JP6830893B2 - 腎前駆細胞を製造する方法 - Google Patents

Description

本発明は、多能性幹細胞から分化した腎前駆細胞を含む細胞集団から、高純度の腎前駆細胞集団を取得し、製造するための細胞表面マーカーを用いる、腎前駆細胞を製造する方法に関する。

腎臓は、生体内における代謝活動により生じる有害物質や老廃物を血中から濾過することで除去し、身体の健康維持を図るべく機能する重要な臓器の一つである。腎臓の機能が損なわれる重篤な疾患として、腎不全があるが、有効な薬物療法が確立されておらず、現状、腎移植、人工透析で治療されている。しかしながら、腎移植には深刻なドナー臓器不足の問題がある一方で、人工透析には合併症の発現に加え、大きな医療費負担の問題があり、新たな治療法の開発が望まれている。

一方、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）や、体細胞へ初期化因子を導入することで得られる人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞）など多能性を有する細胞がこれまでに報告されている（特許文献１及び２）。現在、これらの多能性幹細胞から分化誘導された腎細胞を移植する、腎不全の治療法の開発が検討されている。さらに、これらの多能性幹細胞由来の均一な腎細胞を用いて治療薬の開発を行うことも視野に入れられている。

哺乳類の腎臓は前腎、中腎、後腎の３段階を経て形成されており、そのうち後腎は、中間中胚葉の後方領域に生じることが知られている。これまでの研究で、マウス多能性幹細胞から中間中胚葉への分化誘導方法が検討されており（非特許文献１）、中間中胚葉の特徴的なマーカーとしてＯｄｄ−Ｓｋｉｐｐｅｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １（ＯＳＲ１）が確認されている。また腎前駆細胞を特徴付ける因子の１つとしてＳＩＸ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２（ＳＩＸ２）が知られている（非特許文献２及び３）。細菌人工染色体（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ；ＢＡＣ）ベクターを使用して緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）遺伝子を内在性のＯＳＲ１対立遺伝子との相同組換えで導入したヒトｉＰＳ細胞（ＯＳＲ１−ＧＦＰレポーターヒトｉＰＳ細胞）を作製し、この細胞を用いた検討により、アクチビンＡ（ＡｃｔｉｖｉｎＡ）、Ｗｎｔタンパク質、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ））及び各種低分子化合物を用いてヒト多能性幹細胞から中間中胚葉への分化誘導に成功している（非特許文献３、特許文献３）。次いで、Ｍａｅら（非特許文献３）と同じ相同組換え方法を用いて、ＯＳＲ１−ＧＦＰレポーターヒトｉＰＳ細胞株のＳＩＸ２遺伝子座に赤色蛍光タンパク質であるｔｄＴｏｍａｔｏを導入したＯＳＲ１−ＧＦＰ ＆ ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターｉＰＳヒト細胞株を作製し、この細胞を用いた検討により、ヒト多能性幹細胞から腎前駆細胞への分化誘導系の構築に成功し、この方法で得られた腎前駆細胞の急性腎障害モデルでの薬効を確認している（非特許文献４、特許文献４）。

ＵＳ５，８４３，７８０ ＷＯ２００７／０６９６６６ ＷＯ２０１２／０１１６１０ ＷＯ２０１４／２００１１５

Ｍａｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（２０１０），３９３：８７７−８８２ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，（２００８），３：１６９−１８１ Ｍａｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（２０１３），４：１３６７ Ｔｏｙｏｈａｒａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，（２０１５），４：９８０−９９２

本発明の課題は、腎前駆細胞特異的な細胞表面マーカーを同定することにより、多能性幹細胞から腎前駆細胞に分化誘導した細胞集団から、純度の高い腎前駆細胞集団を取得し、製造する方法を提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＣＤ９陰性（ＣＤ９（−））、ＣＤ５５陰性（ＣＤ５５（−））、ＣＤ１０６陽性（ＣＤ１０６（＋））、ＣＤ１４０ａ陽性（ＣＤ１４０ａ（＋））、ＣＤ１４０ｂ陽性（ＣＤ１４０ｂ（＋））、ＣＤ１６５陽性（ＣＤ１６５（＋））、ＣＤ２７１陽性（ＣＤ２７１（＋））及びＣＤ３２６陰性（ＣＤ３２６（−））から選択される細胞表面マーカーを用いることによって、腎前駆細胞を含む細胞集団から、純度の高い腎前駆細胞集団を取得し、製造できることを初めて見出した。本発明はそのような知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
［１］多能性幹細胞から分化誘導した腎前駆細胞を製造する方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞を腎前駆細胞への分化を誘導する条件下で培養する工程；及び
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞から、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）、ＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）、ＣＤ２７１（＋）及びＣＤ３２６（−）からなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する工程、
を包含する方法。
［２］工程（ｉｉ）において少なくとも２つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する、［１］に記載の方法。
［３］工程（ｉｉ）において少なくとも３つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する、［１］に記載の方法。
［４］工程（ｉｉ）において少なくとも４つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する、［１］に記載の方法。
［５］工程（ｉｉ）において、ＣＤ９（−）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）からなる群より選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを用いる、［１］に記載の方法。
［６］工程（ｉｉ）において、少なくとも３つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する、［５］に記載の方法。
［７］工程（ｉｉ）において、細胞表面マーカーとしてＣＤ９（−）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）を用いる、［４］に記載の方法。
［８］多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の方法で製造された、腎前駆細胞集団。
［１１］腎前駆細胞を含む細胞集団から、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）、ＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）、ＣＤ２７１（＋）及びＣＤ３２６（−）からなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する方法。
［１２］少なくとも２つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する、［１１］に記載の方法。
［１３］少なくとも３つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する、［１１］に記載の方法。
［１４］少なくとも４つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する、［１１］に記載の方法。
［１５］ＣＤ９（−）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）からなる群より選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを用いる、［１１］に記載の方法。
［１６］少なくとも３つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する、［１５］に記載の方法。
［１７］細胞表面マーカーとして、ＣＤ９（−）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）を用いる、［１１］に記載の方法。
［１８］腎前駆細胞が、多能性幹細胞から分化誘導した腎前駆細胞である、［１１］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、［１１］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［２０］多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、［１１］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［２１］［１１］〜［２０］のいずれかに記載の方法によって得られた細胞集団。

本発明によって、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）から腎前駆細胞に分化誘導した細胞集団から、細胞表面マーカーを用いることで、高純度の腎前駆細胞集団を取得し、製造することが初めて可能となった。また、本発明の方法で取得された腎前駆細胞集団は、腎不全等の腎疾患の再生医療用途に使用されうる。

図１は、実施例１におけるＣＤ９、ＣＤ５５、ＣＤ１０６、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６５、ＣＤ２７１及びＣＤ３２６とＯＳＲ１及びＳＩＸ２の発現をフローサイトメーターで測定した結果の２次元展開図を示す。縦軸に各細胞表面マーカーに対する抗体の蛍光強度をとり、横軸にＯＳＲ１又はＳＩＸ２タンパク質の発現を代替する蛍光レポーターの蛍光強度をとる。 図２は、実施例２におけるヒトｉＰＳ細胞由来分化細胞群からのＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）細胞のソーティング結果を示す。図２ＡはヒトｉＰＳ細胞由来分化細胞群をＣＤ９，ＣＤ１４０ａ，ＣＤ１４０ｂ，ＣＤ２７１で染色した際のサイトグラム図であり、縦軸及び横軸に各細胞表面マーカーに対する抗体の蛍光強度をとる。Ｐ６はＣＤ９（−）かつＣＤ１４０ａ（＋）の細胞集団を、Ｐ４はＣＤ９（−）かつＣＤ１４０ｂ（＋）の細胞集団を、Ｐ３はＣＤ９（−）かつＣＤ２７１（＋）の細胞集団を示す。図２Ａに示されるＰ３かつＰ４かつＰ６の細胞集団を分取した。図２Ｂの２次元展開図は、左から分化誘導前のヒトｉＰＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来分化細胞群、ヒトｉＰＳ細胞由来分化細胞群からソーティング後のＰ３かつＰ４かつＰ６の細胞集団についてのＯＳＲ１とＳＩＸ２の発現をフローサイトメーターで測定した図であり、縦軸及び横軸にＯＳＲ１又はＳＩＸ２タンパク質の発現を代替する蛍光レポーターの蛍光強度をとる。百分率で示した数値はＯＳＲ１，ＳＩＸ２共陽性細胞（ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞；右上分画）、ＯＳＲ１陽性かつＳＩＸ２陰性細胞（ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（−）細胞；左上分画）、ＯＳＲ１陰性かつＳＩＸ２陽性細胞（ＯＳＲ１（−）ＳＩＸ２（＋）細胞；右下分画）及びＯＳＲ１，ＳＩＸ２共陰性細胞（ＯＳＲ１（−）ＳＩＸ２（−）細胞；左下分画）の割合を示す。 図３は、実施例３におけるヒトｉＰＳ細胞由来分化細胞群から分取したＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）細胞から近位尿細管様構造を作製した一例を示す。図３Ａは非特許文献４と同じ方法での、細胞塊形成後、Ｗｎｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞と共培養する、近位尿細管への分化方法を示す。ＢＭＰ７及びＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２（Ｗａｋｏ，２５３−００５１３）を添加したマウス尿管芽細胞（ｕｒｅｔｅｒｉｃｂｕｄ ｃｅｌｌｓ（ＵＢＣ））馴化培地を使用し、１ｘ１０^５ｃｅｌｌｓの細胞塊を形成させた。翌日、ＢＭＰ７、Ｙ−２７６３２及びＧＳＫ３β阻害剤であるＢＩＯ（Ｗａｋｏ，０２９−１６２４１）を添加したマウス尿管芽細胞馴化培地に置換し、さらに１日培養後、マイトマイシンＣ処理済みのＷｎｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞上にのせ共培養を行い、近位尿細管への分化誘導を行った。図３ＢはＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）細胞の細胞塊をＷｎｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞と共培養した後の顕微鏡像（左上）、免疫染色像（右上、左下）及びそれらの重ね合わせ画像（右下）を示す。また、Ｌｏｔｕｓ Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ（ＬＴＬ）発現細胞を矢印の拡大図にて示す。図中、ＬＴＬは近位尿細管のマーカーを、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は細胞核染色剤を示し、またスケールバーは１００μｍを示す。 図４は、実施例４における陰性選択マーカーＣＤ９と陽性選択マーカー３種類の網羅的組み合わせによるＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞、ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（−）細胞、ＯＳＲ１（−）ＳＩＸ２（＋）細胞及びＯＳＲ１（−）ＳＩＸ２（−）細胞の割合を百分率で示す。また陰性選択マーカーＣＤ９の代替として、ＣＤ５５又はＣＤ３２６を使用したときのＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞、ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（−）細胞、ＯＳＲ１（−）ＳＩＸ２（＋）細胞及びＯＳＲ１（−）ＳＩＸ２（−）細胞の割合もあわせて示す。 図５は、実施例５におけるＣＤ９（−）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）の任意の細胞表面マーカーの組み合わせにより元細胞集団から回収される細胞集団におけるＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）ｃｅｌｌｓの割合、同細胞表面マーカーの組み合わせで規定される細胞の元細胞集団中の割合、そして同細胞表面マーカーの組み合わせにより回収されるＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞数／元細胞数を百分率で示す。 図６は、実施例６におけるヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株由来分化細胞集団からＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）を指標にソーティングした細胞集団を近位尿細管様構造に分化誘導した結果を示す。図６Ａは、ＯＳＲ１（ＧＦＰによる検出）、ＳＩＸ２（ｔｄＴｏｍａｔｏによる検出）及び各細胞表面マーカーの蛍光強度に対する細胞数のヒストグラムを示す。図６Ｂは、ｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株由来分化細胞集団のＣＤ９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ又はＣＤ２７１の発現をフローサイトメーターで測定した結果の２次元展開図である。縦軸及び横軸に各細胞表面マーカーに対する抗体の蛍光強度をとる。ＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）細胞は、ゲーティング（Ｐ４かつＰ２かつＰ３）分画をソーティングすることにより細胞を分取した。図６Ｃは、ソーティング後のＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）細胞の細胞塊をＷｎｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞と共培養した後の顕微鏡像と免疫染色像の重ね合わせ画像を示す。図中、ＬＴＬは近位尿細管のマーカー（枠内）を示し、スケールバーは１００μｍを示す。 図７は、実施例７におけるｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株由来分化細胞集団の抗ＳＩＸ２抗体による免疫染色の結果を示す。図７Ａは、ソーティング前の細胞集団の免疫染色像を示し、図７Ｂは、ＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）を指標にソーティングした細胞集団の免疫染色像を示す。図中、白矢じりはＳＩＸ２陽性細胞を示し、透明矢じりはＳＩＸ２陰性細胞を示す。スケールバーは１００μｍを示す。Ａ，Ｂともに、写真左は明視野像を、写真中央は抗ＳＩＸ２抗体による染色像を、写真右はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２による核染色像を示す。

本発明を以下に詳細に説明する。

本発明では、多能性幹細胞から分化誘導した腎前駆細胞集団から、細胞表面マーカーを用いて、高純度の腎前駆細胞集団を取得し、製造する方法を提供する。具体的には、本発明には、以下の方法（以下「本発明の製造方法」とも称する）が含まれる：
多能性幹細胞から分化誘導した腎前駆細胞集団を製造する方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞を腎前駆細胞への分化を誘導する条件下で培養する工程；及び
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞から、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）、ＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）、ＣＤ２７１（＋）及びＣＤ３２６（−）からなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する工程、
を包含する方法。

本発明ではまた、腎前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する方法も提供する。具体的には、本発明には、以下の方法（以下「本発明の選別方法」とも称する）が含まれる：
腎前駆細胞を含む細胞集団から、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）、ＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）、ＣＤ２７１（＋）及びＣＤ３２６（−）からなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する方法。

本発明は、本発明の製造方法によって製造された腎前駆細胞集団を含む。

本発明はまた、本発明の選別方法によって得られた細胞集団を含む。

以下に、本発明について説明する。
１．工程（ｉ）多能性幹細胞を腎前駆細胞集団への分化を誘導する条件下で培養する工程：
本工程において使用され得る、多能性幹細胞から腎前駆細胞集団への分化を誘導する方法としては、非特許文献４及び特許文献４に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない任意の方法が使用され得る。工程（ｉｉ）での選別により腎前駆細胞を濃縮できることから、工程（ｉ）では、腎前駆細胞を含む細胞集団が得られればよく、当該工程（ｉ）で得られる細胞集団に含まれる腎前駆細胞の含有率は、特に問題とされないが、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上または３０％以上が例示される。

本発明によって製造される腎前駆細胞は、腎前駆細胞が濃縮された細胞集団として製造され、得られる細胞集団に含まれる腎前駆細胞の含有率は、特に限定されないが、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上又は７５％以上が例示される。従って、本発明において、「選別する」とは、所望の細胞が、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上又は７５％以上を含有する細胞集団を得ることである。

本発明において腎前駆細胞とは、その一部が尿細管へと変化する細胞を意味し、ＯＳＲ１及びＳＩＸ２二重陽性（ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋））である細胞である。ＯＳＲ１は、ヒトＯＳＲ１遺伝子（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿１４５２６０．２）によってコードされるタンパク質が例示され、ＳＩＸ２は、ヒトＳＩＸ２遺伝子（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１６９３２．４）によってコードされるタンパク質が例示される。ＯＳＲ１陽性とは、ＯＳＲ１遺伝子の転写活性が高いことを意味し、ＯＳＲ１のｍＲＮＡが公知の方法で検出できること、ＯＳＲ１のタンパク質が公知の方法で検出できること（実施例１、２及び４〜６）、又はＯＳＲ１遺伝子のプロモーターに機能的に連結したマーカー遺伝子の発現が確認できることなどが例示される。ＳＩＸ２が陽性とは、同様に、ＳＩＸ２遺伝子の転写活性が高いことを意味し、ＳＩＸ２のｍＲＮＡが公知の方法で検出できること、ＳＩＸ２のタンパク質が公知の方法で検出できること（実施例１、２及び４〜６）又はＳＩＸ２遺伝子のプロモーターに機能的に連結したマーカー遺伝子の発現が確認できることなどが例示される。本発明において、マーカー遺伝子とは、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が例示されるが、これに限定されない。

本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの性質・形態の異なる細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、腎前駆細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植技術を使って作製された胚性幹細胞（Ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｎｔＥＳ細胞）、精子幹細胞（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ；ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ；Ｍｕｓｅ細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで取得可能であるという観点から、ｉＰＳ細胞であり、より好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。

ｉＰＳ細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３又はＧｌｉｓ１等の遺伝子あるいは遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６；ＷＯ２００８／１１８８２０；ＷＯ２００９／００７８５２；ＷＯ２００９／０３２１９４；ＷＯ２００９／０５８４１３；ＷＯ２００９／０５７８３１；ＷＯ２００９／０７５１１９；ＷＯ２００９／０７９００７；ＷＯ２００９／０９１６５９；ＷＯ２００９／１０１０８４；ＷＯ２００９／１０１４０７；ＷＯ２００９／１０２９８３；ＷＯ２００９／１１４９４９；ＷＯ２００９／１１７４３９；ＷＯ２００９／１２６２５０；ＷＯ２００９／１２６２５１；ＷＯ２００９／１２６６５５；ＷＯ２００９／１５７５９３；ＷＯ２０１０／００９０１５；ＷＯ２０１０／０３３９０６；ＷＯ２０１０／０３３９２０；ＷＯ２０１０／０４２８００；ＷＯ２０１０／０５０６２６；ＷＯ２０１０／０５６８３１；ＷＯ２０１０／０６８９５５；ＷＯ２０１０／０９８４１９；ＷＯ２０１０／１０２２６７；ＷＯ２０１０／１１１４０９；ＷＯ２０１０／１１１４２２；ＷＯ２０１０／１１５０５０；ＷＯ２０１０／１２４２９０；ＷＯ２０１０／１４７３９５；ＷＯ２０１０／１４７６１２；Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００８），２６：７９５−７９７；Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，（２００８），２：５２５−５２８；ＥｍｉｎｌｉＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，（２００８），２６：２４６７−２４７４；Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００８），２６：１２６９−１２７５；Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，（２００８），３：５６８−５７４；Ｚｈａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，（２００８），３：４７５−４７９；Ｍａｒｓｏｎ Ａ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，（２００８），３：１３２−１３５；Ｆｅｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，（２００９），１１：１９７−２０３；Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００９），２７：４５９−４６１；Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２００９），１０６：８９１２−８９１７；Ｋｉｍ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００９），４６１：６４９−６４３；Ｉｃｈｉｄａ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．，（２００９），５：４９１−５０３；Ｈｅｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，（２０１０），６：１６７−１７４；Ｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２０１０），４６３：１０９６−１１００；Ｍａｌｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，（２０１０），２８：７１３−７２０；Ｍａｅｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２０１１），４７４：２２５−２２９．に記載の組み合わせが例示される。

体細胞には、非限定的に、新生児（仔）の体細胞、及び健常人あるいは患者の体細胞のいずれも包含されるし、また、それら由来の初代培養細胞、継代細胞及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、筋肉細胞、皮膚細胞、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞、脳細胞、肺細胞、腎細胞及び脂肪細胞等の臓器、組織に存在する分化細胞などが例示される。

また、ｉＰＳ細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子型が同一又は実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの３遺伝子座又はそれらにＨＬＡ−Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。

１つの実施形態において、工程（ｉ）としては、非特許文献４及び特許文献４に記載される多能性幹細胞から腎前駆細胞集団への分化を誘導する方法が使用され、具体的には、以下の工程（ｉ−１）〜（ｉ−３）を含む：
（ｉ−１）多能性幹細胞を、アクチビンＡ、ＧＳＫ−３β阻害剤及びレチノイン酸誘導体から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、
（ｉ−２）工程（ｉ−１）で得られた細胞集団を、ＢＭＰ７、ＧＳＫ−３β阻害剤及びレチノイン酸誘導体から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、及び
（ｉ−３）工程（ｉ−２）で得られた細胞集団を、ＴＧＦβシグナル刺激剤及びＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養する工程。

以下に、各工程（ｉ−１）〜（ｉ−３）について説明する。

（ｉ−１）多能性幹細胞を、アクチビンＡ、ＧＳＫ−３β阻害剤及びレチノイン酸誘導体から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程：
本工程では、多能性幹細胞を当該分野で公知の任意の方法で分離し、浮遊培養又は接着培養により培養してもよい。多能性幹細胞の分離の方法としては、例えば、機械的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）およびＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ））又はコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液を用いて解離し、機械的に細かく単一細胞へ分散する方法である。本工程で用いるヒト多能性幹細胞としては、使用した培養皿に対して８０％コンフルエントになるまで培養されたコロニーを用いることが好ましい。

本発明の方法において使用される浮遊培養とは、細胞を培養皿と非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの又は人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ）によるコーティング処理）したものを使用して培養することができる。

本発明の方法において使用される接着培養とは、細胞を培養皿に接着させた状態で培養することであり、特に限定はされないが、コーティング処理された培養皿にて培養することも可能である。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン又はエンタクチン及びこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは、マトリゲル、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）又はゼラチンである。

工程（ｉ−１）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地にアクチビンＡ、ＧＳＫ−３β阻害剤及びレチノイン酸誘導体から選択される１以上の物質を添加して調製することができる。１つの実施形態において、本工程で使用される物質は、アクチビンＡ及びＧＳＫ−３β阻害剤の組み合わせ又はＧＳＫ−３β阻害剤及びレチノイン酸誘導体の組み合わせである。基礎培地としては、例えば、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｆ１２）培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地及びこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清（例えばウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ））が含有されていてもよいし又は無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（Ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ；ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有しうる。本工程の１つの実施形態において、基礎培地は、ＧｌｕｔａＭＡＸ、血清及び抗生物質を含む、ＤＭＥＭとＦ１２の１：１の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）である。

工程（ｉ−１）において、アクチビンＡとしては、ヒト及び他の動物由来のアクチビンＡ並びにこれらの機能的改変体が包含され、例えば、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社等の市販品を使用することができる。本工程で用いるアクチビンＡの濃度は、１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌである。

工程（ｉ−１）において、ＧＳＫ−３β阻害剤としては、ＧＳＫ−３βの機能、例えば、キナーゼ活性を阻害できるものである限り特に限定されず、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ−３β阻害剤ＩＸ；６−ブロモインジルビン３’−オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩ（２，４’−ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３−ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ_２（配列番号１５））及び高い選択性を有するＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル）（Ｎａｔｕｒｅ，（２００８），４５３：５１９−５２３）が挙げられる。これらの化合物は、例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｂｉｏｍｏｌ社等から入手可能であり、また自ら作製してもよい。本工程で用いる好ましいＧＳＫ−３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。本工程で用いるＧＳＫ−３β阻害剤の濃度は、使用するＧＳＫ−３β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＧＳＫ−３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから３μＭである。

工程（ｉ−１）において、レチノイン酸誘導体は、天然のレチノイン酸が有する機能を保持する人工的に修飾されていてもよいレチノイン酸であり、例えば、レチノイド化合物及びビタミンＡ化合物を包含する。レチノイド化合物の例としては、レチノイン酸、３−デヒドロレチノイン酸、４−［［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボニル］アミノ］−安息香酸（ＡＭ５８０）（Ｔａｍｕｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖ．，（１９９０），３２：１７−２６）、４−［（１Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペン−１−イル］−安息香酸（ＴＴＮＰＢ）（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９８３），４３：５２６８−５２７２）、Ｔａｋｅｎａｇａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９８０），４０：９１４−９１９に記載されている化合物、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３−デヒドロレチノール、３−デヒドロレチナール等が挙げられる。レチノイン酸化合物とは、レチノイド化合物のうち、カルボキシル基を有する化合物であり、例えば、レチノイン酸、３−デヒドロレチノイン酸、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ等が挙げられる。本工程の１つの実施形態において、レチノイン酸誘導体は、レチノイド化合物又はビタミンＡ化合物である。本工程の別の実施形態において、レチノイン酸誘導体は、レチノイン酸化合物であり、また別の実施形態において、レチノイン酸誘導体は、ビタミンＡ化合物である。本工程で用いる好ましいレチノイン酸誘導体としては、ＡＭ５８０又はＴＴＮＰＢが挙げられる。本工程で用いるレチノイン酸誘導体の濃度は、使用するレチノイン酸誘導体に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、レチノイン酸誘導体としてＡＭ５８０又はＴＴＮＰＢを用いる場合、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、０．５μＭから２μＭである。

工程（ｉ−１）において使用される培地はさらに、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてもよい。特に、本工程が多能性幹細胞を単一細胞に分散させる工程を含む場合には、培地にＲＯＣＫ阻害剤が含まれていることが好ましい。

ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，（２０００），５７，９７６−９８３；Ｎａｒｕｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（２０００），３２５，２７３−２８４）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Ｕｅｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９９７），３８９：９９０−９９４）、Ｈ−１１５２（例えば、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，（２００２），９３：２２５−２３２）、Ｗｆ−５３６（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，（２００３），５２（４）：３１９−３２４）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４号、同第２００３／００８７９１９号及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、１種又は２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ−２７６３２が挙げられる。本工程で用いるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、使用するＲＯＣＫ阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤としてＹ−２７６３２を用いる場合、０．１μＭから１００μＭ、好ましくは、１μＭから５０μＭ、さらに好ましくは、５μＭから２０μＭである。

工程（ｉ−１）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ_２濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。本工程の培養時間は、例えば２日間以下の培養であり、好ましくは２日間である。

（ｉ−２）工程（ｉ−１）で得られた細胞集団を、ＢＭＰ７、ＧＳＫ−３β阻害剤及びレチノイン酸誘導体から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程：
本工程では、前述の工程（ｉ−１）で得られた浮遊培養後の細胞集団をそのままコーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で接着培養してもよく又は前述の工程（ｉ−１）で接着培養により得られた細胞集団を、培地の交換により培養を続けてもよい。

工程（ｉ−２）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地にＢＭＰ７、ＧＳＫ−３β阻害剤及びレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を添加して調製することができる。１つの実施形態において、本工程で使用される物質は、ＢＭＰ７及びＧＳＫ−３β阻害剤の組み合わせ又はレチノイン酸誘導体である。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、ＥＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地及びこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清（例えば、ＦＢＳ）が含有されていてもよいし又は無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類及びこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。本工程の１つの実施形態において、基礎培地は、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ＫＳＲ、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール及び抗生物質を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２である。

工程（ｉ−２）において、例えば、工程（ｉ−１）で得られた細胞集団を、ＢＭＰ７及びＧＳＫ−３β阻害剤から選択される１以上の物質を含む培地で培養し、その後に、レチノイン酸誘導体を含む培地でさらに培養してもよい。好ましくは、工程（ｉ−２）において、工程（ｉ−１）で得られた細胞集団を、ＢＭＰ７及びＧＳＫ−３β阻害剤から選択される１以上の物質を含む培地で培養し、その後に、レチノイン酸誘導体及びＴＧＦβシグナル刺激剤を含む培地でさらに培養する。すなわち、工程（ｉ−２）は、次の工程（ｉ−２−ａ）及び（ｉ−２−ｂ）の２工程に分離して行っても良い：（ｉ−２−ａ）ＢＭＰ７及びＧＳＫ−３β阻害剤から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程及び（ｉ−２−ｂ）レチノイン酸誘導体及びＴＧＦβシグナル刺激剤を含む培地で培養する工程。より好ましくは、工程（ｉ−２）において、工程（ｉ−２−ａ）は、ＢＭＰ７及びＧＳＫ−３β阻害剤を含む培地で培養する工程であり、工程（ｉ−２−ｂ）は、レチノイン酸誘導体及びＴＧＦβシグナル刺激剤を含む培地で培養する工程である。

工程（ｉ−２）において、ＢＭＰ７としては、ヒトＢＭＰ７（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿００１７１９．２）及び他の動物由来のＢＭＰ７並びにこれらの機能的改変体（分化誘導能を保持した改変体）が包含され、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｒ＆Ｄ社等の市販品を使用することができる。本工程で用いるＢＭＰ７の濃度は、１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌである。

工程（ｉ−２）において、ＧＳＫ−３β阻害剤は、前述の工程（ｉ−１）について例示したＧＳＫ−３β阻害剤を使用することができ、好ましいＧＳＫ−３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。本工程で用いるＧＳＫ−３β阻害剤の濃度は、使用するＧＳＫ−３β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＧＳＫ−３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから３μＭである。

工程（ｉ−２）において、レチノイン酸誘導体は、前述の工程（ｉ−１）について例示したレチノイン酸誘導体を使用することができ、好ましいレチノイン酸誘導体としては、ＡＭ５８０又はＴＴＮＰＢが挙げられる。本工程で用いるレチノイン酸誘導体の濃度は、使用するレチノイン酸誘導体に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、レチノイン酸誘導体としてＡＭ５８０又はＴＴＮＰＢを用いる場合、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、０．５μＭから２μＭである。

工程（ｉ−２）において、ＴＧＦβシグナル刺激剤は、ＴＧＦβシグナル経路を活性化するものである限り特に限定されず、ＴＧＦβシグナル刺激剤としては、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３などのタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒ＆Ｄ社等から入手可能）、ＩＤＥ１（１−［２−［（２−カルボキシフェニル）メチレン］ヒドラジド］ヘプタン酸）及びＩＤＥ２（ヘプタン二酸１−（２−シクロペンチリデンヒドラジド））（Ｂｏｒｏｗｉａｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，（２００９），４：３４８−３５８）などの化合物が例示される。ＩＤＥ１及びＩＤＥ２は、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｔｏｃｒｉｓ社等から入手可能である。好ましいＴＧＦβシグナル刺激剤としては、ＴＧＦβ１が挙げられる。本工程で用いるＴＧＦβシグナル刺激剤の濃度は、使用するＴＧＦβシグナル刺激剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＴＧＦβシグナル刺激剤としてＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３などのタンパク質を用いる場合の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌである。また、ＩＤＥ１及びＩＤＥ２を用いる場合の濃度は、１μＭから１００μＭ、好ましくは、２５μＭから７５μＭ、さらに好ましくは、４０μＭから６０μＭである。

工程（ｉ−２）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ_２濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。培養時間としては、例えば３日以上の培養であり、好ましくは３日以上１２日以下、より好ましくは３日以上９日以下が挙げられる。この時、培地は、３日ごとに交換することが望ましい。工程（ｉ−２）が工程（ｉ−２−ａ）及び（ｉ−２−ｂ）を含む場合、工程（ｉ−２）の培養時間としては前述のとおりであるが、工程（ｉ−２−ａ）の培養時間としては、例えば１日以上の培養であり、好ましくは２日以上１１日以下、より好ましくは２日以上６日以下が挙げられ、工程（ｉ−２−ｂ）の培養時間としては、例えば１日以上の培養であり、好ましくは２日以上１１日以下、より好ましくは３日以上６日以下が挙げられる。このとき、培地は、３日ごとに交換することが望ましい。

前述の工程（ｉ−１）及び（ｉ−２）によって、多能性幹細胞から中間中胚葉細胞が誘導され得る。中間中胚葉細胞を特徴づけるマーカーとしてＯＳＲ１が知られており、１つの実施形態において、工程（ｉ−１）及び（ｉ−２）によって誘導される細胞集団には、ＯＳＲ１陽性ＳＩＸ２陰性（ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（−））の中間中胚葉細胞が多く含有されるが、ＯＳＲ１及びＳＩＸ２二重陽性（ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋））の腎前駆細胞が含まれても良い。従って、工程（ｉ）として、前述の工程（ｉ−１）及び（ｉ−２）で当該工程を終了しても良いが、腎前駆細胞の含有率を高めるとの観点から、工程（ｉ−３）をさらに行うことが望ましい。

（ｉ−３）工程（ｉ−２）で得られた細胞集団を、ＴＧＦβシグナル刺激剤及びＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養する工程：
本工程では、前述の工程（ｉ−１）及び（ｉ−２）で得られた細胞（中間中胚葉細胞）集団を当該分野で公知の任意の方法で分離して又は該細胞をそのまま、浮遊培養又は接着培養により培養してもよい。細胞の分離の方法としては、例えば、機械的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）およびＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ））又はコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。

工程（ｉ−３）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へＴＧＦβシグナル刺激剤及びＢＭＰ阻害剤を添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、ＥＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地及びこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清（例えば、ＦＢＳ）が含有されていてもよいし、無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類及びこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。本工程の１つの実施形態において、基礎培地は、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ＫＳＲ、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール及び抗生物質を含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２である。

工程（ｉ−３）において、ＴＧＦβシグナル刺激剤は、ＴＧＦβシグナル経路を活性化するものである限り特に限定されず、ＴＧＦβシグナル刺激剤としては、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３などのタンパク質、ＩＤＥ１及びＩＤＥ２などの化合物が例示される。好ましいＴＧＦβシグナル刺激剤としては、ＴＧＦβ１が挙げられる。本工程で用いるＴＧＦβシグナル刺激剤の濃度は、使用するＴＧＦβシグナル刺激剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＴＧＦβシグナル刺激剤としてＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３などのタンパク質を用いる場合の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌである。また、ＩＤＥ１及びＩＤＥ２を用いる場合の濃度は、１μＭから１００μＭ、好ましくは、２５μＭから７５μＭ、さらに好ましくは、４０μＭから６０μＭである。

工程（ｉ−３）において、ＢＭＰ阻害剤は、ＢＭＰシグナル経路を活性化するものである限り特に限定されず、ＢＭＰ阻害剤としては、コーディン、ノギン、フォリスタチンなどのタンパク質性阻害剤、ドルソモルフィン（６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）及びその誘導体（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，（２００７），１１６：ＩＩ＿６０；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，（２００８），４：３３−４１；Ｊ．Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，（２００８），３：ｅ２９０４）、ＤＭＨ１（４−［６−（４−イソプロポキシフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン、４−［６−［４−（１−メチルエトキシ）フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］−キノリン）並びにＬＤＮ１９３１８９（４−（６−（４−（ピペリジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン）が例示される。これらの化合物は、例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＥＲＣＫ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥやＷａｋｏ社等から入手可能であり、また自ら作製してもよい。好ましいＢＭＰ阻害剤としては、ＤＭＨ１、ＬＤＮ１９３１８９、ノギン、及びドルソモルフィンが挙げられ、より好ましいＢＭＰ阻害剤は、ＤＭＨ１である。本工程で用いるＢＭＰ阻害剤の濃度は、使用するＢＭＰ阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＢＭＰ阻害剤として、コーディン、ノギン、フォリスタチンなどのタンパク質性阻害剤を用いる場合の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌである。ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９、ＤＭＨ１を用いる場合、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、０．５μＭから１μＭである。

１つの実施形態において、工程（ｉ−３）で使用されるＴＧＦβシグナル刺激剤及びＢＭＰ阻害剤の組み合わせは、ＴＧＦβ１及びＤＭＨ１である。

工程（ｉ−３）の培養工程において、基礎培地に線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＦＧＦ）９、ＦＧＦ２０、ＢＭＰ７、レチノイン酸誘導体及びＧＳＫ−３β阻害剤のいずれか又は任意の組み合わせをさらに添加しても良い。

工程（ｉ−３）の培養工程の日数は、長期間培養することで腎前駆細胞集団の製造効率に特に影響がないため上限はないが、例えば、２日以上、４日以上、６日以上、８日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上、１６日以上、１７日以上、１８日以上、１９日以上、２０日以上が挙げられる。

工程（ｉ−３）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。

２．工程（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞から、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）、ＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）、ＣＤ２７１（＋）及びＣＤ３２６（−）からなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する工程並びに本発明の選別方法：
工程（ｉｉ）及び本発明の選別方法（以下本章において、纏めて「工程（ｉｉ）」と称する）おいて、ＣＤ９、ＣＤ５５、ＣＤ１０６、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６５、ＣＤ２７１、ＣＤ３２６からなる群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現の有無を指標に、工程（ｉ）で得られた細胞集団からより純化された細胞集団を選別する。より具体的には、ＣＤ１０６、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６５及びＣＤ２７１については陽性であること、ＣＤ９、ＣＤ５５、及びＣＤ３２６については陰性であることを指標とする。本明細書中で、細胞表面マーカーに対する（＋）の標記は、細胞がその抗原について陽性であることを意味し、ＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）及びＣＤ２７１（＋）を陽性選択マーカーと称する。本明細書中で、細胞表面マーカーに対する（−）の標記は、細胞がその抗原について陰性であることを意味し、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）及びＣＤ３２６（−）を陰性選択マーカーと称する。本明細書中で、陽性及び陰性の選択マーカーを纏めて細胞表面マーカーとも称する。

好ましい態様において、工程（ｉｉ）において用いる細胞表面マーカーの組み合わせは、ＣＤ９、ＣＤ５５、ＣＤ１０６、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６５、ＣＤ２７１、ＣＤ３２６からなる群より選択される少なくとも２つ、３つ又は４つの細胞表面マーカーの組み合わせであってよい。例えば、少なくとも２つの細胞表面マーカーの組み合わせは、好ましくは、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）及びＣＤ３２６（−）からなる群より選択される１つの陰性選択マーカー（好ましくはＣＤ９（−））並びにＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）及びＣＤ２７１（＋）からなる群（好ましくはＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）からなる群）より選択される１つの陽性選択マーカーの組み合わせを含んでいてもよい。少なくとも３つの細胞表面マーカーの組み合わせは、好ましくは、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）及びＣＤ３２６（−）からなる群より選択される１つの陰性選択マーカー（好ましくは（ＣＤ９（−））並びにＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）及びＣＤ２７１（＋）からなる群（好ましくはＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）からなる群）より選択される２つの陽性選択マーカーの組み合わせ；あるいはＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）及びＣＤ２７１（＋）からなる群より選択される３つの陽性選択マーカーの組み合わせを含んでいてもよい。少なくとも４つの細胞表面マーカーの組み合わせは、好ましくは、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）及びＣＤ３２６（−）からなる群より選択される１つの陰性選択マーカー（好ましくはＣＤ９（−））並びにＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）及びＣＤ２７１（＋）からなる群より選択される３つの陽性選択マーカーの組み合わせを含んでいてもよい。一つの実施形態において、工程（ｉｉ）において用いる細胞表面マーカーは、ＣＤ９（−）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）からなる群より選択される少なくとも２つ又は３つの細胞表面マーカーであり、好ましくは、ＣＤ９（−）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）の組み合わせである。

工程（ｉｉ）で使用する細胞表面マーカーは、ヒトを含むがヒトに限定されない哺乳動物由来の腎前駆細胞の細胞集団を選別するために使用され得る。ヒト腎前駆細胞の細胞集団を選別する場合、８つの各ヒト細胞表面マーカーのＮＣＢＩアクセッション番号は以下の通りに対応する。
ＣＤ９：ＮＭ＿００１７６９．３（配列番号１）
ＣＤ５５：ＮＭ＿０００５７４．４（配列番号３）
ＣＤ１０６：ＮＭ＿００１０７８．３（配列番号５）
ＣＤ１４０ａ：ＮＭ＿００６２０６．４（配列番号７）
ＣＤ１４０ｂ：ＮＭ＿００２６０９．３（配列番号９）
ＣＤ１６５：ｇｅｎｅＩＤ＿２３４４９
ＣＤ２７１：ＮＭ＿００２５０７．３（配列番号１１）
ＣＤ３２６：ＮＭ＿００２３５４．２（配列番号１３）

ヒトの各細胞表面マーカーには、上記アクセッション番号に対応したヌクレオチド配列を有する遺伝子及び当該遺伝子にコードされるタンパク質並びに天然に存在する変異体が包含される。

ヒトＣＤ９は、配列番号１の塩基配列（塩基番号１８５〜８７１）を有する遺伝子によってコードされ、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ヒトＣＤ５５は、配列番号３の塩基配列（塩基番号２９５〜１４４０）を有する遺伝子によってコードされ、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ヒトＣＤ１０６は、配列番号５の塩基配列（塩基番号２２２〜２４４１）を有する遺伝子によってコードされ、配列番号６のアミノ酸配列を有する。ヒトＣＤ１４０ａは、配列番号７の塩基配列（塩基番号３３２〜３６０１）を有する遺伝子によってコードされ、配列番号８のアミノ酸配列を有する。ヒトＣＤ１４０ｂは、配列番号９の塩基配列（塩基番号４７０〜３７９０）を有する遺伝子によってコードされ、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。ヒトＣＤ２７１は、配列番号１１の塩基配列（塩基番号１２６〜１４０９）を有する遺伝子によってコードされ、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。ヒトＣＤ３２６は、配列番号１３の塩基配列（塩基番号３５９〜１３０３）を有する遺伝子によってコードされ、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。ヒトＣＤ１６５は、ＡＤ２またはｇｐ３７としても知られる３７−４２ｋＤａの膜表面タンパク質である。ＣＤ１６５に特異的に結合する抗体としてモノクローナル抗体ＳＮ２が同定されており（Ｓｅｏｎ，ＢＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９８４），１３２：２０８９−２０９５）、当該抗体は市販されている。

上記の細胞表面マーカーの天然に存在する変異体は、ＣＤ９、ＣＤ５５、ＣＤ１０６、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２７１及びＣＤ３２６については、上記の塩基配列に対して少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上の同一性を有する遺伝子によってコードされるか、上記のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞表面マーカーを意味する。

核酸配列またはアミノ酸配列について、本明細書における「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＳＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９７０），４８：４４３−４５３）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝１０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５
Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２

また、上記のヒトの細胞表面抗原に結合する特異的な抗体は市販されている。そのような抗体の一例として、後述する実施例において記載されるものが含まれる。上記の細胞表面マーカーのそれぞれに特異的に結合する市販の抗体が結合するという特徴を保持する細胞表面マーカーもまた、本発明において細胞集団の選別に利用可能な細胞表面マーカーに含まれる。

工程（ｉｉ）において、細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別することは、当該分野で公知の種々の方法により行うことができる。例えば、細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体を用いて、細胞への該抗体の結合に基づいて細胞を選別する方法が挙げられる。このような方法として、蛍光標識した抗体を使用してセルソーターを用いる方法（例えば、ＦＡＣＳ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、抗体を標識した磁気ビーズを用いて磁性により細胞を選別する方法（例えば、ＭＡＣＳ（登録商標）（ミルテニーバイオテク））、抗体が固定化された担体（例えば、細胞濃縮カラム）を用いる方法等が挙げられる。

３．腎疾患治療剤、腎疾患治療方法及び腎疾患治療用細胞を製造する方法：
本発明の方法により取得された腎前駆細胞集団は、腎疾患治療剤として利用可能である。従って、本発明は、以下の腎疾患治療用細胞の製造方法及び腎疾患治療用の細胞集団の選別方法を提供する：
腎疾患治療用細胞を製造する方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞を腎前駆細胞への分化を誘導する条件下で培養する工程；及び
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞から、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）、ＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）、ＣＤ２７１（＋）及びＣＤ３２６（−）からなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを用いて細胞集団を選別する工程、
を包含する方法。

腎前駆細胞を含む細胞集団から、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）、ＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）、ＣＤ２７１（＋）、及びＣＤ３２６（−）からなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを用いて、腎疾患治療用の細胞集団を選別する方法。

本発明での腎疾患治療用細胞とは、ＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）、ＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）、ＣＤ２７１（＋）、及びＣＤ３２６（−）からなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーで特徴づけられる細胞であり、好ましくは、ＣＤ９（−）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、及びＣＤ２７１（＋）で特徴づけられる細胞である。

本発明では、本発明の製造方法で製造された腎前駆細胞集団又は本発明の選別方法で選別された腎前駆細胞集団を含む腎疾患治療剤、及び本発明の製造方法で製造された腎前駆細胞集団又は本発明の選別方法で選別された腎前駆細胞集団を患者に投与する工程を含む腎疾患治療方法を提供する。患者への腎前駆細胞集団又は治療剤の投与方法としては、例えば取得された腎前駆細胞集団をシート化して、患者の腎臓に貼付する方法、取得された腎前駆細胞集団を生理食塩水等に懸濁させ、患者の腎臓に直接又は経血管投与により移植する方法、マトリゲル等から構成されたスキャフォールド上で三次元培養し、得られた腎前駆細胞塊を移植する方法、透析カラムに腎前駆細胞集団を充填する方法、マイクロカプセルに腎前駆細胞集団を包埋し投与する方法などが挙げられる。腎疾患としては、慢性腎不全にまで至らない状態を含む慢性腎臓病が例示される。

本発明において、腎疾患治療剤に含まれる腎前駆細胞の細胞数は、疾患の重篤度、患部や体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製されてもよい。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれらの実施例によって制限されない。

［実施例１］
〈ＯＳＲ１及びＳＩＸ２と各種細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによる腎前駆細胞集団の２次元展開〉
ｉＰＳ細胞は、非特許文献３に記載された方法で作製された、内在性のＯＳＲ１の遺伝子発現と連動してＧＦＰを発現し、内在性のＳＩＸ２の遺伝子発現と連動してｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＯＳＲ１−ＧＦＰ ＆ ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターヒトｉＰＳ細胞株を用いた。このヒトｉＰＳ細胞株から、非特許文献４に記載の方法に従い、腎前駆細胞を含む細胞集団への分化誘導を行った。Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：５６０７４７）を用いて、腎前駆細胞に特異的な発現をする細胞表面マーカーの探索を行った結果、目的の腎前駆細胞を含む細胞集団を明確に分画できる細胞表面マーカーとしてＣＤ９（−）、ＣＤ５５（−）、ＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ１６５（＋）、ＣＤ２７１（＋）及びＣＤ３２６（−）を同定した（図１）。

［実施例２］
〈ＣＤ９（−）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）の細胞集団には７０％以上の腎前駆細胞が含まれる〉
実施例１で得られた細胞表面マーカーを複数組み合わせて用いることで、ヒトｉＰＳ細胞由来分化細胞集団から分画した細胞に含まれる腎前駆細胞の割合を高めることができるかどうか検討した。

まず、陰性選択マーカーとして１つ、陽性選択マーカーとして３つ使用することで、ヒトｉＰＳ細胞由来分化細胞集団に含まれる腎前駆細胞の割合を高めることができるかどうか検討した。細胞表面マーカーとしては、実施例１でＯＳＲ１及びＳＩＸ２との２次元展開図において細胞集団の明確な分離像が得られたＣＤ９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ及びＣＤ２７１を選定し、各細胞表面マーカーに対する抗体としてはそれぞれ、ＡＰＣ−Ｈ７ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ＣＤ９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６５５４０９）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４０ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６２７９８）、ＢＶ４２１ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４０ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６４１２４）及びＢＶ５１０ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ２７１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６３４５１）を使用した。各抗体は２０倍希釈で使用し、室温にて１５分間反応させた。反応後、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳにて２回洗浄し、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。そして、その２次元展開図より、ＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）の細胞分画を設定し、当該細胞を分取した。分取した細胞集団を再度ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（登録商標）を用いて解析したところ、細胞集団全体に含まれるＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞の割合は７０％を超えていた（図２Ｂ）。図２ＡはヒトｉＰＳ細胞由来分化細胞群をＣＤ９，ＣＤ１４０ａ，ＣＤ１４０ｂ，ＣＤ２７１で染色した際のサイトグラム図であり、図２Ｂの２次元展開図は、左から分化誘導前のヒトｉＰＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来分化細胞群、そしてＰ３かつＰ４かつＰ６のソーティング後の細胞集団についてのＯＳＲ１とＳＩＸ２の発現をフローサイトメーターで測定した図である。

［実施例３］
〈ＣＤ９（−）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）によって選別した細胞集団からＬＴＬ（近位尿細管のマーカー）陽性の尿細管様構造の形成〉
腎前駆細胞の特徴として、腎前駆細胞マーカーの発現以外に、尿細管細胞への分化能の保持が挙げられる。よって、実施例２で得られたＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）細胞が腎前駆細胞であるかどうか確認するために、尿細管分化誘導系に供試した。尿細管細胞への分化と尿細管様構造の形成の判定は、近位尿細管のマーカーであるＬＴＬの発現と、形態的特徴から行った。

非特許文献４に記載の方法に従いヒトｉＰＳ細胞株から分化誘導した腎前駆細胞を含む細胞集団を、ＡＰＣ−Ｈ７ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ＣＤ９、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４０ａ、ＢＶ４２１ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４０ｂ及びＢＶ５１０ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ２７１を用いて免疫染色を行い、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（登録商標）にてＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）細胞を分取した。分取した細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ，３５４−ＢＰ−０１０）及び１０μＭ Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ，２５３−００５１３）を添加したＵＢＣ馴化培地（以下参照）を含む紡錘底低接着９６ウェルプレート（住友ベークライト，ＭＳ−９０９６Ｍ）に１．０ ｘ １０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２含有空気雰囲気下で２４時間培養した。次いで、培地を５０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ７、０．５μＭ ＢＩＯ（カルビオケム，３６１５５２）、及び１０μＭ Ｙ−２７６３２を添加したＵＢＣ馴化培地に置き換え、さらに２４時間培養した。その後、非特許文献４に記載の方法に従い、Ｗｎｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞と共培養した。Ｗｎｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞は２４ウェルプレートに４．０ ｘ １０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種しマイトマイシンＣ処理後に用いた。共培養にはＵＢＣ馴化培地を用い、２週間培養したのち、染色を行った。染色の１次反応にはＬＴＬ，Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂ−１３２５）を用い、２次反応にはｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓ−１１２２５）を用い、核染色にはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈ３５７０）を用いた。ＬＴＬは２００倍希釈で使用し、４℃で一晩反応を行った。また、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６ ｃｏｎｊｕｇａｔｅは２００倍希釈で使用し、室温で１時間反応を行った。その結果、ＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）の細胞集団からＬＴＬ陽性の管腔構造が形成されていることを確認した（図３Ｂ）。図３Ａは非特許文献４と同じ方法での細胞塊形成後、Ｗｎｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞と共培養する近位尿細管への分化方法を示す。図３ＢはＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）細胞の細胞塊をＷｎｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞と共培養した際の様子を示す。
〈ＵＢＣ馴化培地〉
尿管芽細胞（ＵＢＣ）馴化培地を文献（Ｂａｒａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（１９９７），２７３，Ｆ７５７−７６７）記載の方法を改良した方法で作製した。ＵＢＣ（コロンビア大学Ｄｒ．Ｂａｒａｓｃｈから譲受、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９７），９４，６２７９−６２８４）を、１０％ ＦＢＳを含有する最小必須培地（ＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。８０％コンフルエントになったところで細胞をＰＢＳで洗浄し、培地をＤＭＥＭとＦ１２の１：１の混合培地に、ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０％ ＫＳＲ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地に置き換えた。次いで、細胞を３日間培養して培養上清を生成した。培養上清は使用前に０．２２μｍフィルターでろ過した。

［実施例４］
〈ＣＤ９（−）と陽性選択マーカー３種類の組み合わせにより選別した腎前駆細胞（ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞）の割合〉
ＣＤ９（−）と実施例１で抽出された陽性選択マーカーを３種類使用したときの網羅的組み合わせ（１０種類）において、ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞の割合をＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて調べた。また実施例３で腎前駆細胞を含む細胞集団を分取することが可能と確認できた組み合わせであるＣＤ９（−）、ＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）、ＣＤ２７１（＋）において、ＣＤ５５（−）及びＣＤ３２６（−）がＣＤ９（−）代替の陰性選択マーカーとなり得るかをあわせて調べた。

抗体にはＡＰＣ−Ｈ７ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ＣＤ９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６５５４０９）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４０ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６２７９８）、ＢＶ４２１ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４０ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６２７９９）、ＢＶ４２１ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４０ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６４１２４）、ＢＶ５１０ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ２７１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６３４５１）、ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１０６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５１１４７）、ＢＶ６０５ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１０６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６３３０７）、ＣＤ１６５−Ｂｉｏｔｉｎ，ヒト（ミルテニーバイオテク，１３０−０９８−５３６）、ＣＤ１６５−ＡＰＣ，ヒト（ミルテニーバイオテク，１３０−０９８−５４２）、Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ５５ Ｂｉｏｔｉｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１３−０５５９）及びＢＶ６０５ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ３２６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６３１８２）を用いた。各抗体は２０倍希釈で使用し、室温にて１５分間反応させたのち、ＰＢＳで３回洗浄し解析を行った。また、ｂｉｏｔｉｎ化抗体は、ＢＶ６０５ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６３２６０）を用いて５００倍希釈にて２次染色を行った。２次染色は室温にて１５分間反応させたのち、ＰＢＳで３回洗浄し解析を行った。ヒトｉＰＳ細胞由来分化細胞集団をＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）を用いて解析し、その２次元展開図より、１２通りの組み合わせの分画を設定し、それぞれの分画の細胞を分取した。分取した細胞集団を再度ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）を用いて解析し、細胞集団全体に含まれるＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞、ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（−）細胞、ＯＳＲ１（−）ＳＩＸ２（＋）細胞及びＯＳＲ１（−）ＳＩＸ２（−）細胞の割合を算出した（図４）。その結果、いずれのマーカーの組み合わせにおいても、分取した細胞集団全体に対してＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞が高い割合で含まれていた。

［実施例５］
〈腎前駆細胞を分取できる細胞表面マーカーの組み合わせの検討〉
ＣＤ９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２７１の細胞表面マーカーの組み合わせにおいて、実施例４にて使用した抗体を用いてＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）による解析を行い、陰性選択マーカーであるＣＤ９（−）並びにＣＤ１４０ａ（＋）、ＣＤ１４０ｂ（＋）及びＣＤ２７１（＋）から選択される任意の陽性選択マーカーの組み合わせにおいて、各種細胞表面マーカーで分取した細胞集団に含まれるＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞の割合を算出した。また、各細胞表面マーカー組み合わせで規定される細胞の元細胞集団中の割合を調べ、所望の各表面マーカーで回収されるＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞数／元細胞数を算出した（図５）。その結果、いずれの細胞表面マーカーの組み合わせにおいてもＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞を濃縮でき、２つ又は３つの細胞表面マーカーの組み合わせでも、４つの細胞表面マーカーの組み合わせと同程度の割合でのＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）細胞の濃縮が可能であった。

［実施例６］
〈腎前駆細胞を分取できる細胞表面マーカーの組み合わせの検討〉
レポーター遺伝子の入っていないヒトｉＰＳ細胞株からもこの細胞表面マーカーを用いて高純度の腎前駆細胞集団を分取できることを確かめる目的で、ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株、京都大学より譲受）を分化誘導系に供試した。ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）は、従来の方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｃｅｌｌ．１３１：８６１−７２）で維持培養し、非特許文献４に記載の方法に従い、腎前駆細胞を含む細胞集団への分化誘導を行った。実施例３と同様に、ＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）を用いて分取し細胞塊形成後、Ｗｎｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞と共培養することで、尿細管への分化能を保持している細胞集団を分取できているかどうか確認した。尿細管への分化の判定は、近位尿細管のマーカーであるＬＴＬの発現と、形態的特徴から行った。その結果、ＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）の細胞集団からＬＴＬ陽性の管腔構造が形成できることを確認した。つまり、ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）からの分化細胞においても、ＣＤ９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ及びＣＤ２７１を用いて、腎前駆細胞を含む細胞集団を高純度で分取できることが確かめられた（図６Ｃ）。図６Ａは、ＯＳＲ１（ＧＦＰ）、ＳＩＸ２（ｔｄＴｏｍａｔｏ）及び各細胞表面マーカーの蛍光強度に対する細胞数のヒストグラムを示す。図６Ｂは、ｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株由来分化細胞集団のＣＤ９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ又はＣＤ２７１の発現をフローサイトメーターで測定した結果の２次元展開図である。図６Ｃは、Ｐ４かつＰ２かつＰ３の細胞集団をソーティング後、細胞塊を形成し、Ｗｎｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞と共培養した像を示す。

［実施例７］
〈腎前駆細胞を分取できる細胞表面抗原マーカーの組み合わせの検討（２）〉
実施例６と同様にヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）を分化誘導した腎前駆細胞を含む細胞集団を、ＡＰＣ−Ｈ７ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ＣＤ９、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４０ａ、ＢＶ４２１ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４０ｂ及びＢＶ５１０ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ２７１を用いて表面抗原の免疫染色を行い、ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）を用いてＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）細胞を分取した。細胞を分取後、Ｓｍｅａｒ Ｇｅｌｌ（登録商標）（ＧｅｎｏＳｔａｆｆ，ＳＧ−０１）を用いてスライドガラス上に塗沫し、核内転写因子の免疫染色を行った。１次抗体にはａｎｔｉ−ＳＩＸ２，ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，１１５６２−１−ＡＰ）を用い、２次抗体にはＤｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａ２１２０６）を用い、核染色にはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈ３５７０）を用いた。顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ，ＢＺ−９０００）を用いて観察した結果、ＣＤ９（−）ＣＤ１４０ａ（＋）ＣＤ１４０ｂ（＋）ＣＤ２７１（＋）の細胞集団は腎前駆細胞の特徴の１つであるＳＩＸ２陽性細胞の割合が、ソート前の分化細胞集団に比べて高いことが観察された（図７）。

以上詳述したように、本発明は、多能性幹細胞から腎前駆細胞に分化誘導した細胞集団から、細胞表面マーカーを用いて高純度の腎前駆細胞を取得し、製造する方法を提供する。本方法で取得された腎前駆細胞は、腎不全等の腎疾患の再生医療に使用されうる。

配列番号１５：Ｌ８０３−ｍｔｓ／ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤；１番目のアミノ酸であるグリシン残基は、Ｎ末端でアミド結合を介したミリスチン酸の結合を受けている；１１番目のアミノ酸であるセリン残基はリン酸化されている；１２番目のアミノ酸であるプロリンはＣ末端がアミド化されている。
［配列表］

Claims (11)

1. 多能性幹細胞から分化誘導した腎前駆細胞を製造する方法であって、
   （i） 多能性幹細胞を腎前駆細胞への分化を誘導する条件下で培養する工程と、
   （ii） 工程（i）で得られた細胞から、下記：
   (a) CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   (b) CD9(-)、CD165(+)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   (c) CD9(-)、CD140a(+)、CD106(+)及びCD271(+)；
   (d) CD9(-)、CD140a(+)、CD165(+)及びCD271(+)；
   (e) CD55(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   (f) CD326(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   (g) CD9(-)、CD140a(+)及びCD271(+)；
   (h) CD9(-)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   (i) CD140a(+)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   のいずれか１つの細胞表面マーカーの組合せを用いて細胞集団を選別する工程と、
   を含む、上記方法。
2. 工程（ii）において、細胞表面マーカーとしてCD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及びCD271(+)を用いる、請求項１に記載の方法。
3. 多能性幹細胞が人工多能性幹（iPS）細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載の方法で製造された、腎前駆細胞集団。
6. 腎前駆細胞を含む細胞集団から、下記：
   (a) CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   (b) CD9(-)、CD165(+)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   (c) CD9(-)、CD140a(+)、CD106(+)及びCD271(+)；
   (d) CD9(-)、CD140a(+)、CD165(+)及びCD271(+)；
   (e) CD55(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   (f) CD326(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   (g) CD9(-)、CD140a(+)及びCD271(+)；
   (h) CD9(-)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   (i) CD140a(+)、CD140b(+)及びCD271(+)；
   のいずれか１つの細胞表面マーカーの組合せを用いて細胞集団を選別する方法。
7. 細胞表面マーカーとして、CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及びCD271(+)を用いる、請求項６に記載の方法。
8. 腎前駆細胞が、多能性幹細胞から分化誘導した腎前駆細胞である、請求項６又は７に記載の方法。
9. 多能性幹細胞が人工多能性幹(iPS)細胞である、請求項８に記載の方法。
10. 多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、請求項８に記載の方法。
11. 請求項６〜１０のいずれかに記載の方法によって得られた細胞集団。