CN107937548A - Olfm3基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及表达 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了OLFM3基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及表达，具体为天然核糖核苷酸的用途技术领域，OLFM3基因在垂体腺瘤生物标记中的应用，鉴别可能患有垂体腺瘤的对象或垂体腺瘤的侵袭性，再或者确定先前经鉴别的对象的手术预后的方法及其引物序列结构、PCR产物识别序列。包括检测来自所述对象的垂体腺瘤组织样本中OLFM3的表达量，其中较高量的OLFM3为所述对象垂体腺瘤侵袭性强，并与所述对象预后不良可能性增加有关。提出了OLFM3基因的用途。表明异常量的OLFM3为所述对象垂体腺瘤侵袭性强，并与所述对象预后不良可能性增加有关。OLFM3基因具有成为垂体腺瘤生物标志物的应用前景。

Description

OLFM3基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及表达
技术领域
本发明涉及OLFM3基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及表达，具体为天然核糖核苷酸的用途技术领域。
背景技术
垂体腺瘤(简称垂体瘤)是人类最常见的颅内肿瘤之一，约占颅内肿瘤的10％-15％。垂体瘤在组织学上属于良性肿瘤，但有些垂体瘤呈侵袭性生长，包绕或侵犯周围组织结构，该部分肿瘤手术难以彻底切除，是肿瘤复发的主要原因之一。根据垂体瘤的生物学行为可分为非侵袭性垂体瘤、侵袭性垂体瘤和垂体癌。侵袭性垂体瘤介于非侵袭性垂体瘤和垂体癌之间，其组织学形态属于良性，生物学特征却似恶性。侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤的临床表现、预后均明显不同。侵袭性垂体腺瘤的坏死、卒中、囊变发生率明显高于非侵袭性垂体腺瘤。侵袭性生长使得外科手术难以做到全切肿瘤，而常用药物溴隐停、生长抑素对这类肿瘤的疗效较差；侵袭性生长同样限制了其对放疗的敏感性，且鞍区放疗容易导致正常垂体、下丘脑及视神经等重要结构的损伤。这些因素导致侵袭性垂体腺瘤术后复发率高，肿瘤残余组织增长快。显而易见，对侵袭性垂体瘤的治疗是神经外科领域和肿瘤治疗领域面临的巨大挑战。因此，寻找与垂体腺瘤侵袭性相关的分子标记对于及时治疗和改善预后至关重要。
OLFM3(Olfactomedin 3)是一种包含有嗅介蛋白C端保守结构域的糖蛋白。OLFM3主要在脑组织中表达，其能够促进肿瘤细胞生长与侵袭。本发明利用实时定量PCR的方法，检测分析OLFM3基因与垂体腺瘤侵袭性有很好相关性，可用于制备垂体腺瘤辅助诊断或者预后判断制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供OLFM3基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及表达。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：OLFM3基因在垂体腺瘤生物标记中的应用，鉴别可能患有垂体腺瘤的对象或垂体腺瘤的侵袭性，再或者确定先前经鉴别的对象的手术预后的方法及其引物序列结构、PCR产物识别序列。
所述方法包括检测来自所述对象的垂体腺瘤组织样本中OLFM3的表达量，其中较高量的OLFM3为所述对象垂体腺瘤侵袭性强，并与所述对象预后不良可能性增加有关。
本发明还提供OLFM3基因在垂体腺瘤生物标记中表达，所述的表达方法包含以下步骤：
步骤一、侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织RNA提取；
步骤二、总RNA反转录cDNA；
步骤三、将cDNA进行定时定量PCR检测，反应结束后检测样品中OLFM3的PCR识别序列，然后与PCR产物序列结果进行对比可知OLFM3在垂体腺瘤组织中进行表达。
进一步优选，所述的步骤一中侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织RNA提取方法是相同的，具体提取方法为：称取2克组织材料，加入250微升RNAiso Plus，手持电动器研磨后，转移至1.5毫升RNase-free的离心管中，12000转4℃离心10分钟，去上清200微升加入1.5毫升RNase-free的离心管中，加入1毫升RNAiso P lus新混匀后室温静置5分钟。加入200微升的氯仿，充分混匀后，室温静置3分钟，12000转4℃离心15分钟，取上清250ul，加入500微升异丙醇混匀后室温静置10分钟，12000转4℃离心10分钟。弃掉上清，加入75％乙醇，颠倒混匀后，7500转4℃离心5分钟，弃掉上清，室温静置5分钟，加入15-20微升Nuclease-Freewater溶解。Nanodrop测算所得液体的OD值及浓度。
进一步优选，所述的步骤二中总RNA反转录cDNA的方法为：按照反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser说明，加入1微克RNA进行基因组DNA的去除，具体加入DNA酶、反应缓冲液及Nuclease-Free水补齐10微升反应体系，PCR仪42℃孵育2分钟。而后进行反转录，具体加入反转录所需的随机引物，缓冲液、反转录酶及Nuclease-Free水补齐20微升反应体系，PCR仪37℃孵育15分钟，85℃孵育30秒，4℃保温，将反转录产物1：10稀释，在冰上制备qPCR混合物。
作为优选，所述的步骤三中将cDNA进行定时定量PCR检测反应条件如下：首先95℃下预变性30秒，然后95℃变性5秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，40个循环，热融解阶段95℃下变性60秒，56℃下热融解30秒，95℃热融解30秒。
本发明的有益效果是：(1)提出了OLFM3基因的用途。(2)本发明的研究表明异常量的OLFM3为所述对象垂体腺瘤侵袭性强，并与所述对象预后不良可能性增加有关。(3)OLFM3基因在侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤病人组织中表达量存在差异，因此OLFM3基因具有成为垂体腺瘤生物标志物的应用前景。
附图说明
图1为使用OLFM3筛查引物对垂体腺瘤患者组织样本表达量筛选结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下面结合具体实施方式对本发明进行进一步描述
1、实验材料，临床样品：19例垂体腺瘤(8例侵袭性垂体腺瘤，9例非侵袭性垂体腺瘤)组织样本有大连医科大学附属第二医院所提供。
试剂：OLFM3筛查引物由Invitrogen公司合成；RNAiso Plus(货号9109)购自Takara公司；
氯仿购自永大化学试剂(天津)有限公司；异丙醇购自永大化学试剂(天津)有限公司；
乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；
反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(货号：RR047Q)购自Takara公司；
SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205-02)购自天根生化科技(北京)有限公司；
Nuclease-Free water(货号RT121)购自根生化科技(北京)有限公司。
2、实验方法，称取2克组织材料，加入250微升RNAiso Plus，手持电动器研磨后，转移至1.5毫升RNase-free的离心管中，12000转4℃离心10分钟，去上清200微升加入1.5毫升RNase-free的离心管中，加入1毫升RNAiso Plus新混匀后室温静置5分钟。加入200微升的氯仿，充分混匀后，室温静置3分钟，12000转4℃离心15分钟，取上清250ul，加入500微升异丙醇混匀后室温静置10分钟，12000转4℃离心10分钟。弃掉上清，加入75％乙醇，颠倒混匀后，7500转4℃离心5分钟，弃掉上清，室温静置5分钟，加入15-20微升Nuclease-Free water溶解。Nanodrop测算所得液体的OD值及浓度。
3、表达量筛查，按照反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser说明，加入1微克RNA进行基因组DNA的去除，具体加入DNA酶、反应缓冲液及Nuclease-Free水补齐10微升反应体系，PCR仪42℃孵育2分钟。而后进行反转录，具体加入反转录所需的随机引物，缓冲液、反转录酶及Nuclease-Free水补齐20微升反应体系，PCR仪37℃孵育15分钟，85℃孵育30秒，4℃保温。
配置反应混合物
B.Real-Time PCR(SYRB Green法)
将反转录产物1：10稀释，在冰上制备qPCR混合物：
将样品放入qPCR仪器中运行，程序如下
4、实验结果，图1为使用OLFM3筛查引物对垂体腺瘤患者样品表达量筛查的结果图。实验结果表明OLFM3基因在侵袭性垂体腺瘤中的表达显著升高，平均表达量(Ct值)差-6.228，相当于侵袭性垂体腺瘤中OLFM3的表达量是非侵袭性垂体腺瘤中的74.95倍。如此大的表达差异给了OLFM3作为侵袭性垂体腺瘤生物标记物的应用前景。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 大连医科大学附属第二医院
<120> OLFM3基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及表达
<141> 2018-01-04
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3477
<212> DNA
<213> 人类(homo sapiens)
<400> 1
gtagtgatgt catatccgtt gtccaggtct ccacacctct ctcagcagtt aatcccttta 60
tctattcctt gggtcaaaac ttttgaggtg ggctagctat atagcagcgg gggagagggt 120
aaactggggc gcgcgggttg gaggcgcttc agcaccgcgg ccagcgccca ctgcagccca 180
acccactctc tagagctccc ggactcctag ctctgagaat gcctgcggaa tgatcgcccc 240
ccagggcggc tgccgccgct gccgctgctg ctgttattgc tactgctgct gccgccgcct 300
ctgcttccac tcggctctga ctggcaggca gaaagtgcaa ctgacgaggg aaaggtctct 360
gcagtgagtg gagagcctac ataaaagaga gtaaagaggg gcaaaaaccc agatcagaat 420
gcaggcgacg tccaaccttc tcaacctcct gctgctgtct ttgtttgccg gattagatcc 480
ttccaagact cagattagtc ctaaagaagg gtggcaggtg tacagctcag ctcaggatcc 540
tgatgggcgg tgcatttgca cagttgttgc tccagaacaa aacctgtgtt cccgggatgc 600
caaaagcagg caacttcgcc aactactgga aaaggttcag aacatgtccc agtctattga 660
agtcttaaac ttgagaactc agagagattt ccaatatgtt ttaaaaatgg aaacccaaat 720
gaaagggctg aaggcaaaat ttcggcagat tgaagatgat cgaaagacac ttatgaccaa 780
gcattttcag gagttgaaag agaaaatgga cgagctcctg cctttgatcc ccgtgctgga 840
acagtacaaa acagatgcta agttaatcac ccagttcaag gaggaaataa ggaatctgtc 900
tgctgtcctc actggtattc aggaggaaat tggtgcctat gactacgagg aactacacca 960
aagagtgctg agcttggaaa caagacttcg tgactgcatg aaaaagctaa catgtggcaa 1020
actgatgaaa atcacaggcc cagttacagt caagacatct ggaacccgat ttggtgcttg 1080
gatgacagac cctttagcat ctgagaaaaa caacagagtc tggtacatgg acagttatac 1140
taacaataaa attgttcgtg aatacaaatc aattgcagac tttgtcagtg gggctgaatc 1200
aaggacatac aaccttcctt tcaagtgggc aggaactaac catgttgtct acaatggctc 1260
actctatttt aacaagtatc agagtaatat catcatcaaa tacagctttg atatggggag 1320
agtgcttgcc caacgaagcc tggagtatgc tggttttcat aatgtttacc cctacacatg 1380
gggtggattc tctgacatcg acctaatggc tgatgaaatc gggctgtggg ctgtgtatgc 1440
aactaaccag aatgcaggca atattgtcat cagccaactt aaccaagata ccttggaggt 1500
gatgaagagc tggagcactg gctaccccaa gagaagtgca ggggaatctt tcatgatctg 1560
tgggacactg tatgtcacca actcccactt aactggagcc aaggtgtatt attcctattc 1620
caccaaaacc tccacatatg agtacacaga cattcccttc cataaccaat actttcacat 1680
atccatgctt gactacaatg caagagatcg agctctctat gcctggaaca atggccacca 1740
ggtgctgttc aatgtcaccc ttttccatat catcaagaca gaggatgaca cataggcaaa 1800
tgtgacatgt tttcattgat ttaaacagtg tgatttgtga taaactctat aagacccctt 1860
ccgttttttt cttcactatt atttttcatc atttctccaa agcaaagcat ttttattgta 1920
aagttggtgt ttcaaaaaca tagctgagct tgtctaactt accatgttgg aaacacatct 1980
taacttctaa atttacaagg cctatcatgt ccttgtcatg aaaagcacta aaaaaaaaaa 2040
gagtttaagt ggctaaagtc atagttttgc aagagattaa tgatctgcct tatattagag 2100
tcagagacta atggtggctt aaatgcacga atgtcttttt ttttaaaact gtcatttttt 2160
actgtctttt gctccatatc aggaaatatt ttggtaggaa ttaggagaac aaaaagcact 2220
tttatcccat ttatttcttt aaaaaatgta aggatttcat ttatattgaa aaataatatt 2280
aatcattttg ctgttaacac aattctctga tgcggtgctg tacagtcatt tttaaatctc 2340
ttgctaacat tttattggca gtatgtattt ctaccattgt aaccaccatt gtgctattgt 2400
atctcttcac ttctgtgaaa gtaatatttt ttataaaata cactgaaatt taacctcagt 2460
aattgagtcc attttcaagt gtggtcaaga ataatcttct tggcttaccc ctttacataa 2520
gcattataaa ctaaaatgaa aaccaaacca gacacctgac atagagtctt tattttaccc 2580
caagtttttt gggccactga cattgaatgc aacaactgat ttcatacaac tgagttactc 2640
tgttcactcc actgaatgca acccatatag tttcttgcac aaggtgcatc tggattccaa 2700
atattggatt tgagttgact ctactcattt attatacact aaagaaattt tgttcttcat 2760
agttaaatgt actagcattt aatttatatt ttacatacaa cttgcaataa tgaaattcct 2820
tatgtcagga ccctgaaaat aagcacattt gaaaactctt agaaaaaaaa aattctgtaa 2880
tgtcctctag atttagatta tgagccctga ggagttattg gcaagatttg tgcaaaataa 2940
aatatgggga gacttgggag ttgtctttgt ggtttcaaaa gtgtaaataa ccaattcaga 3000
aaacaaaatg gaaaaacgac cccttgttac cttgattcac tgtatgtgga aaaataatgt 3060
aaccaaaagg gaagagcttt aataatactt atgttaataa ctctatgaaa catataagct 3120
aactatatat caaacatttc attgagtttg gatgtatttt ccacatatta aaaaaatagt 3180
tccctaaggc agctttatgg aaactaatat aggttggttt tacaatttaa aaagtatatt 3240
ctataataaa taataaaaca aattgtttta aatgtttagt ttcacacata catagtacca 3300
tgattttctt tgaaagataa ggatgtaatg atttagataa agcatcatgt aaagaaatcc 3360
taacatttaa gtgtaattca tttcaaatgt cacaagtaaa gcatcatcct caaatatctc 3420
actgtcaaaa ttgtagaatt aaataaccca atcttgaaac tgtcaaaaaa aaaaaaa 3477
<210> 2
<211> 246
<212> DNA
<213> 人类(homo sapiens)
<400> 2
gcttaaatgc acgaatgtct ttttttttaa aactgtcatt ttttactgtc ttttgctcca 60
tatcaggaaa tattttggta ggaattagga gaacaaaaag cacttttatc ccatttattt 120
ctttaaaaaa tgtaaggatt tcatttatat tgaaaaataa tattaatcat tttgctgtta 180
acacaattct ctgatgcggt gctgtacagt catttttaaa tctcttgcta acattttatt 240
ggcagt 246

Claims (6)

1.OLFM3基因在垂体腺瘤生物标记中的应用，其特征在于：OLFM3基因在垂体腺瘤生物标记中的应用，鉴别可能患有垂体腺瘤的对象或垂体腺瘤的侵袭性，再或者确定先前经鉴别的对象的手术预后的方法及其引物序列结构、PCR产物识别序列，所述的OLFM3碱基序列如SEQIDNO：1所示。
2.如权利要求1所述的应用，包括检测来自所述对象的垂体腺瘤组织样本中OLFM3的表达量，其中较高量的OLFM3为所述对象垂体腺瘤侵袭性强，并与所述对象预后不良可能性增加有关。
3.OLFM3基因在垂体腺瘤生物标记中的表达，其特征在于：具体的表达方法包含以下步骤：
步骤一、侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织RNA提取；
步骤二、总RNA反转录cDNA；
步骤三、将cDNA进行定时定量PCR检测，反应结束后检测样品中OLFM3的PCR识别序列，然后与PCR产物序列结果进行对比可知OLFM3在垂体腺瘤组织中进行表达。
4.根据权利要求3的表达方法，其特征在于：所述的步骤一中侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织RNA提取方法是相同的，具体提取方法为：称取2克组织材料，加入250微升RNAisoPlus，手持电动器研磨后，转移至1.5毫升RNase-free的离心管中，12000转4℃离心10分钟，去上清200微升加入1.5毫升RNase-free的离心管中，加入1毫升RNAiso Plus新混匀后室温静置5分钟，加入200微升的氯仿，充分混匀后，室温静置3分钟，12000转4℃离心15分钟，取上清250ul，加入500微升异丙醇混匀后室温静置10分钟，12000转4℃离心10分钟，弃掉上清，加入75％乙醇，颠倒混匀后，7500转4℃离心5分钟，弃掉上清，室温静置5分钟，加入15-20微升Nuelease-Free water溶解，Nanodrop测算所得液体的OD值及浓度。
5.根据权利要求3的表达方法，其特征在于：所述的步骤二中总RNA反转录eDNA的方法为：按照反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser说明，加入1微克RNA进行基因组DNA的去除，具体加入DNA酶、反应缓冲液及Nuclease-Free水补齐10微升反应体系，PCR仪42℃孵育2分钟，而后进行反转录，具体加入反转录所需的随机引物，缓冲液、反转录酶及Nuclease-Free水补齐20微升反应体系，PCR仪37℃孵育15分钟，85℃孵育30秒，4℃保温，将反转录产物1：10稀释，在冰上制备qPCR混合物。
6.根据权利要求3的表达方法，其特征在于所述的步骤三中将cDNA进行定时定量PCR检测反应条件如下：首先95℃下预变性30秒，然后95℃变性5秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，40个循环，热融解阶段95℃下变性60秒，56℃下热融解30秒，95℃热融解30秒。
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