髓干细胞能形成内皮细胞(ECs)，例如，在与内皮细胞促进条件接触后，藉由标准内皮细胞分化分析法予以测定。该内皮细胞促进条件的实例是为此范畴中已知，并且包括与某些血管新生因子和细胞有丝分裂素接触，例如该是揭示于美国专利案第5,980,887号；PCT/US99/05130(WO 99/45775)，且合并于此以资参考。该揭示的因子与有丝分裂素，是包括酸性与碱性的纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor)(aFGF与bFGF)，血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF-1)、VEGF 165、表皮生长因子(epidermalgrowth factor，EGF)、转形生长因子α与β(transforming growthfactor)(TGF-α与TGF-β)、血小板衍生的内皮生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、肝细胞生长因子(HGF)、类胰岛素生长因子(insulin like growthfactor，IGF)、红血球生长素(erythropoietin)、群落刺激因子(colonystimulating factor，CSF)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)、颗粒球/巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、血管新生生长素(angiopoietin-1，Ang1)与一氧化氮合成(nitric oxide synthase，NOS)；及其功能性片段。请参见，Klagsbrun等人的Annu.Rev.Physiol.，53：217-239(1991)；Folkman等人的J. Biol Chem.，267：10931-10934(1992)与Symes等人的CurrentOpinion in Lipidology，5：305-312(1994)。亦可使用有丝分裂素的突变蛋白(mutein)与片段，只要它们能诱发或促进内皮细胞的形成。
优选的内皮细胞促进条件包括与VEGF接触，尤其是VEDF-1、VEGF165或两者。另外优选的内皮细胞促进条件，包与某些细胞介质蛋白(例如血清纤维结合蛋白(fibronectin))接触。请参见下文的实施例2。
术语「标准内皮细胞分化分析法」意指用于侦测与监控内皮细胞功能的任何分析法，例如揭示于限国专利案第5,980,887号与WO99/45775。优选的分法包括内皮细胞特异标记物的侦测，例如于实施例2所示者。
优选者亦有可形成平滑肌细胞(SMCs)的骨髓干细胞，尤其是与平滑肌细胞促进条件接触后，藉由标准平滑肌细胞分化分析法予以测定。典型平滑肌细胞促进条件是为此范畴中已知，且包括与前述的至少一种血管新生因子或细胞有丝分裂素接触。优选的平滑肌细胞促进条件涉及与血小板衍生的生长因子(PDGF)接触，该PDGF包括其突变蛋白或其活性片段。
术语「标准平滑肌细胞分化分析法」意指能侦测与视需要定量下述至少一种平滑肌细胞特异标准，优选为下述全部平滑肌细胞特异标准，的免疫或分子测试(例如，ELISA、西方墨点法或PCR)：αSMA、PDGFβ受体、SM22α与SMI。可接受的分析法的说明如实施例2所提供。
本发明的骨髓干细胞又进一步可形成神经细胞，特别是在与神经细胞促进条件接触后，藉由标准神经细胞分化分析法予以测定。各种神经细胞促进条件是为此范畴中已知，且包括与前述的一种或多种因子与有丝分裂素接触。优选的条件为涉及与肝细胞生长因子(HGF)单独接触，或优选为合并纤维母细胞生长因子4(FGF-4)。又进一步优选的神经细胞促进条件，涉及进一步与DMSO或医药上可接受的丁酸盐(例如，其钠盐或钾盐)接触。又进一步优选的神经细胞促进条件，包括与合适的细胞介质蛋白接触，例如，聚-L-鸟胺酸-层粘蛋白(poly-L-ornithine-laminin)。
术语「标准神经细胞分化分析法」意指能侦测与视需要定量下述至少一种平滑肌细胞特异标记物，优选为下述全部平滑肌细胞特异标记物的免疫或分子测试(例如，ELISA、西方墨点法或PCR)：GFAP、GalC、NF200、微管蛋白(tubulin)、髓磷酯碱性蛋白(myelin basic protein)、MAP2、GAD与Tau。请参见实施例2(是揭示特别优选的神经细胞促进条件)。
本发明其它合适的骨髓干细胞，包括与辅助心肌细胞(accessorycardiomyocyte)接触后可形成心肌细胞的该细胞。术语「辅助心肌细胞」意指在与骨髓干细胞接触前即为心肌细胞的细胞。该辅助心肌细胞的例子包括经人工培养的该细胞，与抑制心肌组织的心肌细胞。在某些具体实例中，藉由骨髓干细胞而形成的心肌细胞将由干细胞与辅助心肌细胞间的细胞融合来帮助。该心肌细胞(尤其是附属细胞)可藉由其中一种或组合包括该涉及于活体内、活体外和体外维特的方法予以维持。
综合上述，本发明的目的是提供一种包括本文所述的分离骨髓干细胞的移植物(在某些具体实例中是为由本文所述的分离骨髓干细胞所组成的移植物)。「移植物」意指包括来自哺乳动物的骨髓干细胞与其它视需要的细胞(内皮细胞、平滑肌细胞与心肌细胞)的细胞或组织制品。提供者(doner)定义为骨髓干细胞的来源，而受体(recipient)为接受该移植物的个体。提供者与受体间的免疫关是可为同种异体、自体或有需要的异种。本发明优选的具体实例，提供者与受体一般为同卵双生，且通常为相同个体(免疫兼容)。该例子中，对提供者与受体而言，该移植物将为免疫兼容。
「移植物」亦指投予至接受体的本发明骨髓干细胞，而变成该接受体一种多种组织或器官的一部分。有时该术语「移植」用来指骨髓干细胞意欲同化成标的组织或器官(无论是骨髓干细胞或已分化细胞)。优选涉及心血管组织(例如静脉、动脉，优选为心肌组织)的移植。本发明的移植亦可形成组织培养制品，其中本发明的骨髓干细胞是已组合其它细胞，与/或促进分化的有丝分裂素，与/或产生意欲植入的细胞选殖。若有需要，该制品可合并合成或半合成纤维，以给予该移植物结构。对某些应用优选的纤维，例如Dacron、Teflon或Gore-Tex。
本发明优选的移植物实例为从提供者分离出的hBMSC的制品，以预防、治疗或降低与心血管疾病的严重性，例如心肌坏死或梗塞。该制品可包括医药上可接受的载体(例如盐水)，及视需要可包括有丝分裂素、血管新生因子、心肌细胞、内皮细胞、内皮祖细胞与平滑肌细胞中至少一种，以帮助所欲移植的结果。
本发明优选的心肌细胞，是表现出心肌细胞特异蛋白(心肌肌钙蛋白I，cTnI)。优选的内皮细胞为ILB-4。特别有兴趣的平滑肌细胞，是表现α-SMA与相关标记物者。
如上所述，本发明是进一步提供产生如本文所述骨髓干细胞的方法，包括从人类病患获得该细胞(hBMSCs)。在一具体实例中，该方法包括下列至少一步骤，及优选为下列全部步骤：
a)收集来自哺乳动物的骨髓干细胞，其细胞的尺寸小于约100微米，优选为小于约50微米，优选为约40微米或40微米以下，
b)在为贴壁细胞所选择的条件下，将所收集的细胞于培养基中培养(增殖)，
c)选择贴壁细胞，并于培养基中增殖该细胞至半融合状态，
d)以调配好的培养基将该经培养的细胞进行连续稀释至孔室中，该稀释足以产生小于1细胞/孔室的密度，以使该经增殖的细胞为克隆分离物，
e)将各克隆分离物进行培养(增殖)，以及选择具有产生分离骨髓干细胞群的经增殖细胞的孔室。
更特而言的，在所欲为人类细胞的具体实例中，该人类骨髓干细胞(hBMSC)可从年轻男性提供者新鲜未处理的骨髓(BM)细胞获得。再者，可经市售得到该细胞。该细胞一般藉由离心、溶血和相关的标准步骤从血液细胞分离出。在可接受的缓冲液(例如DPBS)中洗涤该骨髓细胞，并过滤以收集具有尺寸约100微米的细胞，优选为小于约50微米，更优选为约40微米。举例而言，可使用标准尼龙滤材。一旦分离出该骨髓，即使其在含有生长因子与细胞激素丰富来源以及低含量葡萄糖的完整培养基中生长，优选为胎牛血清(FBS)。细胞是培养(即增殖)小于约2周，优选佳为约1周或1周以下，例如4至6天。接着将使用过的培养基(conditioned media)以新鲜的培养基置换，使贴壁细胞离开培养皿(culture dish)，并再注入新鲜培养基，以选择可被增殖的细胞。该受选细胞生长至半融合状态(50％至90％融合度)，再选一次贴壁细胞。然后使该等细胞再接种(reseed)至组织培养瓶(tissue culture flask)的完整培养基中，密度约为104细胞/立方公分。在该细胞达到半融合状态后，再将该细胞(连续地)再接种至培养瓶中且维持与104细胞/立方公分相同或相近的密度。该培养优选地会传代得比第一次更多，一般传代小于5次，优选为约2次，以连续选择增殖细胞。然后将受选细胞以小于约1细胞/孔室的密度，优选为1/2细胞/孔室的密度，连续稀释至单一孔室(例如，标准96孔盘)。优选地，以使用过的培养基来培养该细胞，以促进该细胞生长至半融合度(即小于小于50％融合度)。使具有增殖细胞群的孔室进行增殖，有需要时再接种。
特定具体实例中，该方法进一步包括表现下列至少一种标记物的可侦测含量的受选细胞群：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCI类受体(MHC class I receptor)、MHC II类受体(MHC class II receptor)或其它如本文所述的细胞标记物。用于进行该选择的方法，包括如本文所述的任何合适分析法。在需要大量干细胞的具体实例中，通常优选为使用全自动或半自动的方法，例如萤光活化细胞分类法(fluorescenceactivated cell sorting，FACS)。请参见下文所提供的实施例。
藉由下述实施例1提供产生骨髓干细胞的方法的优选实施例。
本发明亦提供一种用于预防、治疗或降低心血管疾病严重性的方法，在一具体实例中，是包括投予需要治疗的哺乳动物至少一种分离的骨髓干细胞、移植物或本文所揭示的上述两者。优选地，该等投予足以预防、治疗或降低哺乳动物此疾病的严重性。在一具体实例中，该方法进一步包括在哺乳动物体内培育该细胞或移植物至少约1周，优选约2至8周。在此范畴从事者将明了此培育时间是为弹性，且可延长或缩短以进行特殊的培育，或有鉴于需治疗个体的健康状况或年龄。骨髓干细胞典型使用的量是依据该或其它经证明的参数而定，包括欲治疗的疾病种类与痊愈所需的速度。然而约103至约107个骨髓干细胞间将满足大部分的应用，典型为约105个该细胞。细胞可藉由任何可接受的途径投予，包括将该等细胞悬浮于盐水中来投予，及以针、支架(stent)、导管等装置来投予。在一具体实例中，从事心肌缺血或梗塞的投予，将以药丸投射邻近处或直接在受伤处。
用于心肌缺血后的心肌组织再生的特定方法，是提供于实施例3与4，亦请参见实施例5至6(指出将hBMSC移植至心肌组织)。如上所述，骨髓干细胞的移植提供多种治疗效果，包括血管新生因子含量的骤升，以及增加微血管与心肌细胞的密度。
在其它具体实例中，该方法进一步包括投予需治疗的哺乳动物至少一种血管新生因子或有丝分裂素(或血管新生因子或有丝分裂素的功能性片段)。优选的血管新生因子与有丝分裂素(及使用方法)是揭示于本文，以及美国专利第5,980,887号与WO 99/45775。或者/再者，该方法可包括投予该哺乳动物能编码(encoding)至少一种血管新生因子或其功能性片段的至少一种核酸。举例而言，投予该核酸至该哺乳动物的方法是揭示于美国专利第5,980,887号与WO 99/45775。可在使用骨髓干细胞前、期间或后，以能编码血管新生因子/有丝分裂素蛋白或核酸者予以治疗。
在另一具体实例该方法进一步包括对该哺乳动物投予内皮祖细胞(EPCs)。本发明的具体实例特别发现需使用于良好的血管生长以从事心血管疾病。已揭示产生与使用内皮祖细胞的方法，例如，请参见美国专利第5,980,887号。典型的方法可包括从该哺乳动物身上分离出该内皮祖细胞，以及于活体外使至少一种血管新生因子与/或有丝分裂素与内皮祖细胞接触。
如上所述，本发明可用于各种心血管疾病的预防与治疗，包括充血性心力衰竭(CHF)，缺血性心肌病变(ischemic cardiomyopathy)、心肌缺血与梗塞。若有需要，该方法可进一步包括在寻求治疗的哺乳动物体内监控心脏功能，例如，藉由监控超声心动描记术(echocardiography)、左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)、心室短缩分率(fractional shortening，FS)、室壁运动指数(wall motion score index，WMSI)与左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)中的至少一种。本发明涉及预防或治疗特定心血管疾病的优选方法，将藉由一或多种该测试的说明来显示良好的心脏功能。术语「良好」意指相较于未接受本发明组成物的控制组而言(或接受安慰剂者)，有至少10％的进步，优选为至少20％或30％的进步。已知进行该测试的优选方法，且描述于实施例的部分。
本发明是进一步提供用于预防、治疗或降低心脏疾病严重性的医药产品，包括例如下列成分的至少一种：骨髓干细胞、尤其是人类骨髓干细胞(hBMSC)，以及视需要用于从哺乳动物体内分离出该细胞的说明书；本文所述的移植物，优选为与hBMSC或其所衍生的细胞或组织，以及视需要用于制备、维持与/或使用该移植物的说明书；此细胞、组织或器官的培养，以及视需要用于制备该等细胞、组织或器官的说明书。在一具体实例中，该产物进一步包括血管新生因子、有丝分裂素的至少一种；或其功能性片段。在另一具体实例中，该产物进一步包含能编码血管新生因子、有丝分裂素或其功能性片段的至少一种核酸。
亦如上所述，本发明是提供分离的骨髓干细胞，例如藉由本文揭示的方法所产生的hBMSC。该细胞具有的优点，例如所欲的可塑性，与长期繁殖而无培养问题(例如不期望的多倍体和失去多能性)的能力。在一具体实例中，该细胞进一步藉由收集不表现下列至少一种标记物的可侦测含量的细胞：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHC I类受体(MHC class I receptor)、MHC II类受体(MHC class II receptor)或其它如本文所述的细胞标记物。
本揭露尤其显示本发明可用从单一细胞、骨髓干细胞分离出，特别是从具有非受限多能性增殖能力与分化成三种株系(例如内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞)能力的hBMSC分离出。将人骨髓干细胞移植至急性梗塞的心肌，俾能藉由重新(de novo)分化成心肌组织以及对毗邻细胞产生所欲的旁分泌(paracrine)效果，此两种方式来减弱心肌机能障碍。
更特而言的，本揭露包括实施例是显示一种已证实位于成人骨髓内的新颖干细胞(SC)株。进一步显示从单一细胞阶段分离出该细胞，以及在140群体倍增(PDs)后的增殖未见明显的老化现象或失去多能性。此类经由无性生殖的方式增殖的人类骨髓所衍生的多能性干细胞(即hBMSC)，可侦测出CD90和CD117有最小的表现甚至没有表现。因此，我们分离出的hBMSC不属于任何已知的骨髓细胞所衍生的干细胞群，例如造血干细胞、间质(mesenchymal)干细胞或多能性成人祖细胞。hBMSC在活体外表现出有分化成全部三种胚层细胞的能力。与新生大鼠的心肌细胞、大鼠主动脉内皮细胞或大鼠平滑肌细胞共培养的hBMSC，是显示由完全分化与细胞间融合所组成的表现型改变。我们想测试急性梗塞的心肌(Myoc)是否可藉由hBMSC的移植而痊愈。使经除毛的大鼠诱发心肌梗塞后，将hBMSC移植至梗塞周围区域的心壁。藉由超音波与压力转换器来量测大鼠的心肌功能，相较于全部以骨髓细胞移植或以盐水注射控制28天后的大鼠，以该hBMSC移植的大鼠其心肌功能明显较好。观察到表现分化成心肌细胞、内皮细胞与平滑肌细胞的经受体细胞是健康地植入。在hBMSC所移植的心肌细胞中，观察到多血管新生性的细胞激素(multiple angiogenic cytokines)与主要的心肌转录因子受到正调控，而内皮细胞与心肌细胞的增殖速率亦提高。结论：一种存在于人类骨髓中的新颖多能性干细胞群，经局部移植后，该hBMSC可藉由重新的血管增生与心肌增生以及扩大增生与保护宿主心肌组织，而改善急性心肌梗塞所造成的结果。首先证明出人类骨髓所衍生的干细胞可在活体内与活体外分化成缺血性心肌再生所需要的所有成分。
如上所述，该揭露显示一种新颖的成人干细胞群，hBMSC，其不属于已知的成人干细胞群，是于单一细胞阶段初期从已混合的全部骨髓细胞培养中分离出该细胞，在培养中以无性生殖的方式增殖超过140群体倍增(PDs)，且未失去多能性与复制所造成的老化现象。再者，以无性生殖方式所衍生的hBMSC在活体外分化成三种胚层(内胚层、中胚层、神经外胚层)。同样地，将hBMSC移植至有心肌梗塞的动物模式能减弱心肌梗塞所产生的功能性与病理性的改变。另外，该经改良的心肌功能的机制不只由分化成主要心肌组织(心肌细胞、内皮细胞与平滑肌细胞)者所组成，而且亦涉及该经移植干细胞明显的旁分泌效果，其能刺激宿主心肌细胞的增生，并预防在梗塞受伤后处于危险状态的细胞坏死。我们已证实hBMSC为一种独特的成人骨髓所衍生的多能性干细胞群，其中小于1％的hBMSC表现CD90与CD117。所有定义为造血干细胞(HSC)、骨髓间质细胞(MSC)、多能性成人祖细胞(MAPC)的常见标记对象是不符合hBMSC的特性。hBMSC未表现已知的骨髓间质细胞标记物蛋白，CD105(SH2)和CD73(SH3和SH4)，甚至所用的培养基与该骨髓间质细胞(MSC)培养相类似{Barry，1999；Barry，2001}。如其它成人多能性干细胞所显示的hBMSC可塑性，事先需要表面分子的最小表现值或不表现[Jiang，2002]{Colter，2001}。由于用于初期培养与克隆分离物/选择步骤的总骨髓细胞群的用途的不同导致hBMSC独特的表面表现型。本发明着手进行干细胞生物学的一项重要问题，即是否多能性干细胞可从单一细胞阶段经培养而增殖。此处，我们首先证明活体内与活体外分化成中胚层、内胚层与神经外胚层的hBMSC，是来自从单一细胞生长成为纯系(clones)时所发生。相较于多能性成人祖细胞(MAPCs)，hBMSC不表现ESCs的基因标记物，例如Oct-4与Rex-1，该基因标记物被认为是MPACs的主要因子。我们的研究暗示该等因子涉及不分化状态的维持，以及不同于该ESCs的非受限具增殖的多能性成人干细胞。其它不同的事实是大鼠的骨髓干细胞不需要培养增殖用的白血病抑制胜(leukemia inhibitory peptide){Yoon YS，2002}，其为MPAC培养所必需。更确实地说，低细胞密度的维持在多能性维持与hBMSC增殖能力上扮演一个重要的角色。
近来的研究证实用于干细胞可塑性的细胞融合的重要性。本发明活体外的资料指出融合与转分化有助于hBMSC改成内皮细胞、平滑肌细胞与心肌细胞的表现型变化，此变化的盛行是根据细胞类型。虽然活体内未能进行可靠的研究来定量所观察到的细胞融合至表现型变化的贡献，但是活体外的研究暗示融合与转分化极可能参与其中。无论来自何种成分的贡献，经移植的hBMSC是有助于缺血性伤害后重建心肌的完整性，只是经融合的肝细胞乃有益于代谢性肝疾。此研究暗示细胞融合不并非治疗应用上所必需要的临界线，至少对于成人干细胞而言。
相较于其它干细胞，本发明的hBMSC提供心脏疾病的再生性治疗的优点。显示改进心脏功能的干细胞有EPC、CD34(+)细胞、血管母细胞(angioblast)，其只在活体内显示促进血管新生作用(neovascularization)。在缺血性动物模型中测试多能性干细胞，例如骨髓间质细胞(MSCs)、c-kit(+)株系(-)细胞(c-kit positive lineage negativecells)、SP细胞与ESC。在缺血性心脏疾病(IHD)的动物模型中已证实ESC的多能性能分化成心肌细胞，但未显示能分化成内皮细胞或平滑肌细胞。再者，由于道德问题使得ESCs的用途受阻，而此事早在临床应用中即被决定至现在。在缺血性心脏疾病中已证实只有老鼠的SP细胞，而非人类的SP细胞，能转分化成多株系，而且此治疗效果尚属未知。同样地，老鼠的而非人类的Lin(-)c-kit(+)细胞已显示多能性与治疗效果，然而在循环系统或骨髓中缺乏该干细胞，而且无法经由培养方式来增殖，因而限制该等细胞的治疗用途。已显示人类骨髓间质细胞能转分化为心肌细胞，然而其形态外观不同于该已在组织中的心肌细胞，而且内皮细胞与平滑肌细胞的分化尚未证实。相反地，本文所述的hBMSC在活体内与活体外皆具有所需的多能性，以使受损的心肌细胞再生，且在培养方式下有增殖的能力，以及揭示在治疗应用上具有功能性的能力。
所有心血管死亡人数中有50％为冠状动脉性心脏病(coronary heartdisease)，而将近40％为心肌衰竭引起。目前的发现已提供令人注意的证据，即本发明可用于预防、治疗或降低各种心脏疾病(包括与梗塞与/或缺血相关的心脏疾病)的严重性。更具体地，本发明重新促进血管-肌再生(vasculo-myogenesis)，与扩大血管新生和存在的心肌细胞增殖、降低纤维化的进展，以及改善心肌梗塞嚙齿类动物模型的血管功能。我们相信为首度证实成人人类干细胞在组织缺血而受损的过程中，可促进急性心肌梗塞的成功治疗。本发明亦可应用于预防或治疗缺血性心脏病(IHD)，尤其是改善缺血性心脏病立即和长期所造成的结果。
下述实施例意图说明，而非缩限本发明。此处所揭示的所有参考资料是合并于此以资参考。
实施例1：hBMSC的培养与特性
评估hBMSC的纯系性(clonality)、表面抗原决定位置(epitope)、整倍体(euploidy)与增殖性(proliferation)如后。购得来自年轻男性提供者的新鲜未处理过的人类骨髓。使用来自三个不同提供者的三种不同样品以用于干细胞培养。将存在于塑料皿的17％胎牛血清(FBS)的低(1克)葡萄糖的Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)中的总骨髓细胞经过连续培养(serial culture)后，以红色萤光染料(DiI)将细胞予以标记。加以限制的稀释(在96孔盘中每孔有1至2个细胞)后，选出由萤光显微镜观察得到含有单一细胞的孔。经证实含有单一细胞的孔中有6±4％(范围在2至13％)有存活及增殖的细胞(第1a图)。当细胞生长至40至50％融合度时，来自各孔(单一纯系)的细胞将再接种至6孔盘的孔中，后分别连续地再接种至25cm2组织培养瓶(T25)、T75和T175中，密度为8×103细胞/立方公分。接着，在T175中以4至8×103细胞/立方公分的密度培养细胞，并置换成1∶20至40稀释倍数。进行再接种三次，在每次培养中选出生长最快速的纯系，并以连续培养的方式增殖。从第6代中的各骨髓获得超过10个纯系后，选择2个纯系做连续培养。形态上，相较于骨髓间质细胞，hBMSC有较多的圆形细胞，其细胞尺寸较小(直径＜15μm)，并且显示有高的核质比(第1b图)。此方法所衍生的纯系细胞群已经历超过140群体倍增(PDs)，在第20至80群体倍增间的倍增时间为38±9小时。使用多表面抗原决定位置的FACS分析法证实CD90(第1c图)与CD117(第1s图)有最小的表现甚至没有表现(0至1％)。hBMSC在以培养的方式增殖时，并无法自动分化而维持其表现型。相反地，在克隆分离物前，该经培养的hBMSC表现低含量的CD105、CD90与CD117，然而间叶干细胞却表现高含量的CD29、CD44、CD73、CD105与CD90(第1b图)。不表现MHC I类ABC分子与MHC I类DR分子，以及已知的造血干细胞标记物(CD34、CD133、FLK-1、Tie2)(第1s图)。胚胎干细胞与多能性成人祖细胞(MAPCs)已知的标记物Oct-4与Rex-1，其RT-PCR分析法呈现阴性。该结果显示hBMSC不属于已知的造血干细胞(HSCs)、骨髓间质细胞(MSCs)或多能性成人祖细胞(MAPCs)，且免疫上呈现惰性(inert)。培养5群体倍增的hBMSC其平均的端粒  限制片段(TRF)的长度为约17千碱基(kb)；当120群体倍增后再测试其TRF仍旧不变(第1d图)。DNA套数(ploidy，DNA所复制的套数)为DNA以碘化丙啶(propidium iodide)染色后藉由FACS分析法予以测定。经证实从三个不同纯系培养20至140群体倍增的hBMSC，其倍数性没有增加的迹象，因此推测整倍体在以培养方式增殖时一直维持不变。
第1A图至第1E图详细讨论如后：a.各孔单一细胞所显示的相位差影像与萤光影像。b.形态上，许多hBMSC显示为直径＜15μm的圆形细胞尺寸。刻度条＝50μm。c.克隆分离物的hBMSC在培养140群体倍增后，以PE或FITC-接合的抗体予以标记，该抗体是相对应于人类CD29、CD44、CD73、CD105、CD90或免疫球蛋白同种型(isotype)对照组。以FACStar流式细胞仪(B-D)分析细胞。蓝线代表对照组的免疫球蛋白；红线表示特定的抗体(Ab)。在克隆分离物前，该经培养的hBMSC表现低含量的CD105、CD90。经克隆分离物后的hBMSC仅显示CD90没有表现以至有最小的表现(0至1％)(第1c图)。相反地，购得的间叶干细胞表现高含量的CD29、CD44、CD73、CD105与CD90。d.培养10群体倍增(线1，kb)与120群体倍增(线2，kb)hBMSC其平均的端粒 限制片段(TRF)的长度并未异于TRF的平均值。e.DNA倍数性分析。以碘化丙啶将克隆分离物前与克隆分离物后的hBMSC染色，并进行FACS分析法。经证实培养20群体倍增(左框)与140群体倍增(右框)的hBMSC，其超过双倍数的DNA量＜1％。代表性的实施例为＞3。
实施例2：hBMSC的可塑性：活体外分化
藉由采用与修改早期发布有关成人和胚胎干细胞的培养条件来测试hBMSC活体外分化的可能性，此是首先需要特定株系的细胞激素。
为了诱使分化成为内皮细胞，将密度为5×104细胞/立方公分的hBMSC再接种至覆盖0.1％白明胶(gelatin)或纤维结合蛋白(fibronectin)的玻璃孔室，该孔室内具有2％FBS、10-8地塞米松(dexamethasone)与10奈克/毫升VEGF的DMEM或EBM-2(Clonetics)。培养5天后，hBMSC形成血管状的结构(第2a图，左上框)。培养15天后，hBMSC表现出内皮细胞特定的表现型，例如冯威里氏因子(von Willebrand factor，vWF)、Flk1、VE-Cadherin、CD31、人类内皮细胞特定标记物(第一型荆豆凝集素，Ulex europaeus lectin type 1，UAE-1)(第2a图)。14天后，藉由免疫细胞化学(immunocytochemistry)证实63±8％(VE-Cadherin)至85±12％的hBMSC有内皮细胞表现型。内皮细胞特定基因、VE-Cadherin、CD34、Flk-1、Tie2与CD31的RT-PCR亦证实(分化前的)hBMSC分化成内皮细胞表现型(分化后)(第2b图)。
为了诱使分化成为平滑肌细胞群系，将密度为1×105细胞/立方公分的hBMSC再接种至未覆盖或覆盖纤维结合蛋白(fibronectin)的塑料皿，该塑料皿内有含PDGF-BB(50奈克/毫升，R&D)补充物的1至2％DMEM或EBM-2[Hellstrom，1999；Yamashita，2000]。培养14天后，以α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)与钙调节蛋白(calponin)染色且呈现阳性的hBMSC分别有89±6％与67±12％，此表示分化为平滑肌细胞的表现型(第2c图)。RT-PCR证实平滑肌细胞特定基因、αSMA、PDGFβ受体、SM22α与SM1(第2d图)。
第2a图至第2d图详细讨论如后：a.在内有DMEM且覆盖白明胶的玻璃孔室内培养5天后的Hoffman影像(左上角)，hBMSC形成典型的血管状的结构。在内皮细胞分化培养基中培养14天的hBMSC，经免疫萤光影像证实hBMSC表现出内皮细胞特定蛋白，例如Vwf、Flk-1、VE-Cadherin、CD31与UEA-1。b.使用内皮细胞特定基因、VE-Cadherin、CD34、Flk-1、Tie2与CD31的RT-PCR亦证实(分化前的)hBMSC分化成内皮细胞表现型(分化后)c.以含PDGF-BB(50奈克/毫升，R&D)补充物的2％DMEM培养14天的hBMSC，藉由免疫固定染色(IF staining)证实表现平滑肌细胞特定蛋白、α-SMA与钙调节蛋白。d.在诱发分化后，RT-PCR分析法显示仅表现平滑肌细胞特定基因、PDGFβ受体、αSMA、SM22α与SM1。RT-PCR中(第2b图和第2d图)，代表分子量标记的浓厚梯状带为600bp。
为了诱使神经株系的分化，将密度为4×104细胞/立方公分的hBMSC接种至覆盖聚-L-鸟胺酸-层粘蛋白的皿或塑料皿，该皿内有含100奈克/毫升bFGF、20奈克/毫升HGF与B27补充物的DMEM/F12[Palmer，1999；Mezey，2000；Brazelton，2000]。10至14天后，hBMSC显示各种神经株系细胞的形态与表现型特性(第3a图)。免疫萤光细胞化学(immunofluorescent cytochemistry)显示星状细胞(astrocytes)的表现型标记物(神经胶质纤维酸性蛋白，glial fibrillar acidic protein，GFAP)、寡树突细胞的半乳糖脑酯(oligodendrocytes(galactocerebroside，GalC))与神经元的神经丝200(neurofilament 200，NF200)；β-微管蛋白III亚型(β-tubulin III isoform)；β-微管蛋白III)的表现分别为22±7％、15±6％、57±9％(NF200)。RT-PCRE实各种神经株系特定基因的重新表现，例如GFAP、MBP(髓磷质碱性蛋白，于寡树突细胞)、MAP2(与微管相关蛋白2，于神经元)、GAD(麸胺酸脱羧(glutamic aciddecarboxylase)，于神经元)与Tau(于神经元)[Sanchez-Ramos，2000]。
为了了解hBMSC是否可分化成内胚层株系，将密度为3至4×104细胞/立方公分的hBMSC接种至有含10-8地塞米松、25奈克/毫升HGF、10奈克/毫升FGF-4以及10毫克/毫升DMSO或0.5毫莫耳浓度丁酸钠补充物的2％FBS的1％Matrigel[Shen，2000；Hamazaki，2001；Oh，2000；Schwartz，2002]。培养10至14天后，约60％的hBMSC获得上皮状的形态。免疫固定组织化学显示经培养的hBMSC中内胚层/肝细胞基因；HNF 3β与α-FP于第10天；HNF 1α与CK18于第14天的表现(第3g图至第31图)。RT-PCR分析法显示内胚层株系特定基因(CK18、CK19、α-FP与白蛋白)的重新表现(第3m图)。
第3a图至第3m图详细讨论如后：a.于神经性分化培养的hBMSC显示出典型神经细胞外观的形态特性。刻度条＝50μm。b至e.在诱使hBMSC神经性分化后，经免疫固定染色证实多个神经特定蛋白的表现：GFAP(于星状细胞)、GalC(于寡树突细胞)、NF200(于神经元)、β-微管蛋白III。f.在诱使神经性分化后，RT-PCR证实神经株系特定基因的重新表现，如GFAP、MBP(于寡树突细胞)、MAP2(于神经元)、GAD(于神经元)与Tau(于神经元)。g至1.hBMSC分化成内胚层(上皮状)细胞的表现型特性。在含有HGF、FGF-4与DMSO培养基的Matrigel上，经培养的hBMSC中HNF 3α(FITC)与αFP(Cy3)于第10天(第3g图至第3i图)以及CK18(FITC)与HNF 1α(Cy3)于第14天(第3j图至第31图)的免疫固定定位。m.在诱使神经性分化后，RT-PCR证实内胚层株系特定基因的重新表现，如CK18、CK19、α-FP与白蛋白。
实施例3：
为了诱使心肌分化，将hBMSC与新生大鼠的心肌细胞共培养(NRCM)。将密度为1×105细胞/立方公分的NRCM接种至含10％胎牛血清(FCS)的DMEM(低葡萄糖)中培养。于第3天，将以Dil标记的hBMSC以1∶4的比例加至经培养的NRCM中[Condorelli，2001]，并培养2周。在以抗心肌特定标记物的抗体固定及染色后，获得免疫萤光影像。经Dil标记的hBMSC(第4b图、第4f图、第4j图)由Dil标记显示出红色萤光，有心肌细胞特定蛋白而呈阳性的细胞是出现绿色，此心肌细胞特定蛋白例如心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心房利钠多(atrial natriuretic peptide，ANP)、-肌凝蛋白重链(-myosin heavy chain，-MHC)(第4c图、第4g图、第4k图)。叠合影像说明有心肌细胞特定蛋白而呈阳性染色且经Dil标记的hBMSC的分率，指出该hBMSC于共培养中显示出心肌细胞表现型的特性(第4图)。藉由RT-PCR来提高心肌转录因子的mRNA表现(第4m图)。由于共培养，GATA-4与Nkx2.5在hBMSC(左边的线)或NRCM(中间的线)培养中不表现。hBMSC与NRCM的共培养(右边的线)只诱使GATA-4与Nkx2.5的重新表现。GATA-4是为心肌特定转录因子，已知能活化数种心肌基因(例如肌凝蛋白轻链、TnT、TnI和α-MHC)和ANP的起动子。Nkx2.5为受限于心肌细胞分化初期的转录因子[Srivastava，2000；Bruneau，2002]。因此，该发现暗示hBMSC已进入朝向心肌细胞表现型的分化的路。值得注意，当把hBMSC与依NRCM调配好的培养基共培养时，观察不到hBMSC的心肌细胞分化。
如第4i图所示，NMCR与hBMSC紧紧地相连在一起，因此藉由上述实验不排除发生融合的可能性。再者，最新研究报导指出细胞融合的结果，使ESCs与骨髓所衍生干细胞可能发生表现型的变化{Ying，2002}{Terada，2002}。为了测定是否为此机制导致hBMSC分化，使用经CFDASE(羧化萤光素二乙酸酯琥珀醯亚胺酯，carboxyfluoresceindiacetate succiniimidyl ester)-标记的NRCM与经DiI标记的hBMSC共培养，而该化学染料不会转移至毗邻细胞。共培养7天后，经培养细胞先以cTnI再以经AMCA接合的二级抗体固定与染色(蓝色萤光)(第4p图)。为了避色细胞重叠，我们选择影像分析用的单层细胞区域。如第4n图至第4q图所示，某些以箭头指出的经Dil标记的hBMSC，亦同时呈现绿色(NRCM)与蓝色(cTnI)萤光的阳性反应，此暗示已发生细胞融合。呈现红色与蓝色萤光阳性反应但绿色萤光为阴性反应的细胞，才是真正经分化的细胞(第4o图至第4q图以三角形所示)。该结果显示在相同共培养的环境中，同时发生分化与融合。从3个不同实验中计数5000细胞/共培养后，分化与融合的趋势分别为2.9±1.1％和3.2±0.9％。为了测定hBMSC与内皮细胞/平滑肌细胞间融合的发生率，将大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)或大鼠平滑肌细胞(RVSMCs)分别与hBMSC共培养。当RAECs与RVSMCs达到50至60％融合度时，以CFDA-SE(绿色萤光)来标记细胞。2天后，将经Dil标记的hBMSC以1∶4的比例加至RAECs与RVSMCs的培养皿，并培养7天。然后，经培养细胞先以VE-cadherin或α-SMA再以经AMCA接合的二级抗体固定与染色。在萤光显微镜四用上述融合与真与分化用的程序，内皮细胞与平滑肌细胞分别的融合趋势为5.3±1.1％与7.4±0.9％，然而分化的趋势则各为3.4±0.7％and3.6±0.5％。该结果揭示hBMSC表现型的变化是由融合与分化所组成，因此，免疫组织化学利用株系特定标记物蛋白予以解释在活体内可能过量估计的真正分化趋势。必需了解到活体内融合与分化的速率可能不同于活体外所陈述者。
第4a图至第4m图详细说明如后。第4a图至第4m图.为了研究心肌性分化，将hBMSC与NRCM共培养。将来自F334大鼠的初级NRCM分离出并于DMEM中培养。于第4天，以1∶4的比例将经Dil标记的hBMSC加至经培养的NRCM，并培养至二周。免疫固定影像显示共培养的经Dil标记的hBMSC(第4b图、第4f图、第4j图)呈现红色，而以心肌细胞特定蛋白(cTnI(c)、ANP(g)与α-MHC(k))染色的NRCM则呈现绿色。在叠合影像(d、h、l)中的呈现双萤光阳性反应的细胞为表现心肌细胞表现型的hBMSC(箭头指示处)。注意少数hBMSC仍未经转分化(第4b图、第4d图、第4j图、第41图中以三角形指示处)。DAPI抗核染色(nuclearcounter-staining)显示没有核的重叠，暗示此明显的转分化并非起因于单纯的hBMSC与NRCMs的重叠。由RT-PCR(第4m图)评估心肌转录因子mRNA的表现。共培养前，hBMSC(线1)和NRCM(线2)培养中未表现心肌转录因子(GATA4与Nkx2.5)。共培养(线3)则指出GATA4与Nkx2.5的重新表现。第4n图至第4q图。为了研究细胞融合，将预先标记好的hBMSC和NRCM共培养。为了测定此两种细胞的融合是否造成心肌细胞表现型的改变，我们将以绿色萤光染料(DFCA-SE)标记的NRCMs(第4n图)与经Dil标记的hBMSC共培养(第4o图)。在共培养7天后，先以cTnI再以经AMCA接合的二级抗体使细胞染色(蓝色萤光)(第4p图)。在免疫固定影像(第4n图至第4p图)中，三种颜色皆呈阳性的细胞(箭头指示处)为表现cTnI蛋白的融合细胞，红色和蓝色萤光呈阳性但绿色萤光呈阴性代表转分化成心肌细胞群系的hBMSC(三角形指示处)。第4r图至第4x图。为了测定hBMSC融合与分化成内皮细胞(第4r图至第4u图)或平滑肌细胞(第4v图至第4y图)的表现型改变的分布，是将经CDFA-SE标记的大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)或大鼠血管平滑肌细胞(RVSMCs)与经Dil标记的hBMSC以4∶1的比率共培养，并培养7天。固定后，先以VF-Cadherin或α-SMA再以经AMCA接合的二级抗体使细胞染色(蓝色萤光)。在第4r图至第4u图的箭头指示处所指为表现VF-Cadherin的hBMSC(红色)与RAECs(绿色)间的融合。在第4r图至第4u图的三角形指示处表示从hBMSC分化成为内皮细胞。在第4v图至第4x图的箭头指示处所指为RVSMCs(绿色)与hBMSC(红色)间的融合。
实施例4：急性缺血性心肌的再生性效果
我们测试是否可藉由如下的hBMSC移植使经缺血伤害的心肌再生。
立即将新生大鼠的冠状动脉结扎后，将8×105hBMSC移植至梗塞周围区域的心壁。取相同数量的人类总骨髓细胞(TBMC)与相同数量的PBS作为对照组。使15只大鼠经历外科手术，14只大鼠接受hBMSC而存活，然而在4周研究期间时，TBMC与PBS组中有12只大鼠存活。为了评估心脏功能，在手术前与手术后4周皆进行心脏波音波。接受hBMSC、TBMC或PBS的大鼠的左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)、心室短缩分率(fractional shortening，FS)、室壁运动指数(wall motion score index，WMSI)的基线相似(资料未示)。治疗4周后，将接受hBMSC的大鼠与以TBMC或PBS治疗的大鼠相较其所进行的心脏超音波，显示LVEDD与LVESD皆明显地变小(LVEDD，相对于TBMC和PBS各为P＜0.05；LVESD，相对于TBMC和PBS各为P＜0.01)(第5a图与第5b图)，因此FS明显变大(相对于TBMC和PBS各为P＜0.01)(第5c图)。心壁运动指数(wall motion score index，WMSI)表示出局部心壁运动异常的程度，该指数显著优选(相对于TBMC和PBS各为P＜0.01)(第5d图)。LVEDD、LVESD、FS与WMSI在TBMC与PBS所治疗的大鼠间并未显示不同。值得注意，在hBMSC和TBMC与PBS所治疗的大鼠中，运动困难的发生率为14％和58％与67％(P＜0.05)。以侵入性血循环动力测量(invasive hemodynamic measurement)证实相较于以TBMC或PBS注射的大鼠，经hBMSC移植的大鼠左心室收缩压(LVSP)、+dP/dt(压力上升速率的最大值)及-dP/dt(压力下降速率的最大值)皆显著地变大(皆各为P＜0.01)(第5e图、第5f图)。同时，该资料显示hBMSC移植导致功能性回复的增强，以及心肌梗塞后更有利的重建。
第5a图至第5d图详细说明如后。第5a图至第5d图。心肌梗塞4周后的心脏超音波与细胞移植显示相较于以TBMC与PBS治疗的大鼠，经hBMSC移植的大鼠有较小的LVEDD、LVESD，以及优选的FS和WMSI，此指出心脏功能的增进。WMSI：心壁运动指数。第5e图、第5f图。hBMSC移植4周后以米勒(Millar catheter)做侵入性血循环动力测量。相较于对照组，有经移植hBMSC的大鼠其左心室收缩压(第5e图)以及+dP/dt和-dP/dt明显地增大。*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例5：活体内经移植hBMSC的植入生长与多株系转分化
为了测定经移植hBMSC的植入生长的尺寸与范围，取4周大心肌部分的冷冻样品做调查。在萤光显微镜下观察梗塞周围与梗塞区域中，大部分的经Dil标记的BMSC其植入生长情形(第6a图、第6b图)。相反地，从经TBMC移植的心脏显示出较小部分分散的经Dil标记的细胞，且其大多位于梗塞区域(第6c图、第6d图)。免疫表现型特性显示经移植的经Dil标记的hBMSC(红色)，对心肌细胞特定蛋白的染色呈现阳性，即cTnI与ANP(绿色)(c-MHC资料未示)，且大多数形态上出现成熟心肌细胞，而无法与原本在梗塞周围与梗塞区域中的心肌细胞区分(第6e图至第61图)，来表示心肌细胞的分化。hBMSC分化成为内皮细胞与平滑肌细胞，亦可藉由经移植hBMSC与呈现ILB4阳性的血管内皮细胞和呈现α-SMA阳性的平滑肌细胞共定位来证实，以暗示分化成为内皮细胞与平滑肌细胞的表现型(第6m图至第6t图)。心肌细胞分化只有在经hBMSC移植的大鼠。观察12至14只存活的经hBMSC移植的大鼠(85％)，藉由与心肌细胞形态上的相似与心肌细胞特定蛋白的表现(cTnI)来定义其是否分化成为心肌细胞。如第6h图与第8c图所示，在9至14只大鼠(64％)发现具有有机体构造的再生心肌细胞相似于原本正常的心肌细胞，在其它3只大鼠(21％)仅观察到分散的细胞分化。然而，在所有经hBMSC治疗的大鼠身上观察到心肌细胞特定蛋白的表现。，藉由所有经调查大鼠的形态与发现阳性标记来定义内皮细胞与平滑肌细胞的分化。同时，该发现暗示经移植hBMSC健康地移植至梗塞/缺血性心肌，并存活一段长时间而造成心肌与血管重新增生。注意，病理上研究显示经经hBMSC移植的心脏无畸胎瘤(teratoma)、血管瘤(angiomatosis)或骨形成。
第6a图至第6d图详细说明如后。使经Dil标记的hBMSC与TBMC植入生长至梗塞的心肌。移植4周后，使大部分hBMSC(红色萤光)(第6a图)植入生长至梗塞与梗塞周围区域的心肌。相反地，观察到相当小部分的TBMCs(红色萤光)，且大多在梗塞区域(第6c图)。第6b图与第6d图为第6a图与第6d图的哈福曼影像(Hoffman image)，显示出植入生长的细胞的定位。第6e图至第1图为hBMSC分化成为心肌细胞的免疫表现型特性。以cTnI(第6g图)与ANP(第6k图)使4周大的心肌细胞样品染色(各以经FITC标记的二级抗体来侦测)。此两种标记物物会使移植的经Dil标记的hBMSC呈现阳性染色，且无法与宿主的心肌细胞区分，来表示心肌细胞的再生。第6m图至第6p图是合并hBMSC至内皮细胞。心肌区域以内皮细胞标记物物ILB4染色(第6o图)，显示经Dil标记的hBMSC与血管内皮细胞共定位，暗示其转分化成内皮细胞(第6p图的箭头指示处)。第6q图至第6t图是合并hBMSC至平滑肌细胞。心肌区域以α-SMA染色(第6s图)，说明经Dil标记的hBMSC与血管平滑肌细胞共定位，表示其转分化成平滑肌细胞表现型(第6t图的箭头指示处)。
实施例6：经移植hBMSC的扩大增殖，与在宿主心肌的存活情形
有鉴于hBMSC移植的完全的生理效果不能只藉由一些大鼠的原位多株系分化程度来解释，我们下一步想要阐明经移植hBMSC是否影响增殖与宿主心肌细胞的存活。为了测定宿主心肌细胞的增殖部分，植入用以持续地输送5-溴-2’-去氧尿嘧啶(BrdU)的微小渗透压帮浦4周，以标记所有进入细胞周期的S期的细胞。从经hBMSC移植的心脏区域，大多数增殖细胞皆于宿主心肌细胞与经受体细胞能观察到(第7a图至第7d图)。相反地，在经TBMC或PBS注射的心脏中观察到相当少数呈现BrdU阳性的细胞(第7e图、第7f图)。BrdU指数，即呈现BrdU阳性的核对各区域计数得到的核总数的百分比，相较于对照组，经移植hBMSC的BrdU指数明显较高(hBMSC与TBMC、PBS；25.8±5.2％与11.2±3.1％、9.5±2.8％，P＜0.001)。双免疫组织化学(Double IF histochemistry)使用抗BrdU的老鼠抗体与ILB4或cTnI，显示心肌细胞与内皮细胞呈现BrdU阳性(第7g图至第7n图)。内皮细胞与心肌细胞的BrdU指数在经经hBMSC移植的心脏较高(与TBMC，PBS；ECs，8.3±2.7 vs.2.9±1.5，2.4±1.3，P＜0.01；CMCs，2.1±1.2 vs.0.2±0.1，0.2±0.1，P＜0.01)。该结果指出宿主心肌细胞(包括内皮细胞与平滑肌细胞)的经移植hBMSC扩大增殖。
接着，研究经受体细胞是否能影响雕亡过程，该雕亡过程一般被视为对急性心肌梗塞后的心肌退化进展有影响力的主要机制的一。使用1周大的心肌样品(n＝4)进行TUNEL分析法。雕亡指数，即TUNEL(+)核对各区域所计数得到的核总数的百分比，相较于经hBMSC移植的心脏，该1周大的心肌样品的TUNEL指数为其1/3(雕亡指数与TBMC，PBS，2.1.0.8与6.6.1.2，7.3.1.1，P＜0.01)(第7o图至第7q图)。该相异处尤其在梗塞周围区域更加明显。在α-肌小节肌动蛋白(α-sarcomericactin)或ILB4与TUNEL共同染色所获得的心肌细胞与内皮细胞的雕亡指数，在经hBMSC移植的心脏中明显减少(与TBMC，PBS；CMCs，0.5±0.1 vs.2.1±0.3，1.9±0.3，P＜0.01；ECs，0.7±0.1 vs.2.5±0.3，2.0±0.2，P＜0.01)(第7r图至第7u图)。因此，藉由该研究阐明hBMSC移植的机制可维持心肌功能，以促进受伤害的心肌细胞与内皮细胞的存活。
第7a图至第7u图详细说明如后。第7a图至第7h图。藉由BrdU免疫组织化学法来辨识增殖细胞。从经hBMSC移殖的心脏区域中，在宿主心肌细胞与经受体细胞中皆观察到大多数BrdU阳性细胞(绿色的点)。相反地，在经TBMC(第7e图)或PBS(第7f图)注射的大鼠心脏中观察到较少量BrdU阳性细胞。第7g图至第7j图。以抗BrdU(第7h图)与ILB4(第7i图)的抗体共同染色证实经hBMSC移殖的心脏的微血管内皮细胞中有BrdU阳性细胞的存在(箭头指示处)。第7k图至第7o图。以抗BrdU(第71图)与cTnI(第7m图)的抗体共同染色显示经hBMSC移殖的心脏的成熟心肌细胞中有BrdU阳性细胞的存在(箭头指示处)。第7m图至第7o图。经hBMSC(第7m图)、TBMC(第7n图)或PBS(第7o图)处理的心肌以抗α-肌小节肌动蛋白的老鼠抗体和TUNEL共同染色，以辨识雕亡心肌细胞(箭头指示处)。相较于接受TBMC(第7p图)或PBS(第7q图)的大鼠，接受hBMSC(第7o图)的大鼠的梗塞周围区域显示有较少的雕亡细胞。放大率×400。第7r图至第7s图。以抗α-肌小节肌动蛋白的老鼠抗体(红色)和TUNEL(绿色)染色后所获得的代表性影像证实来自经PBS注射的心脏的心肌细胞雕亡(箭头指示处)。第7t图至第7u图。以ILB4(红色)和TUNEL(绿色)染色后所获得的代表性影像证实来自经PBS注射的心脏的内皮细胞雕亡(箭头指示处)。
实施例7：经移植的hBMSC的旁分泌效果：血管新生细胞激素与心肌转录因子的正调控
为了辨识对经过心肌伤害的hBMSC治疗效果有影响性的可能的旁分泌机制，使用在hBMSC或PBS处理后的14天和28天所得到的心肌样品，藉由半定量RT-PCR来评估血管新生细胞激素(例如VEGF-A、血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)与血管生成素-2(Ang-2)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、碱性纤维母细胞生长因子(basicfibroblast growth factor，bFGF)、血小板衍生血小板衍生生长因子-B(platelet-derived growth factor-B，PDGF-B)、转形生长因子-(transforming growth factor-，TGF-))，与心肌转录因子(例如Nkx2.5、GATA-4、MEF2c)的mRNA的表现。相较于PBS组，调查经经hBMSC移植的心脏在第2周和第4周的所有血管新生细胞激素的表现皆明显地受到正调控(P＜0.01)。再者，经经hBMSC移植的心脏在第4周所有血管新生细胞激素仍维持高度表现。该发现暗示经移植的hBMSC可调节多种血管新生细胞激素的表现，同时可能促进血管新生与血管再生(vasculogenesis)。相较于对照组，经经hBMSC移植的心脏中GATA-4，Nkx2.5 and MEF2c的表现皆明显地受到正调控(第8b图)，暗示经移植hBMSC可藉由使宿主心肌细胞分化的增殖与/或直接分化成新的心肌细胞来增强心肌再生。正确地说，多种因子的正调控可在某种程度上解释经移植hBMSC在宿主内皮细胞与心肌细胞上的增生效果。
第8A图至第8B图详细说明如后。藉由半定量RT-PCR来评估hBMSC或PBS处理后第2与4周所获得的组织样品的mRNA的表现。RT-PCR产物的代表性凝胶照片(n＝4)(左边框架)，以及血管新生细胞激素(第8A图)与心肌转录因子(第8B图)的mRNA表现(右边框架)的定量(是根据GAPDH表现)。注意在经hBMSC移植的样品中所有因子的显著正调控。实验至少进行三次重复。**P＜0.01，***P＜0.001。
实施例8：hBMSC移植增加微血管和心肌细胞的密度及减少心肌纤维化
为了量测hBMSC移对梗塞后心肌的病理特性的最终影响，在CD31和HE染色后分别定量微血管和心肌细胞密度，并测量周边纤维化的百分比。经hBMSC移植的大鼠其微血密度为经TBMC和PBS注射的大鼠的2至2.3倍高(P＜0.01)(第9a图至第9d图)。经hBMSC移植的大鼠其心肌细胞的密度亦为经TBMC和PBS注射的大鼠的2.4至2.8倍高(P＜0.01)(第9d图至第9g图)。周边纤维化面积的百分比以麦森氏三色染色区域(Masson’s trichrome-stained sections)证实经hBMSC移植的大鼠有较小纤维化的面积(蓝色面积)(P＜0.01与TBMC，PBS)。
第9a图至第9g图详细说明如后。第9a图至第9d图。在细胞移植后4周后梗塞心肌中的CD31的代表性免疫组织化学发现显示经经hBMSC移植的心脏的微血管密度较高。**p＜0.01及TBMC和PBS。第9e图至第9h图。以HE染色的塞面积的代表性发现(第9e图至第9g图)证实经经hBMSC移植的心脏有显著的心肌恢复(salvage)与再生。**p＜0.01及TBMC和PBS。第9i图至第91图。以麦森氏三色染色的心脏代表图显示经经hBMSC移植的心脏明显地有较小的纤维化百分比面积。**p＜0.01及TBMC和PBS。
下列为进行上述实施例1至实施例8的实验所需使用的材料与方法。
1.BMSC的分离与培养
从Biowhitttaker(Cambrex)(Wakersville，MD)购得来自年轻男性提供者的新鲜未经处理的人类骨髓细胞。使骨髓细胞在1300转/分钟(rpm)的转速下离心10分钟以获得细胞沉淀物(cell pellet)。使细胞沉淀物重新悬浮于25毫升含0.5M EDTA(DPBS-E)的DPBS中。以1300rpm离心7分钟后，使细胞重新悬浮于5毫升DPBS-E和20毫升NH4Cl以诱使溶血(hemolysis)。在离心并以DPBS-E洗涤后，使细胞通过40微米(μm)尼龙(Nylon)滤器而过滤，并将细胞接种至以100微克/毫升(g/ml)的血清纤维结合蛋白(fibronectin)覆盖的6孔盘的孔中。该细胞在含有17％FBS、100U/ml盘尼西林与100μg/ml的链霉素的低(1克)葡萄糖的完整DMEM(Biowhittaker；全选择用以促进骨髓细胞的增殖)与2mM麸胺酸盐(glutamate)中于37℃与5％CO2生长4至6天后，该培养基以新鲜培养基置换，此贴壁细胞生长至60％融合度。接着，将该细胞再接种至25cm2组织培养瓶(T25)的完整培养基中，密度为1×104细胞/立方公分。在细胞达到60％融合度后，将该细胞连续地再接种至T75和T175中，且密度仍为1×104细胞/立方公分。在T175培养瓶中培养至少2代后，以CellTrackerTM CM-DiI(Molecular probes)标记该细胞，并接种至96孔盘的孔中，藉由限稀释法(limiting dilution method)使每孔密度为前孔密度的一半。并以限定稀释前收集得来的使用过的培养基予以培养，通过0.2微米的滤器来过滤，并储存于-80℃中。在萤光显微镜下，我们排除含有超过1颗细胞的孔(第1a图)显示孔中单一细胞的相位差(phasecontrast)与萤光影像。当细胞生长到40至50％融合度时，将来自单一孔的细胞连续地再接种至6孔盘的单一孔中，随后连续地再接种至T25、T75与T175中，密度为4至8×103细胞/立方公分。然后将细胞培养于T175中，并以1∶10至40的稀释倍再接种，且生长至4至8×103细胞/立方公分。
2.萤光标记细胞分选技术
对经培养的hBMSC进行hBMSC的萤光标记细胞分选技术(Fluorescent-Activated Cell Sorting，FACS)分析。使用至少三种不同选殖株的选殖前与选殖后所分离的细胞，以作为选殖株系用，利用两祖细胞在5群体倍增(PDs)与在120群体倍增时。FACS染色的程序已于先前描述{Kalka，2000#11}。简单地说，使总数为2×105的经培养细胞再悬浮于含有10％FBS与0.01％NaN3的200微升Dulbecco’s PBS(Cambrex)中，并直接与经PE-或FITC-结合的单株抗体，或先与未结合的单株抗体再以经FITC-结合的抗老鼠的免子IgG(FITC-conjugated rabbitanti-mouse IgG)(Jackson Immunoresearch)于4℃培育20分钟。适当的放射线标记免疫球蛋白做为对照组(Beckton-Dickinson，Medford，MA，USA)。染色后，以2％聚甲醛(paraformaldehyde)固定细胞。FACStar流式细胞仪(Beckton-Dickinson)上进行定量FACS。用于FACS分析的抗体为能辨识下列分子的经FITC-或Phycoerythrin(PE)-结合的抗体：CD4、CD8、CD11b(Mac-1)、CD13、CD14、CD15、CD29、CD30、CD31、CD34、CD44、CD71、CD73、CD90(Thy1)、CD117(c-kit)、CD146、CD166、HLA-DR、HLA-ABC、来自Beckton Dickson(BD)的2-微球蛋白(2-microglobulin)、来自Miltenyl Biotech(Auburn，CA，USA)的CD133(AC133)与来自Ancell(Bayport，MN，USA)的CD105(Endoglin)，以及能辨识来自Santa-Cruz的Oct4的未结合蛋白。举例来说，人类间叶干细胞(PT-2501)与培养基(PT-3001)皆购自Cambrex(Poietics)，并用于FACS。
3.DNA套数的分析
各细胞的DNA量是藉由将100g/ml核糖(Ribonuclease)处理前的细胞、以碘化丙啶(propidium iodide)染色后，由FACS分析法予以测定。
4.端粒长度分析
我们使用TeloTAGGG端粒长度分析套组(Roche，Indianapolis，IN)以测定来自三种不同选殖株在5群体倍增(PDs)与在120群体倍增时的hBMSC的端粒长度。简单地说，分离(1微克)并消化基因体DNA后，藉由凝胶电泳法将DNA片段分离，并藉由南方墨点法(southern blotting)转移至尼龙(NyIon)膜。取针对端粒  限制片段(TRF)有特异性且经长叶毛地黄配质(digoxigenin，DIG)标记的探针(probe)与经墨点法处理过的DNA片段杂交(hybridize)，并使的与对DIG有特异性且和碱性磷酸盐共价结合的抗体培育。最后，藉由碱性磷酸盐能被代谢成CDP-Star(具高灵敏度的化学冷光受质)的特性使经固定的端粒探针显像。藉由比较讯号相对于标准分子量来测定TRF的平均长度。
5.hBMSC的活体外分化
下述所有活体外研究的进行是使用三种不同选殖株于5与90群体倍增的hBMSC。为了诱发分化成为内皮细胞，将密度为5×104细胞/立方公分的hBMSC再接种至覆盖0.1％白明胶或体外连接蛋白(vitronectin)于壁上的玻璃孔室，该孔室中具有2至5％FBS、10-8地塞米松(dexamethasone)与10奈克/毫升VEGF(R&D，Minneapolis，MN)的DMEM或EBM-2(Clonetics)培养14天。为了诱发分化成为平滑肌细胞，将密度为1×105细胞/立方公分的hBMSC再接种至未覆盖或覆盖纤维结合蛋白(fibronectin)的培养皿，该培养皿内有含PDGF-BB(50奈克/毫升，R&D)补充物的1至2％DMEM或EBM-2[Hellstrom，1999#756；Yamashita，2000#757]，并培养14天。为了诱发神经株系的分化，将密度为4×104细胞/立方公分的hBMSC接种至覆盖聚-L-鸟胺酸-层粘蛋白的皿(Beckton-Dickinson)或塑料皿，该皿内有含100奈克/毫升bFGF、20奈克/毫升HGF与B27补充物的DMEM/F12[Palmer，1999#764；Mezey，2000#750；Brazelton，2000#749]，并培养14天。为了诱发内胚层株系的分化，将密度为3至5×104细胞/立方公分的hBMSC接种至有含10-8地塞米松、25奈克/毫升HGF、10奈克/毫升FGF-4补充物的2％FBS的1％Matrigel(Beckton-Dickinson)中，并培养7天，随后添加10毫克/毫升DMSO或0.5毫莫耳浓度丁酸钠。再培养7天[Shen，2000#761；Hamazaki，
2001#762；Oh，2000#763；Schwartz，2002#747]。为了诱发hBMSC的心肌细胞分化，将hBMSC与刚分离的新生大鼠的心肌细胞共培养(NRCM)。将来自F344大鼠的初级NRCM如所述方法分离[De Luca，2000#759]，并以密度为2×105细胞/立方公分予以培养。将经Dil标记的hBMSC以1∶4的比例加至10％胎牛血清(FCS)[Condorelli，2001#758]的DMEM的培养盘中，并培养10天。
6.活体内融合研究
将大鼠主动脉内皮细胞(RACEs)培养于含EGM-2 MV SingleQuots(Cambrex)的EBM-2中。将大鼠血管平滑肌细胞(RVSMCs)培养于含15％FBS、2M的L-麸醯胺和抗生素的具有1克/升葡萄糖(Cellgro)的DMEM中。分离出NRCM并如上述培养。当细胞达到50至60％融合度时(3天内)，根据操作手册以25微莫耳浓度(μM)的Vybrant CFDA SE细胞追踪套组(Molecular Probes，Engene，OR)将细胞染色。以CFDA SE所标记的细胞在萤光显微镜下呈现绿色。两天后，将经Dil标记的hBMSC(红色萤光)以1∶4的比例加至RAECs、RVSMCs或NRCM的培养盘，并培养7天。每2至4天更新培养基。为了决定融合与分化的发生率，依据来自三个不同实验中的共培养计数5000颗细胞。
7.用于免疫萤光细胞化学的抗体
为了进行免疫细胞化学，以4％冷的聚甲醛固定细胞7天，并以PBS洗涤两次。关于内皮细胞标记物，我们使用能辨识下列分子的抗体：vWF(山羊多株抗体)(1∶400，Sigma，St Louis，MO)、Flk-1(老鼠单株抗体)(1∶300，Santa-Cruz，Santa-Cruz，CA)、VE-Cadherin(老鼠单株抗体)(1∶100，BD)、CD31(老鼠单株抗体)(1∶100，BD)、UEA-1凝集素(lectin)(1∶200，Vector，Burlingame，CA)、isolectin B4(1∶200，Vector)与Dil乙醯化的LDL(Biomedical Technologies，Stoughton，MA)。关于平滑肌细胞标记物，我们使用能辨识下列分子的抗体：-平滑肌肌动蛋白(老鼠单株抗体)(1∶300)、钙调节蛋白(老鼠单株抗体)(1∶250，DAKO，Carpinteria，CA，USA)。有关神经株系标记物，我们使用能辨识下列分子的抗体：NF-200(老鼠单株抗体)(1∶400，Sigma)、-微管蛋白III(老鼠单株抗体)(1∶100，Sigma)、Gal-C(免子多株抗体)(1∶100，Sigma)、GFAP(山羊多株抗体)(1∶200，Santa-Cruz)。关于内胚层(肝细胞或其它内皮)株系标记物，我们使用CK18(老鼠单株抗体，1∶300)(Sigma)、α-胎儿蛋白(α-fetoprotein)(山羊多株抗体，1∶200)(Santa-Cruz)、白蛋白(老鼠单株抗体，1∶400)(Sigma)、HNF3.(山羊多株抗体，1∶100)(Santa-Cruz)、HNF1(免子多株抗体，1∶200)(Santa-Cruz)。有关心肌细胞标记物，使用能辨识下列分子的抗体：cTn I(2种型式：老鼠单株抗体与免子多株抗体，1∶100)(Chemicon，Temecular，CA)、心室肌凝蛋白重链α(α-MHC)(老鼠单株抗体，1∶100)(Chemicon)、α-肌小节肌动蛋白(选殖株EA-53，老鼠单株抗体，1∶200)(Sigma)、ANP(免子多株抗体)(Chemicon)。对照组老鼠、免子或山羊皆购自Sigma。抗老鼠、免子或山羊抗体的二级抗体(AMCA，1∶150，FITC or Cy-2，1∶200；Cy-3，1∶200)是购自JacksonImmunoresearch(West 10 Grove，PA)。
8.活体内实验的研究设计
所有程序是根据Caritas St.Elizabeth’s Institutional Animal Careand Use Committee而进行。替6至7周大的雌性经除毛大鼠(Hsd：RH-rnu大鼠，15 Harlan，Indianapolis，IN)进行外科手术，使其具急性心肌梗塞，接着立即在梗塞周围区域的5处(前基位(basal anterior)、前中位(midanterior)、侧中位(mid-lateral)、前顶位(apical anterior)、侧顶位(apicallateral))给予总量为200微升的8×105hBMSC或8×105人类新鲜总骨髓细胞(TBMC)或PBS。随意地安排使各群组有15只大鼠。培养前TBMCs的制备如同hBMSC一般。细胞移植中如先前所述，将hBMSC和TBMCs以碳青(carbocyanine)染色[Kalka，2000；Kawamoto，2001]。在隔离大鼠(n＝4，每一组群)的背部皮肤下植入微渗透帮浦(模型2ML4，Alzet，PaloAlto，CA)于手术后注入1.25毫克的BrdU/d(Sigma)(溶于以1∶1(体积/体积)混合的二甲基亚  与0.154莫耳浓度的NaCl)并于4周后牺牲{McEwan，1998}。为了TUNEL分析法与分子学的研究，将其它大鼠进行相似的手术，并于手术后1及2周后牺牲(n＝4，每一时间点)。手术后28天，使大鼠进行心脏超音波(Echo)与侵入性血循环动力测量。然后，将食盐水灌注至大鼠的主动脉使其牺牲。于尸体解剖时，将大鼠的心脏从顶部至基部切成3个横切面，以4％聚甲醛、甲醇或冷冻于OCT化合物而固定的，并切成5微米厚。
9.急性心肌梗塞模式
如我们实验室先前所述方法来诱发急性心肌梗塞的发生[Kawamoto，2003；Kawamoto，2001]。接着进行胸腔切开术，以及在心脏周围切口处安置人造供氧器(模型683，Harvard Apparatus)，在靠近左前降(LAD)冠状动脉源头处以6-0 prolene缝线(Ethicon)将此冠状动脉结扎。
10.心脏功能量测
如先前方法{Kawamoto，2003}，以连接SONOS 5500(AgilentTechnologies，Andover，MA，USA)的6.0至15.0MHz超频宽线型换能器进行经胸前超声心动描记术、测量左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)、心室短缩分率(FS)。所有测量值皆为至少3个连续心循环的平均值。利用心壁运动指数(WMSI)来评估局部的心壁运动异常{Oh JK，1999}。左心室心壁运动分析是根据个体部分的收缩阶段。在此指数系统中，指数愈高代表心壁运动异常愈严重(1：正常；2：运动减退(hypokinesis)3：运动不能(akinesis)；4：运动困难(dyskinesis)；5：动脉瘤(aneurismal))。将心壁运动指数的总合除以可见部分的总数得到WMSI；此WMSI代表局部的心壁运动异常程度。正常WMSI为1。为了量测血循环动力的变量，经由右颈动脉将1.4法国高保真压力换能器(French high fidelity pressure transducer)(Micro-tip catheter，MillarInstrument，Houston，TX)导至左心室。待血循环动力稳定后，利用polygraph(模型7P)记录LVSP、LVEDP、+dP/dt与-dP/dt(Grass Instrument，West Warwick，RI，USA)[Kawamoto，2001]。
11.心肌组织的免疫萤光组织化学
以4％聚甲醛(PFA)使OCT嵌入的冷冻部分固定，并用于下述的免疫萤光组织化学。为了辨识内皮细胞，以经生物素连接的异凝集素B4(biotinylated isolectin B4)(1∶200；Vector)做为一级抗体，接着为链霉抗生物素-FITC(streptavidin-FITC)[Kawamoto，2001]。平滑肌细胞的辨识是藉由老鼠  -SMC抗体(Sigma，1∶200)接着再用经FITC接合的抗老鼠的山羊IgG(FITC-conjugated goat anti-mouse IgG)。心肌细胞的辨识是藉由抗cTnI与ANP的抗体，接着再用经FITC接合的抗免子的山羊IgG。
12.BrdU免疫组织化学与藉由TUNEL测定雕亡
BrdU是以抗-BrdU的绵羊抗体(1∶50；Biodesign)，再用链霉抗生物素-FITC(streptavidin-FITC)(1∶100；Vector)予以测定。以DAPI进行抗核染。计数梗塞周围区域的BrdU阳性细胞，其中该梗塞周围区域包括可见视野的小于20％的结疤组织(x200放大率)。
如[Fujio，2000]所述，使用原位细胞侦测套组(Roche)以末端由去氧核酸基转化  (TdT)所媒介的dUTP-生物素的缺口末端标记的方法(terminal deoxynucleotidyltransferase(nick end labeling(TUNEL))进行DNA片段的原位标记。2周后，在心肌区域进行TUNEL染色(n＝4，每次)。简单地说，由20微克蛋白K所处理的区域。洗涤后，区域培育于与萤光dUTP混合的TdT溶液中。然后以DAPI抗染该区域以定位细胞核。为了测定心肌细胞或内皮细胞的雕亡细胞核的比率，以抗α-肌小节肌动蛋白(α-sarcomeric actin)或抗ILB4的单株抗体抗染该组织。以显微镜在x 200放大率下检测该组织区域，在全部8个随机视野(全总数～10,000细胞核)下检测梗塞/梗塞周围区域。此雕亡细胞的比例称为雕亡指数(apoptotic index)。
13.RT-PCR的分析
如先前所述{Yoon，2003}来进行RT-PCR的分析。根据操作手册使用Rnaqueous套组(Ambion，Austin，Texas，USA)从经培养细胞或从心脏萃取全部的RNA。利用六聚物与Moloney鼠的白血病病毒反转录(Superscript II套组，Roche)使1微克的全部RNA进行反转录作用。使用Advantage cDNA polymerase mix(Clontech)or Taq聚合(Roche)将该反转录产物进行PCR。为了做半定量RT-PCR，根据GAPDH的表现来计算各基因mRNA表现的定量。PCR引子与接合(annealing)温度的使用如表1所述。藉由代表分子量标记的梯状带为100bp的1.5％琼脂糖(agarose gel)电泳(Life Technologies)来分析RT-PCR的产物，并以UV imagerEagle-Eye II(Stratagene)来定量。
14.心肌组织学与形态学的分析
如先前所述{Kawamoto，2003；Kawamoto，2001}，将4周的样品以抗CD31与抗H&E染的单株抗体染色后，计数微血管的密度与心肌细胞的密度。为了计数，随机从梗塞/梗塞周围区域选出清楚可见微血管和心肌细胞剖面的全部8个可见视野，在x 200放大率下计数微血管或心肌细胞的数目(n＝6，每个群组)。为了测定纤维化面积，如先前所述[Kawamoto，2001]，在以Masson’s trichrome(Sigma)染色后，测量所有组织区域的纤维化面积/左心室面积的平均比例。
15.统计上的分析
藉由比较两组群间所用的单方史都华检定法(unpaired Student’s ttest)予以进行统计上的分析，接着用比较超过两个以上组群所用的薛费氏检定法(Scheffe’s post-hoc)进行变异数分析(ANOVA)。。P＜0.05是认为表示统计上的重要性。
16.聚合连锁反应(PCR)引子
下列表1显示作为此处所揭示的实验进行所用的寡核酸引子。”产物尺寸”是有关于经放大产物的所预期的尺寸(千碱基)。
表1.RT-PCR引子序列与所预期的产物尺寸
引子     序列 产物尺寸(千碱基)
人类Oct4-fOct4-rCD34-fCD34-rKDR-fKDR-rTie2-fTie2-rCD31-fCD31-rVE-cadherin-fVE-cadherin-rSM1-fSM1-rSM22-fSM22-rPDGFRb-fPDGFRb-rGATA4-fGATA4-rNkx2.5-fNkx2.5-rA_FP-fAFP-rAlb-fAlb-rCK18-fCK18-rCK19-f 5’-GAG AAC AAT GAG AAC CTT CAG GAG A-3’5’-TTC TGG CGC CGG TTA CAG AAC CA-3’5’-ACC ACT TCC CTC ATC TCT CCT CCA A-3’5’-AGG GTG AGG GAG GCA GAG ACA GAA A-3’5’-TGC AGG ACC AAG GAG ACT ATG T-3’5’-TAG GAT GAT GAC AAG AAG TAG CC-3’5’-ATC CCA TTT GCA AAG CTT CTG GCT GGC-3’5’-TGT GAA GCG TCT CAC AGG TCC AGG ATG-3’5’-AGG TCA GCA GCA TCG TGG TCA ACA T-3’5’-GTG GGG TTG TCT TTG AAT ACC GCA G-3’5’-CTC TGC ATC CTC ACC ATC ACA G-3’5’-TAG CCG TAG ATG TGC AGC GTG T-3’5’-TAA ACA CCT GCC CAT CTA CTC GG-3’5’-ATC TCA TCA TCC TGG GCT GCT GG-3’5’-CGG CTG GTG GAG TGG ATC ATA G-3’5’-CCC TCT GTT GCT GCC CAT CTG A-3’5’-GCC TTA CCA CAT CCG CTC-3’5’-TCA CAC TCT TCC GTC ACA TTG C-3’5’-AGA-CAT-CGC-ACT-GAC-TGA-GAA-C-3’5’-GAC-GGG-TCA-CTA-TCT-GTG-CAA-C-3’5’-CTT-CAA-GCC-AGA-GGC-CTA-CG-3’5’-CCG-CCT-CTG-TCT-TCT-TCA-GC-3’5’-TGC AGC CAA AGT GAA GAG GGA AGA-3’5’-CAT AGC GAG CAG CCC AAA GAA GAA-3’5’-TGC TTG AAT GTG CTG ATG ACA GGG-3’5’-AAG GCAAGT CAG CAG GCA TCT CAT C-3’5’-GTA CTG GTC TCA GCA GAT TGA GGA G-3’5’-GCT TCT GCT GGC TTA ATG CCT CAG A-3’5’-ATG GCC GAG CAG AAC CGG AA-3’ 219421458512387389732489443475233343181499318
CK19-rGFAP-fGFAP-rMAP2-fMAP2-rMBP-fMBP-rGAD-fGAD-rTau-fTau-r大鼠VEGF-fVEGF-rbFGF-fbFGF-rPDGF-B-fPDGF-B-rNkx2.5-fNkx2.5-rGATA4-fGATA4-rMEF2c-fMEF2c-rAng-1-fAng-1-rAng-2-fAng-2-rHGF-fHGF-rTGF- -fTGF- -rGAPDH-fGAPDH-r 5’-CCA TGA GCC GCT GGT ACT CC-3’5’-TCA TCG CTC AGG AGG TCC TT-3’5’-CTG TTG CCA GAG ATG GAG GTT-3’5’-GAA GAC TCG CAT CCG AAT GG-3’5’-CGC AGG ATA GGA GGA AGA GAC T-3’5’-TTA GCT GAA TTC GCG TGT GG-3’5’-GAG GAA GTG AAT GAG CCG GTTA-3’5’-GCG CCA TAT CCA ACA GTG ACA G-3’5’-GCC AGC AGT TGC ATT GAC ATAA-3’5_-GTA AAA GCA AAG ACG GGA CTG G-3_，5_-ATG ATG GAT GTT GCC TAA TGAG-3_5’-GGA CCC TGA CTT TAC TGC TGT ACC-3’5’-CCG AAA CCC TGA GGA GGC TCC-3’5’-TCT ACT GCA AGA ACG GCG GCT TCTT-3’5’-CAG TGC CAC ATA CCA ACT GGA GTA T-3’5’-CCG AGG AGC TTT ATG AGA TGC TGA G-3’5’-AGC TGC CAC TGT CTC ACA CTT GCA T-3’5’-CAG TGG AGC TGG ACA AAG CC-3’5’-TAG CGA CGG TTC TGG AAC CA-3’5’-CTG TCA TCT CAC TAT GGG CA-3’5’-CCA AGT CCG AGC AGG AAT TT-3’5’-AGC AAG AAT ACG ATG CCA TC-3’5’-GAA GGG GTG GTG GTA CGG TC-3’5’-AGT CGG AGA TGG CCC AGA TAC AAC A-3’5’-TCC AGC AGT TGG ATT TCA AGA CGG G-3’5’-TAC GTG CTG AAG ATC CAG CTG AAG G-3’5’-AGT TGG AAG GAC CAC ATG CGT CGA A-3’5′-CCA ACA CAA ACA ACA GA  GGG TGG A-3′5′-CGA CCA GGA ACA ATG ACA CCA AGA A-3′5′-CAA CTA CTG CTT CAG CTC CAC AGA G-3′5′-AGG AGC GCA CGA TCA TGT TGG ACA A-3′5’-TCG GTG TGA ACG GAT TTG GCC GTA T-3’5’-AGC CCT TCC ACG ATG CCA AAG TTG T-3’ 383527374284512/612434，564，631287479216275407，311169259593314505
-f：前置引子，  -r：反置引子
补充资料
第10图.使用多表面抗原决定位置的FACS分析证实hBMSC中无CD117的表现至有最小的CD117的表现(＜1％)。MHC I类的ABC分子与MHC II类的DR分子为阴性，且而HSC标记物(CD34、CD133、Flk-1、Tie2)未表现。
下述参考资料1至80为全部的实时揭露文件，其内容合并于此以资参考。
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虽然本发明以特定的具体实例做为参考资料来描述，但本发明可在不背离本发明精神前提下进行修改与变化，本发明是以下述申请专利范围定义。所有参考资料其内容合并于此以资参考。
序列表
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gaggaagtga atgagccggt ta
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gcgccatatc caacagtgac ag
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gccagcagtt gcattgacat aa
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gtaaaagcaa agacgggact gg
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atgatggatg ttgcctaatg ag
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ggaccctgac tttactgctg tacc
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ccgaaaccct gaggaggctc c
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tctactgcaa gaacggcggc ttctt
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cagtgccaca taccaactgg agtat
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ccgaggagct ttatgagatg ctgag
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agctgccact gtctcacact tgcat
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cagtggagct ggacaaagcc
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tagcgacggt tctggaacca
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ctgtcatctc actatgggca
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ccaagtccga gcaggaattt
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agcaagaata cgatgccatc
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gaaggggtgg tggtacggtc
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agtcggagat ggcccagata caaca
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tccagcagtt ggatttcaag acggg
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tacgtgctga agatccagct gaagg
25
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agttggaagg accacatgcg tcgaa
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ccaacacaaa caacagaggg tgga
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<223>人工序列的描述：合成引子
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cgaccaggaa caatgacacc aagaa
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caactactgc ttcagctcca cagag
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aggagcgcac gatcatgttg gacaa
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tcggtgtgaa cggatttggc cgtat
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agcccttcca cgatgccaaa gttgt    25

Claims (44)

1.一种分离的骨髓干细胞，其通过标准细胞标记检测分析法予以测定具有下列至少一种无法检测到的或低水平的细胞标记物及优选为具有所有下列的细胞标记物：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct 4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCI类受体和MHCII类受体。
2.如权利要求1所述的分离的骨髓干细胞，其中该细胞通过观察检测基本上呈圆形，且具有直径为小于约25至35微米，优选为小于约15微米。
3.如权利要求1至2中任一所述的分离的骨髓干细胞，其中该细胞具有的端粒限制片段长度(TRF)为小于约30至40千个碱基(kilobase)。
4.如权利要求1至3中任一所述的分离的骨髓干细胞，其中该细胞基本上为整倍体。
5.如权利要求1至4中任一所述的分离的骨髓干细胞，其中该细胞的整倍体在细胞培养中基本上维持至少约10代，优选为介于约20至约200代之间。
6.如权利要求1至5中任一所述的分离的骨髓干细胞，其中该细胞通过标准EC分化分析法予以测定，在与EC促进条件接触后形成内皮细胞(ECs)。
7.如权利要求6所述的分离的骨髓干细胞，其中该EC促进条件包括与血管内皮生长因子(VEGF)接触。
8.如权利要求1至7中任一所述的分离的骨髓干细胞，其中该细胞通过标准SMC分化分析法予以测定，在与SMC促进条件接触后形成平滑肌细胞(SMCs)。
9.如权利要求8所述的分离的骨髓干细胞，其中该SMC促进条件包括与血小板衍生生长因子(PDGF)接触。
10.如权利要求1至9中任一所述的分离的骨髓干细胞，其中该细胞通过标准神经细胞分化分析法予以测定，在与神经细胞促进条件接触后形成神经细胞。
11.如权利要求10所述的分离的骨髓干细胞，其中该神经细胞促进条件包括与肝细胞生长因子(HGF)接触。
12.如权利要求11所述的分离的骨髓干细胞，其中该神经细胞促进条件进一步包括与成纤维细胞生长因子4(FGF-4)接触。
13.如权利要求12所述的分离的骨髓干细胞，其中该神经细胞促进条件进一步包括与DMSO或医药上可接受的丁酸盐接触。
14.如权利要求1至12中任一所述的分离的骨髓干细胞，其中该细胞在与辅助心肌细胞(accessory cardiomyocyte)接触后形成心肌细胞(cardiomyocyte)。
15.如权利要求14所述的分离的骨髓干细胞，其中该形成的至少一部份是与该细胞与该辅助心肌细胞间的融合相关。
16.如权利要求1至15中任一所述的分离的骨髓干细胞，其中该辅助心肌细胞维持于体外、活体外或活体内。
17.一种移植物，其包括如权利要求1至16中任一所述的至少一种分离的骨髓干细胞。
18.如权利要求17所述的移植物，其中该移植物进一步包括由该分离的骨髓细胞产生的心肌细胞。
19.如权利要求17至18中任一所述的移植物，其中该移植物进一步包括由该分离的骨髓细胞产生的ECs。
20.如权利要求17至19中任一所述的移植物，其中该移植物进一步包括由该分离的骨髓细胞产生的SMCs。
21.如权利要求17至20中任一所述的移植物，该移植物进一步包括来自受体的细胞，其中该受体细胞与该骨髓干细胞是哺乳动物的细胞。
22.如权利要求21所述的移植物，其中该受体细胞与该分离的骨髓干细胞是为同种异体的、自体的或同源的。
23.如权利要求17至22中任一所述的移植物，其中该移植物是维持于活体内或体外。
24.如权利要求18所述的移植物，其中由该骨髓细胞产生的心肌细胞表达CMC特定蛋白(cTnI)。
25.如权利要求19所述的移植物，其中由该骨髓细胞产生的ECs表达ILB-4。
26.如权利要求20所述的移植物，其中由该骨髓细胞产生的SMCs表达α-SMA。
27.一种细胞培养物、组织或器官，其包括如权利要求17至26中任一所述的移植物。
28.一种用于预防、治疗或降低心脏疾病严重性的方法，该方法包括对需要治疗的哺乳动物投予至少一种如权利要求1至16中任一所述的该分离骨髓干细胞与如权利要求17至26中任一所述的该移植物，其中该投予是足以预防、治疗或降低哺乳动物该疾病的严重性。
29.如权利要求28所述的方法，其中该方法进一步包括在该哺乳动物体内培育该细胞或移植物至少一周。
30.如权利要求29所述的方法，其中在该哺乳动物体内的培育是介于约2周至8周间。
31.如权利要求28至30中任一所述的方法，其中该方法进一步包括对该哺乳动物投予至少一种血管新生因子。
32.如权利要求28至31中任一所述的方法，其中该方法进一步包括投予编码至少一种血管新生因子或其功能性片段的至少一种核酸。
33.如权利要求28至32中任一所述的方法，其中该方法进一步包括对该哺乳动物投予内皮祖细胞(EPCs)。
34.如权利要求33所述的方法，其中该方法进一步包括从该哺乳动物分离该EPCs，并于活体外使该EPCs接触至少一种血管新生因子。
35.如权利要求28至34中任一所述的方法，其中该心脏疾病是充血性心力衰竭(CHF)，缺血性心肌病变、心肌缺血或梗塞的一种或多种。
36.如权利要求28至35中任一所述的方法，其中该方法进一步包括监控哺乳动物的心脏功能。
37.如权利要求36所述的方法，其中该监控心脏功能是为超声心动描记术、左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)、心室短缩分率(fractional shortening，FS)、室壁运动指数(wall motion scoreindex，WMSI)与左心室收缩压ILVSP)的至少一种。
38.一种用于预防、治疗或降低心脏疾病严重性的医药产品，该产品包括下述成分的至少一种：如权利要求1至16中任一所述的分离骨髓干细胞以及任选的用于从哺乳动物体内分离该细胞的说明书；如权利要求17至26中任一所述的移植物以及任选的用于制备、维持和/或使用该移植物的说明书；如权利要求24所述的细胞培养物、组织或器官以及任选的用于制备该细胞培养物、组织或器官的说明书。
39.如权利要求38所述的医药产品，其中该产品进一步包括至少一种血管新生因子或其功能性片段。
40.如权利要求38至39中任一所述的医药产品，其中该产品进一步包括编码至少一种血管新生因子或其功能性片段的至少一种核酸。
41.一种由下述步骤所获得的分离的骨髓细胞群：
a)收集来自哺乳动物的骨髓细胞，其细胞的尺寸小于约100微米，优选为小于约50微米，更优选为约40微米或40微米以下，
b)在为贴壁细胞所选择的条件下，将所收集的细胞于培养基中培养(增殖)，
c)选择贴壁细胞，并于培养基中增殖该细胞至半融合状态，
d)以调配好的培养基将该培养的细胞进行连续稀释至孔室中，该稀释足以产生小于约每孔室1个细胞的密度，以制得该增殖的细胞的克隆分离物，
e)将各克隆分离物进行培养(增殖)，以及选择具有产生分离骨髓细胞群的增殖细胞的孔室。
42.如权利要求40所述的分离的骨髓细胞群，其中该步骤进一步包括收集不表达可检测水平的下列至少一种细胞标记物的细胞：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCI类受体和MHCII类受体。
43.一种制备如权利要求1至16中任一所述的分离的骨髓细胞的方法，该方法包括：
a)收集来自哺乳动物的骨髓细胞，其细胞的尺寸小于约100微米，优选为小于约50微米，更优选为约40微米或40微米以下，
b)在为贴壁细胞所选择的条件下，将所收集的细胞在培养基中培养(增殖)，
c)选择贴壁细胞，并于培养基中增殖该细胞至半融合状态，
d)以调配好的培养基将该培养的细胞进行连续稀释至孔室中，该稀释足以产生小于每孔室1个细胞的密度，以制得该增殖的细胞的克隆分离物，
e)将各克隆分离物进行培养(增殖)，以及选择具有生成分离的骨髓细胞群的增殖细胞的孔室。
44.如权利要求43所述的方法，其进一步包括收集不表达可检测水平的下列至少一种细胞标记物的细胞：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCI类受体和MHCII类受体。
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