CN107541497B

CN107541497B - 人垂体腺瘤细胞株及其用途

Info

Publication number: CN107541497B
Application number: CN201710650724.4A
Authority: CN
Inventors: 刘潜; 张亚卓; 孙异临; 李储忠
Original assignee: Beijing Neurosurgical Institute
Current assignee: Beijing Neurosurgical Institute
Priority date: 2016-08-04
Filing date: 2017-08-02
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2037-08-02
Also published as: CN106834232A; CN107541497A

Abstract

本发明公开了一株人垂体腺瘤细胞株及其用途，属于肿瘤生物学领域。人垂体腺瘤细胞株HPA1446，保藏号为CGMCC No.12672。本发明的优点是：本发明细胞株在体外可长期培养并保持细胞特性不变，是垂体瘤相关研究的有力工具。是研究肿瘤发病及相关分子作用机制、制备肿瘤相关动物实验模型、研发筛选和评价肿瘤治疗药物/方法/诊断试剂、开发肿瘤药物靶点、肿瘤生物治疗新技术及检测相关生物工程产品研究的有力工具。

Description

人垂体腺瘤细胞株及其用途

技术领域

本发明涉及一株人垂体腺瘤细胞株及其用途，属于肿瘤生物学领域。

背景技术

垂体腺瘤占原发性颅内肿瘤的10％-15％，是最常见的神经系统肿瘤之一。有报道称垂体腺瘤尸检发现率高达14.4％，随机人群MRI检出率为22.5％。根据是否能分泌激素，垂体瘤可分为激素分泌性垂体瘤和无功能性腺瘤。而根据激素分泌的种类，激素分泌性垂体腺瘤又可以分为催乳素，生长激素，促肾上腺皮质激素，促甲状腺激素以及促性腺激素分泌型垂体瘤。垂体瘤的临床表现主要为肿瘤占位性症状以及激素分泌紊乱所导致的一系列临床改变。前者主要表现为头痛，视力下降，视野缺损等，后者根据激素的种类，可能对于患者的生长、发育、劳动能力和生育功能产生严重影响。治愈率低，治疗难度大，预后不佳是目前临床上垂体瘤治疗上亟需解决的问题。目前为止，虽然对垂体瘤展开了大量的研究，但是对于垂体瘤发生发展的分子机制仍远未清楚。其中，缺乏成熟高效的人源化细胞系，成为目前制约垂体腺瘤发病机制及生物学特性研究的极大瓶颈。

垂体腺瘤细胞培养是研究疾病发生和治疗的主要手段。人们对鼠和人不同类型的垂体腺瘤细胞进行了长期研究，已成功建立了数个鼠类垂体腺瘤细胞系，在研究中得到广泛应用。目前分离培养成功、可以稳定传代并保持良好分泌功能的有来源于小鼠垂体ACTH腺瘤细胞的AtT-20细胞系、来源于大鼠垂体肿瘤的GH3细胞系、来源于大鼠垂体泌乳素瘤的MMQ细胞系及来源于转基因小鼠促性腺激素垂体腺瘤的αT3-1、GT1-1等细胞系。

虽然基于人垂体腺瘤组织进行体外培养的实验平台，从取材到培养的整个流程方法、条件历经改良，然而人类垂体腺瘤细胞系的建立始终困难重重。因垂体肿瘤细胞生长缓慢、体外生存环境难以维系垂体肿瘤细胞分泌功能及成纤维细胞混杂等问题，至今仍无人类永生化垂体腺瘤细胞系建立。因此，现有临床及基础实验研究多基于鼠源垂体肿瘤细胞系平台之上开展。但由于啮齿类动物垂体肿瘤细胞与人源垂体肿瘤组织的起源存在较大物种间差异，故鼠源垂体肿瘤细胞平台获取的实验数据仍较难转嫁于人体实验，故成熟的人源垂体腺瘤细胞亟待开发。

目前只有鼠源垂体瘤细胞，并没有人源化的垂体瘤细胞，原代培养的人垂体瘤细胞存在着许多难度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株可以稳定传代的人源无功能垂体腺瘤细胞系。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

人垂体腺瘤细胞株HPA1446，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12672。

该细胞具有垂体来源细胞的生物学特性：

本发明所述的人脑垂体瘤细胞株HPA1446是从无功能垂体腺瘤患者的肿瘤组织中分离培养获得，该细胞通过细胞因子依赖法和反复贴壁法筛选获得人垂体瘤细胞，经过端粒酶转染，细胞纯化，单克隆筛选出具有较强增殖能力的细胞株HPA1446细胞，在体外经过超过20次的传代培养，细胞仍保持垂体肿瘤特性。该细胞具有垂体瘤细胞的超微结构，并表达多种垂体来源组织的标志蛋白，同时也具有肿瘤特性和成瘤能力。

(1)在光学显微镜下大多呈圆梭形，部分为三角形或多角形，有较好的折光性，核膜完整，核仁清晰；(2)稳定传代，首次传代20代以上；(3)染色体为100条异倍染色体核型；(4)该细胞PTTG、PTX2、ESR、D2DR、sca-1蛋白表达呈阳性，Vimentin、s100、GFAP蛋白表达呈阴性；(5)电镜下可见壳膜小圆形促性腺激素分泌颗粒及不规则型分泌颗粒；(6)该细胞分泌上清中GH、PRL、FSH、TSH、LH、ACTH等六项激素水平呈低表达；(7)该细胞具有体内裸鼠部分成瘤能力。该细胞在生长36h即进入生长稳定期。

人垂体腺瘤细胞株HPA1446(保藏号为CGMCC No.12672)的永生化细胞系的培养物或永生化单克隆。

一种细胞培养物，包含人垂体腺瘤细胞株HPA1446(保藏号为CGMCC No.12672)。

本发明细胞株的用途包括但不限于以下用途：

所述的人垂体腺瘤细胞株用于制备肿瘤细胞模型的用途。

所述的人垂体腺瘤细胞株用于制备肿瘤动物模型的用途。

所述的人垂体腺瘤细胞株用于筛选和/或评价/制备肿瘤治疗药物的用途。

所述的人垂体腺瘤细胞株用于用于开发肿瘤药物靶点的用途。

所述的人垂体腺瘤细胞株用于用于制备肿瘤诊断试剂的用途。

所述的人垂体腺瘤细胞株在筛选肿瘤生物治疗药物/试剂中的用途。

所述的人垂体腺瘤细胞株在开发肿瘤治疗新技术中的用途。

所述的人垂体腺瘤细胞株在开发检测肿瘤相关生物工程产品中的用途。

本发明细胞株具备多种用途：可用于研究脑垂体腺瘤发病及相关分子作用机制、研发筛选和评价脑垂体腺瘤治疗药物、垂体腺瘤相关动物实验评价、生物治疗新技术及检测相关生物工程产品等提供必要细胞实验工具。

本发明的优点是：本发明细胞株在体外可长期培养并保持细胞特性不变，是垂体瘤相关药物研究的有力工具。

生物保藏信息：

生物材料名称：HPA1446

分类命名：人垂体腺瘤细胞株

保藏日期：2016年6月24日

保藏号：CGMCC No.12672

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，并非对本发明的限制。凡依照本发明公开内容所进行的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为原代细胞与永生化细胞的生长曲线图。

图2为培养的第20代垂体瘤细胞，大多呈圆梭形，部分为三角形或多角形。

图3为透射电镜下细胞的超微结构。

图4为免疫荧光染色检测sca-1蛋白的表达，阳性细胞为红色荧光的细胞，sca-1的表达率>80％。

图5为免疫荧光染色检测Vimentin蛋白的表达，无红色荧光细胞，Vimentin表达为阴性，表示无成纤维细胞污染。

图6为油镜观察并染色体计数，见染色体为100条异倍染色体核型。

图7为流式细胞术检测细胞周期。

图8为ELISA检测细胞上清分泌激素表达。

图9-1和图9-2为裸鼠成瘤实验结果。

具体实施方式

实施例1：人垂体腺瘤细胞株的获得与培养

一、HPA1446原代细胞培养

1、生物材料来源

本发明所述细胞株是从无功能型垂体瘤手术病人垂体瘤组织组织分离培养获得。肿瘤组织取自首都医科大学附属北京天坛医院神经外科中心的一位患者手术标本，病理诊断为无功能型垂体腺瘤，显微镜下瘤细胞密集分布，胞膜界限不清，细胞核大小形态不甚一致，可见核仁及双核瘤细胞。

2、分离培养方法

无菌超净台内用含破红液(购于Gibco公司)的PBS溶液(1∶1)将组织块洗2次，去除血管和坏死组织，用组织剪将组织块剪成约1mm³大小，加入3ml0.04％EDTA/0.5％胰蛋白酶，37℃水浴消化10分钟，显微镜下观察，待消化成单细胞后，加入3ml含胎牛血清的完全培养基终止消化。用200目的金属筛网过滤，去除未消化的组织。过滤后的细胞悬液在PBS溶液中通过离心(1000rpm/分，10分钟)洗涤2次，收集离心管底部的沉淀细胞，将细胞悬浮于含有生长因子的培养液中，接种于T25培养瓶内，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

含有生长因子的培养液的配制：90％DMEM/F12(购于Gibco公司)，10％FBS(购于Gibco公司)，终浓度为10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast GrowthFactor，bFGF，购于inventrogen公司)，终浓度为20ng/ml的表皮生长因子(EpidermalGrowth Factor，EGF，购于inventrogen公司)。

3、细胞纯化

细胞培养24h后弃悬浮细胞，贴壁细胞换含20％胎牛血清的DMEM/F12继续培养，待细胞生长接近90％汇合时，PBS溶液洗2次，加入0.4ml 0.04％EDTA/0.5％胰蛋白酶消化3分钟，加上述培养液吹打分瓶，37℃培养30分钟，收集悬浮细胞，弃贴壁细胞，悬浮细胞37℃培养30分钟，待细胞再次贴壁后，收集悬浮细胞，弃贴壁细胞，悬浮细胞再37℃培养30分钟，通过反复贴壁法，最终去除成纤维细胞。

4、传代培养

纯化后的细胞生长达90％汇合时，加入0.4ml 0.04％EDTA/0.5％胰蛋白酶消化2分钟，加上述培养液吹打、分瓶，37℃、5％CO₂培养箱中传代培养。重复上述过程，直至传20代，得到原代垂体腺瘤细胞，进行各项检测。

二、永生化的垂体腺瘤细胞的培养

1、细胞永生化处理方法

原代垂体腺瘤细胞经过端粒酶转染、细胞纯化、单克隆筛选出具有较强增殖能力的细胞株传代至20代经微卫星分析细胞特有位点无突变及P53和ras基因测序无位点突变鉴定后获得永生化细胞株。

2、永生化细胞培养方法

(1)培养基类型：DMEM-高糖培养基(购于Gibco公司)

(2)添加因子：10％FBS,1％Penicillin,1％Streptomycin。

(3)冻存条件：90％FBS+10％DMSO。

(4)培养条件：待细胞达到70-80％汇合时准备进行传代培养；

(5)细胞传代培养方法：

a)吸出25cm²培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

b)添加0.25％胰蛋白酶消化液约2ml至培养瓶中，37℃温浴2-3min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；

c)用吸管轻轻吹打混匀，按1:2适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5ml，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养；

(6)得到永生化的垂体瘤细胞，并进行生物材料保藏，保藏号：CGMCC No.12672。

实施例2：细胞生长曲线测定

一、方法：

将实施例1的原代垂体腺瘤细胞和永生化的垂体腺瘤细胞，待细胞长满后调整细胞浓度为5×10⁴cells/mL，将原代的垂体瘤细胞和永生化的垂体瘤细胞分别接种于96孔培养板，每孔100μl，37℃，5％CO₂培养箱内培养；分别培养12h、24h、36h、48h、72h后在每孔加入10μl的MTT，37℃，5％CO₂培养箱内培养避光孵育3-4h；吸净孔内的液体，加入200μl的DMSO，室温于摇床震荡10min；酶标仪492nm波长测出同一时间点OD值，用测得的OD值进行分析。

二、结果：

如图1所示，永生化的垂体瘤细胞在36h进入生长稳定期。增殖能力较原代细胞强。

实施例3：细胞形态检测

一、方法：

1、采用相差显微镜观察细胞株HPA1446(保藏号为CGMCC No.12672)。

2、采用透射电子显微镜观察细胞株HPA1446(保藏号为CGMCC No.12672)的超微结构：

待细胞生长达90％汇合时，弃培养液，加入3ml 0.1MPBS(pH值7.4)，用橡皮细胞刮刮取细胞，收集细胞，离心(1000rpm/分，10分钟)，弃上清，戊二醛/四氧化锇前固定2小时，0.1M PBS(pH值7.4)洗3次，10分钟/次。然后行标本的后固定、脱水、浸透、包埋、切超薄切片和重金属染色(北京市神经外科研究所电镜室完成)。

二、结果：

1、相差显微镜下细胞株HPA1446(保藏号为CGMCC No.12672)生长特性：大多呈梭形，部分为三角形或多角形，有较好的折光性，核膜完整，核仁清晰。(见图2)

2、透射电子显微镜观察细胞株HPA1446(保藏号为CGMCC No.12672)的超微结构：(见图3)。

肿瘤细胞密集分布，胞核形态不规则，核仁大、明显，胞浆及突起内可见壳膜小圆形促性腺激素分泌颗粒及不规则型分泌颗粒。

结果提示：该细胞为垂体细胞来源。

实施例4：免疫荧光检测永生化细胞的蛋白表达情况

一、方法

细胞株HPA1446(保藏号为CGMCC No.12672)，将细胞爬片，PBS漂洗3次之后，4％多聚甲醛固定10min。PBS漂洗5min，重复三次。3％H₂O₂/PBS室温孵育10min，PBS漂洗5min，重复三次。5％FBS封闭，室温15min。分别孵育sca-1抗体(购于santa cruz公司)和Vimentin抗体(购于abcam公司)，4℃孵育过夜，PBS漂洗5min，重复三次。将cy3标记二抗(购于inventrogen公司)滴至切片上，每片1滴，37℃孵育30min。PBS漂洗5min，重复三次。封片，荧光显微镜下观察。

二、结果

荧光显微镜下观察，>80％的细胞呈现出红色荧光，sca-1蛋白表达阳性(图4)。Vimentin抗体的没有细胞呈现红色荧光，Vimentin蛋白表达阴性(图5)。

结果提示：该细胞无成纤维细胞污染。

实施例5：HPA1446细胞的肿瘤特性分析

一、方法

1、染色体核型分析：

细胞株HPA1446(保藏号为CGMCC No.12672)，待细胞生长达90％汇合后，换液并加入终浓度为0.5ug/ml的秋水仙素工作液使细胞停止在分裂中取对数生长期细胞，加秋水仙素至浓度0.4μg/mL，培养3小时；加入胰蛋白酶消化细胞，用无血清培养基洗涤细胞一次，1500rpm离心5min，弃上清，收集细胞；75mmol/L KCl低渗30min,37℃；加入一滴甲醇/冰醋酸(3:1)固定液混匀后4℃离心，弃上清；加1mL固定液，4℃放置30min，混匀后4℃离心，弃上清；继续加入固定液，混匀离心；滴片，空气干燥，80℃烤片2h；吉姆萨染色。油镜下观察。

2、流式细胞术检测细胞周期

取对数生长期细胞(细胞株HPA1446(保藏号为CGMCC No.12672))，弃培养液，胰酶消化细胞，加培养液，离心(1000rpm/分，14分钟)，去上清。PBS洗2次，0.5mlPBS吹打，用5ml注射器吸取细胞，然后用力打入5ml 70％(预冷)乙醇中，封口膜封口，4℃固定过夜。离心(800rpm/分，14分钟)，收集固定细胞，PBS洗2次，0.4ml PBS重悬细胞并轻轻吹打(防止细胞破碎)。加RNase-A约3μl(终浓度为50μg/ml)，37℃水浴消化30分钟，加50μl PI(终浓度为65μg/ml)，冰浴中避光染色30分钟，300目(孔径40～50微米)尼龙网过滤，上机检测(图7)。

3、ELISA检测细胞上清激素分泌水平

取MMQ细胞及细胞株HPA1446(保藏号为CGMCC No.12672)生长24h后细胞上清。分别用大鼠和人ELISA试剂盒方法检测细胞激素分泌水平。

(1)从室温平衡20分钟后的铝箔袋中取出所需板条；

(2)设置标准孔和样本孔，标准品孔各加0、2.5、5、10、20、40ng/ml的标准品各50μl；

(3)样本孔先加待测样本10μl及稀释液40μl；空白孔不加；

(4)除空白孔外，每孔各加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，水浴锅37℃孵育60分钟；

(5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；

(6)每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15min；

(7)每孔加入终止液50μl，孵育15min，在450nm波长处测定各孔的OD值。

(8)根据标准品检测的OD值，绘制标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本的浓度。

4、成瘤能力检测

为了检测细胞的成瘤能力，将1.0*10⁷个HPA1446细胞(保藏号CGMCC No.12672)接种于NOD/SCID裸鼠(购于维通利华公司)腋下皮下，接种后每天观察肿瘤的生长情况，记录成瘤潜伏期和肿瘤大小。

二、结果

1、染色体核型分析：油镜观察并染色体计数，见染色体为100条异倍染色体核型(图6)。

2、流式细胞术检测细胞周期：HPA1446细胞周期各时相的细胞百分率为：G1期66.6％、S期24.4％、G2-M期9.02％。(图7)

3、ELISA检测分泌激素：MMQ细胞高表达PRL激素，而HPA1446细胞分泌上清中GH、PRL、FSH、LH、TSH、ACTH等激素水平呈低表达(图8)。

4、成瘤能力检测：在接种第7天时裸鼠腋下有肿瘤出现，第4周时肿瘤直径长达1厘米(图9-1、图9-2)。

Claims

1.永生化的人垂体腺瘤细胞株HPA1446，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12672。

2.根据权利要求1所述的永生化的人垂体腺瘤细胞株HPA1446，其具有以下生物学特性：(1)大多呈圆梭形，部分为三角形或多角形，有较好的折光性，核膜完整，核仁清晰；(2)稳定传代，首次传代20代以上；(3)染色体为100条异倍染色体核型；(4)该细胞PTTG、PTX2、ESR、D2DR、sca-1蛋白表达呈阳性，Vimentin、s100、GFAP蛋白表达呈阴性；(5)电镜下可见壳膜小圆形促性腺激素分泌颗粒及不规则型分泌颗粒；(6)该细胞分泌上清中GH、PRL、FSH、TSH、LH、ACTH六项激素水平呈低表达；(7)该细胞具有体内裸鼠部分成瘤能力；该细胞在生长36h即进入生长稳定期。

3.权利要求1或2所述的永生化的人垂体腺瘤细胞株HPA1446用于制备肿瘤细胞模型的用途。

4.权利要求1或2所述的永生化的人垂体腺瘤细胞株HPA1446用于制备肿瘤动物模型的用途。

5.权利要求1或2所述的永生化的人垂体腺瘤细胞株HPA1446用于在体外筛选和/或评价肿瘤治疗药物的用途。

6.权利要求1或2所述的永生化的人垂体腺瘤细胞株HPA1446在体外筛选肿瘤生物治疗药物和/或试剂中的用途。

7.权利要求1或2所述的永生化的人垂体腺瘤细胞株HPA1446在体外开发检测肿瘤相关生物工程产品中的用途。