CN110663648A - 一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法。它包括1)临床筛选；2)组织处理；3)实验动物准备；4)中空纤维管预处理；5)组织预处理；6)细胞装填；7)小鼠移植，等步骤。该方法通过将癌症患者手术后的肿瘤组织装填到中空纤维管中，再移植至免疫缺陷鼠中，使小鼠成瘤，以便检测药物治疗效果，构建人癌组织的中空纤维测试法模型。该方法有效的解决了抗癌药物体内筛选的方法学问题，具有高通量(一次可以筛选多种肿瘤细胞、肿瘤组织)、实验周期短，动物和受试药物用量少，可提供全真体内环境等优点，为临床上抗肿瘤药物筛选、肿瘤与癌症的个性化治疗提供了精准的评价平台。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，涉及动物模型的建立方法，具体涉及一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法。
背景技术
人类癌症的治疗是医学领域的世界性难题之一。为了寻找这一难题的解决之道，各种新的治疗方法如抗肿瘤药物，放射治疗，和基因治疗层出不穷，并且已经进行了大量的临床前研究。肿瘤实验动物模型的建立为研究其发病机制、生物学特性和各种治疗方法的检测提供了高度模拟的工具。基于人体试验的伦理方面及实际应用的考虑，精准快速的动物模型对于肿瘤药物研发至关重要。制药公司和研究机构在肿瘤治疗新药的开发过程中消耗大量资源，最佳动物体内模型的选择可以改进或缩短研发进程。随着技术手段的不断革新，肿瘤治疗模式正在向精准、个体化改变，其主要内涵是根据患者的异常特征，为患者选择有效的治疗方案。目前，缺乏快速有效的筛选与验证平台是肿瘤分子标志物研究的瓶颈所在。
中空纤维测试法(Hollow Fiber Assay，HFA)是美国癌症研究所(NationalCancer Institute，NCI)研究的一种药物体内筛选模型。它是一种快速的体内分析技术，使用具有良好生物相容性的半渗纤维膜聚偏氟乙烯(PVDF)材质，内径0.5-1mm，长2cm，可截留分子量500,000Da。蛋白和营养物质可以渗透进入，但细胞不能通过，可以作为细胞支撑生长的媒介，把人源和动物来源的细胞分离。同时经过尾静脉给药或口服给药或腹腔给药，更贴近药物在体内给药途径，不同于体外，药物直接加入细胞培养基内。与传统移植瘤法(比如PDX模型)相比，该方法可以同时在一只小鼠中植入多种不同来源的组织，动物用量少。皮下埋管后，3天即可给药，7天后可以将中空纤维管取出，检测药效，实验周期短。也可以大大减少待测药物的用量，可提供全真体内环境。
基于上述介绍，我们将癌症病人的组织样本与中空纤维测试法动物模型相结合，构建出一套相对完整的实验方法，用以测试针对癌症病人的个体化用药策略，未来实现人-鼠联合临床试验，以用于精准治疗研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法；它是将癌症病人的组织样本与中空纤维测试法动物模型相结合，构建出一套相对完整的动物模型实验方法，用以测试针对癌症病人的个体化用药策略，未来实现人-鼠联合临床试验，以用于精准治疗研究。
本发明的技术方案如下：
一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)临床筛选：收集各种实体瘤病人的原发灶新鲜手术标本组织；
2)组织处理：将组织切分成几部分，一部分固定在4％多聚甲醛中，一部分置于含至少20％胎牛血清的细胞培养基中，该部分需2小时内做后续处理；
此步骤中，培养基中加的胎牛血清要比常规量(10％)高，以使组织有更多的营养存活，且新鲜组织进行后续处理越快越好；
3)实验动物准备：SPF级免疫缺陷鼠，雌性，6-8周龄；
4)中空纤维管预处理：将中空纤维管截成适宜的长度，浸泡于70％酒精中室温放置72h以上；然后用去离子水逐一冲洗中空纤维管内壁3次，浸泡于去离子水中24h以上；高温高压消毒灭菌，4℃冷藏保存待用；
该步骤中，中空纤维管长度一般小于2cm；
5)组织预处理：用无菌手术刀将新鲜病人来源肿瘤组织切成适宜大小的碎片，并用无血清细胞培养基洗涤至少三次，然后用含EDTA的胰酶进行消化片刻，取上清过无菌滤膜，该无菌滤膜的孔径小于0.22μm，得到细胞悬液转移至含胎牛血清的细胞培养基中；
该步骤中，该无菌滤膜的孔径小于0.22μm，若孔径超过此值就不能有效过滤一些杂质和杂菌了；
6)细胞装填：用无菌注射器将细胞悬液注入中空纤维管内。截成小段两端热封，放入盛有完全培养基的六孔板中，置CO2培养箱中培养24h；
7)小鼠移植：小鼠腹腔注射浓度50mg/kg戊巴比妥钠适量，麻醉固定；侧腹部皮肤用75％酒精消毒，于一侧上背部附近用无菌手术剪剪出约2mm大小的皮肤破口，皮下植入装有肿瘤样本的中空纤维管，夹闭伤口；最后于皮肤破口滴加100×双抗(青霉素/链霉素)适量；将小鼠放回笼中，自然苏醒，用以后续的药物处理干预方案。
所述一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤1)中的实验材料为实体瘤病人原发灶新鲜手术标本组织，包括生殖泌尿系统肿瘤、胃癌、喉癌、鼻咽癌、皮肤癌、骨癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、上皮细胞癌；且取材时需获取患者的知情同意以及伦理委员会的许可。该步骤中，选取人实体瘤样本而非液体瘤(如白血病等)样本，以便形成实际的肿瘤组织再进行后续的处理，其次是最好选取易成瘤的上皮细胞癌组织，成瘤快，成瘤影响因素少。
所述一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤2)、5)和6)中使用的细胞培养基多为RPMI1640培养基或高糖DMEM。该步骤中，培养基可为细胞提供营养，包含促使细胞生殖增殖的基础物质，包括氨基酸、维生素、碳水化合物以及一些无机离子，不同种类间成分只有微小的差别：一般情况下，RPMI 1640培养基广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，主要用于悬浮细胞培养，是使用最广泛的培养基。高糖DMEM可用于许多哺乳动物细胞培养，更适合高密度悬浮细胞培养，适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养。本方法中用于培养的是人肿瘤组织消化后的细胞悬液，不需要附着点，又能提供细胞生长所需要的营养，故最好用RPMI1640培养基。
所述一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤3)中免疫缺陷鼠可为裸鼠Balb/C(nu/nu)或者非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠。该步骤中，只有生命体征正常没有其他疾病或者畸形的先天免疫缺陷鼠才能接种人来源的肿瘤细胞，减少排异反应，稳定表征。
所述一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤4)中空纤维管为分子截留值小于500kDa，内径小于500nm的PVDF管(示例生产厂家为美国Spectrum Medical公司)。作为人源肿瘤细胞的载体，选择中空纤维管而不是直接接种到鼠体内，主要是可以实现多种类型细胞的同时接种，保持相对独立的生长环境，也便于直接取出做后续实验检测，选取的分子截留值和内径主要是根据一般体细胞直径(细胞的平均直径在10-200μm之间)以及血液血小板分子(2μm左右)大小为参考。
所述一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于：该方法用途上有两部分：一是为癌症病人试药；二为药物研发企业提供药物筛选模型。
本发明有益效果为：
1、本发明藉由上述技术方案构建出一套相对完整的将癌症病人的组织样本与中空纤维测试法动物模型相结合的动物模型实验方法，用以测试针对癌症病人的个体化用药策略，一是为癌症病人试药；二为药物研发企业提供药物筛选模型。未来实现人-鼠联合临床试验，以用于精准治疗研究。
2、本发明的创新还在于造模之间较短：中空纤维管中装填组织而非细胞，皮下埋管后，3天即可给药，7天后可以将中空纤维管取出，检测药效，实验周期短，也可以大大减少待测药物的用量。
附图说明
图1人源胃癌组织来源的细胞装填入中空纤维管后，分别移植入NSG小鼠皮下，7天后处死小鼠，解剖观察移植结果；
图2中空纤维管取出后放置培养皿中进行胰酶消化，去除管外附着小鼠基质细胞，观察管内组织细胞活性；
图3石蜡固定、HE染色观察管内和管外的细胞形态。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合附图，通过实施例，对本发明技术方案作进一步具体描述：
1.实验材料
1.1.实验动物
裸鼠Balb/CSPF级，雌性，6-8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK(沪)2007-(8)05。
1.2.试剂
RPM-1640培养基：吉诺生物医药技术有限公司；
胎牛血清：美国Gibco公司。
1.3.仪器
37℃CO2恒温培养箱：BINDER，德国；
Heal Force超净工作台：力康生物医疗科技控股有限公司；
倒置相差显微镜：ZEISS，德国；
-80℃超低温冰箱：海尔公司；
PVDF管，分子截留值58kDa，内径1.0mm(美国Spectrum Medical公司)。
2.方法
2.1.细胞培养
用无菌手术刀将新鲜胃癌病人组织切成适宜大小的碎片，并用无血清细胞培养基洗涤3次，然后用含EDTA的胰酶消化3min，取上清过0.22μm无菌滤膜，得到细胞悬液转移至含10％胎牛血清的RPM-1640细胞培养基中。
2.2.中空纤维管预处理
将中空纤维管截成适宜长度，去除严重折损部分，70％酒精冲洗3次，然后浸泡于70％酒精中，室温放置72h。去离子水逐一冲洗中空纤维管内壁3次，浸泡于去离子水中放置24h。高温高压消毒灭菌40min，4℃冷藏待用。
2.3.细胞装填及移植
实验前一天，排出中空纤维管内液体，放入盛有完全RPM-1640培养基的培养皿中。将处于对数生长期肿瘤细胞，换半液。第二天收集细胞，1,000r/min，4℃离心5min，去上清，加入适量条件培养基，细胞计数，调整细胞至合适浓度，置于冰盒中备用。用无菌注射器抽取细胞悬液，注入中空纤维管内。两端热封，每隔2cm进行热封，截成小段，放入盛有完全培养基的六孔板中，置CO2培养箱中培养24h。小鼠腹腔注射50mg/kg戊巴比妥钠，麻醉，固定。消毒小鼠侧腹部皮肤，于一侧上背部附近用无菌手术剪剪出约2mm大小的皮肤破口，皮下植入装有肿瘤样本的中空纤维管，夹闭伤口。最后于皮肤破口滴加100×双抗(青霉素/链霉素)适量。将小鼠放回笼中，自然苏醒。
2.4石蜡固定、HE染色观察管内和管外的细胞形态
2.4.1组织处理与石蜡固定
(1)脱臼处死荷瘤裸鼠，取出肿瘤组织，用10％中性福尔马林固定24小时。
(2)用无菌手术剪去除肿瘤组织内坏死部分，用自动脱水仪进行脱水(甲醛固定液浸泡10min，水洗10min，70％酒精浸泡45min，80％酒精浸泡45min，90％酒精浸泡45min，100％酒精I浸泡45min，100％酒精II浸泡45min)、透明(二甲苯透明I 20min，二甲苯透明II20min，二甲苯透明III 30min)、浸蜡(浸蜡I 30min，浸蜡II30min，浸蜡III 45min)等程序。
(3)包埋盒包埋。
(4)用切片机将制成的蜡块切成4μm厚切片，依次展片、贴片，再于60℃烘2小时。
2.4.2HE染色
(1)脱蜡：二甲苯I浸泡10min，二甲苯II浸泡10min，100％乙醇浸泡3min，95％乙醇浸泡3min，85％乙醇浸泡3min，75％乙醇浸泡3min，自来水洗。
(2)染色：苏木精浸染4min，自来水洗，1％盐酸乙醇分化5s，自来水洗，蓝化(50℃温水)5min，伊红浸染3min。
(3)脱水、透明、封片：85％乙醇浸泡1min，95％乙醇浸泡l min，100％乙醇I浸泡lmin，100％乙醇II浸泡l min，二甲苯-石碳酸液(3:1)l min，二甲苯I浸泡2min，二甲苯II浸泡2min，滴中性树胶，盖盖玻片。
对上述实验进行验证：
1)于第7天取出中空纤维管，放入六孔板中进行胰酶消化，去除外部小鼠基质细胞，转移到新的六孔板中，将热封口剪开，用注射器排出管内肿瘤组织，在六孔板中培养后，消化后培养后，显微镜下观察细胞活力，细胞生长旺盛，可以迅速繁殖(图1)。
2)管内和管外的细胞形态情况：管内部为人源性肿瘤细胞，细胞数多，状态好，活力高。管外部：为管内肿瘤细胞提供营养的小鼠基质细胞，被管子隔离，不会与管子内部的肿瘤细胞直接作用，无排异反应，可以快速筛药(图2)。
3)石蜡固定、HE染色观察管内和管外的细胞形态，管内部为人源性肿瘤细胞，细胞数多，状态好，活力高。管外部：为管内肿瘤细胞提供营养的小鼠基质细胞，被管子隔离，不会与管子内部的肿瘤细胞直接作用(图3)。
Claims (6)
1.一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)临床筛选：收集各种实体瘤病人的原发灶新鲜手术标本组织；
2)组织处理：将组织切分成几部分，一部分固定在4％多聚甲醛中，一部分置于含至少20％胎牛血清的细胞培养基中，该部分需2小时内做后续处理；
3)实验动物准备：SPF级免疫缺陷鼠，雌性，6-8周龄；
4)中空纤维管预处理：将中空纤维管截成适宜的长度，浸泡于70％酒精中室温放置72h以上；然后用去离子水逐一冲洗中空纤维管内壁3次，浸泡于去离子水中24h以上；高温高压消毒灭菌，4℃冷藏保存待用；
5)组织预处理：用无菌手术刀将新鲜病人来源肿瘤组织切成适宜大小的碎片，并用无血清细胞培养基洗涤至少三次，然后用含EDTA的胰酶进行消化片刻，取上清过无菌滤膜，该无菌滤膜的孔径小于0.22μm，得到细胞悬液转移至含胎牛血清的细胞培养基中；
6)细胞装填：用无菌注射器将细胞悬液注入中空纤维管内。截成小段两端热封，放入盛有完全培养基的六孔板中，置CO2培养箱中培养24h；
7)小鼠移植：小鼠腹腔注射浓度50mg/kg戊巴比妥钠适量，麻醉固定；侧腹部皮肤用75％酒精消毒，于一侧上背部附近用无菌手术剪剪出约2mm大小的皮肤破口，皮下植入装有肿瘤样本的中空纤维管，夹闭伤口；最后于皮肤破口滴加100×双抗(青霉素/链霉素)适量；将小鼠放回笼中，自然苏醒，用以后续的药物处理干预方案。
2.根据权利要求1所述一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤1)中的实验材料为实体瘤病人原发灶新鲜手术标本组织，包括生殖泌尿系统肿瘤、胃癌、喉癌、鼻咽癌、皮肤癌、骨癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、上皮细胞癌；且取材时需获取患者的知情同意以及伦理委员会的许可。
3.根据权利要求1所述一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤2)、5)和6)中使用的细胞培养基多为RPMI 1640培养基或高糖DMEM。
4.根据权利要求1所述一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤3)中免疫缺陷鼠可为裸鼠Balb/C(nu/nu)或者非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠。
5.根据权利要求1所述一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤4)中空纤维管为分子截留值小于500kDa，内径小于500nm的PVDF管。
6.根据权利要求1所述一种人癌组织移植瘤中空纤维测试法小鼠模型的建立方法，其特征在于：该方法用途上有两部分：一是为癌症病人试药；二为药物研发企业提供药物筛选模型。
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