KR20110088260A - 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법 - Google Patents

인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법 Download PDF

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문신용
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Abstract

본 발명은 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 BMP2를 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 심근세포 및 분화 유도용 조성물에 관한 것이다.

Description

인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법{Method　for differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocytes}
본 발명은 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 BMP2를 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 심근세포 및 분화 유도용 조성물에 관한 것이다.
인간 배아줄기세포는 자가 재생 능력 및 심근세포를 포함한 매우 다양한 종류의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있으며, 상기 분화된 세포들이 각종 장기에서 발생하는 질환들을 치료할 수 있는 인간 세포치료법에 적용될 수 있을 것으로 제안되어 왔다. 즉, 인간 배아줄기세포는 성상을 정확히 규명할 수 있고 임상 치료 시, 기능부전의 세포를 새로운 세포로 대체하기 위한 세포를 풍부히 공급할 수 있는 강력한 후보자로 여겨지고 있다.
급성심근경색 이후에 진행하는 심부전의 발생률은 지속해서 늘어나는 추세이나, 현재까지의 치료는 이미 비가역적인 상태로 경색상태에 이른 심근을 재생할 수 없다는 한계점이 있어서 심부전이 진행하는 경우 심장이식 이외에는 특별한 대안이 없는 상태이다. 또한 인간의 심방 또는 심실 조직, 및 다양한 종에서 채취 및 일차 분리된 심근세포가 심장 연구 및 치료제 개발과정에 유용하게 이용되고 있으나,이러한 방법에 의해 얻어진 일차 배양세포는 세포 증식률이 매우 제한적이어서 양적인 수급이 한정적이고, 세포 배양 중 세포가 다른 세포 계열로도 함께 분화가 진행될 수 있다는 점, 효과적으로 유전자를 조작하는 것이 매우 어렵다는 점, 인간 세포의 활용에 있어서 치료 목적에 따른 다양한 인간 유래 조직을 확보하기 어렵다는 점 등이 관련 기술개발에 큰 병목점이 되고 있다. 이에 따라, 인간 배아줄기세포-유래의 심근세포는 심장 관련 질환 치료를 위한 임상학적 소스로 관심을 받고 있다. 그러나, 현재까지 인간 배아줄기세포-유래의 심근세포는 고-효율의 분화 방법 등의 부족에 의해 그 적용 가능성이 낮게 평가되어 지고 있는 실정이다. 종전의 연구들은 인간 배아줄기세포로부터 심근세포의 제조에 있어서 배아체 (embryoid bodies, EB) 경유를 통해 분화를 유도하는 방법 또는 혈청을 포함하는 배지에서의 성공에 대해서만 보고 되고 있다. 비록 외부 성장 인자를 공 모양의 배아체에 처리하여 심근 세포를 제조하거나 혈청을 포함하는 환경에서 분화를 유도하는 방법 등에 의한 성공 등이 보고되고 있었으나, 분화 효율의 다양성 및 세포의 혼재 (heterogeneity)가 배아체를 이용한 분화 시스템의 한계였다. 게다가, 심근 특이적 마커들의 발현 효율을 바탕으로 한 분화 효율은 박동하는 클러스터의 형성 비율과 동등하지 않았다. 또한, 종전의 분화 방법들은 단지 한가지 또는 두 개의 세포주에서 분화를 적용하거나 혈청 존재 조건이어서 임상학적으로 완벽히 적용된다고 할 수 없었다. 아울러, 인간 배아줄기세포를 심근관련 질환 세포치료제로 실용화하기 위해서는 분화 과정 중 혈청 및 동물유래 물질 사용을 제한하여, 병원체 감염의 위험을 방지하여 임상 적용 시 안전성을 확보하는 것이 가장 중요하기 때문에 혈청을 바탕으로 하는 현재까지 보고된 방법은 임상 적용에 있어서 한계점이 존재하여 왔다.
이에 본 발명자들은 무혈청 배지 조건에서 인간 배아줄기세포를 박동하는 심근세포로 분화시키는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, BMP2를 배아체를 경유하지 않는 직접 분화법의 분화 초기에 처리할 경우 심근세포로 효율적으로 분화시킬 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 BMP2를 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 분화 유도 방법에 의해 제조된 심근세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 배양 배지 내에 BMP2를 포함하는, 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 무혈청 배지 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 BMP2를 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "BMP2 (Bone morphogenetic protein 2)"는 골형성 단백질의 일종으로 뼈 및 연골의 분화에 중요한 효과를 나타낸다고 알려진 단백질이다.
본 발명에서 용어 "무혈청 배지"란 배양되는 세포를 오염시키거나 이식거부를 유발할 수 있는 외래종 또는 동종의 혈청을 포함하지 않는 임의의 세포 배양 배지를 의미하며, 혈청 대체물을 추가적으로 포함할 수 있다. 무혈청 배지의 예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 넉아웃 혈청 대체재 (knockout serum replacement) 등 통상적으로 구입할 수 있는 혈청 대체물을 사용할 수 있다. 상기와 같은 무혈청 배지의 사용은 혈청 배지 내에 존재하는 우태아혈청 (FBS) 또는 우혈청 (FCS)과 같은 소유래의 물질로 인한 광우병 바이러스 등을 비롯한 오염원을 포함하고 있을 가능성으로 인한 임상학적 적용에 있어서 발생할 수 있는 위험을 제거할 수 있다. 또한 무혈청 배지를 사용하는 경우, 혈청 내의 단백질이 항체 형성을 유도하여 이로 인한 이식된 세포의 이식 거부를 일으킬 위험 등을 제거할 수 있어서 본 발명의 분화 방법에 의해 제조된 심근세포를 심장 관련 질환의 세포 치료제로 임상학적 위험 없이 적용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "인간 배아줄기세포"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴를 추출하여 체외에서 배양한 것으로 인체의 모든세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency)을 가지는 세포를 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체 (embryoid body) 또는 유도 전분화능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell:iPS cell)와 같은 유사 줄기세포들을 포함한다. 또한, 인간 배아 줄기세포 또는 유도 전분화능 줄기세포는 공지의 방법에 의해 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어 "심근세포"는 장래에 기능적인 심근세포가 될 수 있는 능력을 가진 심근 전구 세포, 또는 태아형 심근세포, 성체 심근세포의 모든 분화 단계의 세포를 제한 없이 포함하며, 이하에 기재된 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 방법에 의하여 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 마커나 기준으로 확인할 수 있는 세포를 의미한다. 심근세포 특이적인 각종 마커의 발현은, 공지의 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출할 수 있으며, 이러한 방법은 제한 없이 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 심근 전구 세포 또는 심근세포에 결합하는 마커 특이적인 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 개개의 특이적 마커를 표적으로 하는 항체는 시판용이나 공지의 방법에 의해 제조된 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커의 예로는 미오신 중쇄/경쇄 (MHC/MLC), α-엑티닌 (α-actinin), 트로포닌 I (cTn I), ANP, GATA4, Nkx2.5 및 MEF-2c 등을 들 수 있다. 또는, 심근 전구 세포 또는 심근세포 특이적 마커의 발현은, 특정한 방법에 한정되지 않으나, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이나 혼성화 분석인, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 해석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커(예, 미오신 중쇄/경쇄,α-엑티닌, 트로포닌 I, ANP, GATA4, Nkx2.5 및 MEF-2c) 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행 (GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 다능성 세포의 심근세포로의 분화를 확인하기 위해, 생리학적 기준을 추가적으로 사용할 수 있다. 즉, 다능성 세포 유래의 세포가 자립적 박동성을 가지거나, 각종 이온 채널을 발현하고 있고 전기 생리적 자극에 반응할 수 있는 것 등도 유용한 지표로 활용할 수 있다.
일반적인 분화를 유도하는 방법은 크게 직접 분화 유도법과 배아체 경유법으로 대별될 수 있다. 직접 분화 유도법은 본원에서 "부착 배양법"과 혼용될 수 있으며, 이는 미분화 인간 배아줄기세포를 분화 유도과정에서 배양기 표면에 부착시켜 배양하면서 분화를 유도하는 방법이며, 배아체 경유법은 미분화 인간 배아줄기세포로부터 배아체를 생성하고 이를 다시 배양기 표면에 부착하면서 분화를 유도하는 방법이다.
바람직한 일 실시 태양으로 상기 BMP2를 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법은 인간 배아줄기세포를 배아체를 형성시키지 않고 직접 분화를 유도하는 방법에 의해 수행할 수 있으며, 상기 BMP2를 포함하는 무혈청 배지에 배양하는 시기는 심근세포로 분화시킬 수 있는 기간이라면 제한 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게 분화 유도 초기에 이루어질 수 있으며, 더욱 바람직하게 분화 유도 시작 후 1일 내지 5일 동안 배양할 수 있으며, 더 더욱 바람직하게 분화 유도 시작 후 1일 내지 4일 동안 상기 무혈청 배지에서 배양하여 심근세포로 분화를 유도할 수 있다.
바람직한 일 실시 태양으로 상기 BMP2의 농도는 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도시킬 수 있는 농도라면 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게 5 ng/ml 내지 25 ng/ml 농도의 BMP2를 사용할 수 있으며, 더 바람직하게 10 ng/㎖ 농도의 BMP2를 사용할 수 있다.
바람직한 일 실시 태양으로 상기 BMP2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계 이전에 악티빈 A (Activin A)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 악티빈 A를 포함하는 배지에서 배양하는 단계는 미분화 인간 배아줄기세포에 분화 유도 시작 후 5일 동안 수행될 수 있으며, 더 바람직하게 분화 유도 시작 후 1일 동안 수행될 수 있다. 이와 같이 미분화 인간 배아줄기세포를 분화 유도 시작 후 1일 내지 5일 동안 악티빈 A를 포함하는 배지에서 배양한 후, 악티빈 A 없이 BMP2를 포함하는 배지에서 1일 내지 5일 동안 배양하는 것이 바람직하다.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 악티빈 A의 농도는 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도시킬 수 있는 농도는 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게 상기 악티빈 A의 농도는 50 ng/ml 내지 150 ng/ml, 더 바람직하게 50 ng/ml 내지 100 ng/ml, 가장 바람직하게 100 ng/㎖ 농도의 악티빈 A를 사용할 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 분화 방법은 (i) 미분화 인간 배아줄기세포의 배양 배지에서 지지세포를 제거하는 단계; (ii) 상기 (i) 단계에서 수득한 세포를 악티빈 A를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; (iii) 상기 (ii) 단계의 세포를 악티빈 A를 제거하고 BMP2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 (iv) 상기 (iii) 단계의 세포를 BMP2를 제거한 배지에서 배양하는 단계에 의해 이루어질 수 있다.
구체적인 일 구현예에 따르면 배아체를 거치지 않는 무혈청 배지 조건에서 인간 배아줄기세포로부터 심근세포로 직접 분화 유도하는 방법은 도 1에 나타낸 바와 같다. 본 발명자들은 미분화 상태의 인간 배아줄기세포인 SNUhES3, SNUhES16 및 SNUhES12에 대하여, 지지세포가 제거된 인간 배아줄기세포에 악티빈 A를 24시간 동안 처리한 다음, BMP2를 4일간 처리한 후 분화 기간 동안 5일째부터는 성장 인자들을 첨가하지 않고 분화를 유도하였다. 그 결과, 분화 3일째에 분화된 세포가 인간 배아줄기세포 군락의 가장자리 부분에 나타나는 것을 관찰하였고, BMP2에 짧은 시간 노출된 분화된 세포들이 이동하여 3차원적 구조를 형성하며 10일간의 분화 기간을 더 거친 후 인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 전형적인 형태가 관찰되었고, 분화 14일째에 박동하는 클러스터를 확인하여 기능성 심근세포로 분화가 되었음을 확인하였다. 또한 종래의 한 종류의 인간 배아줄기세포주에서 분화 유도를 관찰한 연구결과들과는 달리 서로 다른 기원의 인간 배아줄기세포주인 3종류의 세포주에서 분화를 유도하여 본 발명의 분화 유도 방법이 세포주에 따라 변이가 없다는 것을 확인하였다.
또한, 분화된 심근세포는 형태에 따라 낭포-유사 (cyst-like), 혼합된 모양 (mixed shape), 부유체 (floating) 및 근육-유사 (muscle-like) 형태의 4종류로 구분할 수 있었으며, 각 세포의 박동은 규칙적이었으며 체외에서 3주 이상 지속되는 것을 관찰할 수 있었다. 각 형태 사이에 박동수의 차이는 관찰되지 않았으며 평균 박동수는 분당 21회에서 47회였다. 이와 같은 결과는 기능적인 박동하는 심근세포를 본 발명의 분화 유도 방법에 의해 효율적으로 제조할 수 있음을 시사한다.
구체적인 일 구현예에 따르면 심장 특이적 표지 인자의 발현을 mRNA 및 단백질 수준에서 관찰한 결과, 중배엽 발생 초기에 발현이 시작되는 중배엽성 세포 계열의 핵심 전사 인자인 브라키우리 (Brachyury)는 분화 1일째에 발현이 시작되고 분화 3일부터 발현이 증가하였고, 초기 심장 신호전달계를 조절하는 다른 전사 인자인 Tbx5 역시 발현이 확인되었고, 초기 전사 인자 중 하나인 GATA4 또한 분화 3일째부터 발현이 되었고, 분화 10일째에 Nkx2.5 및 α-MHC의 발현을 확인하였고, 미분화 배아줄기세포의 표지인자인 Oct4는 발현되지 않거나, 분화하는 세포의 중심부분에서 한정적으로 발현되는 것을 관찰하였다. 이는 분화 초기에 BMP2를 처리하는 본 발명의 분화 유도 방법이 분화된 심근세포에서 주요한 심장 전사인자의 캐스케이드 (cascade)를 유도하는 것을 시사한다.
기능적인 심근세포로의 분화 유도를 더욱 명확히 확인하기 위한 구체적인 일 구현예에 따르면, 박동하는 심근세포의 형성을 확인한 후, 심장 특이적 표지인자인 Nkx2.5, α-MHC 및 cTn I의 발현을 분화된 세포에서 측정한 결과, Nkx2.5의 발현은 높았으며 분화가 진행됨에 따라 증가하였고, 심근 구조 단백질인 α-MHC의 발현 또한 확인할 수 있었다. 모든 유전자들의 발현은 분화 5일째에 증가되었으며, 분화 20일까지 확인한 결과, 심장 표지인자들의 발현은 박동이 시작되는 시점인 14일째와 유사한 15일째에 가장 높다는 사실을 확인하였다 (도 2b). 또한, 심장 표지 인자들의 발현을 단백질 수준에서도 관찰한 결과, Nkx2.5와 구조 단백질 α-MHC, cTn I 및 심근세포의 수축 조절과 관련된 α-엑티닌 등이 분화된 세포에서 관찰되었고, 이와 같은 표지인자들의 비율을 단일 세포 분석을 이용하여 측정한 결과, 브라키우리를 발현하는 세포의 비율은 분화 3일째에 13.7%였다. Nkx2.5 및 α-MHC를 발현하는 세포의 비율은 분화 12일째와 17일째에 각각 21.6%와 28.5%였다 (도 4). 이러한 결과는 분화된 세포들이 명확하게 심근세포의 특성을 보유하고 있음을 나타낸다. 인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 기능적 특성을 분석하기 위해, 심장 수축에 중요한 역할을 하는 심근세포 특이적 이온 채널의 발현을 아울러 측정한 결과, 박동 생성, 심방 및 심실 심근세포에 존재하는 HCN (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated potassium channel)1, 2, 4 중 HCN1은 분화 5일째부터 발현되었고, HCN2의 발현은 HCN1의 발현보다 빨리 시작되었다 (도 2a). 분화된 세포에서 5 μM의 Fluo-4 아세톡시메틸 에스테르 (Fluo-4 acetoxymethylhyl ester)를 이용하여 세포 내 칼슘을 측정한 결과, 박동하는 모든 세포들은 강한 형광을 나타내었다 (도 5). 이러한 결과는 본 발명의 분화 유도방법에 의해 생성된 심근세포가 기능적인 칼슘 채널을 포함하고 있음을 시사하는 결과이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도 방법에 의해 제조된 심근세포에 관한 것이다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 심근세포는 하기의 특징을 가질 수 있다: (i) 낭포-유사 (cyst-like), 혼합된 모양 (mixed shape), 부유체 (floating) 또는 근육-유사 (muscle-like) 형태를 가짐; (ii) Nkx2.5, α-MHC, cTn I, HCN1 또는 HCN2를 발현함; 및 (iii) 박동하는 세포임.
본 발명의 분화 유도 방법에 의해 제조된 심근세포는 심장 관련 질환을 치료하기 위한 심근 재생제 또는 세포 대체요법용 세포 조성물로 이용할 수 있다. 심장 관련 질환은 선척적 또는 후천적으로 심장에 이상이 생기거나 변성이 생겨 발생한 질환이면 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대성 심근증, 확장형 심근증, 심근염, 만성 심부전 등이 있다. 심근 재생제 또는 세포 대체요법용 세포 조성물은 본 발명에 의해 제조된 심근세포를 높은 순도로 포함하는 것이면, 세포를 배지 등의 수성 담체에 부유시킨 것, 세포를 생체 분해성 기질 등의 지지체에 내포시킨 것, 또는 단층 또는 다층의 심근세포 시트 (Shimizu 등, Circ . Res. 90: e40, 2002)로 가공한 것 등, 다양한 형태로 사용할 수 있다. 상기 치료제는 개흉한 뒤 주사기를 이용하여 직접 심장에 주입하는 방법, 심장의 일부를 외과적으로 절개하여 이식하는 방법, 또는 카테터를 이용한 경혈관적 방법에 의해 이식하는 방법 등으로 장해 부위에 수송할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 심근세포의 쇠퇴 및 소실로 인한 상기의 심장 관련 질환에 있어서, 본 발명의 분화 유도 방법에 의해 제조한 심근세포를 질환성 심장 조직에 보충적으로 이식함으로써, 심장 기능 개선의 촉진을 기대할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 배양 배지 내에 BMP2를 포함하는, 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 무혈청 배지 조성물에 관한 것이다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 조성물은 B-27을 추가로 포함할 수 있다 (분화 유도용인 하나의 조성물에 BMP2와 악티빈 A를 동시에 포함하지 않으므로 악티빈에 관한 내용을 삭제하였습니다). 또한 공지의 배지 조성물의 기본 첨가물을 제한 없이 포함할 수 있으며, 그 예로 아미노산, 항생제 등을 포함할 수 있다.
바람직한 일 실시 태양으로, 상기 BMP2의 농도는 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도시킬 수 있는 농도는 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게 5 ng/ml 내지 25 ng/ml의 농도를 사용할 수 있으며, 더 바람직하게 10 ng/㎖ 농도의 BMP2를 사용할 수 있다.
바람직한 일 실시 태양으로, 상기 B-27의 농도는 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도시킬 수 있는 농도는 제한 없이 사용할 수 있다.
구체적인 일 구현예에 따르면 배양한 미분화 인간 배아줄기세포를 B27 및 악티빈 A를 포함하는 RPMI1640 배지에서 1일간 배양하고 악티빈 A를 제거한 후 10 ng/㎖의 BMP2를 추가로 4일간 처리한 후, 상기 성장 인자인 BMP2를 포함하지 않는 배지에서 배양시켜 기능적인 심근세포로 분화 유도하였다.
본 발명에 따른 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법, 본 방법에 의해 제조된 심근세포 및 심근세포 분화 유도용 조성물을 이용하면 심장 관련 질환의 치료를 위한 세포 치료제 등의 개발에 기여할 수 있다. 또한 본 발명의 분화 방법은 임상학적 관점에서 무혈청 배지를 사용하여 외래 혈청 등에 의한 오염의 위험이 없으며 최종적으로 분화된 성숙 세포를 확보하는 데 활용되어 심장 관련 질병의 원인 및 치료법 개발에 이용할 수 있다. 아울러 본 발명에 의해 제조된 심근 세포는 신약 개발 과정에서 요구되는 줄기세포를 이용한 생물학적 약효 검증 시스템 특히, 심근세포 분화 유도 물질 및 심장 기능 강화 물질을 개발하기 위한 약효 검증 시스템과 신약제품화에 활용될 수 있다.
도 1은 인간 배아줄기세포로부터 심근세포로 분화 유도하는 방법의 전체적인 개략도이다. 미분화 인간 배아줄기세포의 분화 유도 초기에 B27이 포함된 무혈청 배지에서 악티빈 A와 BMP2를 초기에 첨가하여 순차적으로 심근세포로 분화를 유도하는 과정을 전체적으로 나타낸 개략도이다.
도 2는 분화된 심근세포에서 심장 특이적 표지인자의 발현을 정량적 역전사 중합반응을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 2a는 인간 배아줄기세포 유래 심근세포에서 칼슘 채널 관련 유전자인 HCN1, 2 및 4의 발현 여부를 5일, 10일, 15일 및 20일 등 5일 간격으로 유전자 중합 반응을 이용하여 확인한 결과이다. 도 2b는 인간 배아줄기세포 유래 심근세포에서 중배엽 표지인자 브라키우리와 심장 특이적 표지인자인 Nkx2.5, αMHC, Tbx5 및 GATA4 등의 발현을 분화 후 5일, 10일, 15일 및 20일 등 5일 간격으로 확인하여 분화가 진행됨에 따라 발현이 증가하는 것을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a 및 b는 분화된 심근세포에서 심장 특이적 표지인자의 발현을 면역 형광 염색을 이용하여 확인한 결과에 대한 사진이다. 브라키우리 및 표지인자 Nkx2.5, cTn I, αMHC 및 α-엑티닌의 발현을 면역 형광 염색으로 확인하였으며, 미분화 표지인자인 Oct4의 발현이 감소하는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 분화된 심근세포에서 심장 특이적 표지인자의 발현을 유세포 분석을이용하여 확인한 결과이다. 분화 3일째의 브라키우리를 발현하는 세포의 비율 및 분화 후 12일과 17일째의 Nkx2.5 및 αMHC를 발현을 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 분화된 심근세포에서 Fluo-4를 이용하여 세포 내 칼슘의 발현을 확인한 결과이다. 분화된 세포 내에서 존재하는 칼슘을 공초점 레이저 현미경을 이용하여 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 인간 배아줄기세포 배양
세 개의 인간 배아줄기세포주, SNUhES3, SNUhES16 및 SNUhES12를 미토마이신 (Mitomycin C, Sigma)이 처리된 STO 지지세포 (ATCC) 위에서 Oh 등(Methods for expansion of human embryonic stem cells, Stem Cells, 2005 May; 23(5): 605-9)의 방법에 따라 배양하였다. DMEM/F12 (Invitrogen)를 기본 배양액으로 하여 20% 넉아웃 시럼 리플레이스먼트 (knockout serum replacement, KO-SR, Invitrogen), 1% 비필수 아미노산 (nonessential amino acids, Invitrogen), 0.1 mM 베타-머캡토에탄올 (β-mercaptoethanol, Sigma), 4 ng/㎖ 염기성 FGF (fibroblast growth factor, bFGF, Invitrogen), 50 U/㎖ 페니실린 (Invitrogen) 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Invitrogen) 등을 첨가하여 인간 배아줄기세포 배양액으로 사용하였다.
실시예 2: 직접 분화법을 이용한 심근세포의 형성
상기 실시예 1에서 얻은 미분화 상태의 인간 배아줄기세포에 0.025% 트립신-EDTA (Invitrogen)를 37℃에서 3분간 처리하였다. 이후, 지지세포를 제거하고 PBS (Invitrogen)로 세정하였다. 세정 후 RPMI 1640 (Invitrogen)배양액에 B27 (Invitrogen)을 첨가한 배양액을 첨가하고 100 ng/㎖의 악티빈 A (Activin A, R&D Systems)를 24시간 동안 처리한 후에 악티빈 A를 제거한 다음, 10 ng/㎖의 BMP2 (R&D Systems)를 4일간 처리하였다. 분화 기간 동안, 5일째부터는 성장인자들을 첨가하지 않고, 이틀 간격으로 배양액을 교체하였다.
상기와 같은 분화 과정의 전체적인 개요는 도 1에 나타낸 바와 같다.
실시예 3: 심근세포의 분화에 대한 주사현미경 분석
분화된 세포를 PBS로 세정한 후 2.5% 글루타르알데히드 (glutaraldehyde, Sigma) 용액으로 상온에서 20분간 반응시켰다. 그 후, 세포를 0.14 M 수크로스 (sucrose)가 첨가된 1% 오스뮴 테트록사이드 (osmium tetroxide, Sigma)를 첨가하여 4℃에서 10분간 반응시켰다. 에폭시 레진을 첨가한 후 중합을 위하여 빔 캡슐 (beam capsule)로 옮겨주었다. 중합된 세포들은 면도칼을 이용하여 레진으로부터 분리하였다. 울트라마이크로톰 (Ultramicrotome, MT-6000, DuPont Instruments-Sorvall Biomedical Div.)을 이용하여 샘플을 잘라준 후, 전자주사현미경 (JEM-1400; JEOL Ltd.)으로 관찰하였다.
그 결과, 미분화 상태의 인간 배아줄기세포는 악티빈 A와 BMP2의 순차적인 처리를 통하여 분화가 유도된 것을 확인할 수 있었다. 상기 실시예 2에서 악티빈 A를 지지세포가 제거된 인간 배아줄기세포에 24시간 동안 처리한 다음, BMP2를 4일간 처리한 결과, 분화 3일째에 분화된 세포가 인간 배아줄기세포 군락의 가장자리 부분에서 나타나는 것을 관찰하였다. BMP2에 짧은 시간 노출된 후에 분화된 세포들은 이동하여 3차원적 구조를 형성하였다. 10일간의 분화 기간을 더 거친 후 인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 전형적인 형태가 관찰되었다. 분화 14일째에 박동하는 클러스터를 확인하였고, 이는 본 발명의 배아체를 거치지 않는 분화법에 의해 인간 배아줄기세포가 완벽하게 심근세포로 분화될 수 있는 것을 입증하는 결과이다.
분화된 심근세포는 형태에 따라 4 종류로 구분할 수 있었다. 4종류는 다음과 같다: 낭포-유사 (cyst-like), 혼합된 모양 (mixed shape), 부유체 (floating) 및 근육-유사 (muscle-like).
인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 박동은 규칙적이었으며, 체외에서 3주 이상 지속되었다. 평균 박동수는 분당 21회에서 47회였다. 다른 형태의 클러스터 사이에 박동수의 차이는 관찰되지 않았다. 또한 초기의 심근세포보다 후기의 심근세포에서 박동수가 느려지는 현상이 나타났다. 이러한 결과는 기능적인, 박동하는 심근세포가 배아체를 거치지 않고, 혈청을 배제한 조건에서 BMP2를 이용한 직접 분화법에 의해 생성될 수 있음을 보여주고 있다.
실시예 4: 심근세포 분화 관련 표지인자 발현 조사
<4-1> 역전사 중합반응 및 정량적 역전사 중합반응에 의한 표지 인자 발현 조사
심장 특이적 표지인자의 발현을 인간 배아줄기세포에서 심근세포로 분화되는 과정 중에 있는 분화 5일, 10일, 15일 및 20일째의 상기 세포들에서 mRNA 수준에서 역전사 중합 반응 및 정량적 역전사 중합반응을 실시하여 확인하였다. 분화 단계별 세포를 트리졸 (Trizol)을 이용하여 전체 RNA를 추출한 후, 1 ㎍의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 반응에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.
<역전사 중합반응(RT-PCR) 및 정량적 역전사 중합반응(qPCR)에 사용한 프라이머>
프라이머 서열(5'-3') 서열번호
RT-PCR




 HCN1 Forward CGGAAACTGGTGGCTACAAT 1
HCN1 Reverse TCGAACACTGGCAGTACGAC 2
HCN2 Forward CTCCTTCGCACTCTTCAAGG 3
HCN2 Reverse AACATCTTGCCCTGGTAACG 4
HCN4 Forward GGTGTCCATCAACAACATGG 5
HCN4 Reverse TGTACTGCTCCACCTGCTTG 6
qPCR










 αMHC Forward TGCTGCAACACCTGGTCCTC 7
αMHC Reverse AGTGCTTCGTGCCCGATGAC 8
브라키우리 Forward TGCTTCCCTGAGACCCAGTT 9
브라키우리 Reverse GATCACTTCTTTCCTTTGCATCAAG 10
GAPDH Forward AGCCACATCGCTCAGACACC 11
GAPDH Reverse GTACTCAGCGCCAGCATC 12
GATA4 Forward TTACACGCTGATGGGACTGGAG 13
GATA4 Reverse GGGGAACGCAGGGGACAAG 14
Nkx2.5 Forward TTGCGCACGGGAGAGTTTGT 15
Nkx2.5 Reverse GCCCGACGAGCTCAGTCCCAGTT 16
TBX Forward TACCACCACACCCATCAAC 17
TBX Reverse ACACCAAGACAGGGACAGAC 18
역전사 중합반응을 Hipi premix를 이용하여, 55℃에서 35주기로 수행하였다. 반응 산물을 2% 아가로오즈 젤에서 확인하였다. 정량적 역전사 중합반응은 RotorGene 3000 (Corbett Life Science)에서 QuantiTectTM SYBR® green PCR kit (Qiagen)를 이용하여 수행하였다. 증폭 프로그램은 95℃에서 15분간 반응시킨 후, 95℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 20초간 결합, 72℃에서 30초간 증폭하는 주기를 45번 반복하였다. 상기 모든 반응은 3번 반복하였으며, CT 값은 RotorGene 6.0 프로그램을 이용하여 계산하였다. 상대적 유전자 발현은 GAPDH 발현을 기준으로 계산하였다.
그 결과, BMP2 의 처리는 심장 표지인자의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 중배엽 발생 초기에 발현이 시작되는 중배엽성 세포 계열의 핵심 전사 인자인 브라키우리 (Brachyury)는 분화 1일째로부터 발현이 시작되는 것이 관찰되었다. 브라키우리의 발현은 분화 3일부터 증가되었다. 초기 심장 신호전달계를 조절하는 또 다른 전사인자인 Tbx5의 발현은 낭배 형성 후 심장 중배엽의 형성을 나타내는 결과이다. 초기의 전사 인자 중 하나인 GATA4 또한 분화 3일째부터 발현되었다. 이러한 결과는 분화 초기의 BMP2의 처리가 인간 배아줄기세포 유래의 분화된 심근세포에서 주요한 심장 전사 인자의 캐스케이드 (cascade)를 유도한다는 사실을 보여주는 결과이다.
또한, 분화 5일, 10일, 15일 및 20일째에서 정량적 역전사 중합 반응을 이용하여 심장 특이적 표지인자인 Nkx2.5, α-MHC 및 cTn I의 발현을 분화된 세포에서 측정한 결과는 Nkx2.5는 높게 발현되었으며, 분화가 진행되면서 점차 증가하는 결과를 나타냈다. 심근 구조 단백질인 α-MHC의 발현 또한 확인되었다. 모든 유전자들의 발현은 분화 5일째에 증가되었으며, 박동하는 심근세포의 형성이 확인된 분화 시작 14일째와 유사한 분화 15일째에 가장 높은 발현을 나타내었으며, 분화 20일까지 관찰하였다 (도 2b). 본 결과는 심장 표지 인자들의 발현이 박동이 시작되는 시점에 가장 높다는 사실을 나타내는 결과이다.
아울러, 인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 기능적 특성을 분석하기 위해, 심장 수축에 중요한 역할을 하는 심근세포 특이적 이온 채널의 발현을 측정하였다. 박동 생성, 심방 및 심실 심근세포에 존재하는 HCN (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated potassium channel)1, 2 및 4의 발현을 측정한 결과, HCN1의 발현은 분화 15일째부터 시작되었으며, HCN2의 발현은 HCN1의 발현보다 빨리 시작되었다 (도 2a).
<4-2> 면역세포염색법에 의한 표지 인자 발현 조사
심장 특이적 표지 인자의 발현을 인간 배아줄기세포에서 심근세포로 분화되는 과정 중에 있는 분화된 세포에서 단백질 수준에서 관찰하였다. 샘플들을 4% PFA (paraformaldehyde, Sigma) 용액을 이용하여 상온에서 20분간 고정하였다. PBS로 세정 후, 비특이적 반응을 억제하기 위해 3% BSA (Sigma)와 0.1% 트리톤 X 100 (Triton X 100, Sigma)이 포함되어 있는 용액으로 12시간 이상 4°C에서 반응시켰다. 일차 항체, 토끼 항-인간 브라키우리 (Brachyury, Santa Cruz Biotechnology), 염소 항-인간 Nkx2.5 (R & D Systems), 토끼 항-인간 Nkx2.5 (Abcam), 염소 항-αMHC (α-myosin heavy chain, Santa Cruz Biotechnology), 쥐 항-cTn I (cardiac Troponin I, Chemicon), 쥐 항-Oct4 (Santa Cruz Biotechnology) 및 염소 항-엑티닌 (actinin, Santa Cruz Biotechnology) 등을 첨가한 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후 PBST (PBS with 0.05% Tween 20)로 세 번 세정한 후, 이차 항체를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST를 이용하여 세 번 세정한 후, DAPI가 포함되어 있는 용액으로 염색하여, 공초점 형광 현미경 (BioRad) 을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 브라키우리의 발현은 분화 3일째의 초기 분화세포의 가장자리 부분에서 뚜렷하였으며, 이는 상기 정량적 역전사 중합반응의 결과와 일치한다. 분화 10일째에 Nkx2.5와 α-MHC의 발현 또한 측정되었다. 또한, 미분화 배아줄기세포의 표지인자인 Oct4는 발현되지 않거나, 분화하는 세포의 중심부분에서 한정적으로 발현되었다 (도 3a). 이는 분화 초기의 BMP2의 처리가 인간 배아줄기세포 유래, 분화된 심근세포에서 주요한 심장 전사 인자의 캐스케이드를 유도한다는 사실을 암시하는 결과이다. 또한, 심장 표지 인자들의 발현도 단백질 수준에서도 확인되었는데, Nkx2.5와 구조 단백질 α-MHC, cTn I 및 심근세포의 수축 조절과 관련된 α-엑티닌 등이 분화된 세포에서 측정되었다 (도 3a 및 3b).
<4-3> 유세포 분석에 의한 표지 인자 발현 조사
박동하는 심근세포의 형성을 확인한 후, 심장 특이적 표지인자의 발현을 분화된 세포에서 측정하였다. 세포는 0.25% 트립신-EDTA에서 10분간 37℃에서 반응시킨 후, 단일 세포로 분리하였다. 그 다음 4% PFA로 고정시킨 후, 블로킹 용액으로 반응시켰다. 일차 항체, 토끼 항-인간 브라키우리 (Santa Cruz Biotechnology), 토끼 항-Nkx2.5 및 쥐 항-인간 α-MHC를 첨가하여, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이차 항체를 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, PBST를 이용하여 세 번 세정하였다. 세포들은 BD FACS CaliburTM (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 브라키우리를 발현하는 세포의 비율은 분화 3일째에 13.7%였다. Nkx2.5와 α-MHC를 발현하는 세포의 비율은 분화 12일째와 17일째에 각각 21.6%와 28.5%였다 (도 4). 이러한 결과는 분화된 세포들이 명확하게 심근세포의 특성을 보유하고 있음을 보여주는 결과이다.
<4-4> Fluo -4 염색에 의한 세포 내 칼슘 조사
박동하는 심근세포의 형성을 확인한 후, 분화된 세포에서 Fluo-4 아세톡시메틸 에스테르 (Fluo-4 acetoxymethylhyl ester)를 이용하여 세포 내 칼슘을 측정하였다. 분화된 세포들을 5 μM Fluo-4 (Invitrogen)를 이용하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 세정하였다. 결과는 공초점 레이저 현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 박동하는 모든 세포들은 강한 형광을 나타내었다 (도 5). 이러한 결과는 혈청을 배제한 조건에서 BMP2에 의해 직접 분화법으로 유도된 인간 배아줄기세포-유래 심근세포가 기능적인 칼슘 채널을 포함하고 있음을 나타내는 결과이다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Method for differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocytes <130> PA090545/KR <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HCN1 <400> 1 cggaaactgg tggctacaat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for HCN1 <400> 2 tcgaacactg gcagtacgac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HCN2 <400> 3 ctccttcgca ctcttcaagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for HCN2 <400> 4 aacatcttgc cctggtaacg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HCN4 <400> 5 ggtgtccatc aacaacatgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for HCN4 <400> 6 tgtactgctc cacctgcttg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for alpha MHC <400> 7 tgctgcaaca cctggtcctc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for alpha MHC <400> 8 agtgcttcgt gcccgatgac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Brachyury <400> 9 tgcttccctg agacccagtt 20 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Brachyury <400> 10 gatcacttct ttcctttgca tcaag 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 11 agccacatcg ctcagacacc 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 12 gtactcagcg ccagcatc 18 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GATA4 <400> 13 ttacacgctg atgggactgg ag 22 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GATA4 <400> 14 ggggaacgca ggggacaag 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nkx2.5 <400> 15 ttgcgcacgg gagagtttgt 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nkx2.5 <400> 16 gcccgacgag ctcagtccca gtt 23 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TBX5 <400> 17 taccaccaca cccatcaac 19 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TBX5 <400> 18 acaccaagac agggacagac 20

Claims (12)

  1. BMP2를 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분화는 인간 배아줄기세포를 배아체를 형성시키지 않고 직접 분화를 유도하는 방법에 의해서 수행되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 BMP2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계는 분화 유도 초기에 이루어지는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 BMP2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계는 분화 시작 후 1일 내지 5일 동안 배양하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 BMP2의 농도는 5 ng/ml 내지 25 ng/ml인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 BMP2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 단계 이전에 악티빈 A를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 악티빈 A를 포함하는 배지에서 배양하는 단계는 분화 시작일부터 1일 동안 이루어진 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 악티빈 A의 농도는 50 ng/ml 내지 100 ng/ml인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 분화 유도하는 방법은
    (i) 미분화 인간 배아줄기세포의 배양 배지에서 지지세포를 제거하는 단계;
    (ii) 상기 (i) 단계에서 수득한 세포를 악티빈 A를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;
    (iii) 상기 (ii) 단계의 세포를 악티빈 A를 제거하고 BMP2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    (iv) 상기 (iii) 단계의 세포를 BMP2를 제거한 배지에서 배양하는 단계에 의해 이루어진 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되며, 하기의 특징을 가지는 심근세포:
    (i) 낭포-유사 (cyst-like), 혼합된 모양 (mixed shape), 부유체 (floating) 또는 근육-유사 (muscle-like) 형태를 가짐;
    (ii) Nkx2.5, α-MHC, cTn I, HCN1 또는 HCN2를 발현함; 및
    (iii) 박동하는 세포임.
  11. 배양 배지 내에 BMP2를 포함하는, 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 무혈청 배지 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 BMP2의 농도는 5 ng/ml 내지 25 ng/ml인 무혈청 배지 조성물.
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