CN112941018B - 氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用 - Google Patents
氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112941018B CN112941018B CN202110220197.XA CN202110220197A CN112941018B CN 112941018 B CN112941018 B CN 112941018B CN 202110220197 A CN202110220197 A CN 202110220197A CN 112941018 B CN112941018 B CN 112941018B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cells
- differentiation
- cells
- myocardial
- dids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title abstract description 90
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 title abstract description 35
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 95
- 239000002727 chloride channel blocking agent Substances 0.000 claims abstract description 18
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 11
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 62
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 45
- YSCNMFDFYJUPEF-OWOJBTEDSA-N 4,4'-diisothiocyano-trans-stilbene-2,2'-disulfonic acid Chemical group OS(=O)(=O)C1=CC(N=C=S)=CC=C1\C=C\C1=CC=C(N=C=S)C=C1S(O)(=O)=O YSCNMFDFYJUPEF-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims description 44
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 108010062745 Chloride Channels Proteins 0.000 claims description 17
- 102000011045 Chloride Channels Human genes 0.000 claims description 17
- AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 22,23-dihydroavermectin B1a Natural products C1CC(C)C(C(C)CC)OC21OC(CC=C(C)C(OC1OC(C)C(OC3OC(C)C(O)C(OC)C3)C(OC)C1)C(C)C=CC=C1C3(C(C(=O)O4)C=C(C)C(O)C3OC1)O)CC4C2 AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 8883yp2r6d Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)CC4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@@]21O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C1)[C@@H](C)\C=C\C=C/1[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\1)O)C[C@H]4C2 SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 0.000 claims description 15
- LKHRMULASXZCLG-UHFFFAOYSA-N DCEBIO Chemical compound ClC1=C(Cl)C=C2NC(=O)N(CC)C2=C1 LKHRMULASXZCLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229960002418 ivermectin Drugs 0.000 claims description 15
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 14
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 13
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 13
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 13
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 11
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 claims description 10
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 9
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical group CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 8
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 4
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 3
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 claims description 3
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- HVAKSLUOHARFLM-UHFFFAOYSA-N selenium;sodium Chemical compound [Se][Na] HVAKSLUOHARFLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims 1
- 101000764260 Homo sapiens Troponin T, cardiac muscle Proteins 0.000 description 16
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 16
- 102100026893 Troponin T, cardiac muscle Human genes 0.000 description 15
- 101000632197 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-2.5 Proteins 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 9
- 102100027875 Homeobox protein Nkx-2.5 Human genes 0.000 description 8
- WRKPZSMRWPJJDH-UHFFFAOYSA-N N-(6-methyl-1,3-benzothiazol-2-yl)-2-[(4-oxo-3-phenyl-6,7-dihydrothieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]acetamide Chemical compound S1C2=CC(C)=CC=C2N=C1NC(=O)CSC1=NC=2CCSC=2C(=O)N1C1=CC=CC=C1 WRKPZSMRWPJJDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- JIMHYXZZCWVCMI-ZSOIEALJSA-N 4-[(z)-[4-oxo-2-sulfanylidene-3-[3-(trifluoromethyl)phenyl]-1,3-thiazolidin-5-ylidene]methyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(C(=O)O)=CC=C1\C=C/1C(=O)N(C=2C=C(C=CC=2)C(F)(F)F)C(=S)S\1 JIMHYXZZCWVCMI-ZSOIEALJSA-N 0.000 description 5
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 5
- WGFOBBZOWHGYQH-MXHNKVEKSA-N lubiprostone Chemical compound O1[C@](C(F)(F)CCCC)(O)CC[C@@H]2[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)C[C@H]21 WGFOBBZOWHGYQH-MXHNKVEKSA-N 0.000 description 5
- 229960000345 lubiprostone Drugs 0.000 description 5
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 5
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 5
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 5
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 101150013356 TNNT2 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 108010045676 holotransferrin Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 1
- 108060006662 GSK3 Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- DLVAMZWIILNQTD-IEKAXWOWSA-H [O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.[O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.[O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.O.O.[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2] Chemical compound [O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.[O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.[O-]P([O-])(OC(C(O[C@@H]1[C@H](CO)O)=O)=C1O)=O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.OC[C@@H]([C@H](C(O)=C1OP(O)(O)=O)OC1=O)O.O.O.[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2] DLVAMZWIILNQTD-IEKAXWOWSA-H 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- PTNUCGGNFGHPPW-UHFFFAOYSA-N bis(magnesiomagnesio)magnesium Chemical compound [Mg][Mg][Mg][Mg][Mg] PTNUCGGNFGHPPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229940074358 magnesium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- AIOKQVJVNPDJKA-ZZMNMWMASA-L magnesium;(2r)-2-[(1s)-1,2-dihydroxyethyl]-4-hydroxy-5-oxo-2h-furan-3-olate Chemical compound [Mg+2].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] AIOKQVJVNPDJKA-ZZMNMWMASA-L 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N n-[2-chloro-5-(trifluoromethyl)phenyl]-2-[3-(4-ethyl-5-ethylsulfanyl-1,2,4-triazol-3-yl)piperidin-1-yl]acetamide Chemical compound CCN1C(SCC)=NN=C1C1CN(CC(=O)NC=2C(=CC=C(C=2)C(F)(F)F)Cl)CCC1 NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用，属于人多能干细胞向心肌细胞分化调控技术领域，其包括以下步骤：于含有分化第3‑5天的干细胞的分化培养基中加入氯离子通道阻断剂以诱导干细胞向心肌方向分化。该方法的特点是采用氯离子阻断剂来诱导干细胞向心肌方向分化。本申请详细阐述了该方法的具体操作步骤，并对分化的心肌细胞进行了鉴定和功能分析，为人多能干细胞来源的心肌细胞的产生提供了新思路。
Description
技术领域
本发明涉及人多能干细胞向心肌细胞分化调控技术领域，具体而言，涉及一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用。
背景技术
人类多能干细胞(hPSCs)可以分化为我们体内的所有细胞类型，是研究人类胚胎发育的重要模型系统。通过hPSC分化产生的特定细胞类型在药物筛选研究中有极大的作用，可为药物筛选提供材料。
但目前并没有有关氯离子通道阻断剂对心肌分化影响的相关报道。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法以解决上述技术问题。
本发明的目的之二在于提供一种经上述方法得到的心肌细胞。
本发明的目的之三在于提供一种原料含有上述心肌细胞的药物。
本申请可这样实现：
第一方面，本申请提供一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法，包括以下步骤：
于含有分化第3-5天的干细胞的分化培养基中加入氯离子通道阻断剂以诱导干细胞向心肌方向分化。
在可选的实施方式中，干细胞为人多能干细胞。
在可选的实施方式中，人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞中的至少一种。
在可选的实施方式中，氯离子通道阻断剂包括DIDS、DCEBIO和Ivermectin中的至少一种。
在可选的实施方式中，DIDS的添加浓度为1-5μmol/L。
在可选的实施方式中，DCEBIO的添加浓度为2-20μmol/L。
在可选的实施方式中，Ivermectin的添加浓度为1-5μmol/L。
在可选的实施方式中，氯离子通道阻断剂的处理时间为3-5天。
在可选的实施方式中，分化培养基的成分包括DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、钠硒、转铁蛋白、脂质浓缩物及青链霉素。
在可选的实施方式中，还包括在干细胞分化的第1天向含有干细胞的分化培养基中加入WNT通路激活剂以诱导干细胞向中胚层分化。
在可选的实施方式中，WNT通路激活剂为GSK3β抑制剂，优选为CHIR99021。
在可选的实施方式中，干细胞向中胚层分化后，去除WNT通路激活剂1天后，再加入氯离子通道阻断剂。
在可选的实施方式中，还包括在氯离子通道阻断剂处理结束后使用含有胰岛素的分化培养基进行培养。
在可选的实施方式中，分化培养基中胰岛素的浓度为5-20μg/mL。
第二方面，本申请提供一种心肌细胞，其经上述方法分化培养得到。
第三方面，本申请提供一种药物，其原料含有上述心肌细胞。
本申请的有益效果包括：
本申请采用成分清晰的方法诱导hPSC分化成心肌细胞，其中所采用试剂不包含动物来源成分，开创性的利用氯离子通道阻断剂诱导hPSC向心肌方向分化，发现其在干细胞分化中的新应用。此外该方法得到的心肌细胞表达成熟心肌细胞的标志物，具有人心房肌和心室肌的电生理信号，表明采用本申请提供的方法可得到具有功能的心肌细胞，可用于相关药物筛选。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1至图2为氯离子通道阻断剂对人胚胎干细胞H1向心肌方向分化的影响图；
图3至图7为氯离子通道阻断剂DIDS诱导H1细胞向心肌细胞方向分化图；
图8至图11为DIDS诱导hPSC H9细胞和iPSC NL4向心肌方向分化图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用进行具体说明。
氯离子通道在真核、原核生物细胞上广泛分布，它介导的氯离子运输通常被认为是转运阴离子的主要途径。氯离子通道在细胞的生理与病理过程中起着重要的作用，如调节细胞增殖、转移、膜电位、pH值、凋亡等，且参与了多种心血管疾病，如心肌缺血、心律失常、心肌肥厚、心力衰竭等。发明人发现，氯离子通道阻断剂还可保护心肌细胞免受各种刺激引起的凋亡。
本发明基于人多能干细胞向心肌方向分化的模型，研究了氯离子通道阻断剂在其中的作用，并开发了全新的心肌细胞分化方法。
具体的，本申请提出一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法，包括以下步骤：
于含有分化第3-5天的干细胞的分化培养基中加入氯离子通道阻断剂以诱导干细胞向心肌方向分化。
上述干细胞为人多能干细胞。在可选的实施方式中，人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞中的至少一种，也即其可以仅是人胚胎干细胞，也可以仅是人诱导多能干细胞，还可以同时以人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞进行分化培养。
在可选的实施方式中，还包括在干细胞分化的第1天向含有干细胞的分化培养基中加入WNT通路激活剂以诱导干细胞向中胚层分化。
可参照地，WNT通路激活剂为GSK3β抑制剂，例如CHIR99021。
可参照地，分化培养基的成分包括DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、钠硒、转铁蛋白、脂质浓缩物(Chemically Defined Lipid Concentrate)及青链霉素。
在可选的实施方式中，分化培养基为E5分化培养基(该培养基可理解为E8培养基去除TGFβ，FGF2和胰岛素，并加入Chemically Defined Lipid Concentrate。具体的，E5分化培养基中含有DMEM/F12，全转铁蛋白(holo-transferrin)10μg/mL，亚硒酸钠(sodiumselenite)14ng/mL，抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐(L-Ascorbic acid 2-phosphatesesquimagnesium salt hydrate)64μg/mL以及脂质浓缩物(chemically defined lipidconcentrate)，其中，脂质浓缩物以1：100的浓度进行稀释使用。此外，本申请所涉及的E8培养基可参照本领域常用的相关培养基，各成分的含量在此不做赘述。
在可选的实施方式中，干细胞向中胚层分化后，去除WNT通路激活剂1天后，再加入氯离子通道阻断剂。
在可选的实施方式中，氯离子通道阻断剂包括DIDS、DCEBIO和Ivermectin中的至少一种。
可参照地，DIDS的添加浓度(也可理解为处理浓度，下同)可以为1-5μmol/L(该单位简称μM)，如1μM、2μM、3μM、4μM或5μM等。DCEBIO的添加浓度可以为2-20μM，如2μM、2.5μM、5μM、10μM或20μM等。Ivermectin的添加浓度可以为1-5μM，如1μM、2μM、2.5μM或5μM等。
在可选的实施方式中，氯离子通道阻断剂的处理时间为3-5天，如3天、4天或5天。
在可选的实施方式中，在可选的实施方式中，于含有分化第8天的干细胞的分化培养基中加入胰岛素。在可选的实施方式中，胰岛素的浓度可以为5-20μg/mL，如5μg/mL、10μg/mL或20μg/mL等。
承上，本申请提供的氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法可以参照以下方式进行：将人类多能干细胞培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70-80％(如70％、75％或80％等)时进行传代。首先用DPBS-EDTA清洗2次，第3次室温孵育5分钟，吸取DPBS-EDTA，加入含有5μMROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3-1：6(如1：3、1：4、1：5或1：6等)密度铺到预先用基质胶包被好的12孔板(此外也可采用其它数量的多孔板)里。细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。待细胞长至60-70％(如60％、65％或70％等)时开始分化，第1天加入含5μMCHIR99021的E5分化培养基以打开Wnt/β-catenin通路诱导hPSCs向中胚层分化。1天后加入新的E5分化培养基进行分化，分化第3天到第5天加入氯离子通道阻断剂(氯离子通道阻断剂需在去除GSK3β抑制剂1天后加入)，期间每天更换含阻断剂的E5培养基。分化的第6天，换上E5培养基，并继续培养2天，期间每天换液。接着用含胰岛素(如10μg/mL)的E5培养基继续培养分化细胞直至心肌细胞出现。可参照地，大约在分化的9-10天心肌细胞开始跳动。
此外，本申请还提供一种心肌细胞，其经上述方法分化培养得到。所得的心肌细胞表达成熟心肌细胞的标志物，具有人心房肌和心室肌的电生理信号，可用于药物筛选。
对应的，本申请还提供一种药物，其原料含有上述心肌细胞。该药物主要为心脏方面的药物。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
为了研究不同氯离子通道阻断剂在心肌分化中的作用，我们选用了DIDS、DCEBIO、Ivermectin、Lubiprostone和CFTR inh-172这5种氯离子通道阻断剂，在分化的第3天到第5天进行处理，检测其对心肌分化的影响。
具体实施方案如下：人胚胎干细胞H1培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70％时进行传代。首先用DPBS-EDTA清洗2次，第三次室温孵育5分钟，吸取DPBS-EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3密度铺到预先用基质胶包被好的12孔板里。细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。待细胞长至60％时开始分化，第一天加入含5μM CHIR99021的E5分化培养基。1天后加入E5分化培养基，第3天到第5天加入DIDS、DCEBIO、Ivermectin、Lubiprostone和CFTR inh-172这5种氯离子通道阻断剂，浓度均为2.5μM，期间每天更换含不同阻断剂的E5培养基。分化的第6天，换上E5培养基，并继续培养2天，期间每天换液。接着用含10μg/mL胰岛素的E5培养基继续培养分化细胞，第10至13天检测分化细胞的心肌标志物水平。
请参照图1和图2，其中，图1表示氯离子通道阻断剂对心肌细胞的标志物NKX2-5和TNNT2基因表达的影响。其中，DIDS、DCEBIO、Ivermectin、Lubiprostone和CFTR inh-172分别代表待测试的5种氯离子通道阻断剂，None代表未添加氯离子通道阻断剂的阴性对照组，IWP2为阳性对照组。在心肌分化的第3天到第5天加入DIDS、DCEBIO、Ivermectin、Lubiprostone和CFTR inh-172使用浓度均为2.5μM；IWP2使用浓度为3μM。图2表示加入氯离子通道阻断剂诱导干细胞分化后12天，通过流式细胞技术分析TNNT2阳性细胞的比例。
上述结果显示：5种氯离子通道阻断剂中，DIDS、DCEBIO和Ivermectin均提高了心肌细胞标志基因NKX2-5和TNNT2的表达水平，而Lubiprostone和CFTR inh-172无明显作用。TNNT2为心肌细胞特异性标志物，DIDS，DCEBIO和Ivermectin不同程度地提高TNNT2阳性细胞的比例，说明氯离子通道阻断剂DIDS、DCEBIO和Ivermectin均能诱导干细胞分化成心肌细胞。
实施例2
DIDS促进人胚胎干细胞H1向心肌细胞方向分化
人胚胎干细胞H1培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70％时进行传代。首先用DPBS-EDTA清洗2次，第3次室温孵育5分钟，吸取DPBS-EDTA，加入含有5μMROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3密度铺到预先用基质胶包被好的12孔板里。细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。待细胞长至60％时开始分化，第1天加入含5μMCHIR99021的E5分化培养基。1天后加入E5分化培养基，第3天到第5天加入不同浓度的DIDS处理3天，期间每天更换含DIDS的E5培养基。分化的第6天，换上E5培养基，并继续培养2天，期间每天换液。接着用含10μg/mL胰岛素的E5培养基继续培养分化细胞，大约在分化的9天心肌细胞开始跳动。
其结果如图3至图7所示，其中，图3表示：在分化第3-5天期间加入不同浓度的DIDS处理3天，阳性对照组采用IWP-2 3μM处理3天，阴性对照组None则在分化的3-5天不加抑制剂诱导。分化10天后，检测心肌细胞的标志物NKX2-5和TNNT2的表达情况，显示结果显示DIDS的处理浓度为2或4μM时，心肌细胞的标志基因NKX2-5和TNNT2的表达比较高，也即2-4μM的DIDS能有效诱导hPSC产生心肌细胞。
图4表示在分化的不同时间加入4μM DIDS，检测心肌细胞的标志物NKX2-5和TNNT2的基因表达情况。具体的，在确定了DIDS的最佳处理浓度后，在分化的不同阶段加入4μM的DIDS，检测心肌细胞的标志基因NKX2-5和TNNT2的表达水平，进一步确定DIDS的处理时间为分化的第3天到第5天。
图5为采用针对NKX2-5和TNNT2的抗体标记4μM DIDS诱导分化的心肌细胞。其中，左边代表TNNT2阳性细胞，中间代表NKX2-5阳性细胞，右边代表DAPI标记的细胞核。标尺50μm。
图6为DIDS诱导H1细胞分化13天后，检测分化细胞的TNNT2阳性细胞的比例图。其中，hESC代表H1细胞；None代表在分化的3-5天不加抑制剂诱导；DIDS代表在分化的3-5天加入4μM DIDS诱导分化；IWP-2代表在分化的3-5天加入3μM IWP-2诱导分化。TNNT2为心肌细胞特异性标志物，TNNT2阳性细胞指示了分化细胞中的心肌细胞。在分化的第12-15天检测TNNT2阳性细胞，结果显示DIDS诱导分化细胞中TNNT2阳性细胞的比例可达90％以上。
进一步分析DIDS诱导分化得到的心肌细胞的电生理信号，图7为分析DIDS诱导的心肌细胞的动作电位图。该图显示该心肌细胞具有正常心室细胞(Ventricular)和心房细胞(Atrial)的动作电位，表明该心肌细胞具备正常心肌细胞的电生理功能，也即说明DIDS诱导分化的心肌细胞具有人心肌细胞的电生理功能。
实施例3
DIDS促进多种人多能干细胞向心肌细胞方向分化
人胚胎干细胞H9和人诱导性多能干细胞NL4细胞培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70％时进行传代。首先用DPBS-EDTA清洗2次，第三次室温孵育5分钟，吸取DPBS-EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3密度铺到预先用基质胶包被好的12孔板里。细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。待细胞长至50％时开始分化，第一天加入含5μM CHIR99021的E5分化培养基。1天后加入E5分化培养基，第3天到第5天加入DIDS 4μM处理3天，期间每天更换含DIDS的E5培养基。分化的第6天，换上E5培养基，并继续培养2天，期间每天换液。接着用含10μg/mL胰岛素的E5培养基继续培养分化细胞，大约在分化的9天心肌细胞开始跳动，此时检测该细胞表达较高水平的心肌细胞标志基因NKX2-5和TNNT2。在分化的第12-15天检测TNNT2阳性的心肌细胞的比例可达60％以上(如图8至图11所示)。
采用4μM DIDS或3μM IWP-2在分化第3-5天期间处理3天，阴性对照组None在此期间不加抑制剂处理。分化10-13天后，检测心肌细胞的标志物NKX2-5和TNNT2的基因表达情况，以及TNNT2阳性的心肌细胞的比例。
图8代表DIDS诱导H9细胞分化成心肌细胞，分析该心肌细胞的NKX2-5和TNNT2基因表达情况。图9代表DIDS诱导H9细胞分化后，检测分化细胞的TNNT2阳性细胞的比例。图10代表DIDS诱导NL4细胞分化成心肌细胞，分析该心肌细胞的NKX2-5和TNNT2基因表达情况。图11代表DIDS诱导NL4细胞分化后，检测分化细胞的TNNT2阳性细胞的比例。
上述结果显示DIDS能有效诱导多种hPSC产生心肌细胞。
实施例4
本实施例提供一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法，具体步骤如下：
人胚胎干细胞H1培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至75％时进行传代。首先用DPBS-EDTA清洗2次，第3次室温孵育5分钟，吸取DPBS-EDTA，加入含有5μMROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：4密度铺到预先用基质胶包被好的12孔板里。细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。待细胞长至65％时开始分化，第1天加入含5μMCHIR99021的E5分化培养基。1天后加入E5分化培养基，第3天到第5天加入DIDS，DCEBIO，Ivermectin这3种氯离子通道阻断剂，浓度均为2.5μM，期间每天更换含不同阻断剂的E5培养基。分化的第6天，换上E5培养基，并继续培养2天，期间每天换液。接着用含胰岛素的E5培养基继续培养分化细胞，直至心肌细胞出现。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：人胚胎干细胞H1培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至80％时进行传代。首先用DPBS-EDTA清洗2次，第3次室温孵育5分钟，吸取DPBS-EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：6密度铺到预先用基质胶包被好的12孔板里。细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。待细胞长至70％时开始分化，第1天加入含5μM CHIR99021的E5分化培养基。1天后加入E5分化培养基，第3天到第5天加入DIDS，DCEBIO，Ivermectin这3种氯离子通道阻断剂，浓度均为2.5μM，期间每天更换含不同阻断剂的E5培养基。分化的第六天，换上E5培养基，并继续培养2天，期间每天换液。接着用含胰岛素的E5培养基继续培养分化细胞直至心肌细胞出现。
综上所述，本申请采用成分清晰的方法诱导hPSC分化成心肌细胞，其中所采用试剂不包含动物来源成分，开创性的利用氯离子通道阻断剂诱导hPSC向心肌方向分化，发现其在干细胞分化中的新应用。此外该方法得到的心肌细胞表达成熟心肌细胞的标志物，具有人心房肌和心室肌的电生理信号，表明采用本申请提供的方法可得到具有功能的心肌细胞，可用于心脏疾病的再生修复以及药物筛选。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在所述干细胞分化的第1天向含有所述干细胞的分化培养基中加入WNT通路激活剂以诱导所述干细胞向中胚层分化；
于含有分化第3-5天的干细胞的分化培养基中加入氯离子通道阻断剂处理3天以诱导所述干细胞向心肌方向分化；其中
所述氯离子通道阻断剂为DIDS、DCEBIO或Ivermectin；
所述DIDS的添加浓度为2-4μmol/L；
所述DCEBIO的添加浓度为2-2.5μmol/L；
所述Ivermectin的添加浓度为2-2.5μmol/L；
所述干细胞为人多能干细胞，所述人多能干细胞为人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化培养基的成分包括DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、钠硒、转铁蛋白、脂质浓缩物及青链霉素。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述WNT通路激活剂为GSK3β抑制剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述干细胞向中胚层分化后，去除所述WNT通路激活剂1天后，再加入所述氯离子通道阻断剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括在氯离子通道阻断剂处理结束后使用含有胰岛素的分化培养基进行培养；所述分化培养基中胰岛素的浓度为5-20 μg/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110220197.XA CN112941018B (zh) | 2021-02-26 | 2021-02-26 | 氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110220197.XA CN112941018B (zh) | 2021-02-26 | 2021-02-26 | 氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112941018A CN112941018A (zh) | 2021-06-11 |
| CN112941018B true CN112941018B (zh) | 2023-04-28 |
Family
ID=76246633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110220197.XA Active CN112941018B (zh) | 2021-02-26 | 2021-02-26 | 氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112941018B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114591895A (zh) * | 2022-04-12 | 2022-06-07 | 澳门大学 | 一种诱导干细胞分化为心肌细胞的方法及其培养基组合 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108060125A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-05-22 | 苏州大学 | 促进多能干细胞分化为心肌细胞成熟的方法 |
| CN108359636A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-08-03 | 苏州大学 | 一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法 |
| WO2019160193A1 (ko) * | 2018-02-14 | 2019-08-22 | (주)넥셀 | 세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법 및 그 방법에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포 |
-
2021
- 2021-02-26 CN CN202110220197.XA patent/CN112941018B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108060125A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-05-22 | 苏州大学 | 促进多能干细胞分化为心肌细胞成熟的方法 |
| CN108359636A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-08-03 | 苏州大学 | 一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法 |
| WO2019160193A1 (ko) * | 2018-02-14 | 2019-08-22 | (주)넥셀 | 세포 분화 및 성숙을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포의 제조 방법 및 그 방법에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 기능성 심근세포 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 4,4′-二异硫氰基芪-2,2′-二磺酸对内质网应激诱导心肌细胞损伤的影响;沈明志等;《中华老年心脑血管病杂志》;20120630;622-625 * |
| DIDS Attenuates Staurosporine-induced Cardiomyocyte Apoptosis by PI3K/Akt Signaling Pathway: Activation of eNOS/NO and Inhibition of Bax Translocation;An-Heng Liu等;《Cell Physiol Biochem 》;20081231;177-186 * |
| Differentiation of Human ES and iPS Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview;Christine L. Mummery等;《Circ Res》;20120720;344-358 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112941018A (zh) | 2021-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102291271B1 (ko) | 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법 | |
| JP6714932B2 (ja) | 脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法 | |
| CN105283542A (zh) | 产生肾前体细胞的方法及含有肾前体细胞的药物 | |
| CN101821383A (zh) | 一种用于人成体原始间充质干细胞体外规模化培养的培养基、方法及获得的原始间充质干细胞及其应用 | |
| CN105754936B (zh) | 人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法 | |
| WO2012096461A2 (ko) | 줄기세포의 부유배양용 조성물 | |
| US20070148767A1 (en) | Method of forming multicellular spheroids from the cultured cells | |
| CN112048470A (zh) | 一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法 | |
| CN109797132A (zh) | 一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法 | |
| CN105378069A (zh) | 人广泛自我更新型成红细胞(esre) | |
| CN112941018B (zh) | 氯离子阻断剂诱导干细胞分化成心肌细胞的方法及心肌细胞与其应用 | |
| CN112813023A (zh) | 诱导干细胞往心肌细胞方向分化及心肌细胞传代与纯化的方法及药剂 | |
| WO2023011251A1 (zh) | 快速高效的临床级色素上皮细胞诱导方法、试剂盒及应用 | |
| CN110734893A (zh) | 含维生素c的促进脐带间充质干细胞增殖的培养基 | |
| JP6218152B2 (ja) | 内耳細胞誘導方法 | |
| US20240101966A1 (en) | End-to-End Platform for Human Pluripotent Stem Cell Manufacturing | |
| Hattori et al. | Limb bud chondrogenesis in cell culture, with particular reference to serum concentration in the culture medium | |
| CN111518762A (zh) | 脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法 | |
| CN105102610A (zh) | 用于细胞培养的方法 | |
| CN115975907A (zh) | 培养基及其应用以及培养心脏类器官的方法 | |
| EP3778871A1 (en) | Method for producing stem cell-derived lacrimal gland tissue | |
| Harris | Some quantitative studies on the multiplication of connective tissue cells in vitro | |
| US20150329826A1 (en) | Materials and methods for cell culture | |
| CN113322226A (zh) | 三维培养胚胎干细胞来源的外泌体及在制备治疗肝纤维化药物的应用 | |
| KR101984227B1 (ko) | 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |