KR101994035B1 - 세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법 - Google Patents

세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)를 마트리겔(Matrigel)로 코팅된 배양용 배지에 분주하여 배양하는 배양 단계; 상기 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)를 인슐린이 배제된 B27 및 wnt신호 활성제를 포함하는 중배엽 유도용 배지에서 배양하여 상기 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포를 중배엽 유도시키는 중배엽 유도 단계; 상기 중배엽 유도 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지로 교체 분주하여 배양하는 중배엽 유도 후 분화 단계; 상기 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27 및 wnt신호 전달 억제제를 포함하는 심근분화 유도용 배지에서 배양하여 상기 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 세포를 심근분화 유도시키는 심근분화 유도 단계; 상기 심근분화 유도 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지로 교체 분주하여 배양하는 심근분화 단계; 및 상기 심근분화 단계를 거쳐 분화된 심근세포를 비타민A가 배제된 B27, 인터루킨-15(Interleukin-15) 및 신경성장인자(NGF)를 포함하는 심근성숙용 배지에서 배양하여 기능성 심근세포로 성숙시키는 심근세포 성숙 단계;를 포함하는 세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법 {METHOD FOR GENERATING HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS DERIVED FUNCTIONAL CARDIOMYOCYTES BY CELL DIFFERENTIATION WITH MATURATION}
본 발명은 세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법 및 그 방법에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포에 관한 것이다.
인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)는 미분화 상태에서는 무한 증식이 가능하며, 심장 근육세포를 포함한 인간을 이루고 있는 대부분의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다.
이에 따라 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)는 심근세포로의 분화 역시 가능한데, 최근 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)에 관한 많은 연구들을 통해 심근세포로의 분화 방법은 이미 일정 부분 확립된 상태이다.
하지만 기존 인간 전분화능 줄기세포의 심근세포로의 분화 방법은 심근세포를 분화시키는 과정에서 심근세포 외의 타 종류 세포가 혼재된 형태로 분화가 이루어져 분화 효율이 50% 이하로 매우 낮은 문제가 있었으며, 이를 극복하기 위한 다양한 연구가 진행 중이다.
이와 관련하여 인간 전분화능 줄기세포의 심근세포로의 분화에 있어서 분화 속도 및 분화 성공률의 개선을 통해 분화 효율을 높이기 위해 마련된 종래기술에 대한 선행문헌에는 대한민국 공개특허공보 10-2017-0141995호의 "세포 외 미세환경 기반의 wnt 신호 조절을 이용한 줄기세포의 심근세포로의 분화방법"(이하, '종래기술'이라고 함)이 있다.
하지만 종래 기술 역시 개선된 분화 효율의 수준이 고효율을 갖추기에 부족한 수준에 그치는 문제점이 있었으며, 실제 성인의 성숙된 심근세포가 갖춘 생리활성과 비교하여 분화의 결과물이 미성숙한 수준에 그치는 문제점이 있었다.
구체적으로, 인간 전분화능 줄기세포의 심근세포로의 분화는 전세계 사망률 1위 질병에 해당하는 심장 및 심혈관 질환의 치료에 있어서 시술이나 약물을 통해 증상을 완화시키는 치료법을 넘어서 한번 손상되면 재생이 불가능한 심장 근육세포의 근본적 치료제 마련에 활용 가능하다.
또한, 인간 전분화능 줄기세포의 심근 세포로의 분화는 신약 개발 과정에서 후보물질의 안정성 및 효과 판별 실험에 이용될 수 있다.
기존의 신약 개발 과정에서 후보물질이 퇴출되는 주요 원인 중 45%가 심장 독성에 의해서 인데, 이 부분은 후보물질의 안정성 및 효과 판별 실험에 있어서 종간 차이로 인해 정확한 결과 도출을 어렵게 하는 동물 모델을 이용하거나, 공급에 한계가 분명한 초대 배양 세포를 이용함에 따른 결과이다.
이에 따라, 인간 전분화능 줄기세포의 심근 세포로의 분화를 통해 실제 성인의 심근세포와 유사한 수준의 생리활성을 갖춘 기능성 심근세포을 마련하여 임상실험 시 정확하고 효과적인 독성 및 약물 효능 평가 실험 결과 도출을 위한 실험 모델에 활용하기 위한 다양한 연구가 시도되고 있다.
하지만, 종래 기술을 비롯한 기존 인간 전분화능 줄기세포의 심근세포로의 분화 방법과 관련된 기술들은 분화 결과물인 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포의 생리활성도가 실제 성인의 심근세포가 갖춘 생리활성도와 비교하여 불충분 수준에 그침에 따라, 심장 근육세포의 근본적 치료제 및 임상실험 시 정확하고 효과적인 독성 및 약물 효능 평가 실험 결과 도출을 위한 실험 모델로의 활용이 아직 불가능한 문제가 있었다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 창작된 것으로써, 본 발명의 목적은 인간 전분화능 줄기세포의 심근세포로의 분화에 있어서, 분화 효율을 극대화하고, 심장 근육세포의 근본적 치료제 및 임상실험 시 정확하고 효과적인 독성 및 약물 효능 평가 실험 결과 도출을 위한 실험 모델로의 활용이 가능한 수준의 생리활성을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포로의 성숙이 이루어질 수 있는 기술을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법은, 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 마트리겔(Matrigel)로 코팅된 배양용 배지에 분주하여 배양하는 배양 단계; 상기 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)를 인슐린이 배제된 B27 및 wnt신호 활성제를 포함하는 중배엽 유도용 배지에서 배양하여 상기 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포를 중배엽 유도시키는 중배엽 유도 단계; 상기 중배엽 유도 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지로 교체 분주하여 배양하는 중배엽 유도 후 분화 단계; 상기 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27 및 wnt신호 전달 억제제를 포함하는 심근분화 유도용 배지에서 배양하여 상기 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 세포를 심근분화 유도시키는 심근분화 유도 단계; 상기 심근분화 유도 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지로 교체 분주하여 배양하는 심근분화 단계; 및 상기 심근분화 단계를 거쳐 분화된 심근세포를 비타민A가 배제된 B27, 인터루킨-15(Interleukin-15) 및 신경성장인자(NGF, Nerve Growth Factors)를 포함하는 심근성숙용 배지에서 배양하여 기능성 심근세포로 성숙시키는 심근세포 성숙 단계;를 포함한다.
여기서, 상기 배양용 배지에 분주되는 상기 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)는 배아줄기세포(hESCs, human Embryonic Stem Cell) 또는 유도만능줄기세포(hiPSCs, Human induced pluripotent stem cells) 중 하나일 수 있다.
또한, 상기 배양 단계는 마트리겔(Matrigel)과 DMEM/F12이 1:60의 부피비를 이루도록 혼합된 상기 배양용 배지에 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)가 분주되어 36℃ 내지 38℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 23 내지 25시간동안 배양되는 단계일 수 있다.
또한, 상기 중배엽 유도 단계는 wnt신호 활성제가 8 내지 15uM의 농도로 포함된 상기 중배엽 유도용 배지에 상기 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포가 분주되어 36℃ 내지 38℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 47 내지 49시간동안 배양되는 단계일 수 있다.
여기서, 상기 중배엽 유도용 배지는 RPMI-1640 배지로 마련되며, 상기 wnt신호 활성제는 CHIR 99021으로 마련될 수 있다.
또한, 상기 중배엽 유도 후 분화 단계는 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지에 상기 중배엽 유도 단계를 거친 세포가 분주되어 36℃ 내지 38℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 23 내지 25시간동안 배양되는 단계이며, 상기 심근분화 단계는 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지에 상기 심근분화 유도 단계를 거친 세포가 분주되어 36℃ 내지 38℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 23 내지 25시간동안 배양되는 단계일 수 있다.
또한, 상기 심근분화 유도 단계는 wnt신호 전달 억제제가 8 내지 10uM의 농도로 포함된 심근분화 유도용 배지에 상기 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 세포가 분주되어 36℃ 내지 38℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 47 내지 49시간동안 배양되는 단계일 수 있다.
여기서, 상기 심근분화 유도용 배지는 RPMI-1640 배지로 마련되며, 상기 wnt신호 전달 억제제는 XAV 939 및 KY 02111으로 마련될 수 있다.
또한, 상기 심근세포 성숙 단계는 8 내지 15uM 농도의 인터루킨-15 및 8 내지 15uM 농도의 신경성장인자가 포함된 상기 심근성숙용 배지에 상기 심근분화 단계를 거친 세포가 분주되어 14일간 배양되는 단계일 수 있다.
여기서, 상기 심근성숙용 배지는 RPMI-1640 배지로 마련되며, 상기 심근성숙용 배지 내 포함되는 인터루킨-15 및 신경성장인자는 각각 10uM 농도로 마련될 수 있다.
한편, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포는 앞 서 설명된 세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법을 통해 제조될 수 있다.
본 발명에 의하면 다음과 같은 효과가 있다.
첫째, 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 마련에 있어 분화율의 수준을 98.6% 수준까지 높일 수 있다.
둘째, 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포로의 성숙을 통해 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포를 한번 손상되면 재생이 불가능한 심장 근육세포의 근본적 치료제로 활용할 수 있다.
셋째, 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포로의 성숙을 통해 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포를 임상실험 시 정확하고 효과적인 독성 및 약물 효능 평가 실험 결과 도출을 위한 실험 모델로 활용할 수 있다
도1은 본 발명에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 세포 분화율 확인을 위한 FACS 분석 기반 cTnT 발현율 시험 결과를 도시하고 있다.
도2는 본 발명의 제조방법 내 심근세포 성숙 단계에서 이용되는 인터루킨-15의 농도별 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 생리활성 수준 확인을 위한 심근 기능 관련 이온채널 유전자의 상대적 발현량 비교 분석 결과를 도시하고 있다.
도3은 본 발명의 제조방법 내 심근세포 성숙 단계에서 이용되는 신경성장인자의 농도별 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 생리활성 수준 확인을 위한 심근 기능 관련 이온채널 유전자의 상대적 발현량 비교 분석 결과를 도시하고 있다.
도4는 본 발명의 제조방법 내 심근세포 성숙 단계에서 인터루킨-15 및 신경성장인자의 포함 유무에 따른 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 생리활성 수준 확인을 위한 심근 기능 관련 이온채널 유전자의 상대적 발현량 비교 분석 결과를 도시하고 있다.
도5는 본 발명에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 골격,α-actinin염색 및 cTnT로 염색 결과를 확인한 현미경 관찰 사진이다.
도6은 본 발명에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 심근 박동수 분석 결과를 도시하고 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명하되, 이미 주지된 기술적 부분에 대해서는 설명의 간결함을 위해 생략하거나 압축하기로 한다.
1. 세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법에 관한 설명
본 발명의 세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조가 어떠한 과정으로 이루어지는지에 대해 상세하게 설명한다.
먼저, 본 발명의 제조방법을 진행하는 실험자는 아래 제조방법의 진행 전에 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)의 계대배양을 기 수행함이 바람직하다.
구체적으로, 마트리겔(Matrigel)과 DMEM/F12을 1:60의 부피비를 이루도록 혼합한 뒤, 세포 배양 플레이트에 첨가하고 상온의 조건 하에서 최소 한 시간 이상 코팅한다.
다음으로, 코팅된 세포 배양 플레이트에 인간 만능 줄기세포인 H9(wicell, WA09-FD)를 Essential 8TM (A1517001, Gibco) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 계대배양을 준비한다.
이 후, 계대배양은 세포가 플레이트에 50% 정도 자랐을 때 수행하며, 계대배양 첫날에는 Y27632 (Cat# 1254, Tocris)를 10uM 농도로 첨가하여 세포 생존율을 향상시켰다. 계대배양 동안에는 배지를 매일 교체하였다.
(1) 배양 단계
본 단계에서는 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 마트리겔(Matrigel)로 코팅된 배양용 배지에 분주하여 배양하는 과정이 이루어진다.
여기서, 배양용 배지에 분주되는 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)는 배아줄기세포(hESCs, human Embryonic Stem Cell) 또는 유도만능줄기세포(hiPSCs, Human induced pluripotent stem cells) 중 하나로 마련됨이 바람직하다.
아울러, 배양 단계에서 사용되는 배양용 배지는 마트리겔(Matrigel)과 DMEM/F12이 1:60의 부피비를 이루도록 혼합된 후, 심근 분화를 위해 6 Well Plate에서 최소 한 시간 이상 상온에서 코팅되는 과정을 거쳐 마련된다.
더욱 구체적으로, 배양 단계에서 사용되는 배양용 배지는 Essential 8TM (A1517001, Gibco) 배지를 이용함이 가장 바람직하다.
그리고 배양 단계에서 사용되는 배양용 배지에는 ROCK 억제제인 Y27632 (1254, Tocris)가 10uM 농도로 첨가될 수 있다.
최종적으로 실험자는 배양용 배지를 3ml씩 6 Well Plate 각 웰에 넣어주고 미리 준비한 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)를 웰당 1.5×105 개가 되도록 분주한 뒤, 36℃ 내지 38℃의 온도조건(가장 바람직하게는 37℃) 및 5% CO2농도조건 하에서 23 내지 25시간(가장 바람직하게는 24시간)동안 배양하는 과정을 수행한다.
(2) 중배엽 유도 단계
본 단계에서는 앞 서 진행된 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)를 인슐린이 배제된 B27 및 wnt신호 활성제를 포함하는 중배엽 유도용 배지에서 배양하여 상기 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포를 중배엽 유도시키는 과정이 이루어진다.
여기서, 중배엽 유도용 배지에 포함되는 인슐린이 배제된 B27(인슐린 미첨가 B27)는 무혈청 보충제(A1895601, Gibco)를 의미한다.
아울러, 무혈청 보충제 B27을 이용함에 있어서 인슐린을 의도적으로 배제하여 인간 전분화능 줄기세포(hPSC) 유래 기능성 심근세포의 제조에 있어서 심근이 형성되기 전 과정인 심중배엽 형성을 억제하도록 한다.
또한, 인슐린이 배제된 B27(인슐린 미첨가 B27)은 심근세포 분화에 효과적임은 물론이고, 항산화 물질이 포함되어 있어 활성 산소에 의한 세포 손상 역시 효과적으로 억제할 수 있다.
이러한 인슐린이 배제된 B27(인슐린 미첨가 B27)은 중배엽 유도용 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1중량부만큼 첨가됨이 바람직하다.
구체적으로, 중배엽 유도용 배지에는 wnt신호 활성제가 8 내지 15uM의 농도로 포함되며, 가장 바람직하게는 10uM의 농도를 갖춘 CHIR 99021로 마련될 수 있다.
아울러, 본 단계에서 이용되는 중배엽 유도용 배지는 RPMI-1640(11875, Gibco)로 마련됨이 바람직하다.
최종적으로 실험자는 앞 선 배양 단계를 거친 6 Well Plate 각 웰에 중배엽 유도용 배지를 3ml씩 교체하여 넣고, 각 웰 내의 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포를 36℃ 내지 38℃의 온도조건(가장 바람직하게는 37℃) 및 5% CO2농도조건 하에서 47 내지 49시간(가장 바람직하게는 48시간)동안 배양하는 과정을 수행한다.
(3) 중배역 유도 후 분화 단계
본 단계에서는 앞 서 진행된 중배엽 유도 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지로 교체 분주하여 배양하는 과정이 이루어진다.
여기서, 인슐린이 배제된 B27(인슐린 미첨가 B27)은 RPMI-1640(11875, Gibco)로 마련되는 분화용 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1중량부만큼 첨가됨이 바람직하다.
최종적으로 실험자는 중배엽 유도 단계를 거친 6 Well Plate 각 웰에 분화용 배지를 교체하여 넣고, 각 웰 내의 중배엽 유도 단계를 거친 세포를 36℃ 내지 38℃의 온도조건(가장 바람직하게는 37℃) 및 5% CO2농도조건 하에서 23 내지 25시간(가장 바람직하게는 24시간)동안 배양하는 과정을 수행한다.
(4) 심근분화 유도 단계
본 단계에서는 앞 서 진행된 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27 및 wnt신호 전달 억제제를 포함하는 심근분화 유도용 배지에서 배양하여 상기 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 세포를 심근분화 유도시키는 과정이 이루어진다.
여기서, 중배엽 유도용 배지에 포함되는 인슐린이 배제된 B27(인슐린 미첨가 B27)는 무혈청 보충제(A1895601, Gibco)를 의미한다.
아울러, 무혈청 보충제 B27을 이용함에 있어서 인슐린을 의도적으로 배제하여 인간 전분화능 줄기세포(hPSC) 유래 기능성 심근세포의 제조에 있어서 심근이 형성되기 전 과정인 심중배엽 형성을 억제하도록 한다.
또한, 인슐린이 배제된 B27(인슐린 미첨가 B27)은 심근세포 분화에 효과적임은 물론이고, 항산화 물질이 포함되어 있어 활성 산소에 의한 세포 손상 역시 효과적으로 억제할 수 있다.
이러한 인슐린이 배제된 B27(인슐린 미첨가 B27)은 심근분화 유도용 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1중량부만큼 첨가됨이 바람직하다.
구체적으로, 중배엽 유도용 배지에는 wnt신호 전달 억제제가 8 내지 10uM의 농도로 포함되며, 가장 바람직하게는 각각 8uM의 농도를 갖춘 XAV 939 및 KY 02111로 마련될 수 있다.
아울러, 본 단계에서 이용되는 심근분화 유도용 배지는 RPMI-1640(11875, Gibco)로 마련됨이 바람직하다.
최종적으로 실험자는 앞 선 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 6 Well Plate 각 웰에 중배엽 유도용 배지를 교체하여 넣고, 각 웰 내의 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 세포를 36℃ 내지 38℃의 온도조건(가장 바람직하게는 37℃) 및 5% CO2농도조건 하에서 47 내지 49시간(가장 바람직하게는 48시간)동안 배양하는 과정을 수행한다.
(5) 심근분화 단계
본 단계에서는 앞 서 진행된 심근분화 유도 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지로 교체 분주하여 배양하는 과정이 이루어진다.
여기서, 인슐린이 배제된 B27(인슐린 미첨가 B27)은 RPMI-1640(11875, Gibco)로 마련되는 분화용 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1중량부만큼 첨가됨이 바람직하다.
최종적으로 실험자는 심근분화 유도 단계를 거친 6 Well Plate 각 웰에 분화용 배지를 교체하여 넣고, 각 웰 내의 심근분화 유도 단계를 거친 세포를 36℃ 내지 38℃의 온도조건(가장 바람직하게는 37℃) 및 5% CO2농도조건 하에서 23 내지 25시간(가장 바람직하게는 24시간)동안 배양하는 과정을 수행한다.
본 단계까지의 진행을 통해 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포의 분화가 높은 수준의 분화율로 고효율을 갖춰 이루어지며, 추후 진행되는 심근세포 성숙 단계를 통해 분화된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포는 기능성을 갖추게 된다.
(6) 심근세포 성숙 단계
본 단계에서는 심근분화 단계를 거쳐 분화된 심근세포를 비타민A가 배제된 B27, 인터루킨-15(Interleukin-15) 및 신경성장인자(NGF, Nerve Growth Factors)를 포함하는 심근성숙용 배지에서 배양하여 기능성 심근세포로 성숙시키는 과정이 이루어진다.
여기서, 심근성숙용 배지에 포함되는 비타민A가 배제된 B27(비타민A 미첨가 B27)는 무혈청 보충제(A1895601, Gibco)를 의미한다.
이러한 비타민A가 배제된 B27(비타민A 미첨가 B27)은 RPMI-1640(11875, Gibco)로 마련되는 심근성숙용 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1중량부만큼 첨가됨이 바람직하다.
구체적으로, 심근성숙용 배지에는 비타민A가 배제된 B27(비타민A 미첨가 B27)와 더불어 8 내지 15uM 농도의 인터루킨-15 및 8 내지 15uM 농도의 신경성장인자가 포함되며, 가장 바람직하게는 각각 10uM의 농도를 갖춘 인터루킨-15 및 신경성장인자가 포함된다.
최종적으로 실험자는 심근분화 단계를 거친 6 Well Plate 각 웰에 심근세포 성숙용 배지를 교체하여 넣고, 각 웰 내의 심근분화 단계를 거친 세포를 36℃ 내지 38℃의 온도조건(가장 바람직하게는 37℃) 및 5% CO2농도조건 하에서 14일동안 배양하는 과정을 수행한다.
아울러, 본 단계의 심근세포 성숙을 위해 14일간에 걸쳐 진행되는 배양 과정은 2일에 한번씩 심근세포 성숙용 배지를 새것으로 교체하면서 진행함이 바람직하다.
본 단계의 진행을 통해 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포의 성숙이 진행되고 기능성 심근세포가 제조된다.
다시 말해, 비타민A가 배제된 B27(비타민A 미첨가 B27)와 더불어 8 내지 15uM 농도(가장 바람직하게는 10uM)의 인터루킨-15 및 8 내지 15uM 농도(가장 바람직하게는 10uM)의 신경성장인자의 작용에 의해 분화 과정을 거친 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포가 기능성을 갖추게 되는데, 여기서 심근세포가 갖추는 기능성이라 함은 실제 성인의 성숙된 심근세포가 갖춘 수준의 생리활성을 의미한다.
이와 같은 일련의 과정을 통해 수득되는 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포는 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포를 한번 손상되면 재생이 불가능한 심장 근육세포의 근본적 치료제로 활용할 수 있음은 물론이고, 신약 개발 과정에서 후보물질의 안정성 및 효과 판별 실험 시 정확하고 효과적인 독성 및 약물 효능 평가 실험 결과 도출을 위한 실험 모델로 활용할 수 있다
2. 세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 분화효율, 성숙적정농도 검증 및 기능성 검증 시험 결과에 관한 설명
다음으로, 본 발명의 세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법에 의해 수득되는 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 분화효율, 성숙적정농도 및 기능성 수준을 시험을 통해 확인하였으며, 해당 시험은 당업계의 기술자들에게 자명한 수단에 의한 성질 등을 정의하기 위한 목적으로 하기와 같은 실험 방법들이 이용되었다.
(1) 심근세포 분화율 시험
우선, 마트리겔(Matrigel)과 DMEM/F12이 1:60의 부피비를 이루도록 혼합되며, 10uM 농도의 ROCK 억제제인 Y27632 (1254, Tocris)가 첨가되어 최소 한 시간 이상 상온에서 코팅된 Essential 8TM 배지(A1517001, Gibco)를 3ml씩 6 Well Plate 각 웰에 넣어주고 미리 준비한 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)를 웰당 1.5×105 개가 되도록 분주한 뒤, 37℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 24시간동안 배양하였다.
다음으로, 10uM의 농도를 갖춘 wnt신호 활성제(CHIR 99021)가 포함되고, 인슐린이 배제된 B27(A1895601, Gibco)이 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1중량부만큼 첨가된 RPMI-1640 배지(11875, Gibco)를 6 Well Plate 각 웰에 3ml씩 교체하여 각 웰 내의 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포를 37℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 48시간동안 배양함에 따라 중배엽 유도시킨다.
다음으로, 인슐린이 배제된 B27(A1895601, Gibco)이 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1중량부만큼 첨가된 RPMI-1640 배지(11875, Gibco)를 6 Well Plate 각 웰에 교체하여 각 웰 내의 중배엽 유도 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포를 6 Well Plate 각 웰에 교체하여 각 웰 내의 중배엽 유도를 거친 세포를 37℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 24시간동안 배양함에 따라 분화 진행시킨다.
다음으로, 각각 8uM의 농도를 갖춘 XAV 939(wnt신호 전달 억제제) 및 KY 02111(wnt신호 전달 억제제)이 포함되고, 인슐린이 배제된 B27(A1895601, Gibco)이 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1중량부만큼 첨가된 RPMI-1640 배지(11875, Gibco)를 6 Well Plate 각 웰에 교체하여 각 웰 내의 중배엽 유도 후 분화를 거친 세포를 37℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 48시간동안 배양함에 따라 심근분화 유도시킨다.
다음으로, 인슐린이 배제된 B27(A1895601, Gibco)이 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1중량부만큼 첨가된 RPMI-1640 배지(11875, Gibco)를 6 Well Plate 각 웰에 교체하여 각 웰 내의 심근분화 유도 단계를 거친 세포를 6 Well Plate 각 웰에 교체하여 각 웰 내의 심근분화 유도를 거친 세포를 37℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 24시간동안 배양함에 따라 신근분화 진행시킨다.
최종적으로 심근 세포 분화율의 비교 검증 시험의 진행을 위해 앞선 심근분화 단계의 진행을 마친 세포를 아래 표1과 같은 각각의 배지 환경에서 성숙단계를 진행한 뒤 샘플로 채취하였다.
표1과 같은 성숙단계 진행을 위한 각각의 배지는 조성의 차이를 가질 뿐, 37℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 14일 동안 배양을 수행하며, 각각의 배지는 배양 기간 14일 동안 2일에 한번 씩 새로운 배지로 교체해줌은 동일하다.
MA1 RPMI-1640, B27 without Vitamin A
MA2 RPMI-1640, B27 without Vitamin A,10uM IL-15
MA3 RPMI-1640, B27 without Vitamin A,10uM NGF
MA4 RPMI-1640, B27 without Vitamin A,10uM IL-15, 10uM NGF
구체적으로, MA1 내지 MA4 배지 각각에서 14일 째에 채취한 세포에서 배양액을 제거하고 칼슘 마그네슘이 없는 PBS로 세척한 후 트립신-EDTA를 처리하여 단일 세포로 분리하고, 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후 200ul의 Perm solution (Cat# 554723, BD)을 넣어서 상온에서 5분간 배양하였다.
배양 후 PBS로 세척한 후, cTnT에 대한 1차 항체(Cat# 564767, BD)를 1:100의 비율로 혼합하여 넣고 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 항체와 반응 시킨 후 PBS로 세척하고 2차 항체(Alexa 488)을 1:1000 비율로 넣고 4℃에서 1시간동안 배양하였다.
배양 후 Perm solution으로 3번 세척하고 최종적으로 Perm solution 200ul에 세포를 넣어 FACS 기기(ACEA bioscience, NovoCyteTM1000)로 분석하여 분화율 시험을 수행하였다.
FACS 기기를 통한 각 배지 별 cTnT 분화율 분석 결과는 도1에 도시된 바와 같고, 각각의 배지별 심근세포의 cTnT 발현비율은 MA1 배지를 사용했을 경우 55.43%, MA2 배지를 사용했을 경우 62.2%, MA3 배지를 사용했을 경우 70.2%, MA4 배지를 사용했을 경우 98.6%의 효율로 심근세포가 분화됨을 확인하였다.
참고로, Control은 cTnT로 염색하지 않은 세포에 해당한다.
이를 통해, 비타민A가 배제된 B27(비타민A 미첨가 B27)와 더불어 8 내지 15uM 농도(가장 바람직하게는 10uM)의 인터루킨-15 및 8 내지 15uM 농도(가장 바람직하게는 10uM)의 신경성장인자의 작용에 의해 분화 과정을 거친 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포가 성숙 단계를 거치게 되면, 98.6%의 높은 분화율을 갖추게 됨을 알 수 있다.
(2) 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포의 성숙단계 진행 시 인터루킨-15 및 신경성장인자의 적정농도 수준 분석 시험
우선, 인터루킨-15 및 신경성장인자의 최적 농도 입증을 위해 앞서 설명한 심근세포 분화율 시험에 관한 설명 중 심근분화 단계까지는 진행을 동일하게 마친 세포를 가지고 심근세포의 성숙단계를 각각 진행하였다.
첫 번째로, 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포의 성숙단계 진행을 위한 인터루킨-15의 최적 농도 입증을 위해 심근분화 단계까지는 진행을 마친 세포를 심근성숙용 배지 내 신경성장인자의 농도가 고정한 상태에서 인터루킨-15의 농도를 변화시켜 가며 심근 기능의 핵심적인 이온채널인 Nav1.5, Cav1.2, hERG, Kir2.1 유전자의 상대적인 발현량을 비교 분석하였다.
구체적으로, 비타민A가 배제된 B27(비타민A 미첨가 B27)이 심근성숙용 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1 중량부만큼 첨가되며, 10ug/ml 농도의 신경성장인자가 포함된 RPMI-1640 배지(11875, Gibco) 각각에 0ug/ml 농도의 인터루킨-15, 5ug/ml 농도의 인터루킨-15, 10ug/ml 농도의 인터루킨-15, 20ug/ml 농도의 인터루킨-15, 50ug/ml 농도의 인터루킨-15을 구분하여 포함시킨 뒤, 각각을 37℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 14일동안 배양하는 과정을 수행하였다.
그리고 나서 각각의 배지 내에서 성숙과정을 거친 세포를 채취하여 Nav1.5, Cav1.2, hERG, Kir2.1 유전자의 상대적인 발현량을 비교 분석하였으며, 분석 결과는 도2에 도시된 바와 같다.
즉, 도2에 도시된 바와 같이 인터루킨-15의 농도가 10ug/ml 농도를 갖출 때 Nav1.5, Cav1.2, hERG, Kir2.1 유전자의 상대적인 발현량이 가장 효과적으로 나타났음을 알 수 있다.
둘 째로, 인간 전분화능 줄기세포 유래 심근세포의 성숙단계 진행을 위한 신경성장인자의 최적 농도 입증을 위해 심근분화 단계까지는 진행을 마친 세포를 심근성숙용 배지 내 인터루킨-15의 농도가 고정한 상태에서 신경성장인자의 농도를 변화시켜 가며 심근 기능의 핵심적인 이온채널인 Nav1.5, Cav1.2, hERG, Kir2.1 유전자의 상대적인 발현량을 비교 분석하였다.
구체적으로, 비타민A가 배제된 B27(비타민A 미첨가 B27)이 심근성숙용 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1 중량부만큼 첨가되며, 10ug/ml 농도의 인터루킨-15가 포함된 RPMI-1640 배지(11875, Gibco) 각각에 0ug/ml 농도의 신경성장인자, 5ug/ml 농도의 신경성장인자, 10ug/ml 농도의 신경성장인자, 20ug/ml 농도의 신경성장인자, 50ug/ml 농도의 신경성장인자를 구분하여 포함시킨 뒤, 각각을 37℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 14일동안 배양하는 과정을 수행하였다.
그리고 나서 각각의 배지 내에서 성숙과정을 거친 세포를 채취하여 Nav1.5, Cav1.2, hERG, Kir2.1 유전자의 상대적인 발현량을 비교 분석하였으며, 분석 결과는 도3에 도시된 바와 같다.
즉, 도3에 도시된 바와 같이 신경성장인자의 농도가 10ug/ml 농도를 갖출 때 Nav1.5, Cav1.2, hERG, Kir2.1 유전자의 상대적인 발현량이 가장 효과적으로 나타났음을 알 수 있다.
결과적으로, 앞 서 설명한 심근세포 성숙 단계의 진행에 있어서, 심근성숙용 배지 내 포함되는 인터루킨-15 및 신경성장인자의 적정농도는 각각 10ug/ml의 농도를 갖춤이 가장 바람직하다.
이를 통해, 비타민A가 배제된 B27(비타민A 미첨가 B27)이 심근성숙용 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1 중량부만큼 첨가되며, 10ug/ml 농도의 신경성장인자 및 0ug/ml 농도의 인터루킨-15가 포함된 심근성숙용 배지를 통한 심근세포 성숙 단계의 진행을 통해 수득되는 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 생리 활성 수준은 매운 높게 제공됨을 알 수 있다.
(3) 심근 성숙 마커 유전자 및 이온 채널 발현 분석 시험
우선, 앞서 설명한 심근세포 분화율 시험에 관한 설명 중 심근분화 단계까지는 진행을 동일하게 마친 세포를 가지고 상기 표1의 MA1 내지 MA4 배지 각각에서 성숙단계를 각각 진행하였다.
여기서, 표1과 같은 성숙단계 진행을 위한 각각의 배지는 조성의 차이를 가질 뿐, 37℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 14일 동안 배양을 수행하며, 각각의 배지는 배양 기간 14일 동안 2일에 한번 씩 새로운 배지로 교체해줌은 동일하다.
그 후, MA1 내지 MA4 배지 각각에서 14일 째에 채취한 심근세포의 성숙된 심근 성숙도 및 기능성을 분석하기 위해서 성숙된 심근세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 발현을 비교하고 심근의 기능에 핵심적인 역할을 하는 이온채널의 발현을 분석하였다.
구체적으로, MA1 내지 MA4 배지 각각에서 14일 째에 채취한 심근세포를 PBS로 세척한 후 Trizol(15596026, invitrogen)을 넣어 RNA를 추출하고 cDNA를 합성한 후 Real-Time PCR (CFX96, bio-rad)기계를 이용하여 이온채널 유전자인 Nav1.5, Cav1.2, hERG, Kir2.1 및 cTnT 의 상대적 유전자 발현정도를 비교 분석하였으며, 분석 결과는 도4에 도시된 바와 같다.
즉, 도4에 도시된 바와 같이 앞 서 설명한 심근세포 성숙 단계의 진행에 있어서, 심근성숙용 배지 내에 10uM 농도의 인터루킨-15 및 10uM 농도의 신경성장인자가 포함될 때 Nav1.5, Cav1.2, hERG, Kir2.1 유전자의 상대적인 발현량이 가장 효과적으로 나타났음을 알 수 있다.
이를 통해, 비타민A가 배제된 B27(비타민A 미첨가 B27)이 심근성숙용 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1 중량부만큼 첨가되며, 10ug/ml 농도의 신경성장인자 및 0ug/ml 농도의 인터루킨-15가 포함된 심근성숙용 배지를 이용한 심근세포 성숙 단계의 진행을 통해 수득되는 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 생리 활성 수준은 매운 높게 제공됨을 알 수 있다.
(4) 성숙된 심근 세포의 형태 확인 시험
우선, 앞서 설명한 심근세포 분화율 시험에 관한 설명 중 심근분화 단계까지는 진행을 동일하게 마친 세포를 가지고 상기 표1의 MA1 내지 MA4 배지 각각에서 성숙단계를 각각 진행하였다.
여기서, 표1과 같은 성숙단계 진행을 위한 각각의 배지는 조성의 차이를 가질 뿐, 37℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 14일 동안 배양을 수행하며, 각각의 배지는 배양 기간 14일 동안 2일에 한번 씩 새로운 배지로 교체해줌은 동일하다.
그 후, MA1 내지 MA4 배지 각각에서 14일 째에 채취한 심근세포의 형태 및 세포골격 구조를 현미경으로 확인하였다.
그 결과, 도5에 나타난 바와 같이 M4 배지를 사용하여 분화 성숙된 심근이 보다 성숙된 인간의 심근 세포와 같이 더 길쭉하고 타원형의 모양을 지니고 있음을 확인 하였으며 M4 배지를 사용하여 분화 성숙된 세포를 α-actinin과 cTnT과 같이 세포골격을 구성하는 단백질 염색하였을 때 체계적으로 잘 구성되어 있음을 확인하였다.
이를 통해, 비타민A가 배제된 B27(비타민A 미첨가 B27)이 심근성숙용 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1 중량부만큼 첨가되며, 10ug/ml 농도의 신경성장인자 및 0ug/ml 농도의 인터루킨-15가 포함된 심근성숙용 배지를 이용한 심근세포 성숙 단계의 진행을 통해 수득되는 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포가 좀 더 길쭉하고 타원형의 모양을 지니며, 세포 내 골격도 잘 구성되어 있음을 알 수 있다.
(5) 심근 박동수 분석 시험
우선, 앞서 설명한 심근세포 분화율 시험에 관한 설명 중 심근분화 단계까지는 진행을 동일하게 마친 세포를 가지고 상기 표1의 MA1 내지 MA4 배지 각각에서 성숙단계를 각각 진행하였다.
여기서, 표1과 같은 성숙단계 진행을 위한 각각의 배지는 조성의 차이를 가질 뿐, 37℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 14일 동안 배양을 수행하며, 각각의 배지는 배양 기간 14일 동안 2일에 한번 씩 새로운 배지로 교체해줌은 동일하다.
그 후, MA1 및 MA4 배지 각각에서 14일 째에 채취한 심근세포의 박동수를 분석하여 실제 인간 심장과 유사한 박동수를 지니고 있는지 확인하는 실험을 수행하였다.
참고로, 인간의 정상적인 심장 박동수는 분당 60 내지 100회이다.
또한, 인간의 전분화능 줄기세포로부터 심근을 분화 시키면 자율 박동을 하게 되는데, MA1 및 MA4 배지 각각에서 14일 째에 채취한 심근세포의 분당 박동수를 분석한 결과는 도6에 도시된 바와 같이 MA1 배지를 사용했을 때는 분당 50회 정도 박동하였지만 MA4 배지를 사용했을 때 실제 인간의 심근과 더 유사한 분당 70회 정도의 박동 속도를 지니고 있음을 확인하였다.
즉, 도6에 도시된 바와 같이 앞 서 설명한 심근세포 성숙 단계의 진행에 있어서, 심근성숙용 배지 내에 10uM 농도의 인터루킨-15 및 10uM 농도의 신경성장인자가 포함될 때 수득되는 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 생리활성 수준이 실제 성인의 성숙된 심근세포가 갖춘 수준의 생리활성과 유사하게 나타났음을 알 수 있다.
이를 통해, 비타민A가 배제된 B27(비타민A 미첨가 B27)이 심근성숙용 배지 전체 50 중량부를 기준으로 1 중량부만큼 첨가되며, 10ug/ml 농도의 신경성장인자 및 0ug/ml 농도의 인터루킨-15가 포함된 심근성숙용 배지를 이용한 심근세포 성숙 단계의 진행을 통해 수득되는 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 심근 박동수와 같은 생리 활성 수준이 실제 성인의 성숙된 심근세포가 갖춘 수준의 생리활성과 유사함을 알 수 있다.
본 발명에 개시된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의해서 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 보호범위는 아래 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 마트리겔(Matrigel)로 코팅된 배양용 배지에 분주하여 배양하는 배양 단계;
    상기 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)를 인슐린이 배제된 B27 및 wnt신호 활성제를 포함하는 중배엽 유도용 배지에서 배양하여 상기 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포를 중배엽 유도시키는 중배엽 유도 단계;
    상기 중배엽 유도 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지로 교체 분주하여 배양하는 중배엽 유도 후 분화 단계;
    상기 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27 및 wnt신호 전달 억제제를 포함하는 심근분화 유도용 배지에서 배양하여 상기 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 세포를 심근분화 유도시키는 심근분화 유도 단계;
    상기 심근분화 유도 단계를 거친 세포를 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지로 교체 분주하여 배양하는 심근분화 단계; 및
    상기 심근분화 단계를 거쳐 분화된 심근세포를 비타민A가 배제된 B27, 인터루킨-15(Interleukin-15) 및 신경성장인자(NGF, Nerve Growth Factors)를 포함하는 심근성숙용 배지에서 배양하여 기능성 심근세포로 성숙시키는 심근세포 성숙 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는
    세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 배양용 배지에 분주되는 상기 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)는 배아줄기세포(hESCs, human Embryonic Stem Cell) 또는 유도만능줄기세포(hiPSCs, Human induced pluripotent stem cells) 중 하나인 것을 특징으로 하는
    세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배양 단계는 마트리겔(Matrigel)과 DMEM/F12이 1:60의 부피비를 이루도록 혼합된 상기 배양용 배지에 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)가 분주되어 36℃ 내지 38℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 23 내지 25시간동안 배양되는 단계인 것을 특징으로 하는
    세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 중배엽 유도 단계는 wnt신호 활성제가 8 내지 15uM의 농도로 포함된 상기 중배엽 유도용 배지에 상기 배양 단계를 거친 인간 전분화능 줄기세포가 분주되어 36℃ 내지 38℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 47 내지 49시간동안 배양되는 단계인 것을 특징으로 하는
    세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 중배엽 유도용 배지는 RPMI-1640 배지로 마련되며, 상기 wnt신호 활성제는 CHIR 99021으로 마련되는 것을 특징으로 하는
    세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 중배엽 유도 후 분화 단계는 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지에 상기 중배엽 유도 단계를 거친 세포가 분주되어 36℃ 내지 38℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 23 내지 25시간동안 배양되는 단계이며,
    상기 심근분화 단계는 인슐린이 배제된 B27을 포함하는 분화용 배지에 상기 심근분화 유도 단계를 거친 세포가 분주되어 36℃ 내지 38℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 23 내지 25시간동안 배양되는 단계인 것을 특징으로 하는
    세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 심근분화 유도 단계는 wnt신호 전달 억제제가 8 내지 10uM의 농도로 포함된 심근분화 유도용 배지에 상기 중배엽 유도 후 분화 단계를 거친 세포가 분주되어 36℃ 내지 38℃의 온도조건 및 5% CO2농도조건 하에서 47 내지 49시간동안 배양되는 단계인 것을 특징으로 하는
    세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 심근분화 유도용 배지는 RPMI-1640 배지로 마련되며, 상기 wnt신호 전달 억제제는 XAV 939 및 KY 02111으로 마련되는 것을 특징으로 하는
    세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 심근세포 성숙 단계는 8 내지 15uM 농도의 인터루킨-15 및 8 내지 15uM 농도의 신경성장인자가 포함된 상기 심근성숙용 배지에 상기 심근분화 단계를 거친 세포가 분주되어 14일간 배양되는 단계인 것을 특징으로 하는
    세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 심근성숙용 배지는 RPMI-1640 배지로 마련되며, 상기 심근성숙용 배지 내 포함되는 인터루킨-15 및 신경성장인자는 각각 10uM 농도로 마련되는 것을 특징으로 하는
    세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법.
  11. 삭제
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