KR100980005B1 - 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HIF-1 (Hypoxia-inducible factor-1)의 억제제를 이용하여 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래 배아체를 심근세포로 분화 유도하는 방법 및 그러한 분화 유도를 위한 조성물에 관한 것이다.

배아줄기세포, 분화, 심근세포, HIF-1(Hypoxia-inducible factor-1)

Description

배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법 {Method for inducing the differentiation of embryonic stem cells into myocardial cells}

본 발명은 배아줄기세포의 배양 배지에 HIF-1의 활성을 억제하는 물질을 가하여 배양함으로써, 배아줄기세포를 효과적으로 심근세포로 분화시키는 방법 및 그러한 분화 유도를 위한 조성물에 관한 것이다.

배아줄기세포는 생체 외 배양조건에서 분화하지 않고 정상적인 핵형을 유지한 채 지속적으로 자가 증식할 수 있는 능력이 뛰어나며 또한 배양 환경에 따라 이론적으로 생체를 구성하고 있는 거의 모든 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다는 특성으로 인해 연구 및 기술개발의 중요성이 강조되고 있다.

줄기세포 분화 기술은 차세대 재생의학 및 의료산업 개발 분야의 핵심 기술로 평가되고 있다. 특히, 배아줄기세포로부터 유래한 조직-특이적 분화 세포는 세포 치료제로서의 이용뿐만이 아니라 신약개발과정에서 약효 검색 및 독성검사를 위한 생물학적 스크리닝 시스템으로서의 활용 가능성이 지속적으로 강조되고 있다. 따라서, 분화유도능이 뛰어난 배아줄기세포를 이용하여 특정 기능을 담당하는 조직 세포로의 분화를 유도하는 기술에 대한 요구는 급증하고 있는 추세이며, 표준화된 분화유도 프로토콜을 개발하기 위해서 조직세포 특이적 분화촉진 물질의 확보가 필수적으로 요구된다고 할 수 있다.

1981년 Evans와 Kaufman이 생쥐 배아에서 배아줄기세포의 배양을 최초로 성공하면서 생쥐 배아줄기세포는 배아줄기세포 연구 및 분화유도 기술 개발을 위한 기반 및 연구의 주재료로 이용되고 있으며, 1998년 Thomson 등에 의해 인간 배반포의 세포 내부괴에서 인간 배아줄기세포 배양이 성공한 이래 인간 배아줄기세포를 이용한 기술 개발, 특히 조직 세포 특이적 분화 유도 기술의 개발이 활발히 진행되고 있다. 다수의 연구 보고에서 인간 배아줄기세포가 생체 외 배양조건에서 망막세포 전구세포(Lamba DA et al., 2006), 신경세포( Li XJ et al., 2006; Zhang SC et al., 2001), 조혈세포(Tian X et al., 2005; Kaufman DS et al., 2005; Kaufman DS et al., 2001), 심근세포(Kehat I et al., 2003; Kehat I et al., 2001) 및 췌장세포(Assady S et al., 2001) 등으로 분화 유도됨이 보고되어 있으며, 인간 배아줄기세포가 생체 외 배양조건에서 배양액의 첨가물 조성, 영양세포를 포함한 세포의 배양조건에 따라 특정세포로 분화 유도하는 것이 가능함이 시사되고 있으며, 질환동물모델에서의 치료효과가 제시되고 있다.

심장세포대체요법(Cardiac-cell based replacement therapy)은 심장관련 질환 (heart disease)을 근본적으로 치료할 수 있는 치료법으로 인식되고 있으며, 현 재까지 배아줄기세포를 포함한 골격근 근모세포(skeletal myoblasts), 골수단핵세포(bone marrow mononuclear cells, BMC) 및 순환성 전구세포(circulating progenitor cells)인 내피전구세포(endothelial progenitorcells), 중간엽 세포(mesenchymal cells), 심장줄기세포(cardiac stem cells) 등이 중요한 세포 공급원이 되고 있으며, 이를 이용한 치료 효과가 집중적으로 연구되고 있다. 특히 1985년 Doetschman 등에 의해 배아줄기세포의 cardiogenial potential 이 보고된 이래, 많은 보고에서 배아줄기세포의 심근세포로의 분화능과 분화 유도 방법 등이 제시되고 있어 (Kehat I et al, 2004, Denning C et al., 2006 Xu C et al., 2006; Xu C et al., 2002 Mummery C et al., 2002), 배아줄기세포 이용은 심장 관련 질환의 새로운 치료 패러다임이 되고 있다.

지금까지 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도를 촉진하는 물질로는 레티노익산 (RA) (Wobus AM et al., 1997), 디메틸설폭사이드 (DMSO) (Ventura C et al., 2000), 아스코르빅산 (비타민 C) (Takahashi T et al., 2003), 카디오제놀 C (Wu X et al., 2004), 노긴 (Yuasa S et al., 2005) 등이 잘 알려져 있지만, 임상적으로 우수한 기능을 수행할 수 있는 인간 배아줄기세포를 이용한 심근세포 분화유도기술은 아직은 미약한 수준이다. 이를 극복하기 위해서는 인간 배아줄기세포에서 심근세포 분화유도에 관여하는 인자 및 작용기전을 이해하는 것이 중요하며 또한 이들의 활성을 조절하는 물질을 발굴하여 분화유도 기술에 활용하는 것이 매우 중요하다고 할 수 있다.

초기발생과정에서 정상적인 기관 형성 및 분화유도과정이 저산소 상태에서 이루어지고 있으며, 저산소 상태를 조절하는 분자적 기전을 이해하는 것은 저산소 상태에서 생존 가능한 줄기세포의 분화과정을 이해하는데 있어 중요한 실마리를 제공할 수 있을 것으로 사료된다. 특히, 세포의 저산소 상태에서 세포의 반응을 매개하는 대표적인 역할을 하는 전사조절인자 저산소-유도성 인자(Hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)는 저산소 상태에서 안정성 및 활성이 증가되며 표적유전자의 저산소 반응 요소(Hypoxia response element, HRE)에 결함함으로써 관련 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 것으로 알려져 있다. HIF-1α와 HIF-1β로 구성된 이형이합체(heterodimer)의 형태로 기능을 수행하는 HIF-1은 혈관신생 관련 세포 분화에 관여하는 유전자들(erythropoietin (EPO), VEGF, FLK-1, bFGF 등)의 발현을 직접 또는 간접적으로 조절한다고 알려져 혈관 신생과 관련된 줄기세포 분화 과정을 이해하는데 중요한 분자적 타겟이 되고 있다.

또한, 줄기세포로부터 심근세포의 분화를 유도하는 방법과 관련된 선행특허로는 국제공개공보 제2005-033298호(METHOD OF INDUCING THE DIFFERENTIATION OF STEM CELLS INTO MYOCARDIAL CELLS ), 국제공개공보 제2003-006950호(CELLS OF THE CARDIOMYOCYTE LINEAGE PRODUCED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS) 및 한국등록공보 제0484550호(세포 이식을 위한 세포의 생산 방법) 등이 있으나, 현재까지 HIF-1 활성 조절을 통해 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법과 관련된 기술은 개시된 바가 없다.

이에, 본 발명에서는 저산소 상태에서 세포의 반응을 매개하는 대표적인 역할을 하는 전사조절인자 저산소-유도성 인자(Hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)의 활성을 억제하기 위한 HIF-1 억제제로서, 새롭게 합성한 저분자 화합물을 배아줄기세포의 배양 배지에 첨가하여 배양했을 때, 심근세포 계통으로의 분화가 효과적으로 유도됨을 확인하였고, 분화된 세포의 특성을 분석함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 저산소 상태에서 세포의 반응을 매개하는 대표적인 역할을 하는 전사조절인자인 HIF-1(Hypoxia-inducible factor-1)의 억제제를 포함하는, 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래 배아체를 심근세포로 분화 유도하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 배양 배지에서 배양함으로써 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래 배아체를 심근세포로 분화 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 HIF-1(Hypoxia-inducible factor-1) 억제제를 포함하는, 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래 배아체를 심근세포로 분화 유도하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "HIF-1(Hypoxia-inducible factor-1)"는 저산소 상태에서 세포의 반응을 매개하는 대표적인 역할을 하는 전사조절인자로서, 저산소 상태에서 안정성 및 활성이 증가되며 표적유전자의 저산소 반응 요소(Hypoxia response element, HRE)에 결함함으로써 관련 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 것으로 알려져 있다. 또한, HIF-1은 HIF-1α와 HIF-1β 로 구성된 이형이합체의 형태로 기능을 수행하는데, 저산소 상태에서 HIF-1α는 HIF-1β와 결합하여 이형이합체(heterodimer)의 형태로 활성화되고 hypoxia Responsive element (HRE)염기서열에 결합하여 표적유전자의 발현을 조절하는데 중추적인 역할을 한다고 알려져 있다.

본 발명에서 용어, "HIF-1 억제제"는 상기 HIF-1의 활성을 억제시켜 정상적인 전사조절과정을 방해하는 물질로서, 바람직하게는 HIF-1α 억제제이다. 또한, HIF-1 억제제는 HIF-1α의 길항제일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물이다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본 발명자는 HIF-1 억제제로서 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물을 최초로 합성하여 국내에서 특허등록을 받은바 있다(한국특허등록 제10-0786336호). 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 제조 방법은 상기 등록 특허에 상세하게 기재되어 있으며, 화학식 1 및 화학식 2의 화합물에 관한 상기 등록 특허의 전체 내용은 본 발명에 참고로 포함된다.

한편, 상기 등록 특허에는 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 줄기세포 분화에 관한 생리학적 기능은 전혀 알려진 바가 없다. 반면, 본 발명은 화학식 1 및 화학식 2의 화합물이 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는데 탁월한 효과가 있다는 것을 최초로 입증하였다. 본 발명은 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 자극 하에 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하며, 상기 자극 방법은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 상기 화합물을 배지 중에 첨가하는 방법을 들 수 있다. 그 밖에도, 상기 화합물을 배지에 첨가하는 방법과 동일한 효과를 나타내는 모든 방법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래 배아체를 심근세포로 분화 유도하기 위한 조성물에서, HIF-1 억제제로서 이용되는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물의 조성물 내 농도는 0.1 내지 20 μM인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 1 μM 이다.

본 발명에서 용어, "배아줄기세포"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이 거나 전능성(全能性, totipotent)일 수 있는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. 배아체는 배아줄기세포의 다양한 조직 형태로의 자발적 분화 과정에서 줄기세포에 의해 형성된 중간구조이며, 배아 줄기 세포의 배양 중에 형성된 응집물(aggregate) 형태이다. 한편, 본 발명의 배아줄기세포 및 배아줄기세포 유래 배아체는 인간 또는 생쥐로부터 유래된 것이 바람직하다.

본 발명에서 "심근세포"는 심실, 심방 및 결절 세포를 포함하는 모든 종류의 심장 근육 세포로 분화할 수 있는 심장 세포의 전구체뿐만 아니라, 분화 과정에서 형성될 수 있는 모든 심근세포 계통의 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 제1형 변형 성장인자 베타 수용체 카이네이즈(Tranforming growth factor-β Type I receptor kinase: TβRI) 억제제를 추가로 포함할 수 있다. TβRI은 세포증식, 분화 및 다양한 종류의 세포에 다양한 작용을 하는 다기능성 펩타이드인 TGF-β의 수용체군으로서, ALK5(activin receptor like kinase 5)라고도 하는데, TβRI 억제제는 TβRI에 결합하여 이들의 정상적인 신호전달 과정을 방해하는 물질을 의미한다. 이때, 본 발명의 조성물에 포함되는 TβRI 억제제는 0.1 내지 20 μM의 농도로 첨가되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 5 μM 농도이다.

또한, 본 발명의 조성물은 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도를 촉진하는 공지의 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면, 레티노익산, 디메틸설폭사이드, 아스코르빅산(비타민 C) 및 카디오제놀이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 조성물은 바람직하게 배지조성물 형태로 제공될 수 있으며, 이때, 상기 배지조성물은 일반적인 기본 첨가물을 포함할 수 있으며, 예를 들면 혈청, 아미노산, 향생제 및 분화조절물질이 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적 실시예에서, HIF-1 억제제로서, 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 다양한 농도로 포함시킨 배양 배지 조성물에서 인간 배아줄기세포 또는 생쥐 배아줄기세포를 배양하여 심근세포 계통으로 분화를 유도한 후, 심근세포로의 분화 정도를 알아보았다. 이를 위해 심근세포 특이적 유전자들의 발현 정도 및 단백질 수준을 알아보기 위해 세미-퀀터테이티브(semi-quantitative) RT-PCR 및 면역형광염색법을 수행한 결과, HIF-1 억제제를 포함하지 않은 대조군에 비해, 심근세포 특이적 유전자들의 발현 정도 및 단백질 발현 수준이 증가된 것으로 나타났으며, HIF-1 억제제의 농도는 1 μM 일 때 세포독성을 보이지 않고 효과적으로 심근세포로의 분화를 유도하는 것으로 나타났다. 이는, 본 발명의 HIF-1 억제제를 포함하는 조성물이 배아줄기세포를 심근세포 계통으로 효과적으로 분화시킬 수 있음을 의미한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 HIF-1 (Hypoxia-inducible factor-1)의 억제제를 포함하는 조성물을 이용하여 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래 배아체를 심근세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법은 부착 배양(Adhesion culture)법, 배아체 경유법 및 공지의 심근세포 분화 유도법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 배아체 경유법이지만 이에 한정되는 것은 아니다. 부착 배양법은 미분화 배아줄기세포를 분화유도과정에서 배양기 표면에 부착시켜 배양하면서 분화를 유도하는 방법이며, 배아체 경유법은 줄기세포를 며칠간 부착 배양(adhesion culture)하다가 부유 배양(suspension culture)하여 배아체를 생성하고 이를 다시 배양용기에 부착 배양하면서 분화를 유도하는 방법을 말한다.

바람직하게, 본 발명의 줄기세포 분화 유도방법은 줄기세포를 준비하는 단계; 줄기세포로부터 배아체(embryoid body)를 얻는 단계; 및 HIF-1 억제제를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 포함하는 배지에서 배아체를 배양하여 배아체로부터 분화된 세포를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

보다 바람직하게, 본 발명의 줄기세포 분화 유도방법은 1) 미분화 배아줄기세포를 영양세포와 함께 공배양하는 단계; 2) 상기 배아줄기세포를 부유 배양하여 배아체를 확립하는 단계; 3) 상기 확립된 배아체를 부착 배양하는 단계; 및 4) HIF-1 억제제를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 포함하는 배지에서 배아체를 배양하여 심근세포로 분화시키는 단계를 포함할 수 있다.

먼저, 상기 단계 1)은 미분화 배아줄기세포를 영양(feeder)세포 위에 부착시켜 공배양함으로써 미분화 상태의 배아줄기세포를 증식시키는 단계이다. 본 단계에서 이용되는 배아줄기세포는 인간 또는 생쥐 유래의 배아줄기세포를 이용할 수 있으며, 영양세포로서 미토마이신 C 처리되어 증식이 정지된 생쥐 유래 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)를 사용할 수 있다. 미분화 배아줄기세포는 영양세포와 공배양하는 것이 바람직하다.

단계 2)는 상기에서 배양된 미분화 배아줄기세포를 부유 배양하여 배아체를 확립시키는 단계이다. 구체적으로, 미분화 인간 배아줄기세포의 경우, 이들을 영양세포 위에 부착시켜 공배양시킨 후 균일한 크기의 배아체를 얻기 위해 계대배양시 인간 배아줄기세포를 사방 500 내지 800 ㎛의 크기로 세포 덩어리를 작제시키고 부유 배양하여 인간 배아줄기세포 유래 배아체를 확립시킬 수 있다. 또한, 미분화 생쥐 배아줄기세포의 경우, 이들을 영양세포 위에 부착시켜 공배양시킨 후 계대배양시 생쥐 배아줄기세포를 800 cells/20㎕(배양배지) 의 농도로 현적배양을 통해 부유 배양하여 생쥐 배아줄기세포 유래 배아체를 확립시킬 수 있다. 단계 2)는 부유배양 상태에서 세포 응집물(cell aggregates)이 형성될 수 있는 충분한 시간 동안 실시하는 것이 일반적이며, 바람직하게는 1일 내지 5일, 더욱 바람직하게는 4일이다.

단계 3)은 상기에서 확립된 배아체를 부착 배양시켜 배아체를 안정화시키는 단계이다. 이후, 부착된 배아줄기세포 유래 배아체에 특정세포로의 분화유도제를 처리함으로써 배아줄기세포를 특정세포로 분화 유도시킬 수 있다.

단계 4)는 상기 부착 배양시킨 배아줄기세포 유래 배아체에 HIF-1 억제제를 처리하여 심근세포로 분화 유도하는 단계이다. HIF-1 억제제는 HIF-1의 활성을 억제시켜 정상적인 전사조절과정을 방해하는 물질이면, 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이때, HIF-1 억제제는 0.1 내지 20 μM 의 배양 배지 내 농도로 처리하고, 더욱 바람직하게는 1 μM 의 농도로 처리한다. 또한, 심근세포로 분화 유도시, HIF-1 억제제 이외에도 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도를 촉진하는 공지의 물질 및 일반적인 배지 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 TβRI 억제제를 포함할 수 있다. 단계 3)은 분화 세포가 형성될 수 있는 충분한 시간 동안 실시하는 것이 일반적이며, 바람직하게는 3일 내지 15일, 더욱 바람직하게는 7일이다.

본 발명의 구체적인 실시예 역시, 상기 4 단계에 따른 배양체 경유법을 이용하여 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도시켰다 (도 2A). 우선 1 단계에서는 계대 배양 이후 인간 배아줄기세포를 20% 넉아웃 시럼 리플레이스먼트(knockout serum replacement, Invitrogen, USA), 0.1 mM 비필수 아미노산(Non-essential amino acid, NEAA; Invitrogen, USA), 0.1 mM 베타-머캡토에탄올, 4 ng/㎖ 인간 재조합 염기성 FGF(recombinant human basic FGF, Invitrogen, USA), 및 1X 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; Invitrogen, USA)이 첨가된 DMEM/F12(Invitrogen, USA) 배양 배지에서 마이토마이신-C로 증식을 억제한 MEF(mouse embryonic fibroblast)와 함께 2일간 공배양하여 세포가 부착되면 새로운 배양액으로 교환하여 추가적으로 5일 동안 배양하였다. 콜로니 형태의 인간 배아줄기세포를 유리 파이펫으로 만든 기구를 이용하여 사방 500 내지 800 ㎛인 크기가 되도록 작제한 후 2단계에서는 작제된 인간 배아줄기세포 클럼프(clump)를 4일 동안 배아체 배지(80% Knockout DMEM, 20% 우태아혈청, 1 mM L-글루타민, 0.1 mM β-머캡토에탄올 및 1 mM NEAA)에서 부유 배양함으로써 배아체를 확립하였다. 3단계에서는 확립된 배아체를 0.1% 젤라틴이 코팅된 세포배양용 용기로 옮기고 상기의 분화배지로 1일간 부착 배양하였다. 4 단계에서는 부착 배양하고 있는 배아체에 HIF-1α 억제제를 첨가하여 7일 이상 배양하였다.

본 발명의 분화 유도방법을 통해 배아줄기세포로부터 심근세포로 분화 유도된 세포는 심근세포의 형태학적, 생리학적 또는 면역학적 특징을 가지는데, 바람직하게는 심근세포 특이적인 표지 인자들의 유전자 발현 정도가 증가될 수 있다. 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 경우, 심근세포 특이적인 표지 인자, 예를 들면 MLC-2α, MLC-2v, Cardiac Actin, cTnT, cTnl, α-actinin, MEF-2C, α-MHC 및 ANP 중 하나 이상의 유전자 발현 정도가 증가되는 특징을 가질 수 있다. 또한, 생쥐 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 경우, Nkx2.5, α-MHC, β-MHC, MLC-2v, GATA4 및 α-actinin 중 하나 이상의 유전자 발현 정도가 증가되는 특징을 가질 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기와 같은 배아체 경유법을 통해 심근세 포로 분화시킨 세포들의 심근세포 특이적 유전자의 발현변이를 분석하기 위해 세미 퀀터테이티브(semi-quantitative) RT-PCR을 실시한 결과, 1 μM의 농도에서 HIF-1α억제제가 세포 독성을 보이지 않고 심근세포 특이적 유전자의 발현을 증가시킴을 확인하였다. 구체적으로, HIF-1α 억제제와 함께 7일 동안 배양한 후 심근세포 특이적 유전자의 발현 변이를 세미 퀀터테이티브(semi-quantitative) RT-PCR을 이용하여 분석한 결과, MLC-2α, MLC-2v, Cardiac Actin, cTnT, cTnl, α-actinin, MEF-2C, α-MHC 및 ANP의 발현이 증가됨을 확인하였고(도 3), 화합물 군에서 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물의 효능이 우수한 것으로 확인되었다(결과로 표시하지 않음).

또한, HIF-1α 억제제의 심근세포로의 분화 촉진능을 좀 더 검증하기 위해 심근세포 표지 인자의 발현을 면역 형광법을 이용하여 단백질 수준에서 검증한 결과, HIF-1α 억제제로서 화학식 1 및 화학식 2를 각각 처리한 세포 그룹에서 심근세포 분화 표지인자 α-MHC 및 α-actinin 양성 염색 반응을 확인하였고(도 4), 이 경우에도 HIF-1α 억제제 화합물 중 화학식 1과 화학식 2의 화합물의 분화 촉진능이 제일 우수하였으며, 처리 농도는 1 μM에서 가장 우수한 효과를 나타냈다(결과로 표시하지 않음). 이들 결과로부터, 인간 배아줄기세포에서 본 발명의 HIF-1α 억제제가 심근세포로의 분화 촉진능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 기능성 심근세포로 분화한 세포에서 특징적으로 관찰할 수 있는 박동하는(beating) 세포가 HIF-1α 억제제에 의해 분화 유도된 세포군에서 생성되는지를 조사하였다. 검증 결과, 화학식 1 및 화학식 2를 각각 처리한 세포 그룹의 박동하는 세포 생성 률이 대조군에 비하여 약 4배 정도 증가하였다(도 5).

한편, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명에서 이용된 HIF-1α 억제제가 생쥐 배아줄기세포인 RW.4(ATCC SCRC-1018)에서도 심근세포 분화유도능을 가지고 있음을 확인하였다. 즉, 1 μM HIF-1α 억제제를 세포에 7일 동안 배아체 세포에 처리하였을 때 효과적으로 심근세포 표지인자인 Nkx2.5, α-MHC, β-MHC, MLC-2v, GATA4 및 α-actinin의 발현이 증가됨을 세미-퀀터테이티브 RT-PCR을 통해 확인하였다 (도 6). 인간 배아줄기세포와 유사하게 HIF-1α 억제제 화합물 중 화학식 1 및 화학식2의 화합물의 분화 촉진능이 제일 우수하였으며 처리 농도는 1 μM에서 가장 우수한 효과를 나타냈다(결과로 표시하지 않음). 또한, HIF-1α 억제제의 심근세포로의 분화촉진능은 박동 군집의 생성비율을 조사한 결과에서도 확인되었는데, 화학식 1 및 화학식 2를 각각 처리한 세포 그룹의 박동하는 세포 생성률이 대조군에 비하여 약 7배 정도 증가하였다 (도 7).

본 발명에서 생산되는 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근 전구세포는 계속 성장 증식하면 심근세포를 대량으로 얻는데 이용될 수 있으며, 심장 근육 관련 질환을 치료하기 위한 세포 대체 요법용 세포 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 HIF-1 억제제를 포함시키는 간단한 조성으로 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화를 효과적으로 유도시킬 수 있으며, 이러한 조성 물을 이용한 심근세포로의 분화 유도방법을 통해 심근세포를 대량으로 생산할 수 있다. 이러한 심근세포는 심장 관련 질환의 치료를 위한 세포치료제 등의 신약개발에 이용될 수 있다.

이하, 실시예 및 제조예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 및 제조예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 제조예에 의해 제한되는 것은 아니다.

< 제조예 1> HIF -1 억제제 - 화학식 1 화합물의 제조

[화학식 1]

2-[2-(4- 터트 -부틸- 페녹시 )- 아세틸아미노 ]- 이소니코틴아마이드

4-터트-부틸페녹시 아세트산(60.1 mg, 0.29 mmol), 2-아미노 이소니코틴아마이드(60.3 mg, 0.44 mmol), DIPEA(0.1 ㎖, 0.58 mmol) 및 PyBOP(301.8 mg, 0.58 mmol)을 DMF 4.0 mL에 넣고 교반시켰다. EtoAC와 물로 분리시키고, 유기층을 염화나트륨 수용액으로 세척하고, 무수 MgSO₄으로 건조시킨 후 농축하였다. Prep-TLC(n- Hexane:EtoAc:MeOH=6:3:1)로 정제하여 목적 화합물을 흰색 고체 형태로 얻었다.(53.6 mg, 56.5% 수득율)

¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 Hz) 10.64(1H, s, NH), 8.42-8.46(2H, m, aromatic-H), 8.20(1H, s, NH₂), 7.68(1H, s, NH₂), 7.49-7.51(1H, m, aromatic-H), 7.28-7.32(2H, m, aromatic-H),. 6.86-6.91(2H, m, aromatic-H), 4.78(2H, s, CH₂), 1.24 (9H, s, CH₃).

< 제조예 2> HIF -1 억제제 - 화학식 2 화합물의 제조

[화학식 2]

2-(2,4- 디클로로 - 페녹시메틸 )- 벤조옥사졸 -6-카르복시산

2-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-벤족사졸-6-카르복시산 메틸 에스테르(100 mg, 0.29 mmol)를 디메틸 설파이드 8 ㎖와 CH₂Cl₂ 58 ㎖에 넣고, 알루미늄 브로마이드(1.24 g, 4.64 mmol)를 첨가하였다. 상온에서 2.5시간 동안 교반시켰다. 물과 10% HCl을 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 교반시킨 후, EtoAC와 물로 분리시켰다. 유기층을 염화나트륨 수용액으로 세척하고, 무수 MgSO₄으로 건조시키고, 농축시킨 후, 플래쉬 크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=4:1)로 정제하여 목적 화합물을 흰색 고체 형태로 얻었다(59.15 mg mg, 61.2% 수득율).

¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 Hz) 13.22(1H, s, COOH), 8.28(1H, s, aromatic-H), 8.00-8.03(1H, m, aromatic-H), 7.88(1H, d, J=8.4Hz, aromatic-H), 7.64-7.65 (1H, m, aromatic-H), 7.34-7.43(2H, m, aromatic-H), 5.66(2H, s, CH₂).

실시예 1 : 인간 배아줄기세포의 배양

본 실시예에서는 인간 배아줄기세포의 미분화 상태를 유지하기 위해, 20% 넉아웃 시럼 리플레이스먼트(knockout serum replacement, Invitrogen, USA), 0.1 mM 비필수 아미노산(Non-essential amino acid, NEAA; Invitrogen, USA), 0.1 mM 베타-머캡토에탄올, 4 ng/㎖ 인간 재조합 염기성 FGF(recombinant human basic FGF, Invitrogen, USA) 및 1X 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; Invitrogen, USA)이 포함된 DMEM/F12 (Invitrogen, USA) 배지에서 마이토마이신-C(Sigma, USA) 처리된 MEF (mouse embryonic fibroblast) 영양세포와 함께 공배양 하였다. MEF 영양세포는 인간 배아줄기세포 계대 배양 하루 전에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Hyclone, USA), 0.1 mM 비필수 아미노산, 1X 페니실린/스트렙토마이신 및 0.5 mM 베타-머캡토에탄올이 첨가된 DMEM (Invitorgen, USA) 배지에서 유지 배양한 후, 10 ㎍/㎖ 마이토마이신-C(Sigma, USA)에서 1시간 30분 동안 불활성화하여 7.5 X 10⁴ cells/cm²의 농도로 0.1% 젤라틴(Sigma, USA)으로 코팅한 배양 용기에 부착한 후 인간 배아줄기세포 공배양에 사용하였다. 인간 배아줄기세포의 계대배양을 위해 콜로니 상태의 인간 배아줄기세포를 유리 파스퇴르 파이펫으로 만든 기구를 사용하여 사방 500 내지 800 ㎛ 크기로 세포 덩어리를 작제한 후 영양세포 위에 적당한 간격을 유지 하면서 올려놓는다. 세포 덩어리가 영양세포 위에 부착하고 약 2일 후부터 매일 배양배지를 교환하였으며, 5~6일 간격으로 계대 배양하였다.

실시예 2 : 인간 배아줄기세포로부터 배아체의 형성

인간 배아줄기세포의 계대배양시 균일한 크기의 배아체를 얻기 위해 실시예 1에서 기술한 유리 파이펫으로 사방 500 내지 800 ㎛ 크기로 콜로니 상태의 인간 배아줄기세포를 자른 후, 이를 부유 상태로 회수하여 박테리아 배양용 배양 접시로 옮긴 후 10% 넉아웃 시럼 리플레이스먼트(knockout serum replacement, Invitrogen, USA), 0.1 mM 비필수 아미노산(Non-essential amino acid, NEAA; Invitrogen, USA), 0.1 mM 베타-머캡토에탄올 및 1X 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; Invitrogen, USA)이 포함된 배아체 배양 배지 (EB cultrure medium)에서 부유 배양하였다.

실시예 3 : 인간 배아줄기세포의 심근세포로의 분화

상기 실시예 1에서 얻어진 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위해, 상기 실시예 2에서 얻어진 인간 배아줄기세포 유래 배아체를 배아체 배양 배지을 이용하여 4일 동안 부유 배양한 후 1일 동안 부착 배양하였다. 이후 1 μM의 HIF-1α 억제제인 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물이 각각 첨가된 배아체 배양 배지에서 7일 이상 배양하였다 (도 2A).

실시예 4 : 생쥐 배아줄기세포 배양

본 실시예에서는 생쥐 배아줄기세포의 미분화 상태를 유지하기 위해, 20% 우태아혈청, 0.1 mM 비필수 아미노산(Non-essential amino acid, NEAA; Invitrogen, USA), 1 mM 피루브산나트륨 (Invitrogen), 0.1 mM 베타-머캡토에탄올 및 1X 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; Invitrogen, USA, 1000U/㎖ leukemia inhibitory factors (LIF); Chemicon, USA)이 포함된 DMEM(GIBCO-BRL, USA) 배지에서 마이토마이신-C(Sigma, USA) 처리된 MEF (mouse embryonic fibroblast) 영양세포와 함께 공배양하였다. MEF 영양세포는 생쥐 배아줄기세포 계대 배양 하루 전에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Hyclone, USA), 0.1 mM 비필수 아미노산, 1X 페니실린/스트렙토마이신 및 0.5 mM 베타-머캡토에탄올이 첨가된 DMEM (Invitorgen, USA) 배지에서 유지 배양한 후, 10 ㎍/㎖ 마이토마이신-C(Sigma, USA)에서 1시간 30분 동안 불활성하여 7.5 X 10⁴ cells/cm²의 농도로 0.1% 젤라틴(Sigma, USA)으로 코팅한 배양용기에 부착한 후 생쥐 배아줄기세포 공배양에 사 용하였다. 생쥐 배아줄기세포는 2일 간격으로 Trypsin/EDTA 용액을 이용하여 계대배양하였다.

실시예 5 : 생쥐 배아줄기세포 로부터 배아체의 형성

계대 배양시 생쥐 배아줄기세포를 800 cells/20 ㎖ (배양 배지)의 농도로 hanging drops 방법에 의해 10% 우태아혈청, 0.1 mM 비필수 아미노산(Non-essential amino acid, NEAA; Invitrogen, USA), 0.1 mM 베타-머캡토에탄올 및 1X 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; Invitrogen, USA)이 포함된 배아체 배양 배지 (EB cultrure medium)에서 부유 배양함으로써 배아체를 형성하였다.

실시예 6 : 생쥐 배아줄기세포 의 심근세포로의 분화

상기 실시예 4에서 얻어진 생쥐 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위해, 상기 실시예 5에서 얻어진 생쥐 배아줄기세포 유래 배아체를 배아체 배양배지에서 3일 동안 부유 배양한 후 1일 동안 부착 배양하였다. 이후 1 μM의 HIF-1α 억제제인 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물이 각각 첨가된 배아체 배양배지에서 7일 이상 배양하였다 (도 2B).

실시예 7 : 박동 군집 생성비율 조사

본 실시예에서는 기능성 심근세포로 분화한 세포에서 특징적으로 관찰할 수 있는 박동하는(beating) 세포가 분화 유도물질에 의해 생성되는지를 조사하였다.

7-1. 인간 배아줄기세포 유래 배아체의 박동하는 세포 생성률 조사

박동하는 세포 생성률을 관찰하기 위해 실시예 2(인간 유래, 도 2A stage II)에서 얻어진 배아체를 60 mm dish (x 5)에 각 20개씩 부착하였고 분화 유도물질을 처리한 군과 처리하지 않은 군에서 나타나는 박동을 현미경을 통해 매일 관찰하면서 박동하는 배아체 수를 카운트하였다. 본 실험은 세 번 이상 반복하여 통계 처리하였다.

검증 결과, 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 각각 처리한 그룹의 박동하는 세포 생성률(화합물 처리 후, 7일 경과)은 처리하지 않은 대조군에 비하여 약 4배 정도 증가하였다(도 5).

7-2. 생쥐 배아줄기세포 유래 배아체의 박동하는 세포 생성률 조사

박동하는 세포 생성률을 관찰하기 위해 실시예 5(생쥐 유래, 도 2B stage II)에서 얻어진 배아체를 35 mm dish (x 5)에 각 20개씩 부착하였고 분화 유도물질을 처리한 군과 처리하지 않은 군에서 나타나는 박동을 현미경을 통해 매일 관찰하면서 박동하는 배아체 수를 카운트하였다. 본 실험은 세 번 이상 반복하여 통계 처리하였다.

검증 결과, 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 각각 처리한 세포 그룹의 박동하는 세포 생성률(화합물 처리 후, 7일, 14일 경과)은 대조군에 비하여 이 약 7배 정도 증가하였다(도 7).

실시예 8 : 심근세포 분화관련 표지 인자 발현 조사

8-1. 세미 퀀터테이티브 ( semi - quantitative ) RT - PCR

상기 실시예 3(인간 유래) 또는 6(생쥐 유래)에서 얻어진 세포로 세미 쿼터테이티브 RT-PCR을 실시하여 심근세포 분화양상을 확인하였다. 우선, HIF-1α 억제제인 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 각각 1 μM을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 분화단계별로 회수한 후 트리졸 시약(Invitrogen, USA)을 이용하여 모든 RNA를 분리하였고 이를 주형으로 역전사효소(Superscript II reverse transcriptase)와 oligo(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 심근세포 특이적인 표지 유전자의 발현을 확인하기 위해 하기 표 1 및 표 2에서 제시된 프라이머들을 사용하였다.

인간 심근세포 특이적 표지 유전자 발현을 확인하기 위한 중합효소반응 프라이머

Name	PCR primer		Size ( bp )	Gene Bank Accession No .
ANP	Forward	GGAACCAGAGGGGAGAGACAGAG (서열번호 1)	406	NM_006172
	Reverse	CGCCCTCAGCTTGCTTTTTAGGAG (서열번호 2)
α-MHC	Forward	ATGACCGATGCCCAGATGGCTGA (서열번호 3)	424	NM_002471
	Reverse	TCACTCCTCTTCTTGCCCCGGTA (서열번호 4)
MLC-2a	Forward	ACAGAGTTTATTGAGGTGCCCC (서열번호 5)	381	NM_021223
	Reverse	AAGGTGAAGTGTCCCAGAGG (서열번호 6)
MLC-2v	Forward	TATTGGAACATGGCCTCTGGAT (서열번호 7)	382	BC015821
	Reverse	GGTGCTGAAGGCTGATTACGTT (서열번호 8)
cTnT	Forward	GGCAGCGGAAGAGGATGCTGAA (서열번호 9)	152	NM_001001431
	Reverse	GAGGCACCAAGTTGGGCATGAACGA(서열번호 10)
cTnl	Forward	CCTGCGGAGAGTGAGGATCT (서열번호 11)	218	NM_000363
	Reverse	TAGGCAGGAAGGCTCAGCTC (서열번호 12)
MEF-2C	Forward	ATGGATGAACGTAACAGACAGGT (서열번호 13)	99	S57212
	Reverse	CGCAATCTCACAGTCACACAG (서열번호 14)
α-actinin	Forward	GGCGTGCAGTACAACTACGTG (서열번호 15)	580	BC051770
	Reverse	AGTCAATGAGGTCAGGCCGGT (서열번호 16)
Cardiac actin	Foreard	TCTATGAGGGCTACGCTTTG (서열번호 17)	630	NM_005159
	Reverse	CCTGACTGGAAGGTAGATGG (서열번호 18)
GAPDH	Forward	GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (서열번호 19)	226	NM_002046
	Reverse	GAAGATGGTGATGGGATTTC (서열번호 20)

생쥐 심근세포 특이적 표지 유전자 발현을 확인하기 위한 중합효소반응 프라이머

Name	PCR primer		Size ( bp )	Gene Bank Accession No .
α-MHC	Forward	GCCCAGTACCTCCGAAAGTC (서열번호 21)	110	NM_101856
	Reverse	GCCTTAACATACTCCTCCTTGTC (서열번호 22)
β-MHC	Forward	ACTGTCAACACTAAGAGGGTCA (서열번호 23)	144	NM_080728
	Reverse	TTGGATGATTTGATCTTCCAGGG (서열번호 24)
GATA4	Forward	TCTCACTATGGGCACAGCAG (서열번호 25)	135	NM_008092
	Reverse	GCGARGRCRGAGRGACAGGA (서열번호 26)
Nkx2.5	Forward	CAAGTGCTCTCCTGCTTTCC (서열번호 27)	136	NM_008700
	Reverse	GGCTTTGTCCAGCTCCACT (서열번호 28)
MLC-2v	Forward	TGTGGGTCACCTGAGGCTGTGGTTCAG (서열번호 29)	189	NM_016754
	Reverse	GAAGGCTGACTATGTCCGGGAGATGC (서열번호 30)
α-actinin	Forward	TGGCACCCAGATCGAGAAC (서열번호 31)	121	NM_033268
	Reverse	GTGGAACCGCATTTTTCCCC (서열번호 32)
GAPDH	Forward	GTGTTCCTACCCCCAATGTG (서열번호 33)	215	NM_008084
	Reverse	TGTCATTGAGAGCAATGCCA (서열번호 34)

상기 방법에 의하여 인간 배아줄기세포의 유전자 발현 양상을 살펴본 결과, 도 3에서 제시한 바와 같이, 심근세포의 분화 표지인자인 MLC-2α, MLC-2v, Cardiac Actin, cTnT, cTnl, α-actinin, MEF-2C, α-MHC 및 ANP의 경우에는 HIF-1α 억제제인 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 각각 1μM을 처리한 세포에서는 발현이 증가된 양상을 세미 퀀터테이티브 RT-PCR,을 통해 관찰할 수 있었다.

생쥐 배아줄기세포의 경우에서도 심근세포의 분화 표지인자인 Nkx2.5, α-MHC, β-MHC, MLC-2v, GATA4 및 α-actinin의 유전자 발현이 HIF-1α 억제제인 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 각각 1μM을 처리한 세포군에서 증가된 양상을 세미 퀀터테이티브 RT-PCR을 통해 관찰할 수 있었다 (도 6).

8-2. 면역형광염색 ( Imunofluorescent staining )

상기 실시예 3에서 얻어진 세포의 특성을 단백질 수준에서 확인하기 위해 1 cm² 커버글라스에서 분화 증식된 세포를 배양 배지를 제거하고 인산완충식염수로 세척한 후, 고정액(citrate-acetone-formaldehyde)을 첨가하여 약 30초간 실온에 방치 한 후 45초간 증류수로 세척하였다. 이후 3% 우혈청알부민/인산완충식염수 용액에서 30분간 처리한 후 일차 항체를 첨가하여 12 시간 반응하였다. 0.1% 트리톤 x-100/인산완충식염수 용액에서 15분간 3번씩 세척한 후 Alexa488-접합 이차 항체(Molecular probes, USA)로 실온에서 30분간 반응하여 표지한다. 다시 0.1% 트리톤 x-100/인산완충식염수 용액에서 15분간 3번 세척한 후 형광현미경 (Olympus, Japan)으로 관찰하였다(도 4). 심근세포 분화 표지인자의 발현을 확인하기 위한 일차 항체는 α-MHC(1:100, Abcam, USA), 알파알파엑티닌(1:250, Sigma, USA)을 사용하였다.

인간 배아줄기세포 유래 배아체에 HIF-1α 억제제를 처리하고 심근세포 분화 표지인자인 α-MHC 및 α-actinin 단백질 발현을 면역형광염색법에 의해 검증한 결과, 도 4에서 제시한 바와 같이, HIF-1α 억제제인 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 각각 1μM을 처리한 세포에서 α-MHC 및 α-actinin을 포함한 단백질 발현이 우수하게 이루어지고 있음을 확인하였다.

본 발명에 따라 생산된 심근세포는 심장 관련 질환의 치료를 위한 세포치료 제 개발에 기여할 수 있으며, 신약 개발 과정에서 요구되는 줄기세포를 이용한 생물학적 약효 검증 시스템 특히, 심근세포 분화유도 물질 및 심장 기능 강화 물질을 개발하기 위한 약효 검증 시스템과 신약제품화에 활용될 수 있다.

또한, 인간 배아줄기세포로부터 심근세포 직계열의 분화과정을 조절하는 신호전달과정 및 심장 외과학과 약리학 연구 및 이해에 기여함으로써 다른 신규 심장관련 인자들을 규명하는데 활용되거나, 임상적인 관점에서 최종적으로 분화된 성숙세포를 확보하는데 활용되어 심장관련 질병의 원인 및 치료법 개발에 이용될 수 있다.

도 1은 HIF-1α 억제제인 화학식1 및 화학식2의 화합물을 나타낸 것이다.

도 2는 도 1의 화합물들을 인간(A) 또는 생쥐(B) 배아줄기세포에 처리하기 위한 방법에 대한 간략한 도식이다.

도 3은 도 1의 화합물들을 도 2A의 모식화된 방법으로 인간배아줄기세포에 처리하였을 때, 심근세포 특이적으로 발현하는 유전자들(MLC-2α, MLC-2v, Cardiac Actin, cTnT, cTnl, α-actinin, MEF-2C, α-MHC 및 ANP)의 발현이 유도됨을 역전사-중합효소반응(RT-PCR)을 통하여 확인한 전기영동 사진이다.

도 4는 도 1의 화합물들을 도 2A의 모식화된 방법으로 인간배아줄기세포에 처리하였을 때 심근세포 특이적으로 발현하는 단백질(α-actinin, α-MHC)의 발현 증가를 면역형광염색법을 사용하여 염색한 세포사진이며, 세포의 핵은 DAPI로 대조염색하였다.

도 5는 도 1의 화합물들을 도 2A의 모식화된 방법으로 인간배아줄기세포에 처리하였을 때 심근세포로의 분화로 인한 박동하는 인간 배아줄기세포 유래 배아체의 생성률을 표시한 것이다.

도 6은 도 1의 화합물들을 도 2B의 모식화된 방법으로 생쥐배아줄기세포에 처리하였을 때 심근세포 특이적으로 발현하는 유전자들(Nkx2.5, α-MHC, β-MHC, MLC-2v, GATA4 및 α-actinin)의 발현 증가를 역전사-중합효소반응(RT-PCR)을 통하여 확인한 전기영동 사진이다.

도 7은 도 1의 화합물들을 도 2B의 모식화된 방법으로 생쥐배아줄기세포에 처리하였을 때 심근세포로의 분화로 인한 박동하는 생쥐 배아줄기세포 유래 배아체의 생성률을 표시한 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for inducing the differentiation of embryonic stem cells into myocardial cells <130> PA070828 <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying ANP gene <400> 1 ggaaccagag gggagagaca gag 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying ANP gene <400> 2 cgccctcagc ttgcttttta ggag 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying alpha-MHC gene <400> 3 atgaccgatg cccagatggc tga 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying alpha-MHC gene <400> 4 tcactcctct tcttgccccg gta 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying MLC-2a gene <400> 5 acagagttta ttgaggtgcc cc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying MLC-2a gene <400> 6 aaggtgaagt gtcccagagg 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying MLC-2v gene <400> 7 tattggaaca tggcctctgg at 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying MLC-2v gene <400> 8 ggtgctgaag gctgattacg tt 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying cTnT gene <400> 9 ggcagcggaa gaggatgctg aa 22 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying cTnT gene <400> 10 gaggcaccaa gttgggcatg aacga 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying cTnl gene <400> 11 cctgcggaga gtgaggatct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying cTnl gene <400> 12 taggcaggaa ggctcagctc 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying MEF-2C gene <400> 13 atggatgaac gtaacagaca ggt 23 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying MEF-2C gene <400> 14 cgcaatctca cagtcacaca g 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying alpha-actinin gene <400> 15 ggcgtgcagt acaactacgt g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying alpha-actinin gene <400> 16 agtcaatgag gtcaggccgg t 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying cardiac actin gene <400> 17 tctatgaggg ctacgctttg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying cardiac actin gene <400> 18 cctgactgga aggtagatgg 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying GAPDH gene <400> 19 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying GAPDH gene <400> 20 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying alpha-MHC gene <400> 21 gcccagtacc tccgaaagtc 20 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying alpha-MHC gene <400> 22 gccttaacat actcctcctt gtc 23 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying beta-MHC gene <400> 23 actgtcaaca ctaagagggt ca 22 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying beta-MHC gene <400> 24 ttggatgatt tgatcttcca ggg 23 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying GATA4 gene <400> 25 tctcactatg ggcacagcag 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying GATA4 gene <400> 26 gcgargrcrg agrgacagga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying Nkx2.5 gene <400> 27 caagtgctct cctgctttcc 20 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying Nkx2.5 gene <400> 28 ggctttgtcc agctccact 19 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying MLC-2v gene <400> 29 tgtgggtcac ctgaggctgt ggttcag 27 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying MLC-2v gene <400> 30 gaaggctgac tatgtccggg agatgc 26 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying alpah-actinin gene <400> 31 tggcacccag atcgagaac 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying alpah-actinin gene <400> 32 gtggaaccgc atttttcccc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying GAPDH gene <400> 33 gtgttcctac ccccaatgtg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying GAPDH gene <400> 34 tgtcattgag agcaatgcca 20

Claims (13)

1. HIF-1 (Hypoxia-inducible factor-1)의 억제제를 포함하는 배양 배지에서 배양함으로써 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래 배아체를 심근세포로 분화 유도하는 방법.
2. 제1항에 있어서, HIF-1 (Hypoxia-inducible factor-1)의 억제제는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법:

   [화학식 1]

   

   [화학식 2]

   
3. 제2항에 있어서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2 화합물의 배양 배지 내 농도는 0.1 내지 20μM 인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 배아줄기세포 및 배아줄기세포 유래 배아체는 인간 또는 생쥐로부터 유래된 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 인간 배아줄기세포 유래 배아체는 계대배양시 사방 500 내지 800 ㎛의 크기로 작제된 인간 배아줄기세포를 부유 배양함으로써 확립된 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제4항에 있어서, 인간 배아줄기세포로부터 분화된 심근세포는 MLC-2α, MLC-2v, Cardiac Actin, cTnT, cTnl, α-actinin, MEF-2C, α-MHC 및 ANP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현 정도가 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제4항에 있어서, 생쥐 배아줄기세포로부터 분화된 심근세포는 Nkx2.5, α-MHC, β-MHC, MLC-2v, GATA4 및 α-actinin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현 정도가 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지는 제 1형 변형 성장인자 베타 수용체 카이네이즈(Tranforming growth factor-β Type I receptor kinase: TβRI) 억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 심근세포로 분화 유도하는 방법은 1) 미분화 배아줄기세포를 영양세포와 함께 공배양하는 단계; 2) 상기 배아줄기세포를 부유 배양하여 배아체를 확립하는 단계; 3) 상기 확립된 배아체를 부착 배양하는 단계; 및 4) HIF-1 억제제를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 포함하는 배지에서 배아체를 배양하여 심근세포로 분화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. HIF-1 (Hypoxia-inducible factor-1)의 억제제를 포함하는, 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래 배아체를 심근세포로 분화 유도하기 위한 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 HIF-1 억제제는 제2항의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물의 농도는 0.1 내지 20μM 인 조성물.
13. 제10항에 있어서, 제1형 변형 성장인자 베타 수용체 카이네이즈(Tranforming growth factor-β Type I receptor kinase: TβRI) 억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

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