CN113201560B - 一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法 - Google Patents
一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113201560B CN113201560B CN202110490974.2A CN202110490974A CN113201560B CN 113201560 B CN113201560 B CN 113201560B CN 202110490974 A CN202110490974 A CN 202110490974A CN 113201560 B CN113201560 B CN 113201560B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- kidney precursor
- stem cell
- kidney
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 title claims abstract description 104
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 102
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000008439 repair process Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 151
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 34
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 30
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 25
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 14
- 101001126417 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102100030485 Platelet-derived growth factor receptor alpha Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 35
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 11
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 11
- FHYUGAJXYORMHI-UHFFFAOYSA-N SB 431542 Chemical compound C1=CC(C(=O)N)=CC=C1C1=NC(C=2C=C3OCOC3=CC=2)=C(C=2N=CC=CC=2)N1 FHYUGAJXYORMHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 claims description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- QQUXFYAWXPMDOE-UHFFFAOYSA-N kenpaullone Chemical compound C1C(=O)NC2=CC=CC=C2C2=C1C1=CC(Br)=CC=C1N2 QQUXFYAWXPMDOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 7
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 101001134782 Arabidopsis thaliana Precursor of CEP4 Proteins 0.000 claims description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101100243377 Mus musculus Pepd gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150029183 PEP4 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 5
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 9
- 206010061481 Renal injury Diseases 0.000 abstract description 5
- 208000037806 kidney injury Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 3
- 101100096242 Mus musculus Sox9 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 5
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 2
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010036426 SOX9 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000012083 SOX9 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004926 tubular epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0687—Renal stem cells; Renal progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/602—Sox-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/603—Oct-3/4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/65—MicroRNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，步骤如下：收集尿液，离心收集细胞并洗涤，然后重悬细胞；对悬浮细胞进行筛选，筛选得到含有CD9(‑)、CD106(+)、CD140a(+)和CD140b(+)细胞表面标志的SOX9阳性肾前体细胞；对筛选得到的肾前体细胞进行扩增培养；将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入扩增培养后的肾前体细胞中；将转入质粒后的细胞在诱导培养基和人胚胎干细胞培养基中培养，得到修复型多能肾前体干细胞库。本申请的修复型多能肾前体干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能，将其移植到病人体内，可起到重建肾小管结构、修复肾脏损伤的作用，且免疫原性不会改变，临床应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及细胞库构建技术领域，具体是一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法。
背景技术
肾脏为通过将由生物体内的代谢活动产生的有害物质等废物从血液中过滤而除去以谋求维持身体的健康而起作用的重要的器官之一。目前，急慢性肾脏疾病导致的肾功能衰竭严重威胁人类健康，困扰着全国近1.5亿肾病患者。传统的药物治疗和透析治疗难以逆转肾脏结构的损伤和肾功能的持续下降。在此情况下，除了异体肾移植手术外，基于成体组织干细胞(前体细胞)移植的再生医学新技术有望为临床上治疗这类疾病带来新的思路。所以，本申请欲构建一种多能干细胞库以用于急慢性肾脏疾病的治疗，具有重大的科学和临床意义。
发明内容
本发明就是为了解决现有技术中存在的问题，所提出了一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法。
本发明的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，是采用了如下的技术方案。
一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，包括以下步骤：
S1.收集尿液，离心收集细胞并洗涤，然后重悬细胞；
S2.对步骤S1得到的悬浮细胞进行筛选，筛选得到含有CD9(-)、CD106(+)、CD140a(+)和CD140b(+)细胞表面标志的SOX9阳性肾前体细胞；
S3.对步骤S2筛选得到的肾前体细胞进行扩增培养；
S4.将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入步骤S3扩增培养后的肾前体细胞中；
S5.将步骤S4转入质粒后的细胞在诱导培养基和人胚胎干细胞培养基中培养，得到修复型多能肾前体干细胞库。
通过采用上述技术方案，本申请从尿液来源的细胞群中筛选得到SOX9+肾前体细胞，再将其重新编程为多能性干细胞，最终得到修复型多能肾前体干细胞库，整个细胞库的构建过程简单，构建得到的多能肾前体干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。
具体的，本申请从尿液来源的细胞群中筛选得到SOX9+肾前体细胞，SOX9是一种转录因子，在急性肾损伤早期SOX9表达升高，在急性肾损伤28d后，SOX9依旧处于较高的表达水平，并且约有40％的SOX9+细胞在肾损伤后增殖并扩增。所以，SOX9+细胞具有很强的增殖和分化能力，可促进受损肾小管上皮细胞的修复，从而实现肾小管结构的重建、肾脏损伤的修复。
本申请再将筛选得到的SOX9+肾前体细胞诱导出干性，得到自我更新、增殖和分化能力进一步增强的SOX9+肾前体干细胞，肾前体干细胞在细胞形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、增殖能力、分化能力、拟胚胎和畸形瘤形成方面都与胚胎干细胞相似。而且，肾前体细胞经体外诱导成肾前体干细胞，再移植到病人体内，其免疫原性不会改变，相当于自体移植，从而避免了胚胎干细胞面临的伦理学问题和免疫排斥的问题。
另外，本申请将尿液作为肾前体细胞的来源，具有样本方便采集、易于大量获得、无创性等特点。
综上所述，本申请构建的修复型多能肾前体干细胞库具有很强的自我更新、高度增殖和多向分化的潜能，将其应用于急慢性肾脏疾病的治疗，可起到重建肾小管结构、修复肾脏损伤的作用，且有效解决了供体细胞来源问题，为肾内细胞移植技术提供一条新的途径。
可选的，步骤S1中，收集尿液并在2-8℃、400-500g条件下离心8-10min，去除上清后采用PBS溶液洗涤细胞，然后再次在2-8℃、400-500g条件下离心8-10min，去除上清后采用PBS溶液重悬细胞，重悬细胞的PBS溶液加入量与细胞的体积比为(500-1000):1。
通过采用上述技术方案，本申请对尿液进行简单离心、洗涤、重悬等操作得到含有肾前体细胞的细胞群，操作方法简单，最大程度的将尿液中的细胞进行收集，为后续的实验操作奠定基础。
可选的，步骤S2中，采用标记了CD106抗体、CD140a抗体和CD140b抗体以及SOX9抗体的磁珠对细胞进行正筛选，同时采用标记了CD9抗体的磁珠对细胞进行负筛选。
通过采用上述技术方案，本申请采用肾前体细胞表面标志物对尿液中的细胞群进行筛选，筛选得到含有CD9(-)、CD106(+)、CD140a(+)和CD140b(+)细胞表面标志的纯度较高的肾前体细胞，同时本申请还采用SOX9抗体对细胞群进行筛选，最终筛选得到SOX9阳性的肾前体细胞，其存在自我更新和分化潜能，能够用于急慢性肾脏疾病的治疗。
可选的，步骤S3中，将步骤S2筛选得到的肾前体细胞进行离心，采用培养基洗涤沉淀，再次离心后采用培养基重悬细胞，并在37℃5％CO2的条件下培养72-96h。
通过采用上述技术方案，本申请将筛选得到的肾前体细胞在诱导其干性之前进行常规培养，为后续将其诱导成多能干细胞奠定了基础，提高了细胞库构建的成功率。
可选的，所述培养基为含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F-12培养基。
通过采用上述技术方案，本申请在DMEM/F-12培养基中加入胎牛血清以及抗生素，一方面，提供了细胞增殖所需的营养物质和生长因子，另一方面防止了杂菌的生长，防止发生污染而影响最终的实验结果。
可选的，步骤S4中，所述表达多能干细胞诱导因子的质粒为含有OCT4和SOX2基因的PEP4质粒以及含有miR 302-367基因的PCEP4质粒。
通过采用上述技术方案，本申请将只含2种多能干细胞诱导因子基因的质粒与含有miR 302-367基因的质粒共同转入肾前体细胞中，在成功的获得诱导干细胞的同时，提高了编程的效率，还极大地降低了致瘤性。
可选的，步骤S4中，采用电转染的方式将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入步骤S3扩增培养后的肾前体细胞中；所述电转染的电压为200-300V，电击时间为200-300μs。
通过采用上述技术方案，本申请采用电穿孔法将质粒转入肾前体细胞中，电穿孔法转染的效率较高，且易于控制，可有效促进肾前体细胞向肾前体干细胞的转变。
可选的，步骤S4中，在与表达多能干细胞诱导因子的质粒混合前，采用DPBS溶液洗涤步骤S3扩增培养后的肾前体细胞，然后采用含0.25％胰酶的EDTA溶液对肾前体细胞进行消化，消化1-2min，再采用10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化；再在300-400g条件下离心3-4min，用DPBS溶液重悬细胞，使细胞密度控制在2-5×106个/ml。
通过采用上述技术方案，本申请在与表达多能干细胞诱导因子的质粒混合前，还对肾前体细胞进行预处理操作，提高了质粒转入肾前体细胞的效率，从而提高了肾前体细胞重编程的成功率。
可选的，步骤S5中，所述诱导培养基为含有5-AzadC、Kenpaullone、SB-431542、PD0325901和CHIR99021五种小分子化合物的人胚胎干细胞培养基；所述5-AzadC的终浓度为1.5-2μmol/L，Kenpaullone的终浓度为2.5-3μmol/L，SB-431542的终浓度为0.5-0.6μmol/L、PD0325901的终浓度为0.8-1μmol/L，CHIR99021的终浓度为1.5-2μmol/L。
通过采用上述技术方案，本申请向诱导培养基中加入五种小分子化合物，这五种小分子化合物可以通过不同途径提高重编程效率，可以单独或以不同组合发挥作用，同时还可以替代相关转录因子进行重编程及维持干细胞的多能性和自我更新，降低了由转录因子导致的致瘤性，提高了诱导多能干细胞的安全性。
可选的，步骤S5中，将转入质粒后的细胞在诱导培养基中诱导培养8-12d；然后在300-400g条件下离心3-4min，采用人胚胎干细胞培养基重悬细胞，继续培养15-18天，期间每天更换一次培养基。
通过采用上述技术方案，本申请将质粒转入后的细胞在诱导培养基中培养一段时间，再在普通培养基中培养一段时间，诱导培养基可以保证重编程的过程的顺利且完全地进行，普通培养基用于诱导多能干细胞的增殖培养，最终可得到具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能特性的修复型多能肾前体干细胞库，可用于急慢性肾脏疾病的治疗，促进干细胞在医学临床治疗方面的进一步发展。
本发明获得了如下有益效果。
1、本申请的修复型多能肾前体干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能，可起到重建肾小管结构、修复肾脏损伤的作用；
2、本申请将筛选得到SOX9+肾前体细胞经体外诱导成肾前体干细胞，再移植到病人体内，其免疫原性不会改变，从而避免了胚胎干细胞面临的伦理学问题和免疫排斥的问题；
3、本申请从尿液来源的细胞群中筛选得到SOX9+肾前体细胞，再将其重编程为多能性干细胞，最终得到修复型多能肾前体干细胞库，整个细胞库的构建过程简单，重编程效率较高，致瘤性较低，诱导多能干细胞的安全性较高；
4、本申请将尿液作为肾前体细胞的来源，具有样本方便采集、易于大量获得、无创性等特点。
附图说明
图1是本申请制备得到的肾前体干细胞标志物表达情况图。
具体实施方式
以下参照附图和实施例对本发明进行进一步的技术说明。
本申请的Kenpaullone、SB-431542购自上海芮晖化工科技有限公司；
本申请的5-AzadC、PD0325901购自Sigma-Aldrich公司；
本申请的CHIR99021购自Abcam中国公司；
本申请的人胚胎干细胞培养基为人胚胎干细胞培养基MTESR1，购自杭州百通生物技术有限公司；
本申请的CD9抗体、CD106抗体、CD140a抗体、CD140b抗体和SOX9抗体购自Abcam中国公司。
实施例1
一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，包括以下步骤：
S1.收集尿液并在2℃、400g条件下离心10min，去除上清后采用PBS溶液洗涤细胞，然后再次在2℃、400g条件下离心10min，去除上清后采用PBS溶液重悬细胞，重悬细胞的PBS溶液加入量与细胞的体积比为500:1；
S2.采用标记了CD106抗体、CD140a抗体和CD140b抗体以及SOX9抗体的磁珠对步骤S1得到的悬浮细胞进行正筛选，同时采用标记了CD9抗体的磁珠对细胞进行负筛选，筛选得到含有CD9(-)、CD106(+)、CD140a(+)和CD140b(+)细胞表面标志的SOX9阳性肾前体细胞；
S3.将步骤S2筛选得到的肾前体细胞进行离心，采用培养基洗涤沉淀，再次离心后采用培养基重悬细胞，并在37℃5％CO2的条件下培养72h；
所述培养基为含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F-12培养基；
S4.采用DPBS溶液洗涤步骤S3扩增培养后的肾前体细胞，然后采用含0.25％胰酶的EDTA溶液对肾前体细胞进行消化，消化1min，再采用10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化；再在300g条件下离心4min，用DPBS溶液重悬细胞，使细胞密度控制在2×106个/ml；
将含有OCT4和SOX2基因的PEP4质粒以及含有miR 302-367基因的PCEP4质粒与上述预处理后的肾前体细胞混合，在电压为200V，电击时间为300μs的条件下进行电转染，将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入肾前体细胞中；
S5.将步骤S4转入质粒后的细胞在诱导培养基中诱导培养12d，然后在300g条件下离心4min，再采用人胚胎干细胞培养基重悬细胞，继续培养15天，期间每天更换一次培养基，得到修复型多能肾前体干细胞库。
所述诱导培养基为含有5-AzadC、Kenpaullone、SB-431542、PD0325901和CHIR99021五种小分子化合物的人胚胎干细胞培养基；所述5-AzadC的终浓度为1.5μmol/L，Kenpaullone的终浓度为3μmol/L，SB-431542的终浓度为0.5μmol/L、PD0325901的终浓度为1μmol/L，CHIR99021的终浓度为1.5μmol/L。
实施例2
一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，包括以下步骤：
S1.收集尿液并在4℃、500g条件下离心8min，去除上清后采用PBS溶液洗涤细胞，然后再次在4℃、500g条件下离心8min，去除上清后采用PBS溶液重悬细胞，重悬细胞的PBS溶液加入量与细胞的体积比为1000:1；
S2.采用标记了CD106抗体、CD140a抗体和CD140b抗体以及SOX9抗体的磁珠对步骤S1得到的悬浮细胞进行正筛选，同时采用标记了CD9抗体的磁珠对细胞进行负筛选，筛选得到含有CD9(-)、CD106(+)、CD140a(+)和CD140b(+)细胞表面标志的SOX9阳性肾前体细胞；
S3.将步骤S2筛选得到的肾前体细胞进行离心，采用培养基洗涤沉淀，再次离心后采用培养基重悬细胞，并在37℃5％CO2的条件下培养96h；
所述培养基为含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F-12培养基；
S4.采用DPBS溶液洗涤步骤S3扩增培养后的肾前体细胞，然后采用含0.25％胰酶的EDTA溶液对肾前体细胞进行消化，消化2min，再采用10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化；再在400g条件下离心3min，用DPBS溶液重悬细胞，使细胞密度控制在5×106个/ml；
将含有OCT4和SOX2基因的PEP4质粒以及含有miR 302-367基因的PCEP4质粒与上述预处理后的肾前体细胞混合，在电压为300V，电击时间为200μs的条件下进行电转染，将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入肾前体细胞中；
S5.将步骤S4转入质粒后的细胞在诱导培养基中诱导培养8d，然后在400g条件下离心3min，再采用人胚胎干细胞培养基重悬细胞，继续培养18天，期间每天更换一次培养基，得到修复型多能肾前体干细胞库。
所述诱导培养基为含有5-AzadC、Kenpaullone、SB-431542、PD0325901和CHIR99021五种小分子化合物的人胚胎干细胞培养基；所述5-AzadC的终浓度为2μmol/L，Kenpaullone的终浓度为2.5μmol/L，SB-431542的终浓度为0.6μmol/L、PD0325901的终浓度为0.8μmol/L，CHIR99021的终浓度为2μmol/L。
实施例3
一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，包括以下步骤：
S1.收集尿液并在8℃、400g条件下离心8min，去除上清后采用PBS溶液洗涤细胞，然后再次在8℃、400g条件下离心8min，去除上清后采用PBS溶液重悬细胞，重悬细胞的PBS溶液加入量与细胞的体积比为500:1；
S2.采用标记了CD106抗体、CD140a抗体和CD140b抗体以及SOX9抗体的磁珠对步骤S1得到的悬浮细胞进行正筛选，同时采用标记了CD9抗体的磁珠对细胞进行负筛选，筛选得到含有CD9(-)、CD106(+)、CD140a(+)和CD140b(+)细胞表面标志的SOX9阳性肾前体细胞；
S3.将步骤S2筛选得到的肾前体细胞进行离心，采用培养基洗涤沉淀，再次离心后采用培养基重悬细胞，并在37℃5％CO2的条件下培养72h；
所述培养基为含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F-12培养基；
S4.采用DPBS溶液洗涤步骤S3扩增培养后的肾前体细胞，然后采用含0.25％胰酶的EDTA溶液对肾前体细胞进行消化，消化1min，再采用10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化；再在300g条件下离心3min，用DPBS溶液重悬细胞，使细胞密度控制在4×106个/ml；
将含有OCT4和SOX2基因的PEP4质粒以及含有miR 302-367基因的PCEP4质粒与上述预处理后的肾前体细胞混合，在电压为200V，电击时间为250μs的条件下进行电转染，将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入肾前体细胞中；
S5.将步骤S4转入质粒后的细胞在诱导培养基中诱导培养10d，然后在300g条件下离心3min，再采用人胚胎干细胞培养基重悬细胞，继续培养16天，期间每天更换一次培养基，得到修复型多能肾前体干细胞库。
所述诱导培养基为含有5-AzadC、Kenpaullone、SB-431542、PD0325901和CHIR99021五种小分子化合物的人胚胎干细胞培养基；所述5-AzadC的终浓度为1.8μmol/L，Kenpaullone的终浓度为2.5μmol/L，SB-431542的终浓度为0.5μmol/L、PD0325901的终浓度为1μmol/L，CHIR99021的终浓度为1.8μmol/L。
性能检测
检测多能肾前体干细胞中干细胞标志物的表达
收集实施例3中的SOX9阳性肾前体细胞和培养10代以上的肾前体干细胞，使用RNA提取试剂盒提取RNA并反转录成DNA，然后利用进行实时荧光PCR检测Oct4、Sox2、c-Myc、KLF4四种干细胞标志物基因。
实验结果见图1，从图1可以看出，以上四种干细胞标志物在SOX9阳性肾前体细胞中不表达或少量表达，而在多能肾前体干细胞中表达上调。以上结果表明，本申请的肾前体细胞成功的被重编程为多能肾前体干细胞，具有诱导多能干细胞典型的多能性标志物，具有多能性。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.收集尿液，离心收集细胞并洗涤，然后重悬细胞；
S2.对步骤S1得到的悬浮细胞进行筛选，筛选得到含有CD9(-)、CD106(+)、CD140a(+)和CD140b(+)细胞表面标志的SOX9阳性肾前体细胞；
S3.对步骤S2筛选得到的肾前体细胞进行扩增培养；
S4.将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入步骤S3扩增培养后的肾前体细胞中；所述表达多能干细胞诱导因子的质粒为含有OCT4和SOX2基因的PEP4质粒以及含有miR 302-367基因的PCEP4质粒；
S5.将步骤S4转入质粒后的细胞在诱导培养基和人胚胎干细胞培养基中培养，得到修复型多能肾前体干细胞库；所述诱导培养基为含有5-AzadC、Kenpaullone、SB-431542、PD0325901和CHIR99021五种小分子化合物的人胚胎干细胞培养基；所述5-AzadC的终浓度为1.5-2μmol/L，Kenpaullone的终浓度为2.5-3μmol/L，SB-431542的终浓度为0.5-0.6μmol/L、PD0325901的终浓度为0.8-1μmol/L，CHIR99021的终浓度为1.5-2μmol/L。
2.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S1中，收集尿液并在2-8℃、400-500g条件下离心8-10min，去除上清后采用PBS溶液洗涤细胞，然后再次在2-8℃、400-500g条件下离心8-10min，去除上清后采用PBS溶液重悬细胞，重悬细胞的PBS溶液加入量与细胞的体积比为(500-1000):1。
3.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S2中，采用标记了CD106抗体、CD140a抗体和CD140b抗体以及SOX9抗体的磁珠对细胞进行正筛选，同时采用标记了CD9抗体的磁珠对细胞进行负筛选。
4.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S3中，将步骤S2筛选得到的肾前体细胞进行离心，采用培养基洗涤沉淀，再次离心后采用培养基重悬细胞，并在37℃5％CO2的条件下培养72-96h。
5.根据权利要求4所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：所述培养基为含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F-12培养基。
6.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S4中，采用电转染的方式将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入步骤S3扩增培养后的肾前体细胞中；所述电转染的电压为200-300V，电击时间为200-300μs。
7.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S4中，在与表达多能干细胞诱导因子的质粒混合前，采用DPBS溶液洗涤步骤S3扩增培养后的肾前体细胞，然后采用含0.25％胰酶的EDTA溶液对肾前体细胞进行消化，消化1-2min，再采用10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化；再在300-400g条件下离心3-4min，用DPBS溶液重悬细胞，使细胞密度控制在2-5×106个/ml。
8.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S5中，将转入质粒后的细胞在诱导培养基中诱导培养8-12d；然后在300-400g条件下离心3-4min，采用人胚胎干细胞培养基重悬细胞，继续培养15-18天，期间每天更换一次培养基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110490974.2A CN113201560B (zh) | 2021-05-06 | 2021-05-06 | 一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110490974.2A CN113201560B (zh) | 2021-05-06 | 2021-05-06 | 一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113201560A CN113201560A (zh) | 2021-08-03 |
| CN113201560B true CN113201560B (zh) | 2023-05-30 |
Family
ID=77029869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110490974.2A Active CN113201560B (zh) | 2021-05-06 | 2021-05-06 | 一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113201560B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115322947B (zh) * | 2022-06-25 | 2024-02-09 | 同济大学 | 一种采用成体肾前体细胞经悬浮分化培养构建肾微器官的方法和应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102925409B (zh) * | 2012-11-19 | 2014-07-02 | 上海市第六人民医院 | 尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法和应用 |
| EP3348632B1 (en) * | 2015-09-11 | 2021-11-03 | Astellas Pharma Inc. | Method for producing kidney progenitor cells |
| CN107760654A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-03-06 | 广东艾时代生物科技有限责任公司 | 一种无血清、无饲养层的小鼠诱导多能干细胞的培养基及其方法 |
| CN112430567B (zh) * | 2019-08-20 | 2023-12-08 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | 一种尿源性肾干细胞的培养方法及其应用 |
| CN110684737B (zh) * | 2019-08-29 | 2021-06-18 | 中山大学中山眼科中心 | 一种rpe65基因突变患者的诱导多能干细胞 |
| CN111961640B (zh) * | 2020-04-27 | 2023-05-12 | 同济大学 | 一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法及培养体系 |
-
2021
- 2021-05-06 CN CN202110490974.2A patent/CN113201560B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113201560A (zh) | 2021-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20040235165A1 (en) | In vitro differentiation of adult stem cells | |
| CN114317443B (zh) | 乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法 | |
| CN114874982B (zh) | 一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法 | |
| CN112708591A (zh) | 一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基 | |
| CN113215094A (zh) | 逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 | |
| CN108588017B (zh) | 一种脐带间充质干细胞的扩增方法及其在关节炎上的应用 | |
| Coppes et al. | Stem cell therapy to reduce radiation-induced normal tissue damage | |
| CN102140438A (zh) | 猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法 | |
| CN113201560B (zh) | 一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法 | |
| CN103223194A (zh) | 一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法 | |
| CN113274411A (zh) | 经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用 | |
| CN109609461A (zh) | 一种原代肿瘤细胞分离培养方法 | |
| CN115820548A (zh) | 一种动物组织来源的凋亡囊泡的制备方法及其应用 | |
| JP2005287479A (ja) | 組織幹細胞採取方法及びそれを利用した装置 | |
| CN106282101A (zh) | 一种促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及应用 | |
| CN112755250A (zh) | 一种组织工程化周围神经组织及其制备方法 | |
| Lu et al. | Isolation and characterization of human muscle-derived cells | |
| CN105705631B (zh) | 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为造骨细胞的方法 | |
| CN116855448A (zh) | 一种干细胞外泌体制备方法、该方法制备的外泌体及在护肤方面的应用 | |
| CN116064373A (zh) | 一种小鼠肾类器官的培养基及其制备方法 | |
| CN116218762A (zh) | 肾小管类器官培养基及应用、肾小管类器官的培养方法 | |
| CN110628712B (zh) | 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用 | |
| Zhang et al. | Direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes | |
| Li et al. | Differentiating chondrocytes from peripheral blood-derived human induced pluripotent stem cells | |
| CN114292807A (zh) | 一种外泌体的提取方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |