CN116218762A - 肾小管类器官培养基及应用、肾小管类器官的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肾小管类器官培养基及应用、肾小管类器官的培养方法。本发明的肾小管类器官培养基对于肾小管类器官的生长有较好的支持和促进作用，7天左右即可获得典型的肾小管类器官，在体外较好的保留了患者来源的组织一致性和异质性，为进一步进行肾小管研究应用奠定了基础；本发明的肾小管类器官的培养方法，采用本发明的肾小管类器官培养基进行培养，能够有效的模拟肾小管组织，可为肾小管相关疾病发病机理、致病因素研究和正常肾小管组织药物毒性研究提供强大平台；本发明的培养方法步骤简便清晰，操作人员对培养结果影响较小，提高了培养结果的一致性，为后续大规模培养提供了便利条件。

Description

肾小管类器官培养基及应用、肾小管类器官的培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种肾小管类器官培养基及应用、肾小管类器官的培养方法。
背景技术
肾脏是人体的重要器官，能够清除体内代谢产物及某些废物、毒物，生成尿液，调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。肾脏同时还有内分泌功能，可以生成肾素、促红细胞生成素等物质。肾脏的这些功能，保证了机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行。其中，肾小管和肾小管间质构成肾脏的重要部分，并且是对损伤做出反应的主要部位，容易受到各种损伤，包括缺氧、感染、毒素、代谢紊乱和衰老的影响。越来越多的证据表明，肾小管上皮细胞在肾脏修复或进展为慢性肾脏疾病中发挥着重要的作用。
为了了解肾小管相关的肾脏疾病，并将这一知识转化为临床应用，迫切需要有代表性和稳定的临床前肾小管模型。目前，最普遍的临床前模型是小鼠模型和二维培养的细胞系。然而，这两种模型存在许多缺陷，阻碍了其临床应用。细胞系无法体现患者的异质性，因而无法从根本上代表肾脏相关疾病的复杂性；而人源肿瘤异种移植虽然可以保持遗传和原始肾脏疾病的组织学特点，但是小鼠基因特性、生长环境等与肾脏病患者不尽相同，这在很大程度上导致了其应用的局限性。
类器官是一种新发展的体外三维培养技术，与常规细胞系培养相比，类器官培养系统形成的组织结构和功能较为复杂，具有拟合度高、传代稳定、培养周期短、成功率高等优势，是目前理想的体外培养模式。由于其保持了亲本组织的关键特征，可以利用类器官进行药物筛选、疾病建模等，对个性化治疗做出贡献。因此，肾小管类器官的构建，对于研究肾小管相关肾脏疾病具有重要的意义，然而目前并没有较好的肾小管类器官构建的技术方案。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种肾小管类器官培养基及肾小管类器官的培养方法，以解决或至少部分解决现有技术中存在的技术问题。
第一方面，本发明提供了一种肾小管类器官培养基，包括基础培养基、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、pH缓冲剂、抗氧化剂、血清替代物、人重组蛋白、TGF-β受体抑制剂、生长因子、ROCK抑制剂。
优选的是，所述的肾小管类器官培养基，还包括原代细胞抗生素和青霉素/链霉素双抗。
优选的是，所述的肾小管类器官培养基，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12基础培养基；
和/或，所述pH缓冲剂为HEPES缓冲剂；
和/或，所述抗氧化剂为N-乙酰半胱氨酸；
和/或，所述血清替代物为B-27supplement；
和/或，所述人重组蛋白为R-Spondin-3；
和/或，所述TGF-β受体抑制剂为A83-01；
和/或，所述生长因子包括EGF、FGF-10；
和/或，所述ROCK抑制剂为Y27632。
优选的是，所述的肾小管类器官培养基，所述原代细胞抗生素为primocin。
优选的是，所述的肾小管类器官培养基，所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为1～3mM，所述HEPES缓冲剂的浓度为10～25mM、所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.5～2mM，所述B-27supplement的体积浓度为1～2％，所述R-Spondin-3的浓度为200～250ng/mL，所述A83-01的浓度为5～10μM，所述EGF的浓度为50～100ng/mL，所述FGF-10的浓度为50～100ng/mL，所述Y27632的浓度为5～10μM，所述primocin的浓度为80～120μg/mL，所述青霉素/链霉素双抗的浓度为50～100IU/mL。
第二方面，本发明还提供了一种所述的肾小管类器官培养基在培养肾小管类器官中的应用。
第三方面，本发明还提供了一种肾小管类器官的培养方法，采用所述的肾小管类器官培养基进行培养。
优选的是，所述的肾小管类器官的培养方法，包括以下步骤：
获取肾组织样本；
对肾组织样本进行清洗、消化、重悬，得到肾细胞沉淀；
将肾小管类器官培养基与肾细胞沉淀混合，得到细胞溶液；
将细胞溶液与Matrigel基质胶混合，然后接种至孔板中，接种完成后，静置直至Matrigel基质胶凝固；
待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养，即得肾小管类器官。
优选的是，所述的肾小管类器官的培养方法，对肾组织样本进行清洗、消化、重悬，得到肾细胞沉淀，具体包括以下步骤：
将肾组织样本剪碎后，使用含有青霉素/链霉素双抗的DPBS溶液清洗；
向清洗后的肾组织样本中加入胰酶消化液，并于37℃、体积浓度为5％的CO2培养箱中消化40～50min，再加入AdvancedDMEM/F12基础培养基终止消化，再经过离心分离，弃掉上清液，收集沉淀，即得肾细胞沉淀。
优选的是，所述的肾小管类器官的培养方法，若所得肾细胞沉淀为红色，在将肾小管类器官培养基与肾细胞沉淀混合之前还包括：向沉淀中加入红细胞裂解液，孵育，再次离心分离，弃掉上清液，收集沉淀，即得肾细胞沉淀；
将细胞溶液与Matrigel基质胶混合的步骤中，细胞溶液与Matrigel基质胶的体积比为(1～2):(1～2)；
待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养的步骤中，培养调节为：37℃、体积浓度为5％的CO2环境下培养；
待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养，每2～3d更换肾小管类器官培养基。
本发明的肾小管类器官培养基及应用、肾小管类器官的培养方法相对于现有技术具有以下有益效果：
1、本发明的肾小管类器官培养基，包括：基础培养基、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、pH缓冲剂、抗氧化剂、血清替代物、人重组蛋白、TGF-β受体抑制剂、生长因子、ROCK抑制剂；本发明的培养基对于肾小管类器官的生长有较好的支持和促进作用，7天左右即可获得典型的肾小管类器官，在体外较好的保留了患者来源的组织一致性和异质性，为进一步进行肾小管研究应用奠定了基础；
2、本发明的肾小管类器官的培养方法，采用本发明的肾小管类器官培养基进行培养，能够有效的模拟肾小管组织，可为肾小管相关疾病发病机理、致病因素研究和正常肾小管组织药物毒性研究提供强大平台；本发明的培养方法步骤简便清晰，操作人员对培养结果影响较小，提高了培养结果的一致性，为后续大规模培养提供了便利条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中肾小管类器官培养基中培养第7天的肾小管类器官光学显微镜下的形态图；其中，放大倍数为100倍；
图2为本发明实施例2中肾小管类器官培养基中稳定培养第60天的肾小管类器官光学显微镜下的形态图；其中，放大倍数为200倍；
图3为本发明实施例2中肾小管类器官HE染色及免疫组化结果图；
图4～5为本发明实施例2中肾小管类器官透射电镜结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
本申请实施例提供了一种肾小管类器官培养基，包括：基础培养基、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、pH缓冲剂、抗氧化剂、血清替代物、人重组蛋白、TGF-β受体抑制剂、生长因子、ROCK抑制剂。
本发明的培养基对于肾小管类器官的生长有较好的支持和促进作用，7天左右即可获得典型的肾小管类器官，在体外较好的保留了患者来源的组织一致性和异质性，为进一步进行肾小管研究应用奠定了基础。
在一些实施例中，肾小管类器官培养基，还包括原代细胞抗生素和青霉素/链霉素双抗(penicillin/streptomycin)。
在一些实施例中，基础培养基为DMEM/F12基础培养培养基，具体为AdvancedDMEM/F12。
在一些实施例中，pH缓冲剂为HEPES缓冲剂。
在一些实施例中，抗氧化剂为N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)。
在一些实施例中，血清替代物为B-27supplement。
在一些实施例中，人重组蛋白为R-Spondin-3。
在一些实施例中，TGF-β受体抑制剂为A83-01。
在一些实施例中，生长因子包括EGF、FGF-10。
在一些实施例中，ROCK抑制剂为Y27632。
在一些实施例中，原代细胞抗生素为primocin。
具体的，Advanced DMEM/F12基础培养基作为溶剂，在基础培养基的基础上加入L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、pH缓冲剂、抗氧化剂、血清替代物、人重组蛋白、TGF-β受体抑制剂、生长因子、ROCK抑制剂、青霉素/链霉素双抗，即得本申请的肾小管类器官培养基。
本发明的肾小管类器官培养基，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、HEPES、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸、血清替代物为基础养分；其中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMax)是细胞培养的添加剂，可以改善细胞活力和生长情况，防止在长期培养过程中谷氨酰胺的降解和氨的积累；HEPES为细胞培养常用的两性离子有机化学缓冲剂，N-乙酰半胱氨酸为抗氧化剂，B-27为血清替代物；人重组蛋白为R-Spondin-3、A83-01为信号通路因子；R-Spondin-3为wnt/β-catenin信号通路的正向调节剂，研究表明，其对肾脏稳态和修复至关重要；A83-01是TGF-βI型受体ALK5/ALK4/ALK7的有效抑制剂，能够防止生长停滞和上皮间质转化；本发明的肾小管类器官的培养基，其中含有EGF、FGF-10两种因子，EGF(表皮细胞生长因子)是一种有效的生长因子，可刺激各种表皮和上皮细胞的增殖；FGF-10(成纤维细胞生长因子)在肝脏、肾脏发育过程中发挥重要作用，可促进上皮细胞增殖；抑制剂Y27632是人类ROCK-1和ROCK-2同工酶的高效抑制剂，能够阻止细胞衰亡，同时能够提高传代时类器官的存活率；肾小管类器官培养基中还包括抗菌成分primocin和青霉素/链霉素双抗，其中primocin是用于保护原代细胞免受微生物污染的抗生素，对细菌、支原体和真菌均有杀伤作用；青霉素/链霉素双抗对革兰阳性细菌和革兰阴性细菌具有有效的联合抗菌作用，可用于防止细胞培养受到细菌污染。进一步确保该培养基能够有利于肾小管类器官的培养。
在一些实施例中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为1～3mM，HEPES缓冲剂的浓度为10～25mM、N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.5～2mM，B-27supplement的体积浓度为1～2％，R-Spondin-3的浓度为200～250ng/mL，A83-01的浓度为5～10μM，EGF的浓度为50～100ng/mL，FGF-10的浓度为50～100ng/mL，Y27632的浓度为5～10μM，primocin的浓度为80～120μg/mL，青霉素/链霉素双抗的浓度为50～100IU/mL。
基于同一发明构思，本发明还提供了一种上述的肾小管类器官培养基在培养肾小管类器官中的应用。
基于同一发明构思，本发明还提供了一种肾小管类器官的培养方法，采用上述的肾小管类器官培养基进行培养。
在一些实施例中，肾小管类器官的培养方法，包括以下步骤：
S1、获取肾组织样本；
S2、对肾组织样本进行清洗、消化、重悬，得到肾细胞沉淀；
S3、将肾小管类器官培养基与肾细胞沉淀混合，得到细胞溶液；
S4、将细胞溶液与Matrigel基质胶混合，然后接种至孔板中，接种完成后，静置直至Matrigel基质胶凝固；
S5、待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养，即得肾小管类器官。
在一些实施例中，步骤S1具体为：手术切除的肾脏尿路上皮癌(经病理确诊)标本，肾盂部见一枚4.5×2×1cm的肿瘤，用无菌手术刀在远离肿瘤部位的大体肾脏标本中切下3mm3左右的正常肾组织，即得到肾组织样本。
在一些实施例中，步骤S2具体包括以下步骤：
S21、将肾组织样本剪碎后，使用含有青霉素/链霉素双抗的DPBS溶液清洗；
S22、向清洗后的肾组织样本中加入3～7mL胰酶消化液，并于37℃、体积浓度为5％的CO2培养箱中消化40～50min，再加入Advanced DMEM/F12基础培养基终止消化，再经过离心分离，弃掉上清液，收集沉淀，即得肾细胞沉淀。
在一些实施例中，若所得肾细胞沉淀为红色，在将肾小管类器官培养基与肾细胞沉淀混合之前还包括：向沉淀中加入1～2mL红细胞裂解液，孵育，再次离心分离，弃掉上清液，收集沉淀，即得肾细胞沉淀；若，消化、重悬，得到肾细胞沉淀不呈红色时，则直接进行步骤S3。
在一些实施例中，将细胞溶液与Matrigel基质胶混合的步骤中，细胞溶液与Matrigel基质胶的体积比为(1～2):(1～2)，优选的，体积比为1:1。
在一些实施例中，待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养的步骤中，培养调节为：37℃、体积浓度为5％的CO2环境下培养。
在一些实施例中，待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养，每2～3d更换新的肾小管类器官培养基，培养7d即得肾小管类器官。
在一些实施例中，步骤S22中，再经过离心分离，弃掉上清液，收集沉淀，即得肾细胞沉淀，其中，离心条件为：4℃、300g、离心5min。
在一些实施例中，向沉淀中加入1～2mL红细胞裂解液，孵育，再次离心分离，弃掉上清液，收集沉淀，即得肾细胞沉淀，其中，离心条件为：300g、离心5min。
本发明的肾小管类器官的培养方法，能够有效的模拟肾小管组织，可为肾小管相关疾病发病机理、致病因素研究和正常肾小管组织药物毒性研究提供强大平台；本发明的培养方法步骤简便清晰，操作人员对培养结果影响较小，提高了培养结果的一致性，为后续大规模培养提供了便利条件。
以下进一步以具体实施例说明本申请的肾小管类器官培养基、肾小管类器官的培养方法。本部分结合具体实施例进一步说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。如未特别说明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
本申请实施例提供了一种肾小管类器官培养基，包括：基础培养基、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、pH缓冲剂、抗氧化剂、血清替代物、人重组蛋白、TGF-β受体抑制剂、生长因子、ROCK抑制剂、原代细胞抗生素和青霉素/链霉素双抗；
其中，基础培养基为Advanced DMEM/F12，pH缓冲剂为HEPES缓冲剂，抗氧化剂为N-乙酰半胱氨酸，血清替代物为B-27supplement，人重组蛋白为R-Spondin-3，TGF-β受体抑制剂为A83-01，生长因子包括EGF、FGF-10，ROCK抑制剂为Y27632，原代细胞抗生素为primocin；
具体的，肾小管类器官培养基各组分的名称、供应厂商、以及终浓度如下表1所示。
表1-肾小管类器官培养基各组分的名称、供应厂商、以及终浓度
Figure BDA0004140910980000101
Figure BDA0004140910980000111
实施例2
本申请实施例还提供了一种肾小管类器官的培养方法，采用实施例1中的肾小管类器官培养基进行培养，所有操作相关步骤均在生物安全柜中进行，保持无菌操作，具体包括以下步骤：
S1、获取肾组织：手术切除的肾脏尿路上皮癌(经病理确诊)标本，肾盂部见一枚4.5×2×1cm的肿瘤，用无菌手术刀在远离肿瘤部位的大体肾脏标本中切下3mm3左右的正常肾组织，得到肾组织样本；
S2、将S1中肾组织样本放置在培养皿中，使用含有100IU/mL青霉素/链霉素双抗的DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)溶液清洗对肾组织样本反复清洗，洗走血液，直至清洗液澄清，同时除去培养皿中残留的DPBS溶液；
S3、向培养皿中加入2mLAdvanced DMEM/F12基础培养基，并将红色肾组织剪碎为1mm3的碎块；
S4、将S3中肾组织块转移到50mL离心管中，并向离心管中添加5mL的胰酶消化液，并在体积浓度为5％的CO2、37℃的摇床中消化45min；
S5、再向S4中离心管中加入20mL Advanced DMEM/F12基础培养基终止消化，将消化后的组织和细胞悬液，经过孔径为70μm的细胞过滤筛研磨，然后于4℃、300g下离心5min，弃上清液，得到肾组织细胞沉淀；
S6、向S5中的肾组织细胞沉淀中加入2mL红细胞裂解液；再使用移液枪上下吹打，常温(25℃)孵育2min；孵育结束后于4℃、300g下离心5min，弃上清液后得到的细胞沉淀即为肾细胞沉淀；
S7、将实施例1中的肾小管类器官培养基与S6中肾细胞沉淀混合得到细胞溶液，再将细胞溶液与的Matrigel基质胶按体积1:1的比例进行混合，混合后，按每孔50μL的体积接种到超低吸附24孔板中进行胶滴接种；
S8、接种完成后，在37℃培养箱中静置30min直至Matrigel基质胶凝固；
S9、待Matrigel基质胶凝固后，每孔加入经过37℃预热的500μL实施例1中的肾小管类器官培养基，置于37℃、体积浓度为5％CO2的细胞培养箱中培养；
S10、每3天更换新的肾小管类器官培养基，培养7天后得到肾小管类器官。
按照实施例2中的培养方法，培养7天后得到肾小管类器官，肾小管类器官在显微镜下的形态如图1所示，可见大量管状结构出现，管腔形态较一致，可见管腔内圆形规则分布的细胞核。
实施例2中得到的肾小管类器官可在培养7～14天进行传代，多次传代后仍然可以稳定生长，肾小管类器官在实施例1中的肾小管类器官培养基中培养60天后显微镜下的形态如图2所示。从图2中可见迂曲、袢状的管状结构，可见小管分支，及数量不等的细胞核。
对实施例2中得到的肾小管类器官包埋切片后进行常规HE染色和免疫组化染色，检测标志物包括PAX8、CK7、CAM5.2、CD10、EMA的表达，结果如图3所示。
从图3中可以看出，HE染色显示分支状迷路样管状结构相互融合形成器官样结构，胞核位于管腔周边部；PAX8为肾上皮胞核特异性标记物，弥漫着色，分布于肾小管周边基底部；CK7、CAM5.2、CD10、EMA阳性，是上皮细胞特有标志物，证实肾小管上皮细胞免疫组化特异性。
对实施例2中的肾小管类器官包埋切片后进行透射电镜分析，结果如图4和图5所示。从图4～5可以看见明显的管腔结构，上皮细胞为立方形，细胞核圆，有核仁，近基底部，胞质内见到丰富的线粒体，细胞侧面见侧突，上皮细胞腔面有刷状缘。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肾小管类器官培养基，其特征在于，包括基础培养基、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、pH缓冲剂、抗氧化剂、血清替代物、人重组蛋白、TGF-β受体抑制剂、生长因子、ROCK抑制剂。
2.如权利要求1所述的肾小管类器官培养基，其特征在于，还包括原代细胞抗生素和青霉素/链霉素双抗。
3.如权利要求1～2任一所述的肾小管类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12基础培养基；
和/或，所述pH缓冲剂为HEPES缓冲剂；
和/或，所述抗氧化剂为N-乙酰半胱氨酸；
和/或，所述血清替代物为B-27supplement；
和/或，所述人重组蛋白为R-Spondin-3；
和/或，所述TGF-β受体抑制剂为A83-01；
和/或，所述生长因子包括EGF、FGF-10；
和/或，所述ROCK抑制剂为Y27632。
4.如权利要求3所述的肾小管类器官培养基，其特征在于，所述原代细胞抗生素为primocin。
5.如权利要求4所述的肾小管类器官培养基，其特征在于，所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为1～3mM，所述HEPES缓冲剂的浓度为10～25mM、所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.5～2mM，所述B-27supplement的体积浓度为1～2％，所述R-Spondin-3的浓度为200～250ng/mL，所述A83-01的浓度为5～10μM，所述EGF的浓度为50～100ng/mL，所述FGF-10的浓度为50～100ng/mL，所述Y27632的浓度为5～10μM，所述primocin的浓度为80～120μg/mL，所述青霉素/链霉素双抗的浓度为50～100IU/mL。
6.一种如权利要求1～5任一所述的肾小管类器官培养基在培养肾小管类器官中的应用。
7.一种肾小管类器官的培养方法，其特征在于，采用如权利要求1～5任一所述的肾小管类器官培养基进行培养。
8.如权利要求7所述的肾小管类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取肾组织样本；
对肾组织样本进行清洗、消化、重悬，得到肾细胞沉淀；
将肾小管类器官培养基与肾细胞沉淀混合，得到细胞溶液；
将细胞溶液与Matrigel基质胶混合，然后接种至孔板中，接种完成后，静置直至Matrigel基质胶凝固；
待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养，即得肾小管类器官。
9.如权利要求8所述的肾小管类器官的培养方法，其特征在于，对肾组织样本进行清洗、消化、重悬，得到肾细胞沉淀，具体包括以下步骤：
将肾组织样本剪碎后，使用含有青霉素/链霉素双抗的DPBS溶液清洗；
向清洗后的肾组织样本中加入胰酶消化液，并于37℃、体积浓度为5％的CO2培养箱中消化40～50min，再加入AdvancedDMEM/F12基础培养基终止消化，再经过离心分离，弃掉上清液，收集沉淀，即得肾细胞沉淀。
10.如权利要求9所述的肾小管类器官的培养方法，其特征在于，若所得肾细胞沉淀为红色，在将肾小管类器官培养基与肾细胞沉淀混合之前还包括：向沉淀中加入红细胞裂解液，孵育，再次离心分离，弃掉上清液，收集沉淀，即得肾细胞沉淀；
将细胞溶液与Matrigel基质胶混合的步骤中，细胞溶液与Matrigel基质胶的体积比为(1～2):(1～2)；
待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养的步骤中，培养调节为：37℃、体积浓度为5％的CO2环境下培养；
待Matrigel基质胶凝固后，再加入肾小管类器官培养基进行培养，每2～3d更换肾小管类器官培养基。
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