EA022736B1

EA022736B1 - Способ получения эндотелиальных клеток (варианты)

Info

Publication number: EA022736B1
Application number: EA201000378A
Authority: EA
Inventors: Сергей Львович КИСЕЛЕВ; Мария Андреевна ЛАГАРЬКОВА
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий"
Priority date: 2008-03-19
Filing date: 2008-12-24
Publication date: 2016-02-29
Also published as: EA201000378A1; EP2277993B1; EP2277993A1; WO2009116893A1; EP2277993A4; RU2359030C1

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека и их применению. Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека предусматривает дифференцировку ЭСК человека на подложке и в синтетической среде, которые обеспечивают направленную прямую дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки на основе смеси DMEM/FI2 с заменителем сыворотки KnockOut с факторами роста VEGF, SCF, BMP4, bFGF, TGFbeta в эффективных количествах, причем TGFbeta добавляют на 3-6 день дифференцировки. Также может быть использована среда для дифференцировки на основе смеси DMEM/FI2 с фетальной бычьей сывороткой с факторами роста VEGF, SCF, bFGF. Сепарацию проводят на 3-9 день методом иммунологической селекции с использованием маркеров, специфических для эндотелиальных клеток, после чего полученные эндотелиальные клетки культивируют в указанной среде при плотности посева не менее 50000 клеток на 1 см.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека и их применению. Человеческие эмбриональные стволовые клетки (обозначение, принятое в мире ΙιΕδί'Ό нужно рассматривать как ценный источник для регенеративной медицины из-за их способности дифференцироваться во все типы клеток. Полученные в результате дифференцировки эндотелиальные клетки могут найти широкое применение в медицинской практике и в изучении механизмов дифференцировки. Эндотелиальные клетки не только выстилают стенки кровеносного сосуда, но и также способны мигрировать в потоке крови к различным местам. Таким образом, они могли использоваться не только для регенерации судов с помощью их интеграции или секреции ростовых факторов, но и служить транспортным средством для терапевтического гена или доставки препарата. Однако потенциальное клиническое применение дифференцированных ίη νίίτο клеток требует подтверждения, что желательный клеточный фенотип будет поддержан без возвращения к плюрипотентному состоянию.

Предшествующий уровень техники

На стадии развития бластоцисты происходит формирование внутренней клеточной массы бластоцисты (ВКМ), из которой и получают линии ЭСК. Способность ΡΕδΟδ дифференцироваться в некоторые специфические типы клеток в настоящее время интенсивно изучается. Общая цель таких исследований обычно состоит в том, чтобы получать специализированные функциональные клетки. Однако дальнейшая возможность применения этих клеток для лечения человека может быть реализована только при условии обеспечения устойчивой клеточной специализации. Таким образом, нужно рассматривать не только морфологические, иммунологические или функциональные свойства клетки, но также и генетические и эпигенетические.

Дифференцировка ЭСК по определенному пути сопровождается изменением паттерна экспрессии генов, от генов, характерных для плюрипотентного состояния, к тканеспецифическим генам. Изменение паттерна экспрессии осуществляется за счет затухания экспрессии ключевых транскрипционных факторов, участвующих в поддержании плюрипотентности, и экспрессией тканеспецифических транскрипционных факторов. Параллельно работают эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов, которые репрессируют гены, необходимые для плюрипотентного состояния, и активируют тканеспецифические. Так как ЭСК - это ίη νίίτο аналог клеток эпибласта, искусственно поддерживаемых в недифференцированном состоянии, при изменении условий культивирования ЭСК спонтанно дифференцируются в различные типы клеток. Ιη νίίτο спонтанная дифференцировка ЭСК человека наблюдается как при длительном культивировании прикрепленных колоний, так и в процессе роста эмбриоидных телец (ЭТ) в суспензии. В отличие от ЭСК мыши не все линии ЭСК человека легко образуют эмбриоидные тельца, и ни одна линия ЭСК не образует эмбриоидные тельца из одиночных клеток.

Для ЭСК человека была показана способность к дифференцировке во многие типы клеток: нейроны и глия, эндотелий, кератиноциты, трофобласты, кардиомиоциты, остеобласты, клетки крови, гепатоциты, инсулин-продуцирующие клетки и некоторые другие.

Производные энтодермы получить оказалось труднее всего. В недавно опубликованных сообщениях о дифференцировке ЭСК человека в инсулин-секретирующие клетки (1) и гепатоциты (2) было показано, что по белковым и генетическим маркерам они совпадают с зрелыми инсулин-секретирующими клетками или гепатоцитами. Однако факторы, определяющие дифференцировку в энтодерму, плохо охарактеризованы, и почти отсутствуют маркеры ранней энтодермальной дифференцировки.

В отличие от ЭСК мыши, которые легко дифференцируются в кардиомиоциты в отсутствии 1еикет1а тЫЫЮгу ГасЮг ЫР, спонтанная дифференцировка ЭСК человека наблюдается у разных линий ЭСК в разном проценте случаев - от спонтанно сокращающихся участков в 70% ЭТ до полного отсутствия спонтанной дифференцировки (3). Показано, что кардиомиоциты, дифференцированные из ЭСК человека, экспрессируют транскрипционные факторы Икх 2.5, ОАТЛ4, а также специфические маркеры кардиомиоцитов - тропонин 1 и тяжелую цепь альфа-миозина. Недавно опубликована работа по дифференцировке кардиомиоцитов в бессывороточной среде, минуя стадию эмбриоидных телец (4). При длительном культивировании ЭСК могут подвергаться искусственной случайной селекции. Кроме того, как оказалось, ЭСК, идентичные по основным морфологическим характеристикам и экспрессии основных генов, могут отличаться эпигенетическим статусом в регуляторных областях некоторых генов. Эти факторы могут приводить к тому, что клеточные линии ЭСК будут иметь преимущественные пути дифференцировки. То есть, например, ЭСК будут легко дифференцироваться в нейроны и плохо в кардиомиоциты. Возможно, именно разница в эпигенетическом статусе ЭСК мыши и человека может объяснить столь различный потенциал дифференцировки.

При нормальном развитии эмбриона сосудистая ткань формируется из мезодермы. Вскоре после гаструляции мезодерма формируется как отдельный слой между экто- и эндодермой. Предполагается, что эндотелиальные и гематопоэтические клетки происходят от общего мезодермального предшественника гемангиобласта (5). Клетки-предшественники, потенциально способные образовывать гематопоэтические и эндотелиальные клетки, были идентифицированы на модели мышиных ЭСК (6, 7, 8) и лишь позже ίη νίνο при изучении гаструляции мышиного эмбриона (9). Существует три основных технических под- 1 022736 хода для изучения дифференцировки ЭСК в клетки эндотелия и гематопоэтические клетки. Первый дифференцировка ЭСК в эндотелиальные или гематопоэтические клетки через стадию ЭТ (10-15). Второй - совместное культивирование ЭСК со стромальными клетками (16, 17). Третий - дифференцировка ЭСК в двумерных условиях (18, 8).

Дифференцировка ЭСК через образование ЭТ - это всегда спонтанная, ненаправленная дифференцировка. Как уже упоминалось, ЭТ содержит клетки, происходящие из разных зародышевых листков, и поэтому доля клеток требуемого типа мала. Процент клеток эндотелия в эмбриоидных тельцах составляет около 2%. Кроме того, этот подход обладает еще несколькими ограничениями. Например, трудно наблюдать клетки в микроскоп, проводить анализ дифференцировки единичных клеток, трудно разделять клетки из агрегатов клеток в ЭТ. Однако на сегодняшний день в большом количестве публикаций используется именно этот подход. Это обусловлено, в частности, тем, что направленная дифференцировка клеток требует специального подбора условий, а ЭТ - грубый модельный аналог развивающегося эмбриона, в котором присутствуют различные клетки, в том числе и необходимые исследователю.

Нами было проверено, есть ли эндотелиальные клетки в ЭТ, образованных из линий ЭСК человека, имеющихся в распоряжении. Для анализа были взяты линии ЙЕ8М01 и ЙЕ8М03. Эти линии, выделенные в лаборатории ранее, проявляли характерную для данного типа клеток морфологию, экспрессировали соответствующие маркеры и имели нормальный кариотип (19). При переводе в суспензионную культуру ЭСК формировали ЭТ с характерной морфологией для данного типа структур. При иммуногистохимическом анализе эмбриоидных телец после 10-12 дней культивирования были обнаружены в небольшом количестве (не более 1-5%) эндотелиоцитоподобные клетки, экспрессирующие ΟΌ31.

Дифференцировка ЭСК человека в клетки эндотелия в двумерных условиях (минуя стадию образования ЭТ) использовалась только одной группой исследователей (20). Известный способ выбран нами в качестве ближайшего аналога. Способ предусматривает дифференцировку ЭСК человека в присутствии человеческого фактора роста эндотелия сосудов (УЕСР) на подложке из коллагена IV. Селекция эндотелиальных клеток осуществлялась по размеру клеток с помощью фильтрации через фильтр с диаметром пор 40 мкм. Из работы не ясно, какую долю составляли клетки эндотелия после селекции. Однако, полагая, что эндотелиальные клетки связаны с гематопоэтическими клетками и происходят от общего предшественника гемангиобласта, механический выбор не мог обеспечить желательную чистоту клеток. Скорее всего, данный метод селекции не стоит использовать, если необходимо получить чистую популяцию клеток эндотелия.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - формирование сосудистоподобных структур и монослоя при дифференцировке ЭСК человека (8 дней): А - светлое поле; Б - иммуногистохимическое окрашивание антителами к ΟΌ31;

фиг. 2 - дифференцировка ЭСК человека в эндотелиальные клетки в двумерной системе: А - недифференцированные колонии ЭСК на фидере МЭФ; Б - дифференцированные производные, 3 день культивирования; В - дифференцированные производные, 5 день культивирования; Г - сосудистоподобные структуры, 7 день культивирования;

фиг. 3 - ОТ-ПЦР анализ генов νΕ-οαύΙκιϊη. САТА-2, Р1к1, ΟΑΡΌΗ, САТА-3, οΝϋδ. ΟΌ31 в недифференцированных ЭСК линии Е8М03 (И), клетках эндотелия из ЭСК линии Е8М03, полученных с помощью иммуномагнитной сепарации (Е), и в клетках эндотелия из пупочной вены (Н) человека;

фиг. 4 - результаты бисульфитного секвенирования промоторной области гена САТА-2 с 43 по -187 нуклеотид относительно старта транскрипции: А - ЭСК человека, Б - эндотелий, полученный из ЭСК человека, В - ΗυνΈΟ;

фиг. 5 - результаты бисульфитного секвенирования промоторной области гена САТА-3 с 228 по -115 нуклеотид относительно старта транскрипции: А - из ЭСК человека, Б - эндотелий, полученный из ЭСК человека, В - IПЛТС;

фиг. 6 - результаты бисульфитного секвенирования промоторной области гена βΝΘδ с 13 по - 297 нуклеотид относительно старта транскрипции: А - из ЭСК человека, Б - эндотелий, полученный из ЭСК человека, В - ΗυνΈ^ фиг. 7 - изменение плотности кровеносных сосудов через 30 дней после введения 5 клеток эндотелия: а - до введения, б - через 30 дней после введения;

фиг. 8а - матригель, удаленный из экспериментальных животных через 8 дней, не содержащий клеток эндотелия, фиг. 8б матригель, удаленный из экспериментальных животных через 8 дней, содержащий клетки эндотелия.

Раскрытие изобретения

Нами была поставлена задача разработать эффективный и воспроизводимый метод дифференцировки ЙЕ8С5 в чистую популяцию функциональных эндотелиальных клеток, в которой изменения паттерна генной регуляции соответствуют зрелым эндотелиальным клеткам. В отличие от дифференцировки через стадию ЭТ прямая дифференцировка ЭСК проста для наблюдения за клетками и манипуляциями с ними, однако требует предварительных исследований по определению условий дифференцировки. Кроме того, контролируемая дифференцировка, во-первых, должна приводить преимущественно к желаемому клеточному фенотипу. Во-вторых, должна существовать возможность селекции нужных популяций

- 2 022736 клеток, причем сам процесс селекции не должен существенным образом влиять на жизнеспособность клеток и их дифференцировку. Следующей поставленной перед нами задачей явилась разработка метода сепарации предшественников эндотелия и эндотелиальных клеток из дифференцированных ЭСК человека.

Отсутствие в литературе данных по дифференцировке ЭСК человека в двумерной системе без формирования ЭТ в эндотелиальные клетки потребовало определение условий и сред для дифференцировки. Было испробовано более 15 способов культивирования с различными сочетаниями сред, сывороток и ростовых факторов. Для этого колонии ЭСК перемещали в чашки Петри с ростовыми средами различного состава (табл. 1).

Таблица 1

Сравнение различных сред для дифференцировки ЭСК человека в эндотелий. Сравнение проводилось через 8 дней культивирования на основании иммуногистохимического анализа

Среда	Альфа- МЕМ	Альфа-МЕМ	ЕСМ	ЕСМ	ΡΜΕΜ/ΡΙ2	0ΜΕΜ/ΡΙ2	ΩΜΕΜ/Ρ12
Сыворотка	Нус1опе бейпеб сыворот- ка эмбрио- нальная телячья	Зегигп гер1асетеп1 (заменитель сыворотки)			Нус1опе сЬагас1ег τίζβά (сыворотка эмбриональная телячья)	Нус1опе сйагас1ег1ге£\|(сыворотка эмбриональная телячья)	КО (КпоскОи! хетт гер1асетеп1) заменитель сыворотки
Ростовые факторы	Активин УЕОР васкуляр но- эндотели альный фактор роста	УЕОР Васкулярноэндотелиальный фактор роста, РСР фактор роста фибробластов,8СР фактор роста стволовых клеток, ЕОР, эпидермальный фактор роста	РСР фактор роста фибро- бластов	УЕОР Васкулярноэндотелиальный фактор роста, РСР фактор роста фибробластов.	УЕОР васкулярноэндотелиальный фактор роста, РСР фактор роста фибробластов, 8СР фактор роста стволовых клеток, ЕОР эпидермальный фактор раста	УЕОР Васкулярно- эндотелиальный фактор роста, 5СР фактор роста стволовых клеток, ЬРСР основной фактор роста фибробластов	УЕОР Васкулярно- эндотелиальный фактор роста, 5СР фактор роста стволовых клеток, ВМР4 костный морфогенетический белок 4, ТОРЬес трансформирующий фактор бета, ЬРСР основной фактор роста фибро-бластов
Под- ложка	Коллаген I	Коллаген IV	Кол лаген ΐν+ Кол лаген I	Кол лаген IV	Коллаген IV	Коллаген IV	Коллаген IV
клеток эндотелия, %	0-2	5-8	5-8	10-15	25-40	20-30	>50

В процессе дифференцировки были обнаружены отдельные клетки, экспрессирующие ранний маркер эндотелия ΟΏ31 и маркер позднего, дифференцированного эндотелия - фактор Вон Виллибрандта (ν^Ε).

После применения различных композиций сред в различных комбинациях с факторами роста были выявлены ростовые факторы, обеспечивающие эффективную дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки. К таким ростовым факторам белковой природы относятся з1еш се11 Гас1ог 8СЕ (производитель Сйеш1соп), человеческий фактор роста эндотелия сосудов УЕСЕ (производитель Сйешюоп), Ьопе шогрЕодетс рго!ет ВМР4, Ьаз1с БЬгоЫаз! дго\\1Ь Гас1ог БЕСЕ (производитель СЕетюоп), Шшог дго\\1Ь Гас1ог ТОЕЬе1а.

Количественные соотношения данных ростовых факторов зависит от состава среды, наличия или отсутствия в среде компонентов неопределенного происхождения, а также могут варьировать в зависимости от используемых линий ЭСК. Количество ростовых факторов может быть подобрано экспериментальным путем.

В течение дифференцировки в среде, содержащей компоненты, необходимые для направленной дифференцировки ЭСК человека в эндотелиальные клетки, мы могли наблюдать изменения и в морфологии клеток, и специфической экспрессии маркеров эндотелия. Сначала на 4 день после индукции дифференцирования были обнаружены СО31 эндотелиальные маркеры. Появление сосудистоподобных структур совпало с экспрессией ν^Ε. На дни 6, 7 почти 60% клеток экспрессировали СО31 молекулу и к концу процедуры дифференцирования (12-й день) приблизительно 50% клеток экспрессировали СО105 антиген (табл. 2). При этом стоит заметить, что экспрессия СО133 молекулы была высока в недифференцированных ЬЕ8Сз и понижалась в течение дифференцировки в эндотелиальных предшественниках. Довольно высокий процент дифференцировки в эндотелиальные клетки позволял нам проводить тест на формирования сосудов без селекции клеток.

Т аблица 2

маркер	Дни дифференцировки
0	г	4	6	8	10	12
СО31	-		+		+	+	+
УЕ-саЛзепп	-		+	+	+	+	+
СО133	+	+	+/-	+/-	+/-	-	-
уАУР	-	-	-	-	+	+	+
СО-105	-	-	-	-	-	+	+
СО-34	-	-	+	+	+	+	+

СО31 положительные клетки представлены не только в составе сосудистоподобных структур, но и в виде монослоя (фиг. 1). По данным исследований баланс между сосудистоподобными клетками и монослоем зависит от концентрации УЕСЕ.

- 3 022736

Для сепарации дифференцированных из ЭСК человека эндотелиальных клеток нами был выбран метод иммунологической селекции с использованием поверхностных или внутренних маркеров, специфических для клеток эндотелия. Например, в данном случае использовался метод иммуномагнитной сепарации МЛС8 (тадпейс асйуа(ей се11 котйпд) эффективная технология магнитного сортинга, основанная на разделении клеток по поверхностным антигенам (см/№№№.тй1епу1Ыо1ес.сот). Подобный метод позволяет быстро и эффективно (с чистотой 98% и более) провести селекцию нужной популяции клеток по поверхностным маркерам. Однако может быть использован и другой метод, например флуоресцентноактивированный клеточный сортинг (РАС8), или любые другие, позволяющие разделить клетки в зависимости от поверхностных или внутренних маркеров.

Для селекции эндотелия, полученного из ЭСК в двумерной системе, мы воспользовались маркером ί'.Ό31. но могут быть использованы и другие маркеры эндотелия, как СЭ34. фактор у\7Р или другие.

Селекцию на СЭ31 проводили на 5-7 дни дифференцировки. Замечено, что жизнеспособность клеток, отобранных на 5 день, была выше, чем отобранных в день 7 после начала дифференцировки. Этот факт можно объяснить тем, что на 7 день дифференцировки клетки эндотелия уже формируют структуры, которые достаточно трудно разрушить ферментативной обработкой, а увеличение времени обработки и/или разрушение уже сформировавшихся межклеточных контактов ведет к существенному снижению жизнеспособности. Следовательно, проведение селекции на 5 день дифференцировки в наших условиях можно считать оптимальным. При использовании для селекции других маркеров селекцию можно проводить на 3-9 дни дифференцировки.

Выделенные клетки высевали на чашки, покрытые коллагеном, в среду для эндотелиальной дифференцировки. Клетки высевали в высокой плотности (не менее 50000 клеток на 1 см² и более), так как посев в более низкой плотности негативно влиял на жизнеспособность клеток.

Нами предложено 2 варианта способа получения эндотелиальных клеток из ЭСК человека.

Сущность первого варианта способа получения эндотелиальных клеток из ЭСК человека заключается в следующем.

1. Проведение дифференцировки ЭСК человека на подложке и в синтетической среде, которые обеспечивают направленную прямую дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки, с УБОР, 8СР, ВМР4, ЬРОР, ТОРЬе!а. Использование в качестве основы синтетической среды смеси жидкой ΌΜΕΜ/ΡΙ2 с жидким КО заменителем сыворотки в количестве, об.%: жидкая ΌΜΕΜ/ΤΙ2 - 75-95, жидкий КпоскОЩ заменитель сыворотки - 5-25. Причем ТОРЬе1а вносят в синтетическую среду на 3-6 дни дифференцировки.

2. Проведение иммунологической селекции с использованием маркеров, специфических для клеток эндотелия на 3-9 дни дифференцировки.

3. Культивирование эндотелиальных клеток при плотности посева не менее 50000 клеток на 1 см².

Сущность второго варианта способа получения эндотелиальных клеток из ЭСК человека заключается в следующем.

1. Проведение дифференцировки ЭСК человека на подложке и в среде, которые обеспечивают направленную прямую дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки, с УЕОР, 8СР, ЬРОР. Использование в качестве основы среды смеси жидкой ΌΜΕΜ/ΡΙ2 и фетальной бычьей сыворотки в количестве, об.%: жидкая ΌΜΕΜ/ΡΙ2 - 75-95, жидкая фетальная бычья сыворотка - 5-25.

В наших способах были опробованы линии клеток ΗΕ8Μ01, ΗΕ8Μ03, ΗΕ8Μ02, 04, Н1, ΗυΕ87,8,9, при этом полученные результаты были близкими, что подтверждает возможность его применения для дифференцировки любых ЭСК человека.

Соотношение компонентов среды может оптимизироваться для каждой клеточной линии в отдельности для достижения максимальной эффективности. В качестве среды для культивирования клеток могут быть использованы и другие синтетические среды полностью известного и охарактеризованного состава.

Заявленные способы позволяют получить высокий выход клеток в конце процедуры дифференцировки, имеющих иммунологические маркеры эндотелия, большинство из которых способно участвовать в формировании трубчатой сети. Даже больше, дифференцировка была воспроизведена с использованием заменителя сыворотки вместо характеризованной фетальной бычьей сыворотки (РВ8), что значительно лучше существующих методов дифференцировки. Использование синтетической среды, не содержащей компонентов животного происхождения, делает метод воспроизводимым и независимым от состава сыворотки. Однако даже в этом случае приблизительно половина клеток была представлена неизвестным типом клеток или незначительной популяцией недифференцированных клеток. Важно отметить, что даже маленький процент недифференцированных клеток или клеток, которые дифференцировались в различные типы, может загрязнить клеточную культуру. Эти сторонние популяции могут иметь большое воздействие на безопасную и функциональную эффективность культуры для терапевтического применения или дальнейшего изучения. Таким образом, селекция специфической популяции клеток важна.

- 4 022736

СЭ31 признан лучшим иммунологическим маркером эндотелиальных клеток, и в то же самое время его экспрессия была обнаружена очень рано на день 6 ЬЕ§С8 дифференцировки, что позволило его использовать в методе иммуномагнитного сортинга. Однако использование других маркеров (например, ί'Ό34. фактор у\УР) и других методов селекции (например, РЛС8) тоже давало хорошие результаты.

Варианты осуществления изобретения

Возможность осуществления способа подтверждается следующими примерами его реализации, которые показывают лишь частные случаи его выполнения.

Пример 1. Культивирование ЭСК человека.

Линии ЭСК человека культивировали в среде, содержащей 80% КиоскОи! ΌΜΕΜ, 20% КО заменителя сыворотки, глутамин 1 мМ, 1% заменимые аминокислоты, 50 пенициллина ЕД/мл, 50 мкг/мл стрептомицина (производитель 1иуйгодеи), 0,1 мМ β-меркаптоэтанола (81дта) и 4 мкг/мл ЬРСР (СЬетюои) на ингибированных митомицином С (10 мкг/мл, Шдта) мышиных эмбриональных фибробластах (МИФ) при плотности 10⁴ клеток/см² в культуральных чашках, покрытых 0,1%-ным желатином (Мегск). Фибробласты приготавливали из 12-дневных мышиных эмбрионов Р1 (С57ВЬ/61хСВА/Са). ЬЕ§С колонии пассировали каждые 5-6 дней культивирования обработкой коллагеназы типом IV (200 и/т1, Шуйтодеи) и механической диссекцией. Чашки с недифференцированными колониями ЬЕ§С, выращенными в течение 8 дней, обрабатывали коллагеназой IV в течение 10 мин, смывали дважды ростовой средой и собрали колонии с фидера механически, наконечником микропипетки вручную. Плюропотентные линии клеток, изолированные и выращенные на фидере, показывали типичную ЭСК морфологию клетки, экспрессировали иммунологические маркеры, характерные для недифференцированных клеток, и поддерживали нормальный кариотип. Мы не наблюдали даже маленький процент ΟΌ31 положительных клеток в недифференцированных колониях.

Пример 2. Дифференцировка ЭСК человека в эндотелиальные клетки.

Среда для дифференцировки.

Для дифференцировки использовали синтетическую среду следующего состава: основа 85% жидкой ΌΜΕΜ/Ρ12 (Нус1опе или аналог другой фирмы), 15% жидкого КО заменитель сыворотки (Шуйтодеи или аналог другой фирмы) с добавлением 1% заменимых аминокислот, 2 мМ Ь-глутамина, 50 ед/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, 50 нг/мл 8СР, 10 нг/мл ВМР4, 50 нг/мл АРСР, активина 10 нг/мл, 20 нг/мл ЬРСР, 2 нг/мл ТСРЬе!а. ТСРЬе!а вносят на 4 день дифференцировки. Концентрации и сочетания ростовых факторов могут отличаться от указанных на 50-100% в зависимости от клеточной линии и индивидуальных условий культивирования.

Способ приготовления среды.

Жидкую среду ΌΜΕΜ/ΡΙ2 смешивали с жидким заменителем сыворотки, антибиотиками и глутамином и для дальнейшего использования хранили при 4°С. Все остальные компоненты (ростовые факторы и пр.) добавлялись в среду непосредственно перед добавлением к клеткам. Полная среда не хранилась.

Методика проведения дифференцировки.

Чашки с недифференцированными колониями ЬЕ§С, выращенными в течение 8 дней (фиг. 2А), обрабатывали коллагеназой IV в течение 10 мин, смывали дважды ростовой средой и колонии собрали вручную наконечником микропипетки, разрезая на фрагменты размером 300-500 клеток. Колонии ЭСК для проведения дифференцировки были перемещены в 35-мм чашки Петри, покрытые коллагеном IV (70 ид/т1) в среде указанного выше состава (фиг. 2Б). На 4 день дифференцировки в среду добавляли 2 нг/мл ТСРЬе!а 1. На следующий после добавления день клетки приобретали морфологию дифференцированных производных (фиг. 2В). На 6-10 дни культивирования колонии содержали кластеры сосудистоподобных структур (фиг. 2Г).

Пример 3. Дифференцировка ЭСК человека в эндотелиальные клетки.

Отличается от примера 1 использованием среды на основе смеси жидких ΌΜΕΜ/Ρ12 (Нус1оие) и фетальной бычьей сыворотки (Нус1оие сНагас1еп/ей).

Среда для дифференцировки.

Для дифференцировки использовали среду следующего состава: основа 85% жидкой ΌΜΕΜ/Ρ12 (Нус1оие или аналог другой фирмы) и 15% фетальной бычьей сыворотки (Нус1оие,сйатас1ег17ей или аналог другой фирмы), 2 мМ Ь-глутамина, 1% заменимые аминокислоты, 50 единиц/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, (все от Шуйтодеи или аналог другой фирмы), 20 нг/мл 8СР (СЬетюои или аналог другой фирмы), от 10 до 50 нг/мл АРСР (СЬетюои или аналог другой фирмы), 5 нг/мл ЬРСР (СЬетюои или аналог другой фирмы). Ростовые факторы могут варьировать, как указано в примере 1. Среду готовят, как описано в примере 1.

Клетки также на 3-6 дни приобретали морфологию дифференцированных производных. На 6-10 дни культивирования колонии содержали кластеры сосудистоподобных структур.

Пример 4. Сепарация эндотелиальных клеток.

Для ΟΌ31+ клеточной селекции клетки на 5-7 дни дифференцировки были отделены обработкой коллагеназы IV (Шуйтодеи или аналог другой фирмы) при 37°С в течение 10 мин и смыты дважды забуференным фосфатом физиологическим раствором (рйо8рйа1е ЬиГГегй вайие РВ§), содержащим 0,5% аль- 5 022736 бумина бычьей сыворотки (ΒδΆ). Полученные клетки инкубировали в течение 30 мин с антителами мыши против СИ31 человека в порции 10 мкг на 10⁶ клеток и затем с 1дС козы против мыши, пришитыми к магнитным шарикам (Μίΐΐοηνί Вю1ес или аналог другой фирмы) в течение 15 мин при 8°С. СИ31 положительные клетки были изолированы, проходя через фильтр и колонку М§, прикрепленную к магнитному блоку Мий-МЛС'Ъ кератайои ιιηίΐ (Μίΐΐοηνί Вю1есН или аналог другой фирмы), чтобы получить сохраненную магнитом фракцию очищенных СИ31 + клеток. После элюции СИ31 положительные клетки были помещены на покрытые коллагеном IV плашки с плотностью посева 50000 клеток на 1 см² и клетки были выращены в эндотелий-поддерживающей среде.

Промышленная применимость

Чистоту выделенной популяции определяли по иммуноцитохимическому анализу. Чтобы узнать, являются ли СИ31 + клетки, элюированные с колонки, клетками эндотелия или их предшественниками, часть клеток подвергали функциональному тесту на принадлежность клеток к эндотелию - тесту на матригеле. Анализ экспрессии генов, характерных для эндотелия, проводили методом полуколичественного ОТ-ПЦР (обратной транскрипции ПЦР).

Иммуноцитохимический анализ.

Клетки фиксировали 100%-ным ледяным метанолом в течение 5 мин или 4%-ным парафармальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Слайды были промыты в трех ΡΒδ, 0,1% Тетееи20, и инкубировались с вторичными антителами: А1еха Р1иот 546-соищда1ей 1дС козы против мыши, А1еха Р1иот 488-соищда1ей 1дС козы против мыши в разведении 1:800. Первичные используемые антитела были античеловеческим СИ31, античеловеческим у\УР, античеловеческим СИ105, античеловеческим СИ34, античеловеческим СИ133, античеловеческим Р1к-1, античеловеческим СИ14, античеловеческим СИ45. Клетки были также окрашены 4,6-диамидино-2-фенилондолом (ИАР1). После этого иммуномеченые клетки или фрагменты были исследованы с помощью флюоресцентного микроскопа. Чтобы избегать артефактов в обнаружении, мы использовали антитела с различной спецификой от используемых для селекции клеток. Чистота популяции клеток была больше чем 90%.

Испытание на способность образовывать сосудистоподобные структуры.

Испытание было проведено, как описано в (21). Матригель добавлялся в 24 лунки планшета. 0,52х10⁴ клеток были помещены в лунки в 0,5 мл ростовой среды и инкубировались при 37°С и 5% СО₂. Морфология клеток анализировалась в фазовом контрасте на инвертированном световом микроскопе. Как видно, на клетки формируют характерную для эндотелия ячеистую сосудоподобную сеть.

Обратной транскрипции ПЦР (ОТ-ПЦР).

Тотальная РНК была изолирована от недифференцированных ЬЕ§С8, СИ31 селектированных эндотелиальных клеток и НИ¹УЕС5 (эндотелиальные клетки вены человеческой пуповины) использованием КЫеаку Μίηί Κίΐ (Ц1адеи). Обратная реакция транскрипции была выполнена, используя РНК (1-2 мкг), случайные шестинуклеотидные праймеры (Рготеда), РеуеПАИ Μ-ΜυΡν обратную транскриптазу и реактивы (Рготеда) согласно рекомендациям изготовителя. Кодирующая ДНК была растворена в конечном объеме 25 мл. Определенное количество кДНК (1-5мл) было подвергнуто ПЦР амплификации, используя Тас.| ДНК полимеразу и реактивы (Реттейак). Все образцы РНК были способны привести к равной амплификации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (САРИН) как внутренний стандарт. Последовательности праймеров для ОТ-ПЦР указаны в табл. 3. Продукты амплификации были сепарированы в 1,5% агарозном геле.

- 6 022736

Таблица 3

Название гена	Последовательность праймеров
\Т,-сас1Ьегн1	5 ’ ССООСОССААААОАО АОАЗ ’ 5 ’САСООАСОСАТТОААСААСЗ ’
ОАТА-2	5 ’СССТААОСАОСОСАОСААОАСЗ ’ 5 ’ТОАСТТСТССТОСАТОС АСТЗ ’
' ОАТА-3	5’ТСАСААААТОААСООАСАОААСЗ ’ 5 ’ОООТТАААСОАОСТОТТСТТОЗ ’
βΝΟδ	5 ’ОТОАТООСОААОС ОАОТОААОЗ ’ 5’ССОАОСССО ААС АС АС АОААСЗ ’
СО31	5’ОСТОТТООТООААООАОТОСЗ’ 5 ’ОААОТТООСТООАООТОСТСЗ ’
Р1к1	5 ’ ТООАООТОАСТОАОТОСАОЗ ’ 5’ОАССАТОССАОСАТАОСТОЗ’
ЭРРАЗ	5 ’ ТАСТССОТСОАОАОТСТОТАОЗ ’ 5’ТТОООСТТСТААОАСАСАТООЗ’
ЭРРА5	5 ’ АССТОАААОАТССАОАООТОТЗ ’ 5 ’ССООСТТСАТТОСАТТООСТЗ ’
ОСТ4	5’СОАССАТСТОССОСТТТОАОЗ’ 5 ’СССССТОТСССССАТТССТАЗ ’
ΝΑΝΟΟ	5 ’АОС АТССОАСТОТА А АО ААТСТТС АСЗ ’ 5 ’ СООСС АОТТОТТТТТСТОСС АССТЗ ’
ОАРОН	5 ’ОААООТОААООТСООАОТСАЗ ’ 5 ’ТТСАСАСССАТОАСОААСАТЗ ’

Факторы транскрипции играют важную роль в течение эмбрионального развития в направлении дифференцировки и поддержании фенотипа. Особенно эндотелий-специфичные факторы транскрипции ОЛТА-2 и 3, которые почти полностью выключены в недифференцированных ΙιΕδίΤ. хотя их экспрессия в полученной из НЕ5>Ск чистой популяции эндотелиальных клеток была сопоставима с их экспрессией в НИУЕСк. Ген еЫО8а не экспрессировался недифференцированными ЬЕ§Ск, но после дифференцировки в эндотелий его экспрессия была обнаружена в чистой популяции эндотелиальных клеток на том же самом уровне как в НИУСк. Таким образом, анализ экспрессии генов, характерных для эндотелия методом полуколичественного ОТ-ПЦР, показал, что уровень экспрессии этих генов в клетках эндотелия из ЭСК сравним с экспрессией в НИУЕС (фиг. 3)

Геномное бисульфитное секвенирование.

Были выделены геномные ДНК от недифференцированных ЬЕ§Ск, СЭ31 отобранных ЬЕ§Скполученных эндотелиальных клеток и НИУЕС. Геномная ДНК была подвергнута обработке натрием бисульфитом, используя СрОепоте™ Рак! ΌΝΑ МобШсаДои Κίΐ, Сйетюои. Аликвоты ДНК, модифицированной бисульфитом натрия (25-50 нг), были использованы для ПЦР при 45 циклах амплификации. Праймеры для ПЦР в интересующих участках были подобраны для натрия бисульфит модифицированной матрицы (табл. 4). Конечные ПЦР продукты были клонированы с помощью набора рОЕМ-Т Еаку (А1360, Рготеда), и клоны плазмиды (10 для каждого участка) были секвенированы использованием автоматизированной ΑΒΙ Рпкш 377 ДНК Бециепсег (АррБеб Вюкук1ешк).

Таблица 4

Название гена	Последовательность праймеров	Положение праймеров относительно старта транскрипции
βΝΟδ	5 ’ ТОАТТТТТТООТООТТТТ АТТТТОТТЗ ’	-321
5 ’СТСТТС АААТТАССС АТАТТ АСТАТЗ ’	37
ОАТА-2	5’АОТОТООАТОТАТАОООТОТОЗ’ 5’АСАААСААТАААСАААСТТАААСААЗ ’	-217 67
ОАТА-3	5 ’ОАТОАТАТТАОА А АТТТТТТТААОТТОЗ ’ 5 ’ААТССТСССАААТААТТАААААСААЗ ’	-139 252

Чтобы подтвердить, что эндотелиальные клетки, дифференцированные из ЬЕ§Ск, имеют правильное проявление эпигенетического статуса, мы сравнили профили метилирования регулирующих участков ОАТА-2, -3, и генов еNОСа в ЬЕ§Ск, эндотелиальных клеток дифференцированных из ЬЕ§Ск и НИУЕСк. Мы исследовали уровень метилирования каждого СрО в области, соответствующей селективному промотору гена ОАТА-2 (с 43 по -187 нуклеотид относительно старта транскрипции, определяемого как +1) с помощью бисульфитного секвенирования. В недифференцированных ЬЕ§Ск эта область была высоко метилирована почти до 80% метилирования (фиг. 4). Уровни метилирования селективного промотора в НИУЕС и эндотелиальных клетках, дифференцированных из ЬЕ§Ск, были низкими и варьировали от 20% в эндотелиальных клетках, дифференцированных из ЬЕ§Ск до 10% в НИУЕСк.

СрО, расположенные в области от 228-115 нуклеотидов, были высоко метилированы в недифференцированных клетках (до 90%), но в полученных из ЬЕ§С клетках эндотелия и в НИУЕСк метилирова- 7 022736 ние обозначенной области понижалось до 15-20% (фиг. 5). Таким образом, несмотря на гиперметилирование проксимального промотора, ген ОЛТА-3 был слабо экспрессирован в недифференцированных №805, хотя гипометилированный промотор значительно увеличил его экспрессию.

Согласно данным Сйаи (22) в эндотелиальных клетках самые существенные эпигенитические модификации происходят в области промотора οΝϋδα. самой близкой к сайту начала транскрипции. Эта область гена οΝϋδα между 13 и-237 нуклеотидами была выбрана для анализа бисульфитного секвенирования, который показал, что область была гиперметилирована в недифференцированных ЬЕ§С8 приблизительно на том же самом уровне как регулирующие области ОАТА-2 и ОАТА-3 генов от 70 до 90% по каждому СрО положению. После ЬЕ§С8 дифференцировки в эндетелиальные происхождения метилирование этой области уменьшилось до 20% в функциональных эндотелиальных клетках, отобранных из ЬЕ§С8, и не превышал 10% в НИУЕС8 (фиг. 6).

Бисульфитное секвенирование позволило выявить, что область селективного промотора ОАТА-2 гиперметилирована в ЬЕ§С8 и гипометилирована в ЬЕ§С8-полученных эндотелиальных клетках. Таким образом, мы показали, что статус метелирования ОАТА-2 селективного промотора оказывает влияние на экспрессию этого фактора транскрипции.

Принятие во внимание корреляции экспрессии ОАТА-2 и его промотора метилирования в ЬЕ§С8полученных эндотелиальных клетках мы могли признать важную роль селективного промотора ОАТА-2 в эндотелий-дифференцировке. Несмотря на гиперметилирование ОАТА-3 проксимального промотора, ОАТА-3 ген был слабо экспрессирован в недифференцированных ЬЕ§С8. Однако мы не могли исключить, что в недифференцированных ЬЕ§С8 ОАТА-3 ген запущен альтернативным промотором.

Проанализировав все полученные данные, мы можем заключить, что ίη νίίτο внешние сигналы вызывают сложную комбинацию молекулярных механизмов, заканчивающихся индукцией определенных факторов транскрипции экспрессии. Даже больше, полагая, что ДНК деметилирование является заключительным шагом эпигенетических событий, ведущих к активации гена, эта индукция постоянна и необратима. Несомненно, стволовые клетки имеют большой потенциал, однако этот потенциал должен управляться ίη νίίτο, иначе нежелательные последствия могут иметь место после неконтролируемой в естественных условиях дифференцировки.

Согласно нашим данным ОАТА-2 и οΝϋδ промоторы подвергаются гипометилированию в ходе ЬЕ§С8 дифференцировки в эндотелий. Следовательно, мы можем заключить, что эндотелийспецифичная экспрессия οΝϋδα регулируется через двойной негативный эпигенетический контроль. В недифференцированных ЬЕ§С8 не только промотор еИО8а, но также и промотор его регулирующего фактора транскрипции ОАТА-2 был блокирован метилированием.

Наши исследования демонстрируют существенные различия в метилировании областей промоторов трех генов от ЬЕ§С8 к из ЬЕ§С8-полученным эндотелиальным клеткам. Однако мы наблюдали некоторые различия между областями промоторов метилирования трех генов, изученных в из ЬЕ§С8-полученных эндотелиальных клетках и НИУЕС. В полученных из ЬЕ§С8 эндотелиальных клетках области промоторов изученных генов были немного больше метилированы, чем соответствующие области в НИУЕС, хотя это не кончалось подавлением транскрипции. Возможно, это отражает, что происходящие из ЬЕ§С8 эндотелиальные клетки не были эндотелиальными клетками вены пуповины, а скорее представляли смесь специализированных подтипов эндотелиальных клеток (например, капиллярные, аортальные эндотелиальные клетки, легочные эндотелиальные клетки), где уровень метилирования является переменным.

Полученные эндотелиальные клетки могли быть подвергнуты заморозке и хранению. При этом клетки сохраняли жизнеспособность и свои свойства.

Криоконсервацию и оттаивание эндотелиальных клеток осуществляли следующим образом.

Среда для заморозки имела следующий состав: 90% фетальная бычья сыворотка (инактивированная при 56°С в течение 45 мин) Цпуйтодеп или аналог другой фирмы), 10% ΌΜδΟ (ΙΟΝ ВютебюаЦ 1пс. или аналог другой фирмы).

С культивируемых клеток удаляли среду, промывали дважды РВ8, добавляли трипсин/ЭДТА 2 мл на 100-мм чашку или 75-см² флакон. Инкубировали при 37°С 5 мин, нейтрализовали трипсин/ЭДТА 5 мл культуральной среды и пипетировали, чтобы получить одноклеточную суспензию. Полученную суспензию переносили в 25 мл пробирку и центрифугировали 5 мин при 1200 грт. Осадок суспендировали в 1 мл среды для заморозки, затем переносили в криовиалу и сразу помещали на 24 ч на -70°С. На следующий день криовиалы переносили в жидкий азот для продолжительного хранения. В одной криовиале замораживали 1,5-3 млн клеток.

Криовиалы оттаивали на водяной бане при 37°С, стерилизовали 95% этанолом. Содержимое виалы переносили в 15-мл пробирку и постепенно добавляли 9 мл культуральной среды. Центрифугировали 5 мин при 1000 грт, надосадочную жидкость удаляли, осадок суспендировали в 1 мл среды и переносили в культуральную чашку или флакон со средой. Клетки равномерно распределяли по поверхности и помещали в инкубатор при 37°С и 5% СО₂. Методы, способы, применение полученных клеток эндотелия (эндотелеоциты).

- 8 022736

1. Полученные описанным выше способом клетки эндотелия могут быть применены для формирования сосудистой сети (коллатералей) Де ηονο за счет неоангиогенеза путем введения 10⁴, 10⁵, 10⁶ или большего количества клеток в вену или артерию млекопитающих, включая человека (фиг. 7).

2. Полученные клетки могут быть применены для васкуляризации имплантанта путем заключения их в биосовместимый материал, такой как желатин, хитозан, коллаген, матригель и другие либо их комбинации, обеспечивающие формирование трехмерной структуры, в которую, кроме клеток эндотелия, могут входить такие клетки, как фибробласты, кардиомиоциты, гепатоциты, кератиноциты, нейроны, мультипотентные клетки костного мозга, глиальные клетки, хондроциты, остеоциты и другие клеточные типы или сочетания типов клеток и имплантирования (введения) в организм млекопитающих, включая человека. Васкуляризации имплантанта может осуществляться либо за счет привлечения эндотелиальных клеток организма, либо за счет васкуляризации имплантированными клетками, содержащимися в трехмерной структуре для обеспечения импланта (введенной тканевой или клеточной композиции) кровоснабжением (фиг. 8).

3. Полученные клетки эндотелия могут быть использованы для изготовления трубчатой структуры, покрытой эндотелиоцитами, путем нанесения их на двумерную подложку из коллагена, мтаригеля, хитозана, фибронектинов и/или других биосовместимых материалов в сочетании с другими типами клеток или без них, которая может быть использована в качестве трубки при операциях на сосудах для восстановления нарушенного или недостаточного кровообращения, путем замены части, фрагмента или полного сосуда или его стентирования.

4. Полученные стандартизованным методом из стандартной возобновляемой клеточной культуры клетки эндотелия могут быть использованы для тестирования токсичности химических или биологических субстанций или могут быть использованы для определения эффективности веществ стимулировать рост (пролиферацию) клеток эндотелия путем определения пролиферации или гибели клеток эндотелия с помощью известных методов.

5. Клетки эндотелия могут быть использованы для диагностических или терапевтических целей для лечения генетических заболеваний или для доставки генов токсинов либо сами токсины в места активного ангиогенеза (роста сосудов) для блокирования последнего (например, в случае роста сосудов в опухоли) с целью прекращения кровоснабжения органа или ткани и ее последующей гибелью путем их генетической модификации, конструкциями, содержащими гены репортеры, например зеленый флуоресцентный белок или аналогичные, или генетическими конструкциями, содержащими гены токсинов, или генетическими конструкциями, содержащими гены для восстановления работы нарушенных генов и введения модифицированных клеток эндотелия в организм млекопитающих, в частности человека. Эндотелиальные клетки, модифицированные генетическими конструкциями, кодирующими ростовые факторы, могут быть векторами для стимуляции роста определенной ткани, клеток, группы клеток.

6. Сочетания перечисленных выше методов использования.

Таким образом, наша двумерная система дифференцировки позволила нам производить эндотелиальные клетки с высокой эффективностью, выбирать чистую популяцию функциональных эндотелиальных клеток, которые приобретали тот же самый эпигенетический статус ключевых факторов транскрипции и гомеостаза поддержания генов как их аналоги, дифференцирующиеся в эмбрионе ίη νίνο. Полученные эндотелиальные клетки могут найти широкое применение в медицинской практике.

Отобранные НЕЗС-полученные эндотелиальные клетки экспрессировали эндотелий-специфические гены, формировали сосудоподобные структуры и были морфологически неотличимы от первичных эндотелиальных клеток. СЭ31 отобранные эндотелиальные клетки, дифференцированные из НЕЗСТ, были способны культивироваться ίη νίίτο по крайней мере до 4 пассажей.

Используя наш способ дифференцировки, мы наблюдали СЭ31 и УЕ-саДНепп экспрессию на 6 день. Несомненно, это могло произойти из-за различий между линиями клеток, хотя условия культивирования (то есть среда культивирования, факторы роста, обработка) имеют большое воздействие на свойства дифференцировки. Интересно то, что мы обнаружили УЕ саДйетш экспрессию на 6 день НЕЗСТ дифференцировки, в то время как в естественных условиях его экспрессия наблюдалась только в 8 неделю беременности. Таким образом, маркер дифференцированных эндотелиальных клеток УЕ-саДйетш был обнаружен очень рано ίη νίίτο.

- 9 022736

Список литературы.

ЕВаЬагуапб, Н., ЛаГагу, Н., Маззипн, М, АзНПат, 5.К. Оепегабоп οί тзиНп-зесгейп§ сеПз Ггот Ьитап етЪгуотс з!ст се11з. ϋον ОгоМЬ ОПТег. 2006, 48; 323-332.

2. Нау, ϋ-С., 7Ъао, Ώ., Розз, А., Мапба1ат, К.., ЬеЬко^зк), I., Сш, IV. Окесс ОкГсгспОаОоп оГ Нитап ЕтЪгуотс 81ет СеПз ίο Нера1осу£е-Пке СеПз ΕχΗϊΟίίιηβ Рипс1юпа1 Асбуйез. С1опт§ 81ет СеПз. 2007,9: 51-62

3. Неп£, В.С., НаИег, Н.КЪ., Згт, Е.К., Сао, Τ., Ν&, 8.С. 81га1е§1ез Гог бкесбпц 1Ье бПГегепйабоп оГ з1ет сеПз ίηίο 1Ье сагбютуо^етс Ппсаде ίη νΐίτο. Сагбюуазс К.ез. 2004, 62; 34-42.

4. Хи, С., Не, Εζ>., Катар, Т.Е, Роксе, 8., Нао, X., О'8и1куап, С., Сагреп1ег, М.К., ЕеЬко\узк1, Е, Оо1б ГО. Нитап етЪгуотс з1ет се11-бепуеб сагбютуосу1ез сап Ье татТатеб ίη бейпеб тесЪит χνίΐΗουί зегит. 81ет СеПз Юеу. 2006, 15; 931-941.

5. Расаиб, О., Ке11ег, С., КоизкоГГ, V. Тгаскт§ тезобегт Гогтайоп апб зретЯсайоп Ю 1Ъе Ьетап§юЫаз1 ίη укго.Тгепбз Сагбюуазс Меб. 2004, 14, 314-317.

6. СЪо1, К., Кеппебу, М., Кагагоу. А., Рарабткпои, ЕС., КеПег, О. А соттоп ргесигзог Гог ЪетаЮрогейс апб епбо1ЪеНа1 сеПз. ϋενοίορηιβηί. 1998, 125, 725-732.

7. СЬип§, Υ.3., /.Напе., \ν.,Ι., Агеп1зоп, Е., Ктдк1еу. Р.П., РаНз, I,, СЬо1, К. Ртеаце апа1уз1з οί 1Ъе ЪстапдюЫаз! аз бейпеб Ьу РЬК1 апб ЗСЬ ехргеззюп. Осус1ортсп1. 2002, 129, 5511-5520.

8. №з1пка\уа, 8.Е, №зЫка\уа, 8., НиазЫта, М., Ма1зиуоз1и, Ν., Кобата, Н. Рго£гезз1уе Ппеа§е апа1уз!3 Ьу се!1 зогйп§ апб сикиге гбепййез РРК1+УЕ-сабкепп+ сеПз аС а

- 10 022736 бксгдтд ροίηί οί епбо(ЬеЬа1 апб Ьеторгяейс Ьпеадез. ϋενείοριηεηι. 1998, 125, 17471757.

9. НиЬег, Т.Ь., КоизкоГГ, V., РеЬПпд, Н.1, РаПз, 1., Ке11ег, О. НаетапдюЫаз( соттЬтеп! ίί тша1еб ίη 0>е рптЬке зйеак οί (Ье тоизе етЬгуо, Катге. 2004,432, 625-630.

10. Сегбап, С., Кои1еаи, А., ВЬайа, М., УЕОР-А165 аидтепЕз егуЙ1горо1ейс беуе!ортеп(

Ггот Ьитап етЪгуотс з(ет сеПз. В!ооб. 2004, 103, 2504-12.

11. СЬабМск, К., АУапд, Ь., Ι,ί, Ь., Мепепбег, Р., МигбосЬ, В., Кои1еаи, А., ВЬайа, М.

СуЕоктез апб ВМР-4 ргото1е Ьета(оро1ейс бЬГегепйайоп οί Ьитап етЪгуотс з(ет сеПз.

В1ооб. 2003, 102, 906-915

12. Т.ее'епЬегд, 8., Оо1иЬ, 6.8., АтЬ, М., 11зкоуЬг-Е1бог, 1., Ьапдег, К. Епбо(ЬеЬа1 сеПз бегкеб йот Ьитап етЪгуотс з(ст сеПз. Ргос Νβίΐ Асаб 80 и 8 А. 2002,99: 4391-4396.

13. Ν§, Е.З., Оэуёз, К.Р., Агго1а, Ь., 81ап1еу, Е.О., Е1еГап(у, А.О. Рогсеб аддгедайоп οί бейпеб питЬегз οί Ьитап етЬгуотс з(ет се11з ϊηίο етЬгуо1б Ъобюз Гоз(егз гоЬиз(, гергобиОЫе Ьета(оро1ебс бЬГегепйайоп. В1ооб. 2005, 106, 1601-1603.

14. Ζ»πιΗ6ίί>, Е.Т., РеаиЬ, В„ Рагк, Т.З., Випг, Р„ Οίνίη, С.1., НетаЮрО1ейс бОТегепйайоп οί Ьитап етЬгуотс з(ет сеПз ргодгеззез (ЬгоидЬ зециепйа1 Ьста1оспбо(ЬеЬа1, рптЬке, апб бейпкке з(адез гезетЫтд Ьитап уо1к зас бс\'е1ортспг. В1ооб. 2005, 106, 860-870.

15. /Ьап, X., Огахаб, О., Уе, Ζ., Наттопб, Н., ЗЬатЫоП, М., ОеагЬай, 1., СЬепд, Б.

Рипсйопа1 апйдеп-ргезепйпд 1еисосу1ез бсгкеб йот Ьитап етЬгуотс зсет сеПз ίη νίίΓο.Ьапсей 2004, 364, 163-171

16. Каиппап, Ώ.8., Напзоп, Е.Т., БеМз, К.Б., АиегЬасЬ, К., ТЬотзоп, ТА. Нета(оро1ейс со1опу-Готйпд сеПз бегкеб йот Ьитап етЬгуотс зГет сеПз. Ргос ЧМаП Асаб 8сё и 8 А.

2001,98, 10716-10721.

17. Уобуатк, М.А., Вогк, Ι.Α., ТЬотзоп, ТА., 81ик\4п, 1,1. Нитап етЪгуотс в1ет се11бегкеб СОЗ4+ сеПз: еГйОеп( ргобисйоп ίη (Ье сосикиге М(Ь ОР9 зйота! сеПз апб апа1уз1з оГ1утрЬоЬета(оро1ейс ро(епйа1. В1ооб. 2005, 105, 617-626.

18. НйазЫта, М., Ка(аока, Н., МзЫката, 8., Ма(зиуозЫ, Ν., №зЫка\уа, 8. МаШгайоп οί етЬгуотс зГет сеПз ϊηίο епбо1ЬеЬа1 сеПз ίη ап ίη νίΐΓΟ тобе1 οί уазси1одепез13. В1ооб.

1999, 93, 1253-1263.

19. Бадагкоуа, М.А., УокЬкоу, Ρ.Υ., БуакйЬеуа, АУ., РЬПопепко, Е.З., Κίββίβν, 8.Б.

Окегзе ер1депейс ргоГйе οί ηονεΙ Ьитап етЬгуотс з(ет сеП Нпез. СеП Сус1е. 2006, 5:

416-420.

20. ОегесЫ-Мй, 8., ΖίδΟηά, А., СоЬеп, 8., 1(зкоУЙг-Е1бог, Б Нитап етЬгуотс з1ет сеПз аз ап ίη νίΐΓΟ тобе1 Гог Ьитап уазси1аг беус1ортеп1 апб (Ье тбисйоп оГ \^;азси1аг б1ЙГегепйайоп. ЬаЬ ΙηνεΒί. 2003, 83: 1811-1820.

21. Вотра13, Н. е( а1. Нитап епбо(ЬеЬа1 сеПз бепуеб йот сйси1айпд ргодепкогз б1зр1ау зресШс Гипсйопа1 ргорегйез сотрагеб \уйЬ та(иге уеззе! №а11 епбо(ЬеПа1 сеПз. Βίοοά 103,

2577-2584 (2004)

22. СЬап, У., Р(зЬ, БЕ., О'АЬгсо, С. ТЬе се11-зреС1Йе ехргеззюп οί епбо(ЬеЬа1 пНпс-0Х1бе зуп(Ьазе: а го!е Гог ϋΝΑ те(Ьу1айоп. .1 ΒίοΙ СЬет. 2004,279: 35087-35100.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, предусматривающий дифференцировку ЭСК человека на подложке и в среде, которые обеспечивают направленную прямую дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки, с человеческим фактором роста эндотелия сосудов УЕОР и сепарацию полученных эндотелиальных клеток, отличающийся тем, что используют синтетическую среду для дифференцировки на основе смеси ΌΜΕΜ/ΕΊ2 с заменителем сыворотки КпоекОШ при соотношении жидкая ΌΜΕΜ/ΡΙ2 - 75-95%, жидкий заменитель сыворот- 11 022736 ки КпоскОи! - 5-25%, при этом синтетическая среда дополнительно содержит факторы роста 8СР, ВМР4, ЬРОР, ТОРЬсШ в эффективных количествах, причем ТОРЬс1а добавляют на 3-6 дни дифференцировки, а сепарацию проводят на 3-9 дни методом иммунологической селекции с использованием маркеров, специфических для клеток эндотелия, после чего полученные эндотелиальные клетки культивируют в указанной синтетической среде при плотности посева не менее 50000 клеток на 1 см².

2. Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, предусматривающий дифференцировку ЭСК человека на подложке и в среде, которые обеспечивают направленную прямую дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки, с человеческим фактором роста эндотелия сосудов УЕОР и сепарацию полученных эндотелиальных клеток, отличающийся тем, что используют среду для дифференцировки на основе смеси ΌΜΕΜ/ΡΙ2 с фетальной бычьей сывороткой при соотношении жидкая ΌΜΕΜ/ΡΙ2 - 75-95%, жидкая фетальная бычья сыворотка - 5-25%, при этом среда дополнительно содержит факторы роста 8СР и ЬРОР в эффективных количествах, а сепарацию проводят на 3-9 дни методом иммунологической селекции с использованием маркеров, специфических для эндотелиальных клеток, после чего полученные эндотелиальные клетки культивируют в указанной среде при плотности посева не менее 50000 клеток на 1 см².