CN105283542A - 产生肾前体细胞的方法及含有肾前体细胞的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种由间介中胚层细胞产生肾前体细胞的方法，所述方法包括将间介中胚层细胞在含有TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的培养基中进行培养的工序；以及通过该方法所产生的肾前体细胞；含有该细胞的药物组合物及含有该细胞的肾病治疗剂。

Description

产生肾前体细胞的方法及含有肾前体细胞的药物
技术领域
本发明涉及一种由多能干细胞诱导分化肾前体细胞的方法。本发明还涉及一种含有这样得到的肾前体细胞的肾病治疗剂。
背景技术
肾脏为通过将由生物体内的代谢活动产生的有害物质等废物从血液中过滤而除去以谋求维持身体的健康而起作用的重要的器官之一。作为肾脏的疾病，可列举肾功能不全等，作为治疗方法，可列举人工透析。但是，由于该治疗中需要的医疗费用负担大，因此，不仅从医学方面、而且从医疗经济面考虑，都依然为世界性问题。另外，作为其他治疗方法，可列举肾移植，但却是极其严重的供体器官不足状态。
另一方面，迄今为止，报导了通过向胚胎干细胞(ES细胞)或体细胞导入未分化细胞特异性的基因而得到的诱导性多能干细胞(iPS细胞)等具有多能性的细胞(专利文献1及2)。因此，作为肾功能不全的治疗方法，研究了将由这些多能干细胞诱导分化成的肾细胞进行移植的治疗方法。进而，使用来自这些多能干细胞的均一的肾细胞进行治疗药物的开发也映入视野。
哺乳动物的肾脏经过前肾、中肾、后肾的3个阶段而形成，其中，已知后肾在间介中胚层的后方区域生成。迄今为止，研究了由小鼠多能干细胞向间介中胚层的诱导分化方法用于肾形成(非专利文献1)，作为间介中胚层的特征标记物，确认有OSR1。另外，使用细菌人工染色体(BAC)载体将绿色荧光蛋白(GFP)基因通过与内源性OSR1等位基因的同源重组而导入，制备了人iPS细胞(OSR1-GFP报告基因人iPS细胞)，通过使用该细胞的研究，在使用激活素A、Wnt、BMP及各种低分子化合物的由人多能干细胞向间介中胚层的诱导分化方面取得了成功(非专利文献2、专利文献3)。
考虑针对肾组织的移植时，优选诱导来自间介中胚层并进一步向肾脏进行分化的肾前体细胞，作为对肾前体细胞赋予特征的因子之一，已知有SIX2(非专利文献4)。但是，迄今为止，由间介中胚层向肾前体细胞人工诱导的方法没有被确立。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第5,843,780号
专利文献2：国际公开第WO2007/069666号
专利文献3：国际公开第WO2012/011610号
非专利文献
非专利文献1：MaeS，etal.(2010)，BiochemBiophysResCommun.393：877-82
非专利文献2：MaeS，etal.(2013)，NatCommun.4：1367
非专利文献3：OsafuneK，etal.(2006)，Development.133：151-61
非专利文献4：KobayashiA，etal.(2008)，CellStemCell.3：169-81
发明内容
本发明的课题在于，提供一种由间介中胚层细胞诱导分化肾前体细胞的方法。更具体而言，提供一种由间介中胚层细胞诱导分化肾前体细胞的方法，所述方法包括将由多能干细胞诱导成的间介中胚层细胞进一步诱导分化为肾前体细胞的工序。
本发明人等为了解决上述的课题进行了深入研究，结果最初发现：通过在含有TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的培养基中进行培养，可由间介中胚层细胞诱导分化肾前体细胞。本发明是基于这样的见解而完成的。
即，本发明具有以下的特征：
[1]一种由间介中胚层细胞产生肾前体细胞的方法，所述方法包括：将间介中胚层细胞在含有TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的培养基中进行培养，由间介中胚层细胞诱导肾前体细胞的工序。
[2]如[1]所述的方法，其中，所述肾前体细胞为SIX2阳性细胞。
[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，所述间介中胚层细胞为OSR1阳性细胞。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述TGFβ信号激活剂为选自由TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、IDE1及IDE2构成的组中的1种以上的物质。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，所述BMP抑制剂为选自由Dorsomorphin(ドルソモルフィン)、头蛋白(Noggin)、LDN193189及DMH1构成的组中的1种以上的物质。
[6]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述TGFβ信号激活剂为TGFβ1，所述BMP抑制剂为DMH1。
[7]如[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，所述间介中胚层细胞为由多能干细胞诱导成的间介中胚层细胞。
[8]如[7]所述的方法，其中，所述间介中胚层细胞为通过包括以下的工序(i)及(ii)的方法所产生的间介中胚层细胞：
(j)将多能干细胞在含有选自由激活素(Activin)A、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
(ii)将工序(i)中得到的细胞在含有选自由BMP7、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序。
[9]如[8]所述的方法，其中，所述工序(ii)包括以下的工序(ii-1)及(ii-2)：
(ii-1)将工序(i)中得到的细胞在含有选自BMP7及GSK-3β抑制剂中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
(ii-2)将工序(ii-1)中得到的细胞在含有选自TGFβ信号激活剂及视黄酸衍生物中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序。
[10]如[9]所述的方法，其中，所述工序(ii-1)为在含有BMP7及GSK-3β抑制剂的培养基中进行培养的工序，所述工序(ii-2)为在含有TGFβ信号激活剂及视黄酸衍生物的培养基中进行培养的工序。
[11]如[8]～[10]中任一项所述的方法，所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
[12]如[8]～[11]中任一项所述的方法，其中，所述视黄酸衍生物为AM580或TTNPB。
[13]如[7]～[12]中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干(iPS)细胞。
[14]如[13]所述的方法，其中，所述iPS细胞为人iPS细胞。
[15]一种由多能干细胞产生肾前体细胞的方法，所述方法包括以下的工序(i)～(iii)：
(i)将多能干细胞在含有选自由激活素A、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；
(ii)将工序(i)中得到的细胞在含有选自由BMP7、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
(iii)将工序(ii)中得到的细胞在含有TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的培养基中进行培养的工序。
[16]如[15]所述的方法，其中，所述肾前体细胞为SIX2阳性细胞。
[17]如[15]或[16]所述的方法，其中，所述工序(ii)中得到的细胞为OSR1阳性细胞。
[18]如[15]～[17]中任一项所述的方法，其中，所述TGFβ信号激活剂为选自由TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、IDE1及IDE2构成的组中的1种以上的物质。
[19]如[15]～[18]中任一项所述的方法，其中，所述BMP抑制剂为选自由Dorsomorphin、Noggin、LDN193189及DMH1构成的组中的1种以上的物质。
[20]如[15]～[17]中任一项所述的方法，其中，所述TGFβ信号激活剂为TGFβ1，所述BMP抑制剂为DMH1。
[21]如[15]～[20]中任一项所述的方法，其中，所述工序(ii)包括以下的工序(ii-1)及(ii-2)：
(ii-1)将工序(i)中得到的细胞在含有选自BMP7及GSK-3β抑制剂中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
(ii-2)将工序(ii-1)中得到的细胞在含有选自TGFβ信号激活剂及视黄酸衍生物中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序。
[22]如[21]所述的方法，其中，所述工序(ii-1)为在含有BMP7及GSK-3β抑制剂的培养基中进行培养的工序，所述工序(ii-2)为在含有TGFβ信号激活剂及视黄酸衍生物的培养基中进行培养的工序。
[23]如[15]～[22]中任一项所述的方法，其中，所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
[24]如[15]～[23]中任一项所述的方法，其中，所述视黄酸衍生物为AM580或TTNPB。
[25]如[15]～[24]中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干(iPS)细胞。
[26]如[25]所述的方法，其中，所述iPS细胞为人iPS细胞。
[27]一种肾前体细胞，所述肾前体细胞通过[1]～[26]中任一项所述的方法来产生。
[28]一种药物组合物，所述药物组合物含有通过[1]～[26]中任一项所述的方法产生的肾前体细胞。
[29]一种肾病治疗剂，所述肾病治疗剂含有通过[1]～[26]中任一项所述的方法产生的肾前体细胞。
[30]一种治疗肾病的方法，所述方法包括：将通过[1]～[26]中任一项所述的方法产生的肾前体细胞施用于需要治疗的患者的工序。
[31]一种肾前体细胞，所述肾前体细胞通过[1]～[22]中任一项所述的方法来产生，所述肾前体细胞用于肾病的治疗。
[32]通过[1]～[26]中任一项所述的方法产生的肾前体细胞在制备用于治疗肾病的药物组合物中的用途。
利用本发明能够首次实现由间介中胚层向肾前体细胞的人工诱导。进而，利用本发明能够首次实现由多能干细胞(例如iPS细胞)向肾前体细胞的人工诱导。另外，确认了通过本发明的方法产生的肾前体细胞具有对肾病模型动物的治疗效果。通过本发明的方法产生的肾前体细胞可用于肾功能不全等肾病的治疗或再生医疗。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请2013-123072号(申请日：2013年6月11日)以及2014-92108号(申请日：2014年4月25日)的说明书和/或附图中所记载的内容。
附图说明
图1表示实施例2～4中的诱导分化后的SIX2阳性细胞的含有率。图1A表示在含有DMSO作为对照的培养基中进行培养后的结果。图1B表示利用诱导方法1(实施例2)的结果。图1C表示利用诱导方法2(实施例3)的结果。图1D表示利用诱导方法3(实施例4)的结果。图中，tdTomato表示报告基因。
图2表示实施例5中的诱导分化后的SIX2阳性细胞的含有率。图2A表示在含有DMSO作为对照的培养基中进行培养后的结果。图2B、C及D表示在诱导方法1的阶段3中分别使用头蛋白(Noggin)、LDN193189及DMH1代替Dorsomorphin(ドルソモルフィン)时的结果。图2E及F表示在诱导方法1的阶段3中分别使用IDE1及IDE2代替TGFβ1时的结果。图2G表示在诱导方法1的阶段3中，使用TGFβ2及LDN193189时的结果。图2H表示在诱导方法1的阶段3中，使用TGFβ3及LDN193189时的结果。
图3表示由人iPS细胞产生OSR1+SIX2+肾前体细胞的方法的一个实例。图3A表示使用EB(拟胚体)三维培养的向OSR1+SIX2+肾前体细胞的分化方法。图3B表示利用流式细胞仪的OSR1+SIX2+细胞的随时间推移的分化模式分析，具体而言，表示细胞群的二维分布的结果(n＝5)。图3C表示针对分化细胞群中的表示的各基因的mRNA表达的时间过程分析。图表表示第1天～第28天中的相对于β肌动蛋白表达的相对表达量(n＝3)。图3D表示实施例7中的利用流式细胞仪的OSR1+SIX2+细胞的随时间推移的分化模式分析，具体而言，表示该细胞群的时间过程分析的结果(n＝5)。图3D中，d1表示第1天中的iPS细胞，d3表示在含有CHIR99021和激活素(Activin)A的培养基(阶段1)中产生的EB(第3天)的结果。图3D中，d6～d28表示至第6天～第28天的DMSO组(记载为DMSO)及TGFβ1+TTNPB处理组(记载为Tx)的结果。在阶段2(第3天～第6天)中，在含有CHIR99021和BMP7的培养基中培养3天后，在第6天分为DMSO组和Tx组，进行在阶段3及阶段4的培养。需要说明的是，在DMSO组中，在阶段3中，取代TGFβ1及TTNPB，在含有DMSO的培养基中进行培养，(在第8天，交换为相同的培养基)，在阶段4中，取代TGFβ1及DMH1，在含有DMSO的培养基中进行培养(每3天1次交换为相同的培养基)。图3E表示由培养第28天的4A6C3-10分化成的OSR1+SIX2+肾前体细胞中的肾前体细胞标记物表达。
图4表示TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的各组合用于由人iPS细胞诱导OSR1+SIX2+细胞的效果。数据用平均值±S.E.M表示(n＝5)。
图5表示通过利用各种人iPS细胞及人ES细胞的诱导方法4的分化诱导的结果(OSR1表达量(图5A)及SIX2表达量(图5B))。表示各细胞中的OSR1及SIX2相对于4A6C3-10中的表达量的的相对表达量。
图6表示肾前体细胞的评价试验的结果。图6A表示将OSR1+SIX2+细胞在REGM培养基中培养7天后的免疫染色图像。图中，NEPHRIN表示肾小球足细胞的标记物，AQP1及MEGALIN表示肾小管近曲小管的标记物，且UROMUCOID表示亨利氏环的标记物。对该各标记物和核分别被染色为粉红色和蓝色。比例尺表示50μm。图6B表示将OSR1+SIX2+细胞的细胞团块与表达Wnt4的NIH3T3共培养7天后的显微镜图像(左图)及免疫染色图像(3个右图)。图6C表示将OSR1+SIX2+细胞的细胞团块与E11.5的小鼠胚脊髓共培养7天后的显微镜图像(左图)及免疫染色图像(3个右图)。图6D表示将OSR1+SIX2+细胞的细胞团块与E11.5的小鼠胚胎后肾细胞器官培养后的免疫染色图像。图6E表示对将OSR1+SIX2+细胞的细胞团块向NOD.CB17-Prkdcscid/J的附睾脂肪组织移植后的组织进行免疫染色的图像。图中，WT1及PODOCALYXIN(PODX)表示肾小球足细胞的标记物(分别为红色、粉红色)，LTL表示肾小管近曲小管的标记物(红色)，LAMININ表示极性上皮(極性上皮)的标记物(粉红色)，CDH1表示肾小管远曲小管的标记物(粉红色)，及CDH6表示肾小囊(腎小胞)的标记物(粉红色)，HuNu表示人核(绿色)，小鼠核被染色为蓝色，另外，比例尺表示50μm。图6F表示将来自iPS细胞的各群体(分画)(OSR1－SIX2－、OSR1+SIX2－、OSR1－SIX2+及OSR1+SIX2+)的细胞团块与E11.5的小鼠输尿管芽器官培养7天后的显微镜图像(左图)及OSR1+SIX2+细胞团块与输尿管芽的共培养的免疫染色图像(右图)。图中，DBA表示输尿管芽的标记物(红色)，比例尺表示50μm。HuNu为人核(绿色)，小鼠核被染色为蓝色。
图7表示向小鼠肾病模型的移植实验的结果。图7A及B表示将OSR1+SIX2+细胞的细胞团块向肾实质的移植后2周的小鼠急性肾损伤(AKI)模型(图7A)及小鼠慢性肾功能不全模型(图7B)的肾脏切片的免疫染色图像。LTL及AQP1表示肾小管近曲小管的标记物，分别被染色为绿色和红色。HuNu表示人核(粉红色)，比例尺表示50μm。图7C表示接受了hiPSC-RP(n＝10、iPSC-RPs、三角形)、未分化的人iPS细胞(n＝10、iPSCs、四角形)、或生理盐水(n＝10、生理盐水(Saline)、圆形)的肾脏被膜下移植的AKI模型小鼠中的BUN水平及血清Cr水平的时间过程分析[＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001vs生理盐水]。图7D表示来自移植了hiPSC-RP(iPSC-RPs)或生理盐水(生理盐水)的小鼠的肾组织的组织学的观察结果。将肾组织在缺血再灌注后(I/R)第3天用过碘酸-Schiff(PAS，上)或马森氏三色(MT，下)染料进行染色。图7E表示I/R后第3天的宿主肾脏中的具有管型的内腔的扩张的肾小管(Dilatedtubuleswithcasts)或纤维化(Fibrosis)的面积的测定结果[＊＊P＜0.01vs生理盐水，每一组n＝3]。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。
在本发明中，提供一种产生肾前体细胞的方法，所述方法包括将间介中胚层细胞在含有TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的培养基中进行培养的工序。
在本发明中，间介中胚层细胞是指在本发明中通过在含有TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的培养基中进行培养而诱导成肾前体细胞的任何细胞。作为取得间介中胚层细胞的方法，例如，由小鼠及人的多能干细胞向间介中胚层细胞的诱导分化方法为公知的(非专利文献1及2、专利文献3)。作为对间介中胚层细胞赋予特征的标记物，已知有OSR1，作为本发明的方法中所使用的间介中胚层细胞的实例，可列举OSR1阳性的间介中胚层细胞。例如，可将具有在OSR1启动子控制下所导入的报告基因(例如GFP)的多能干细胞(例如后述实施例记载的OSR1-GFP报告基因人iPS细胞)进行培养，以该报告基因的表达为指标，利用本领域中公知的方法(例如使用细胞分选仪的方法)将OSR1阳性的间介中胚层细胞进行分离。另外，也可通过分析定量的RT-PCR(NatCommun4,1367,(2013))等基因表达的方法来确认间介中胚层细胞中的OSR1的表达。在本发明中，在OSR1阳性的间介中胚层细胞中包含：表达OSR1蛋白的细胞、及表达利用在OSR1启动子控制下的基因所编码的蛋白质的细胞。在本发明中，在OSR1中包含：作为NCBI的登录号，在人的情况下为具有NM_145260.2中所记载的核苷酸序列的基因以及该基因所编码的蛋白质、在小鼠的情况下为具有NM_011859.3中所记载的核苷酸序列的基因以及该基因所编码的蛋白质、以及具有这些功能的天然存在的变体。优选本发明的方法中所使用的间介中胚层细胞为SIX2为阴性、OSR1为阳性的细胞。
在本发明中，肾前体细胞作为与肾元前体细胞同等细胞使用，为在体内能够分化为肾脏的肾小球结构或肾小管结构等器官结构的细胞，向器官结构的分化能力例如可通过OsafuneK，etal.(2006)，Development133：151-61所述的方法进行评价。作为用于维持作为肾元前体细胞的状态的特征的因子，已知有SIX2(非专利文献4)，作为用本发明的方法诱导成的肾前体细胞的实例，可列举SIX2阳性的肾前体细胞。例如，可将具有在SIX2启动子控制下所导入的报告基因(例如tdTomato)的多能干细胞(例如后述实施例记载的OSR1-GFP&SIX2-tdTomato报告基因人iPS细胞)进行培养，以该报告基因的表达为指标，利用本领域中公知的方法(例如使用细胞分选仪的方法)将SIX2阳性的肾前体细胞进行分离。另外，也可通过分析定量的RT-PCR(NatCommun4,1367,(2013))等基因表达的方法来确认肾前体细胞中的SIX2的表达。在本发明中，在SIX2阳性的肾前体细胞中包含：表达SIX2蛋白的细胞、及表达在SIX2启动子控制下的基因所编码的蛋白质的细胞。在本发明中，在SIX2中包含：作为NCBI的登录号，在人的情况下为具有NM_016932.4中所记载的核苷酸序列的基因以及该基因所编码的蛋白质、在小鼠的情况下为具有NM_011380.2中所记载的核苷酸序列的基因以及该基因所编码的蛋白质、以及具有这些功能的天然存在的变体。优选在本发明的方法中所衍生的肾前体细胞为OSR1为阳性、且SIX2为阳性的细胞。
在本发明中，间介中胚层细胞或肾前体细胞可作为含有其他的细胞类型的细胞群被提供，也可以为被纯化的细胞团。优选为含有5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、20％以上、28％以上或30％以上该细胞的细胞群。
在本发明的方法中，通过用任何方法将间介中胚层细胞基本上进行分离(或解离)，可在单细胞的状态、或者在细胞彼此粘附的细胞团块的状态下通过悬浮培养进行培养，或者使用进行了涂覆处理的培养皿进行贴壁培养。在此，作为分离的方法，可列举例如机械分离、或具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液(可列举例如含有胰蛋白酶和胶原酶的溶液Accutase(TM)及Accumax(TM)(InnovativeCellTechnologies，Inc))或使用仅具有胶原酶活性的分离溶液的分离。
本发明的方法中所使用的悬浮培养为将细胞在对培养皿非贴壁的状态下进行培养，没有特别限定，可使用：没有进行以提高细胞的贴壁性的目的人工处理(例如利用细胞外基质等的涂覆处理)、或者使用人工地抑制贴壁的处理(例如利用聚甲基丙烯酸羟乙酯(poly-HEMA)的涂覆处理)。
本发明的方法中所使用的贴壁培养为在进行了涂覆处理的培养皿中进行培养。作为涂覆剂，可列举例如：基质胶(BDBiosciences)、Synthemax(Corning)、胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸类肝素蛋白多糖、或内功素、及它们的组合，优选为基质胶、Synthemax或明胶。
本发明的间介中胚层细胞的培养工序中所使用的培养基可向用于动物细胞的培养的基础培养基中添加TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂而制备。作为基础培养基，包含：例如IMDM培养基、Medium199培养基、伊格尔氏最小必需培养基(Eagle’sMinimumEssentialMedium；EMEM)培养基、αMEM培养基、杜氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium；DMEM)培养基、Ham’sF12(F12)培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、及它们的混合培养基等。在培养基中，既可含有血清(例如胎牛血清(FBS))，或可以为无血清的。根据需要，既可含有例如白蛋白、转铁蛋白、KnockOut血清替代物(KnockOutSerumReplacement；KSR)(ES细胞培养时的血清替代物)(Invitrogen)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫醇甘油等1个以上的血清替代物，也可含有脂质、氨基酸、L-谷氨酸、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需氨基酸(NEAA)、维生素、生长因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐及它们的等同物等1种以上的物质。在1个实施方式中，基础培养基为在DMEM和F12的1：1的混合培养基(DMEM/F12)中含有GlutaMAX、KSR、非必需氨基酸、2-巯基乙醇及抗生素的培养基。
在本发明中所使用的TGFβ信号激活剂，只要激活TGFβ信号通路，就没有特别限定，作为TGFβ信号激活剂，可例示：TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3等蛋白质(可从Peprotech、R&D公司等获得)、IDE1((Z)-2-((2-(6-羧基己酰基)亚肼基)甲基)苯甲酸)及IDE2(7-(2-亚环戊基肼基)-7-氧代庚酸)(BorowiakM，etal，CellStemCell.2009，4：348-58)等化合物。IDE1及IDE2可从Stemgent公司、Tocris公司等获得。优选的TGFβ信号激活剂为TGFβ1。
在本发明中，使用TGFβ信号激活剂时的浓度可根据使用的TGFβ信号激活剂由本领域技术人员适当选择，例如使用作为TGFβ信号激活剂的TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3等蛋白质时的浓度为0.1ng/ml～100ng/ml，优选为1ng/ml～10ng/ml，进一步优选为5ng/ml～10ng/ml。另外，使用IDE1及IDE2的时的浓度为1μM～100μM，优选为25μM～75μM，进一步优选为40μM～60μM。
在本发明中所使用的BMP抑制剂，只要抑制BMP(骨形态发生蛋白(BoneMorphogeneticProtein))信号通路，就没有特别限定，作为BMP抑制剂，可例示：Chordin、Noggin、Follistatin等蛋白抑制剂、Dorsomorphin(6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑并[1,5-a]嘧啶)及其衍生物(P.B.Yuetal.(2007)，Circulation，116：II＿60；P.B.Yuetal.(2008)，Nat.Chem.Biol.，4：33-41；J.Haoetal.(2008)，PLoSONE，3(8)：e2904)、DMH1(4-[6-(4-异丙氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉，4-[6-[4-(1-甲基乙氧基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-喹啉)、以及LDN193189(4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)。Dorsomorphin及LDN193189从Sigma-Aldrich、Stemgent、Merck、AxonMedChem、Peprotech公司等市售可获得。作为优选的BMP抑制剂，可列举DMH1、Noggin、LDN193189及Dorsomorphin，更优选的BMP抑制剂为DMH1。
在本发明中，使用BMP抑制剂时的浓度可根据使用的BMP抑制剂由本领域技术人员适当选择，例如使用Chordin、Noggin、Follistatin等蛋白抑制剂作为BMP抑制剂时的浓度为0.1ng/ml～1000ng/ml，优选为1ng/ml～500ng/ml，进一步优选为10ng/ml～100ng/ml。另外，使用Dorsomorphin、DMH1及LDN193189时的浓度为0.01μM～100μM，优选为0.1μM～10μM，进一步优选为0.5μM～1μM。
在本发明的间介中胚层细胞的培养工序中，可向基础培养基中进一步添加FGF9、FGF20、BMP7、视黄酸衍生物、GSK-3β抑制剂的任一种或任何组合。
由于长时间培养对肾前体细胞的产生效率没有特别影响，因此，本发明的间介中胚层细胞的培养工序的天数没有上限，可列举例如2天以上、4天以上、6天以上、8天以上、10天以上、11天以上、12天以上、13天以上、14天以上、15天以上、16天以上、17天以上、18天以上、19天以上、20天以上。
在本发明的间介中胚层细胞的培养工序中，培养温度并不限于以下，为约30～40℃，优选为约37℃，在含CO2的空气的氛围下进行培养，CO2浓度优选为约2～5％。
在本发明的1个实施方式中，间介中胚层细胞为由多能干细胞诱导成的间介中胚层细胞。该情况下，可将诱导成的间介中胚层细胞暂时分离，将所分离的间介中胚层细胞通过本发明的培养工序诱导成肾前体细胞。或者，也可通过由多能干细胞诱导间介中胚层细胞，将间介中胚层细胞不分离而直接供于本发明的培养工序而诱导成肾前体细胞。
将间介中胚层细胞进行分离时，可使用具有利用内源性的OSR1启动子控制表达的报告基因的多能干细胞。作为在多能干细胞的OSR1启动子控制下导入报告基因的方法，可列举例如使用BAC载体等的同源重组，记载于WO2012/011610等。另外，为了将诱导成的肾前体细胞进行分离，可使用具有利用SIX2启动子控制表达的报告基因的多能干细胞，可使用与上述同样的方法而产生。作为所使用的报告基因，可列举编码β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、tdTomato、细胞表面蛋白等公知的编码报告蛋白的基因。由这些多能干细胞诱导成的间介中胚层细胞或肾前体细胞可采用本领域中公知的方法进行分离：以该报告蛋白的表达为指标使用细胞分选仪的方法、使用针对该细胞表面蛋白的抗体而使用磁珠利用磁性筛选细胞的方法(例如MACS)、使用将该抗体等进行了固定化的载体(例如细胞富集柱)的方法等。
在本发明中，多能干细胞为具有可分化为存在于生物体的许多细胞的多能性且同时也具有增殖能力的干细胞，包含可诱导成本发明中所使用的间介中胚层细胞的任何细胞。对多能干细胞没有特别限定，包含例如胚胎干(ES)细胞、经由核移植获得的克隆胚胎衍生的胚胎干(ntES)细胞、精子干细胞(“GS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)、诱导性多能干(iPS)细胞、培养成纤维细胞或骨髓干细胞衍生的多能细胞(Muse细胞)等。从在产生工序中可以不破坏胚胎、卵子等而获得的观点出发，优选的多能干细胞为iPS细胞，更优选人iPS细胞。
产生iPS细胞的方法为本领域中公知，可通过向任何体细胞导入重编程因子而产生。在此，重编程因子可例示例如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因产物，这些重编程因子可单独使用，也可组合使用。作为重编程因子的组合，可例示：WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、HuangfuD，etal.(2008)，Nat.Biotechnol.，26：795-797、ShiY，etal.(2008)，CellStemCell，2：525-528、EminliS，etal.(2008)，StemCells.26：2467-2474、HuangfuD，etal.(2008)，Nat.Biotechnol.26：1269-1275、ShiY，etal.(2008)，CellStemCell，3，568-574、ZhaoY，etal.(2008)，CellStemCell，3：475-479、MarsonA，(2008)，CellStemCell，3，132-135、FengB，etal.(2009)，Nat.CellBiol.11：197-203、R.L.Judsonetal.，(2009)，Nat.Biotechnol.，27：459-461、LyssiotisCA，etal.(2009)，ProcNatlAcadSciUSA.106：8912-8917、KimJB，etal.(2009)，Nature.461：649-643、IchidaJK，etal.(2009)，CellStemCell.5：491-503、HengJC，etal.(2010)，CellStemCell.6：167-74、HanJ，etal.(2010)，Nature.463：1096-100、MaliP，etal.(2010)，StemCells.28：713-720、MaekawaM，etal.(2011)，Nature.474：225-9中记载的组合。
在体细胞中，非限定性地包含胎儿(胎児(仔))的体细胞、新生儿(婴儿)的体细胞及成熟健康或患病的体细胞的任一种，另外，还包含原代培养细胞、传代细胞及细胞系的任一种。具体而言，体细胞可例示例如(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(成体干细胞)、(2)组织前体细胞、(3)血液细胞(外周血细胞、脐带血细胞等)、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰细胞(胰外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞及脂肪细胞等分化的细胞等。
另外，将iPS细胞用作移植用细胞的材料的情况下，从不引起排斥反应的观点出发，优选使用移植前的个体的HLA基因型相同或基本上相同的体细胞。在此，“基本上相同”是指在针对移植的细胞利用免疫抑制剂而能够抑制免疫反应的程度上HLA基因型一致，例如，为具有HLA-A、HLA-B及HLA-DR的3个基因座或加入有HLA-C的4个基因座一致的HLA型的体细胞。
在本发明中，在由多能干细胞向间介中胚层细胞的分化衍生时，可使用包括以下的工序的方法：
(i)将多能干细胞在含有选自由激活素A、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
(ii)将工序(i)中得到的细胞在含有选自由BMP7、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序。
以下，对各工序进一步进行说明。
(i)将多能干细胞在含有选自由激活素A、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序：
本工序中，可将多能干细胞用本领域中公知的任何方法进行分离，通过悬浮培养或贴壁培养进行培养。作为多能干细胞的分离的方法，可列举例如：机械分离、或使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液(可列举例如Accutase(TM)及Accumax(TM)(InnovativeCellTechnologies，Inc))或仅具有胶原酶活性的分离溶液的分离。优选为使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液进行解离、机械地细致地分散为单细胞的方法。作为本工序中使用的人多能干细胞，优选采用相对于使用的培养皿培养至成为70％～80％汇合的集落形态。
本工序(i)中所使用的培养基可向用于动物细胞的培养的基础培养基添加选自由激活素A、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质而制备。在1个实施方式中，本工序中所使用的物质为激活素A及GSK-3β抑制剂的组合、或GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物的组合。作为基础培养基，包含例如IMDM培养基、Medium199培养基、伊格尔氏最小必需培养基(EMEM)培养基、αMEM培养基、杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)培养基、Ham’sF12(F12)培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、及它们的混合培养基等。在培养基上既可含有血清(例如FBS)，或者也可以为无血清的。根据需要可含有例如白蛋白、转铁蛋白、KnockOut血清替代物(KSR)(ES细胞培养时的血清替代物)(Invitrogen)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫醇甘油等1个以上的血清替代物，也可含有脂质、氨基酸、L-谷氨酸、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需氨基酸(NEAA)、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等1种以上的物质。在本工序的1个实施方式中，基础培养基为含有GlutaMAX、血清及抗生素的DMEM/F12。
在本工序(i)中，在激活素A中包含来自人及其他动物的激活素A、以及它们的功能性变体，例如可使用R&Dsystems公司等所市售的物质。本工序中使用的激活素A的浓度为1ng/ml～1000ng/ml，优选为10ng/ml～500ng/ml，更优选为50ng/ml～200ng/ml。
在本工序(i)中，GSK-3β抑制剂只要可抑制GSK-3β的功能、例如激酶活性，就没有特别限定，可列举例如作为靛玉红衍生物的BIO(别名：GSK-3β抑制剂IX；6-溴靛玉红-3’-肟)、作为马来酰亚胺衍生物的SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、作为苯基-α-溴甲基酮化合物的GSK-3β抑制剂VII(α,4-二溴二苯甲酮)、作为细胞膜透过型的磷酸肽的L803-mts(别名：GSK-3β肽抑制剂；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2：序列号1)及具有高的选择性的CHIR99021(Nature(2008)453：519-523)。这些化合物例如可从Stemgent公司、Calbiochem公司、Biomol公司等中获得，另外，也可自己制备。作为本工序中使用的优选的GSK-3β抑制剂，可列举CHIR99021。本工序中使用的GSK-3β抑制剂的浓度可根据所使用的GSK-3β抑制剂而由本领域技术人员适当选择，例如使用CHIR99021作为GSK-3β抑制剂时，为0.01μM～100μM，优选为0.1μM～10μM，进一步优选为1μM～3μM。
在本工序(i)中，视黄酸衍生物为保持天然的视黄酸具有的功能的可人工地进行修饰的视黄酸，例如包含类维生素A化合物及维生素D3化合物。作为类维生素A化合物的实例，可列举：视黄酸、3-脱氢视黄酸、4-[[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羰基]氨基]-苯甲酸(4-[[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-Benzoicacid)(AM580)(TamuraK,etal.,CellDiffer.Dev.32：17-26(1990))、4-[(1E)-2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯-1-基]-苯甲酸(4-[(1E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propen-1-yl]-Benzoicacid)(TTNPB)(StricklandS,etal.,CancerRes.43：5268-5272(1983))、及Tanenaga,K.etal.,CancerRes.40：914-919(1980)中所记载的化合物、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇、视黄醛、3-脱氢视黄醇、3-脱氢视黄醛等。视黄酸化合物为在类维生素A化合物中具有羧基的化合物，可列举例如：视黄酸、3-脱氢视黄酸、AM580、TTNPB等。在维生素D3化合物的实例中，可列举Abe,E.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)78：4990-4994(1981)、及Schwartz,E.L.etal.,Proc.Am.Assoc.CancerRes.24：18(1983)中所记载的化合物。在本工序的1个实施方式中，视黄酸衍生物为类维生素A化合物或维生素D3化合物。在本工序的其他实施方式中，视黄酸衍生物为类维生素A化合物，另外，在其他实施方式中，视黄酸衍生物为视黄酸化合物。作为本工序中使用的优选的视黄酸衍生物，可列举AM580或TTNPB。本工序中使用的视黄酸衍生物的浓度可根据所使用的视黄酸衍生物而由本领域技术人员适当选择，例如，使用AM580或TTNPB作为视黄酸衍生物时，为0.01μM～100μM，优选为0.1μM～10μM，进一步优选为0.5μM～2μM。
本工序(i)中的培养基可进一步含有ROCK抑制剂。特别是在本工序含有使多能干细胞分散为单细胞的工序的情况下，优选在培养基中含有ROCK抑制剂。
ROCK抑制剂只要可抑制Rho-激酶(ROCK)的功能，就没有特别限定，可列举例如：Y-27632(例如参照Ishizakietal.，Mol.Pharmacol.57，976-983(2000)；Narumiyaetal.，MethodsEnzymol.325，273-284(2000))、Fasudil/HA1077(例如参照Uenataetal.，Nature389：990-994(1997))、H-1152(例如参照Sasakietal.，Pharmacol.Ther.93：225-232(2002))、Wf-536(例如参照Nakajimaetal.，CancerChemotherPharmacol.52(4)：319-324(2003))及它们的衍生物、以及ROCK对应的反义核酸、RNA干扰诱导性核酸(例如siRNA)、负显性突变体、及它们的表达载体。另外，作为ROCK抑制剂，也可使用其他公知的低分子化合物(例如参照美国专利申请公开第2005/0209261号、第2005/0192304号、第2004/0014755号、第2004/0002508号、第2004/0002507号、第2003/0125344号、第2003/0087919号、及国际公开第2003/062227号、第2003/059913号、第2003/062225号、第2002/076976号、第2004/039796号)。本发明中，可使用1种或2种以上的ROCK抑制剂。作为本工序中使用的优选的ROCK抑制剂，可列举Y-27632。本工序中使用的ROCK抑制剂的浓度可根据所使用的ROCK抑制剂而由本领域技术人员适当选择，例如，使用Y-27632作为ROCK抑制剂时，为0.1μM～100μM、优选为1μM～50μM，进一步优选为5μM～20μM。
在本工序(i)中，培养温度并不限于以下，为约30～40℃，优选为约37℃，在含CO2的空气的氛围下进行培养。CO2浓度为约2～5％，优选为约5％。本工序的培养时间为例如2天以下的培养，优选为2天。
(ii)将工序(i)中得到的细胞在含有选自由BMP7、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序：
本工序中，可在将上述工序(i)中得到的悬浮培养后的细胞群直接在进行了涂覆处理的培养皿中、用任何培养基进行贴壁培养，或者也可将在上述工序(i)中通过贴壁培养而得到的细胞通过培养基交换而继续培养。
本工序(ii)中所使用的培养基可向用于动物细胞的培养的基础培养基中添加选自由BMP7、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质而制备。在1个实施方式中，本工序中所使用的物质为BMP7及GSK-3β抑制剂的组合、或视黄酸衍生物。作为基础培养基，包含例如IMDM培养基、Medium199培养基、伊格尔氏最小必需培养基(EMEM)培养基、αMEM培养基、杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)培养基、Ham’sF12(F12)培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、及它们的混合培养基等。在培养基中，既可含有血清(例如FBS)，或者可以为无血清的。根据需要可含有例如白蛋白、转铁蛋白、KnockOut血清替代物(KSR)(ES细胞培养时的血清替代物)(Invitrogen)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫醇甘油等1个以上的血清替代物，也可含有脂质、氨基酸、L-谷氨酸、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需氨基酸(NEAA)、维生素、生长因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐及它们的同等物等1种以上的物质。在本工序的1个实施方式中，基础培养基为在DMEM和F12的1：1的混合培养基(DMEM/F12)中含有GlutaMAX、KSR、非必需氨基酸、2-巯基乙醇及抗生素的培养基。
在本工序(ii)中，例如可将工序(i)中得到的细胞在含有选自BMP7及GSK-3β抑制剂中的1种以上的物质的培养基中进行培养，其后在含有视黄酸衍生物的培养基中进一步培养。优选在本工序(ii)中将工序(i)中得到的细胞在含有选自BMP7及GSK-3β抑制剂中的1种以上的物质的培养基中进行培养，其后在含有视黄酸衍生物及TGFβ信号激活剂的培养基中进一步培养。
即，本工序(ii)可分开为以下的工序(ii-1)及(ii-2)的两个工序而进行：
(ii-1)在含有选自BMP7及GSK-3β抑制剂中的1种以上的物质的基础培养基中进行培养的工序；及
(ii-2)在含有选自TGFβ信号激活剂及视黄酸衍生物中的1种以上的物质的基础培养基中进行培养的工序。
更优选在本工序(ii)中，(ii-1)工序为在含有BMP7及GSK-3β抑制剂的培养基中进行培养的工序，且(ii-2)工序为在含有TGFβ信号激活剂及视黄酸衍生物的培养基中进行培养的工序。
在本工序(ii)中，在BMP7中包含人BMP7(NCBI的登录号：NM_001719.2)及来自其他动物的BMP7、以及这些功能性变体，例如可使用Invitrogen公司、R&D公司等所市售的物质。本工序中使用的BMP7的浓度为1ng/ml～1000ng/ml，优选为10ng/ml～500ng/ml，更优选为50ng/ml～200ng/ml。
在本工序(ii)中，GSK-3β抑制剂可使用上述工序(i)中所例示的GSK-3β抑制剂，作为优选的GSK-3β抑制剂，可列举CHIR99021。本工序中使用的GSK-3β抑制剂的浓度可根据使用的GSK-3β抑制剂而由本领域技术人员适当选择，例如，使用CHIR99021作为GSK-3β抑制剂时，为0.01μM～100μM、优选为0.1μM～10μM，进一步优选为1μM～3μM。
在本工序(ii)中，TGFβ信号激活剂只要激活TGFβ信号通路，就没有特别限定，作为TGFβ信号激活剂，可使用TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3或IDE1及IDE2，作为优选的TGFβ信号激活剂，可列举TGFβ1。在本工序(ii)中，使用TGFβ信号激活剂时的浓度可根据所使用的TGFβ信号激活剂而由本领域技术人员适当选择，例如使用TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3等蛋白质作为TGFβ信号激活剂时的浓度为0.1ng/ml～100ng/ml，优选为1ng/ml～10ng/ml，进一步优选为5ng/ml～10ng/ml。另外，使用IDE1及IDE2时的浓度为1μM～100μM，优选为25μM～75μM，进一步优选为40μM～60μM。
在本工序(ii)中，视黄酸衍生物可使用上述工序(i)中所例示的视黄酸衍生物，作为优选的视黄酸衍生物，可列举AM580或TTNPB。本工序中使用的视黄酸衍生物的浓度可根据所使用的视黄酸衍生物而由本领域技术人员适当选择，例如，使用AM580或TTNPB作为视黄酸衍生物时为0.01μM～100μM，优选为0.1μM～10μM，进一步优选为0.5μM～2μM。
在本工序(ii)、(ii-1)及(ii-2)中，培养温度并不限于以下，为约30～40℃，优选为约37℃，在含CO2的空气的氛围下进行培养。CO2浓度为约2～5％，优选为约5％。由于通过长时间进行培养而对肾前体细胞的产生效率没有特别影响，因此，培养时间没有上限，作为工序(ii)的培养时间，例如为3天以上的培养，可列举优选3天以上～12天以下、更优选3天以上9天以下。工序(ii)含有工序(ii-1)及(ii-2)时，作为工序(ii)的培养时间，如上所述，作为工序(ii-1)的培养时间，例如为1天以上的培养，可列举优选2天以上至11天以下、更优选2天以上6天以下，作为工序(ii-2)的培养时间，例如为1天以上的培养，可列举优选2天以上11天以下，更优选3天以上6天以下。此时，优选每3天交换培养基。
本发明中，分别提供通过上述的方法得到的肾前体细胞；含有该肾前体细胞的药物组合物；含有该肾前体细胞的肾病治疗剂；治疗肾病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的该肾前体细胞的工序；用于肾病的治疗的该肾前体细胞；及该肾前体细胞在制备用于治疗肾病的药物组合物中的用途。作为对需要治疗的患者施用治疗剂的方法，可列举例如将得到的肾前体细胞片材化而贴于患者的肾脏的方法、将使得到的肾前体细胞于生理盐水等中悬浮的细胞悬浮液或者进行三维培养(例如DevCell.Sep11,2012；23(3)：637-651)而得到的细胞团块直接移植于患者的肾脏的方法、将在由基质胶等构成的支架上进行三维培养而得到的肾前体细胞团块进行移植的方法等。移植部位只要为肾脏内，就没有特别限定，优选为肾被膜下。作为肾病，可例示急性肾损伤、慢性肾功能不全、不会导致慢性肾功能不全的慢性肾病。
在本发明中，就肾病治疗剂中所含的肾前体细胞的细胞数而言，只要是移植片在施用后能够植入，就没有特别限定，可根据患部的大小或身材而适当增减而制备。
实施例
通过以下的实施例进一步具体地说明本发明，但本发明的范围并不受这些实施例限制。
[实施例1]
[OSR1-GFP&SIX2-GFP敲入人iPS细胞系的建立]
人iPS细胞(201B7)受赠于京都大学(日本国、京都)的山中伸弥教授，用现有的方法进行培养(TakahashiK，etal.Cell.131：861-72)。接着，用MaeS，etal，NatCommun.4：1367，2013中所记载的方法，结合内源性的OSR1的表达而制备表达GFP的OSR1-GFP报告基因人iPS细胞系。接着，使用与Mae等(上述)相同的方法，使用插入有IRES-tdTomato的BAC克隆(RP11-819H19、Children’sHospitalOaklandResearchInstitute)，向该OSR1-GFP报告基因人iPS细胞系的SIX2的终止密码子的下游通过同源重组导入IRES-tdTomato，结合内源性的SIX2的表达而制备表达tdTomato的OSR1-GFP&SIX2-tdTomato报告基因iPS人细胞系。
[实施例2]
[SIX2阳性细胞的诱导方法1]
＜阶段1＞
在含有添加有5ng/mlbFGF(Wako)的灵长类ES/iPS细胞用培养基(reproCELL)的10cm培养皿上，将SNL细胞(McMahon，A.P.andBradley，A.(1990)Cell62；1073-1085)(用15.5μg/ml的丝裂霉素(协和发酵麒麟)处理2～3小时，在10cm培养皿中播种3×105个细胞)用作饲养细胞，将实施例1的方法中得到的OSR1-GFP&SIX2-tdTomato报告基因人iPS细胞系在37℃、2～5％CO2氛围下培养至成为汇合。向此加入CTK溶液(2.5％胰蛋白酶(Invitrogen)、1mg/ml胶原酶IV(Invitrogen)、0.1MCaCl2、10mLKnockOutSR(Invitrogen)、29.5mLH2O)而解离，除去饲养细胞之后，悬浮于含有1μMCHIR99021(Stemgent、04-0004)、100ng/ml激活素A(R&Dsystems、338-AC)、1％GlutaMAX(100X)(Invitrogen、35050-061)、2％FBS(Hyclone)及0.5％PenStrep(Invitrogen、10565)的DMEM/F12培养基，向非吸附培养板(LOWCELLBIND6WELLDISH(Nunc、145383))每1孔移入从10cm培养皿中得到的细胞悬浮液的1/3～1/6量，通过悬浮培养，在37℃、5％CO2氛围下培养2天。
＜阶段2＞
将阶段1中得到的细胞团块移至利用基质胶(BDMatrigelMatrixGrowthFactorReduced(BDBiosciences、356230))进行了涂覆的24孔或6孔培养皿(用DMEM中0.2mg/ml的基质胶涂覆，在37℃下处理30分钟或在4℃下处理一夜)或利用Synthemax(CorningSynthemaxII-SCSubstrate(Corning、3535XX1))进行了涂覆的24孔或6孔培养皿(利用用灭菌水稀释了40倍的Synthemax涂覆，在室温下处理2小时)，交换成添加了含有1μMCHIR99021、100ng/mlBMP7(重组人BMP7(R&Dsystems、3534-BP))、0.1％2-巯基乙醇(1000X)(Invitrogen、21985)、1％GlutaMAX(100X)、10％KnockOutSR(Invitrogen)、0.1mMMEMNEAA(Invitrogen、11140)及0.5％PenStrep的DMEM/F12的培养基，在37℃、5％CO2氛围下通过贴壁培养培养3天～6天。培养3天以上的情况下，在第3天交换成相同条件的培养基。
＜阶段3＞
从阶段2中得到的细胞中除去培养基，用PBS洗涤后，交换成添加了含有5ng/mlTGFβ1(Peprotech，100-21C)、0.5μMDorsomorphin(AMPK抑制剂，CompoundC(Merck、171260))、0.1％2-巯基乙醇(1000X)、1％GlutaMAX(100X)、10％KnockOutSR、0.1mMMEMNEAA及0.5％PenStrep的DMEM/F12的培养基，进一步通过悬浮培养在37℃、5％CO2氛围下培养15天～22天。此时，每3天1次交换成相同条件的培养基。使用流式细胞仪(Becton,Dickinson)评价得到的细胞的SIX2-tdTomato阳性细胞率，结果为21.5±2.0％(图1B)。
[实施例3]
[SIX2阳性细胞的诱导方法2]
＜阶段1＞
将实施例1的方法中得到的OSR1-GFP&SIX2-tdTomato报告基因人iPS细胞系通过与诱导方法1的阶段1中记载的方法相同的方法，将SNL细胞用作饲养细胞在10cm培养皿上培养至成为汇合。向其加入CTK溶液而解离，除去饲养细胞之后，悬浮于含有1μMTTNPB(Sigma、T3757)、1μMCHIR99021、1％GlutaMAX(100X)、2％FBS及0.5％PenStrep的DMEM/F12培养基，向非吸附培养板(LOWCELLBIND6WELLDISH)每1孔移入从10cm培养皿中得到的细胞悬浮液的1/3～1/6量，通过悬浮培养在37℃、5％CO2氛围下培养2天。
＜阶段2＞
将阶段1中得到的细胞团块移至利用基质胶进行了涂覆的培养皿或利用Synthemax进行了涂覆的培养皿(用诱导方法1的阶段2所述的方法制备)，交换成添加了含有1μMTTNPB、0.1％2-巯基乙醇(1000X)、1％GlutaMAX(100X)、10％KnockOutSR、0.1mMMEMNEAA及0.5％PenStrep的DMEM/F12的培养基，通过贴壁培养在37℃、5％CO2氛围下培养3天～9天。此时，每3天1次交换成相同条件的培养基。
＜阶段3＞
从阶段2中得到的细胞中除去培养基，用PBS洗涤后，交换成添加了含有5ng/mlTGFβ1、0.5μMDorsomorphin、0.1％2-巯基乙醇(1000X)、1％GlutaMAX(100X)、10％KnockOutSR、0.1mMMEMNEAA及0.5％PenStrep的DMEM/F12的培养基，进一步通过悬浮培养在37℃、5％CO2氛围下培养12天～22天。此时，每3天1次交换成相同条件的培养基。在得到的细胞中使用流式细胞仪评价SIX2-tdTomato阳性细胞率，结果为20.6±5.3％(图1C)。
[实施例4]
[SIX2阳性细胞的诱导方法3]
＜阶段1＞
将实施例1的方法中得到的OSR1-GFP&SIX2-tdTomato报告基因人iPS细胞系通过与诱导方法1的阶段1中记载的方法相同的方法，将SNL细胞用作饲养细胞，在10cm培养皿上培养至成为汇合。向其加入CTK溶液并解离，除去饲养细胞，加入Accutase(TM)(InnovativeCellTechnologies、AT-104)，使iPS细胞分散为单细胞。接着，悬浮于含有10μMY-27632(Wako、253-00513)、1μMCHIR99021、1μMTTNPB、1％GlutaMAX(100X)、2％FBS及0.5％PenStrep的DMEM/F12培养基，将上述细胞悬浮液(1×105个细胞/孔(96孔的情况))移至用0.1％明胶(来自猪皮的明胶，TypeA(Sigma、G1890))进行了涂覆的培养皿，在37℃、5％CO2氛围下通过贴壁培养培养2天。
＜阶段2＞
将阶段1中得到的细胞用PBS洗涤，交换成添加了含有1μMTTNPB、0.1％2-巯基乙醇(1000X)、1％GlutaMAX(100X)、10％KnockOutSR、0.1mMMEMNEAA及0.5％PenStrep的DMEM/F12的培养基，通过贴壁培养在37℃、5％CO2氛围下培养3天～9天。此时，每3天1次交换成相同条件的培养基。
＜阶段3＞
向阶段2中得到的细胞加入Accutase(TM)并解离，将OSR1(GFP)作为指标，利用FACS分选OSR1阳性细胞。将得到的OSR1阳性细胞在添加了含有5ng/mlTGFβ1、0.5μMDorsomorphin、0.1％2-巯基乙醇(1000X)、1％GlutaMAX(100X)、10％KnockOutSR、0.1mMMEMNEAA及0.5％PenStrep的DMEM/F12的培养基中、以1×106个细胞/孔移至非贴壁培养板(LOWCELLBIND6WELLDISH)，在37℃、5％CO2氛围下通过悬浮培养培养2天。将得到的细胞团块移至利用基质胶(BDMatrigelMatrixGrowthFactorReduced)进行了涂覆的培养皿，在含有5ng/mlTGFβ1、0.5μMDorsomorphin、0.1％2-巯基乙醇(1000X)、1％GlutaMAX(100X)、10％KnockOutSR、0.1mMMEMNEAA及0.5％PenStrep的DMEM/F12中、在37℃、5％CO2氛围下贴壁培养2天～13天。此时，每3天1次交换成相同条件的培养基。在得到的细胞中使用流式细胞仪评价SIX2-tdTomato阳性细胞率，结果为31.1±10.0％(图1D)。
[实施例5]
[利用Dorsomorphin的替代物的研究]
在SIX2阳性细胞的诱导方法1的阶段3中，将Dorsomorphin变更为100ng/mlNoggin(Peprotech)、0.5μMLDN193189(AxonMedChem、1509)或0.5μMDMH1(Tocris、4126)，同样地进行诱导分化，SIX2-tdTomato阳性细胞率结果分别为7.5％、20.4％或15.4％(分别为图2B、C及D)。
[利用TGFβ1的替代物的研究]
在SIX2阳性细胞的诱导方法1的阶段3中，将TGFβ1变更为50μMIDE1(Tocris)或50μMIDE2(Tocris)，同样地进行分化诱导，SIX2-tdTomato阳性细胞率结果分别为8.4％、39.4％(图2E及F)。
[利用组合的研究]
在SIX2阳性细胞的诱导方法1的阶段3中，将Dorsomorphin变更为0.5μMLDN193189，将TGFβ1变更为10ng/mlTGFβ2(Peprotech)或10ng/mlTGFβ3(R&D)，同样地进行诱导分化，SIX2阳性细胞率结果分别为8.6％、9.3％(图2G及H)。
[实施例6]
[OSR1-GFP&SIX2-tdTomato敲入人iPS细胞系的建立]
使用与实施例1中记载的同样的方法，由MaeS，etal，NatCommun.4：1367，2013中记载的OSR1-GFP报告基因人iPS细胞系(3D45)制备OSR1-GFP&SIX2-tdTomato报告基因iPS人细胞系(4A6C3-10)。
[实施例7]
[SIX2阳性细胞的诱导方法4]
＜阶段1＞
在添加了含有500U/ml青霉素/链霉素(Invitrogen)及5ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF、Wako)的灵长类ES培养基(ReproCELL)的10cm培养皿上将来自胎生12.5天ICR小鼠胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或SNL饲养细胞(McMahon，A.P.andBradley，A.(1990)Cell62；1073-1085)(用15.5μg/ml的丝裂霉素(协和发酵麒麟)处理2～3小时，在2×105个细胞/6cm培养皿中接种)用作饲养细胞，将实施例6的方法中得到的OSR1-GFP&SIX2-tdTomato报告基因人iPS细胞系4A6C3-10在37℃、2～5％CO2氛围下培养至成为70％～80％汇合。用PBS冲洗含有细胞的10cm培养皿，用CTK溶液(PBS中，0.25％胰蛋白酶(Invitrogen)、0.1％胶原酶IV(Invitrogen)、20％KnockOutSR(KSR、Invitrogen)及1mMCaCl2)在37℃下处理4分钟。通过用PBS冲洗除去CTK溶液之后，替换为含有0.1mMMEMNEAA(Invitrogen)、1000U/ml青霉素/链霉素、0.55mM2-巯基乙醇(Invitrogen)及20％KSR的DMEM/F12+Glutamax(Invitrogen)。接着，用细胞刮棒刮取细胞，接种于进行了0.2％明胶涂覆的6cm培养板上，除去饲养细胞。1小时后，用含有500U/ml青霉素/链霉素及2％FBS(HyClone)的DMEM/F12+Glutamax[阶段1培养基]洗涤细胞，移至包含含有100ng/ml重组人/小鼠/大鼠激活素A(R&Dsystems)及1μMCHIR99021的阶段1培养基的超低吸附培养皿(Corning3471)，在37℃、5％CO2氛围下培养2天。
＜阶段2＞
为了使细胞分化为间介中胚层，将阶段1中得到的细胞团块(拟胚体(EB))移至利用SynthemaxII(Corning)进行了涂覆的24孔板，交换成含有0.1mMMEMNEAA、500U/ml青霉素/链霉素、0.55mM2-巯基乙醇、10％KSR、100ng/mlBMP7(重组人BMP7、R&Dsystems)及1μMCHIR99021的DMEM/F12+Glutamax，在37℃、5％CO2氛围下培养3天。
＜阶段3＞
阶段2之后，将培养基交换成含有0.1mMMEMNEAA、500U/ml青霉素/链霉素、0.55mM2-巯基乙醇、10％KSR、1μMTTNPB(SigmaT3757)及5ng/mlTGFβ1(Peprotech)的DMEM/F12+Glutamax，在37℃、5％CO2氛围下培养5天。在培养开始后第2天(阶段1开始(第1天)～第8天)交换成相同条件的培养基。
＜阶段4＞
阶段3之后，将培养基交换成含有0.1mMMEMNEAA、500U/ml青霉素/链霉素、0.55mM2-巯基乙醇、10％KSR、5ng/mlTGFβ1及0.5μMDMH1(Tocris)的DMEM/F12+Glutamax，在37℃、5％CO2氛围下培养17天(从阶段1开始(第1天)到全28天的培养。图3A)。此时，每3天1次交换成相同条件的培养基。在得到的细胞中使用流式细胞仪评价OSR1阳性SIX2阳性(OSR1+SIX2+)细胞率，在培养第28天结果为32.8％(图3B)。另外确认：OSR1+SIX2+细胞率在培养第25天达到最大，其后维持至培养28天(图3D)。
[实施例8]
[利用各种TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的组合的研究]
对各种TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的组合，研究了由所述iPS细胞系4A6C3-10向OSR1+SIX2+细胞的诱导。具体而言，在以下说明的条件1)～10)之下，研究了由4A6C3-10向OSR1+SIX2+细胞的诱导。
在条件1)～10)的阶段1～2中，分别使用与实施例7的阶段1～2相同的方法。在条件1)～7)及10)的阶段3中，使用与实施例7的阶段3相同的方法。在条件8)的阶段3中，在将实施例7的阶段3中的5ng/mlTGFβ1及1μMTTNPB替换为5ng/mlTGFβ2(Peprotech)的培养基中进行培养。在条件9)的阶段3中，在将实施例7的阶段3中的5ng/mlTGFβ1及1μMTTNPB取代为5ng/mlTGFβ3(Peprotech)的培养基中进行培养。在各条件的阶段4中，用与实施例7的阶段4相同的方法，或在将实施例7的阶段4中的5ng/mlTGFβ1及0.5μMDMH1替换为以下的任一种的培养基中进行培养：条件1)仅DMSO、条件2)5ng/mlTGFβ1、条件3)0.5μMDMH1、条件4)5ng/mlTGFβ1及100ng/mlNoggin(Peprotech)、条件5)5ng/mlTGFβ1及0.5μMDorsomorphin(Merck)、条件6)5ng/mlTGFβ1及0.5μMLDN193189(AxonMedChem)、条件7)5ng/mlTGFβ1(Peprotech)及0.5μMDMH1(与实施例7相同)、条件8)5ng/mlTGFβ2(Peprotech)及0.5μMDMH1、条件9)5ng/mlTGFβ3(Peprotech)及0.5μMDMH1、条件10)50μMIDE2(Tocris)及0.5μMDMH1。
其结果(图4)，在向OSR1+SIX2+细胞的诱导中确认了：作为TGFβ信号激活剂，使用TGFβ1是有效的，作为BMP抑制剂，使用DMH1是有效的。在实施例7中的阶段4中，在含有5ng/mlTGFβ1及0.5μMDMH1的同时，还含有作为TGFβ受体1抑制剂的SB431542(Tocris)(10μM)的培养基中进行培养的情况(条件11))下，向OSR1+SIX2+细胞的分化被抑制。
[实施例9]
[利用各种人iPS细胞及人ES细胞的研究]
用与实施例7所述的方法相同的方法对15种人iPS细胞(由外周血衍生的iPS细胞585A1、585B1、604A1、604B1、648A1、648B1、692D2；由脐带血衍生的iPS细胞606A1、606B1、610B1；由成人皮肤成纤维细胞(aHDF)衍生的iPS细胞201B6、201B7、253G1、253G4；及4A6C3-10)及3种人ES细胞(khES1、khES3、H9)(ProcNatlAcadSciUSA109，12538-12543(2012)、StemCells31,458-466(2013)、)进行处理，利用定量的RT-PCR(NatCommun4，1367，(2013))分析OSR1及SIX2的基因表达。通过实施例7所述的方法，在4A6C3-10以外的多个细胞系中确认了OSR1及SIX2的表达(图5)，确认了本方法也可适用于其他iPS细胞及ES细胞。
[实施例10]
[表达标记物分析]
用RT-PCR或定量RT-PCR分析在实施例7的诱导工序中进行了处理的4A6C3-10中的各种表达标记物。将结果示于图3C及E。在阶段1后的细胞中确认了作为后侧新生中胚层(posteriornascentmesoderm)的标记物的BRACHYURY及TBX6的表达，在阶段2后的细胞中确认了作为间介中胚层的标记物的OSR1的表达(图3C)。其后，作为后肾间充质(间层)(後腎間充織(間間))标记物的WT1、PAX2、SIX2及后侧(posterior)HOX基因的表达被激活(图3C)。在培养第28天的OSR1+SIX2+细胞中，表达了作为肾前体细胞标记物的CITED1、EYA1、PAX2、WT1、SALL1、ITGA8、CDH11、GDNF、HOXA11及HOXD11，另一方面，在该细胞中没有检出作为间质标记物的FOXD1、作为中肾管标记物、输尿管芽的HOXB7(图3E)。
[肾前体细胞的评价]
用流式细胞仪分离在实施例7的诱导工序中进行了处理的培养第28天的OSR1+SIX2+细胞，在涂覆了SynthemaxII的96孔板上以3.0×104个细胞/孔接种，在添加有10μMY-27632的REGM培养基(LONZA)中、在37℃、5％CO2氛围下培养7天。将得到的细胞通过针对NEPHRIN(肾小球足细胞标记物)、AQP1及MEGALIN(肾小管近曲小管标记物)以及UROMUCOID(亨利氏环标记物)的免疫染色，确认了各标记物的阳性细胞(图6A)。
接着，在含有添加有50ng/mlBMP7(R&Dsystems)及10μMY-27632(Wako)的UBC培养上清液(参照以下)的纺锤底低吸附96孔板(LipidureCoat、NOF)上以1.0×105个细胞/孔接种相同的OSR1+SIX2+细胞，在37℃、5％CO2氛围下培养24小时。接着，将培养基替换为添加有50ng/mlBMP7、0.5μMBIO(Wako)及10μMY-27632的UBC培养上清液，培养2～3天后，回收细胞，在进行了丝裂霉素处理的表达Wnt4的NIH3T3(OsafuneK，etal.(2006)，Development133：151-61)上以3.0×104个细胞/孔(24孔板)接种，培养5～7天。将得到的细胞通过针对翅荚百脉根凝集素(LotusTetragonolobuslectin；LTL)(肾小管近曲小管标记物)、LAMININ(极性上皮细胞标记物)、CDH1(肾小管远曲小管标记物)以及PODOCALYXIN及WT1(肾小球足细胞标记物)的免疫染色，确认了各标记物的阳性细胞(图6B)。
进而，将OSR1+SIX2+细胞与E11.5的小鼠胚胎脊髓进行器官培养。详细而言，在含有添加有50ng/mlBMP7(R&Dsystems)及10μMY-27632(Wako)的UBC培养上清液(参照以下)的纺锤底低吸附96孔板(LipidureCoat、NOF)上以1.0×105个细胞/孔接种OSR1+SIX2+细胞，在37℃、5％CO2氛围下培养24小时。接着，将培养基替换为添加有50ng/mlBMP7、0.5μMBIO(Wako)及10μMY-27632的UBC培养上清液，培养2～3天后，回收细胞，与E11.5的小鼠胚胎脊髓同时在具有0.4μm孔的聚碳酸酯(polycarbonate)过滤器(Millipore)上的空气-培养液的界面、在37℃下进行培养。在培养液侧使用添加有500U/ml青霉素/链霉素及10％FBS的DMEM(Nacalaitesque)(OsafuneK，etal.(2006)，Development133：151-61)。一周后，将得到的细胞通过针对LTL、LAMININ、CDH1、PODOCALYXIN及WT1的免疫染色，确认了各标记物的阳性细胞(图6C)。
同样地，将OSR1+SIX2+细胞与E11.5的小鼠胚胎后肾进行器官培养。详细而言，将OSR1+SIX2+细胞在含有添加有50ng/mlBMP7(R&Dsystems)及10μMY-27632(Wako)的UBC培养上清液(参照以下)的纺锤底低吸附96孔板(LipidureCoat、NOF)上以1.0×105个细胞/孔接种，在37℃、5％CO2氛围下培养24小时。接着，将培养基替换为添加有50ng/mlBMP7、0.5μMBIO(Wako)及10μMY-27632的UBC培养上清液，培养2～3天后，回收细胞，使用Accumax进行分离。从ICR小鼠中提取E11.5的小鼠胚胎后肾，在DMEM中切碎，在0.05％胰蛋白酶-EDTA中放置10分钟，利用吸管吹打进行分离。分离的小鼠胚胎后肾细胞在添加有500U/ml青霉素/链霉素及10％FBS的DMEM中、在37℃下静置10分钟之后，用40μm细胞过滤器(BD)进行过滤。将得到的5.0×105个细胞的小鼠胚胎后肾细胞与5.0×105个细胞的所述用Accumax进行了分离的OSR1+SIX2+细胞进行混合，在纺锤底低吸附96孔板上、在添加有10μMY-27632、500U/ml青霉素/链霉素及10％FBS的DMEM中培养一昼夜，以形成聚集体。将得到的聚集体在具有0.4μm孔的聚碳酸酯(polycarbonate)过滤器(Millipore)上的空气-培养液的界面、在37℃下进行培养。在培养液侧使用添加有500U/ml青霉素/链霉素及10％FBS的DMEM(Nacalaitesque)(Uchino，S.etal.JAMA294，813-818(2005))。一周后，将得到的细胞通过针对CDH6(肾小囊标记物)、LTL、LAMININ、CDH1、PODOCALYXIN及WT1的免疫染色，确认了各标记物的阳性细胞(图6D)。
进而，在含有添加有50ng/mlBMP7(R&Dsystems)及10μMY-27632(Wako)的UBC培养上清液(参照以下)的纺锤底低吸附96孔板(LipidureCoat、NOF)上以1.0×105个细胞/孔接种OSR1+SIX2+细胞，在37℃、5％CO2氛围下培养24小时。接着，将培养基替换为添加有50ng/mlBMP7、0.5μMBIO(Wako)及10μMY-27632的UBC培养上清液，培养2～3天后，回收细胞，移植到免疫缺陷小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J(Charlesriver))的附睾脂肪组织，30天后回收移植部位，结果为确认了LTL及LAMININ阳性的肾小管近曲小管结构(图6E)。
进而，将在实施例7的诱导工序中进行了处理的培养第28天的各群体的细胞(OSR1－SIX2－、OSR1+SIX2－、OSR1－SIX2+、及OSR1+SIX2+)与E11.5的小鼠胚胎输尿管芽进行器官培养。详细而言，在含有添加有50ng/mlBMP7(R&Dsystems)及10μMY-27632(Wako)的UBC培养上清液(参照以下)的纺锤底低吸附96孔板(LipidureCoat、NOF)上以1.0×105个细胞/孔接种由iPS细胞衍生的细胞，在37℃、5％CO2氛围下培养24小时。接着，将培养基替换为添加有50ng/mlBMP7、0.5μMBIO(Wako)、及10μMY-27632的UBC培养上清液，培养2～3天后，回收细胞，使用Accumax进行分离。从ICR小鼠中提取E11.5的小鼠胚胎输尿管芽。将得到的5.0×105个细胞的小鼠胚胎输尿管芽与5.0×105个细胞的所述用Accumax进行了分离的OSR1－SIX2－、OSR1+SIX2－、OSR1－SIX2+及OSR1+SIX2+的各细胞组进行混合，在纺锤底低吸附96孔板上、在添加有10μMY-27632、500U/ml青霉素/链霉素及10％FBS的DMEM中培养一昼夜，以形成聚集体。将得到的聚集体在具有0.4μm孔的聚碳酸酯过滤器(Millipore)上的空气-培养液的界面、在37℃下进行培养。在培养液侧使用添加有500U/ml青霉素/链霉素及10％FBS的DMEM(Nacalaitesque)(Uchino，S.etal.JAMA294，813-818(2005))。一周后，观察得到的细胞聚集体，结果，仅在以OSR1+SIX2+细胞形成的聚集体中确认了管结构(图6F左图)。进而，对以OSR1+SIX2+细胞形成的聚集体进行针对DBA(输尿管芽标记物)的免疫染色，结果确认了来自小鼠输尿管芽的分支(图6F右图)。
由以上显示：用实施例7所述的方法诱导分化成的OSR1+SIX2+细胞为肾前体细胞。
[UBC培养上清液]
用改良了文献(AmJPhysiol273，F757-767(1997))记载的方法的方法制备了输尿管芽(UretericBud)细胞(UBC)驯化培养基。将UBC(由DrSakurai提供、ProcNatlAcadSciUSA94，6279-6284(1997))在含有10％胎牛血清(FBS)的最小必需培养基(MEM；Invitrogen)中进行培养。在成为80％汇合时，用PBS冲洗细胞，将培养基替换为含有0.1mMMEMNEAA、500U/ml青霉素/链霉素及0.55mM2-巯基乙醇、10％KSR的DMEM/F12+Glutamax。接着，将细胞培养3天而产生培养上清液。培养上清液在使用前用0.22μm过滤器进行过滤。
[实施例11]
[由人iPS衍生的肾前体细胞的治疗效果]
将用实施例7所述的方法进行了诱导分化的第25天～第28天的人iPS衍生的肾前体细胞(OSR1+SIX2+细胞；也称为RP-OS)或含有人iPS衍生的肾前体细胞的细胞组(OSR1+SIX2－细胞及OSR1+SIX2+细胞；也称为hiPSC-RP)用流式细胞仪进行分离，在含有添加有50ng/mlBMP7(R&Dsystems)及10μMY-27632(Wako)的UBC培养上清液(上述)的纺锤底低吸附96孔板(LipidureCoat、NOF)上以1.0×105个细胞/孔接种，在37℃、5％CO2氛围下培养24小时。接着，将培养基替换为添加有50ng/mlBMP7、0.5μMBIO(Wako)及10μMY-27632的UBC培养上清液，进一步培养24小时。作为对照，在含有添加有10μMY-27632的灵长类ES细胞培养基(ReproCELL)的纺锤底低吸附96孔板上以1.0×105个细胞/孔接种未分化的人iPS细胞(4A6C3-10)，在37℃、5％CO2氛围下培养48小时。用生理盐水洗涤培养后的各细胞，除去培养基。其后，如以下记载的那样，将15个hiPSC-RP的细胞团块移植在急性肾损伤(AKI)模型小鼠的肾脏被膜下。另外，作为确认OSR1+SIX2+细胞的组织分化的实验(图7A及B)，如以下所记载的那样，将5个RP-OS的细胞团块用吸量管注入于AKI模型小鼠及慢性肾功能不全模型小鼠的肾脏实质。
[小鼠急性肾损伤(AKI)模型试验]
按照公知的方法(AgingCell8，192-200(2009)、JAmSocNephrol20，1544-1555(2009)、JAmSocNephrol25，316-328(2014))制备小鼠缺血再灌注AKI模型。通过异氟烷吸入麻醉6周龄的雌性免疫缺陷小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J(Charlesriver))，并维持在37℃。侧腹切开而进行右肾切除后，使用无创微血管夹钳(夏目制作所、日本国)闭塞左肾动脉45分钟。取下夹钳之后，移植RP-OS、hiPSC-RP、或4A6C3-10(于对照小鼠注入生理盐水)。使用DRI-CHEM7000VZ(富士胶片、日本国)测定作为小鼠的外周血中的肾功能标记物的血中尿素氮(BUN)及血清肌酐(Cr)水平。就AKI状态的确立而言，在缺血再灌注后不伴有肾梗塞，通过在第2天BUN水平上升(＞41mg/dl)而确认。在肾组织的分析中，在缺血再灌注后(I/R)第3天，用过碘酸-Schiff(PAS)或马森氏三色(MT)染剂进行染色。
[小鼠慢性肾功能不全模型试验]
按照公知的方法(NephrolDialTransplant26，832-838(2011))制备小鼠慢性肾功能不全模型(5/6肾切除模型)。通过异氟烷吸入麻醉6周龄的雌性免疫缺陷小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J)，并维持在37℃。进行右肾切除后，切除左肾脏的上下两极。在术后2周移植RP-OS的细胞团块。在移植3天后或2周后处死小鼠，对肾组织切片进行免疫染色试验。
[结果]
在RP-OS的肾实质移植后第2周的AKI模型(图7A)及慢性肾功能不全模型(图7B)的两种模型中，一些移植的RP-OS并入宿主的肾脏，已分化为肾小管近曲小管标记物LTL及AQP1阳性细胞。但是，RP-OS的肾实质移植在两种模型中没有显示针对肾功能的明确的效果(数据未显示)。报道了与静脉内注射进行比较，通过向肾脏被膜下进行移植直接递送至损伤了许多间充质干细胞的肾脏(TransplantProc41,947-951(2009))，因此，本发明人等试验了hiPSC-RP的对肾脏被膜下的移植引起的治疗效果。其结果，在缺血再灌注后第2、4、6天，与对照组及未分化的人iPS细胞移植组进行比较，在hiPSC-RP移植组中BUN水平及血清Cr水平显著地降低(图7C)。通过组织学的分析确认：与对照组进行比较，肾实质区域中具有管型的扩张肾小管在hiPSC-RP移植组中显著地减小，纤维化区域也在hiPSC-RP移植组中较小(图7D及E)。hiPSC-RP没有并入宿主的肾脏，因此，表明本方案中所确认的hiPSC-RP的治疗效果主要基于旁分泌作用(パラクライン効果)。
工业上的可利用性
如以上详述的那样，本发明提供由间介中胚层细胞诱导分化肾前体细胞的方法。由此，用本方法产生的肾前体细胞可在肾功能不全等肾病的再生医疗中使用。
将本说明书中引用的全部的刊行物、专利及专利申请直接作为参考引入本说明书中。

Claims (32)

1.一种由间介中胚层细胞产生肾前体细胞的方法，所述方法包括：将间介中胚层细胞在含有TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的培养基中进行培养，由间介中胚层细胞诱导肾前体细胞的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肾前体细胞为SIX2阳性细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述间介中胚层细胞为OSR1阳性细胞。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述TGFβ信号激活剂为选自由TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、IDE1及IDE2构成的组中的1种以上的物质。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述BMP抑制剂为选自由Dorsomorphin、Noggin、LDN193189及DMH1构成的组中的1种以上的物质。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述TGFβ信号激活剂为TGFβ1，所述BMP抑制剂为DMH1。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述间介中胚层细胞为由多能干细胞诱导成的间介中胚层细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述间介中胚层细胞为通过包括以下的工序(i)及(ii)的方法所产生的间介中胚层细胞：
(i)将多能干细胞在含有选自由激活素A、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
(ii)将工序(i)中得到的细胞在含有选自由BMP7、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述工序(ii)包括以下的工序(ii-1)及(ii-2)：
(ii-1)将工序(i)中得到的细胞在含有选自BMP7及GSK-3β抑制剂中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
(ii-2)将工序(ii-1)中得到的细胞在含有选自TGFβ信号激活剂及视黄酸衍生物中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述工序(ii-1)为在含有BMP7及GSK-3β抑制剂的培养基中进行培养的工序，所述工序(ii-2)为在含有TGFβ信号激活剂及视黄酸衍生物的培养基中进行培养的工序。
11.根据权利要求8～10中任一项所述的方法，其中，所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
12.根据权利要求8～11中任一项所述的方法，其中，所述视黄酸衍生物为AM580或TTNPB。
13.根据权利要求7～12中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干(iPS)细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述iPS细胞为人iPS细胞。
15.一种由多能干细胞产生肾前体细胞的方法，所述方法包括以下的工序(i)～(iii)：
(i)将多能干细胞在含有选自由激活素A、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；
(ii)将工序(i)中得到的细胞在含有选自由BMP7、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
(iii)将工序(ii)中得到的细胞在含有TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的培养基中进行培养的工序。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述肾前体细胞为SIX2阳性细胞。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述工序(ii)中得到的细胞为OSR1阳性细胞。
18.根据权利要求15～17中任一项所述的方法，其中，所述TGFβ信号激活剂为选自由TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、IDE1及IDE2构成的组中的1种以上的物质。
19.根据权利要求15～18中任一项所述的方法，其中，所述BMP抑制剂为选自由Dorsomorphin、Noggin、LDN193189及DMH1构成的组中的1种以上的物质。
20.根据权利要求15～17中任一项所述的方法，其中，所述TGFβ信号激活剂为TGFβ1，所述BMP抑制剂为DMH1。
21.根据权利要求15～20中任一项所述的方法，其中，所述工序(ii)包括以下的工序(ii-1)及(ii-2)：
(ii-1)将工序(i)中得到的细胞在含有选自BMP7及GSK-3β抑制剂中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
(ii-2)将工序(ii-1)中得到的细胞在含有选自TGFβ信号激活剂及视黄酸衍生物中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述工序(ii-1)为在含有BMP7及GSK-3β抑制剂的培养基中进行培养的工序，所述工序(ii-2)为在含有TGFβ信号激活剂及视黄酸衍生物的培养基中进行培养的工序。
23.根据权利要求15～22中任一项所述的方法，其中，所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
24.根据权利要求15～23中任一项所述的方法，其中，所述视黄酸衍生物为AM580或TTNPB。
25.根据权利要求15～24中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干(iPS)细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述iPS细胞为人iPS细胞。
27.一种肾前体细胞，所述肾前体细胞通过权利要求1～26中任一项所述的方法来产生。
28.一种药物组合物，所述药物组合物含有通过权利要求1～26中任一项所述的方法产生的肾前体细胞。
29.一种肾病治疗剂，所述肾病治疗剂含有通过权利要求1～26中任一项所述的方法产生的肾前体细胞。
30.一种治疗肾病的方法，所述方法包括：将通过权利要求1～26中任一项所述的方法产生的肾前体细胞施用于需要治疗的患者的工序。
31.一种肾前体细胞，所述肾前体细胞通过权利要求1～26中任一项所述的方法来产生，所述肾前体细胞用于肾病的治疗。
32.通过权利要求1～26中任一项所述的方法产生的肾前体细胞在制备用于治疗肾病的药物组合物中的用途。
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