CN107674916A - 一种环状rna在结直肠癌生物标志物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种环状RNA(Circular RNA\circRNA)(FNDC3B‑circRNA)在结直肠癌生物标志物中的应用，这条环状RNA(FNDC3B‑circRNA)长4009bp，位于人类的第3号染色体上1172247533到172251541之间，FNDC3B是该circRNA的覆盖基因。本发明可用于鉴别可能患有结直肠癌的对象或结直肠癌的病理分型，再或者确定先前经鉴别的对象的手术预后的方法。本发明制备了筛查环状RNA(FNDC3B‑circRNA)的引物。所述方法包括检测来自所述对象的癌症和癌旁组织样品中的环状RNA(FNDC3B‑circRNA)的量，其中较低量的FNDC3B‑circRNA与所述对象结直肠癌预后不良的可能性增加相关。具有制备临床结直肠癌生物标志物的应用前景。

Description

一种环状RNA在结直肠癌生物标志物中的应用
技术领域
本发明属于天然核糖核苷酸的用途，涉及环状核糖核苷酸(FNDC3B-circRNA)的用途，尤其涉及FNDC3B-circRNA结直肠癌患者的新的生物标记中的用途，用于鉴别结直肠癌及更不良预后的对象。
背景技术
结直肠癌又称大肠癌，是一种常见的恶性肿瘤。结肠癌在早期并无明显症状，直到发病中晚期发现。提高结直肠癌的早期诊断率对于及时治疗和改善预后至关重要。如通过在结直肠癌中出现的FNDC3B-circRNA所证明的，已知在结直肠癌组织中有异常的FNDC3B-circRNA表达。考虑到FNDC3B-circRNA表达量在结直肠癌中可升高或降低，因此提供了疾病进展的病理学指征。
circRNA广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定、丰度高和组织特异性表达等特征。是基因组DNA转录表达过程中，环化成环形RNA，的一类非编码RNA。研究表明，一些circRNA作为竞争性内源RNA(ceRNA)来发挥基因表达调控的作用。circRNA利用其microRNA(miRNA)应答元件结合miRNA，以阻断miRNA对其靶标基因表达的抑制作用，从而调控其他相关mRNA的表达水平。circRNA在基因表达调控中重要作用的发现提示circRNA在药物开发和疾病诊治中具有良好的应用前景。
circRNA作为一种调控性RNA(Regulatory RNA)近几年成为肿瘤研究的热点领域。circRNAs其表达具备组织特异性。circRNA中既有一部分作为竞争性内源RNA(ceRNA)来发挥基因表达调控的作用。Thomas B.Hansen等人通过对人AGO蛋白和miR-7的分析研究，证明了circRNA作为高效的microRNA海绵的作用。circRNAs在肿瘤和正常组织中的表达水平差别十分显著，甚至能达到数百甚至数千倍，这种显著的差异使得其在成为候选标志物上具有明显优势。
发明内容
本发明的目的是提供环状RNA(Circular RNA\circRNA)FNDC3B-circRNA在结直肠癌生物标志物中的应用，英文名FNDC3B-circRNA，FNDC3B-circRNA长4009bp，位于人类的第3号染色体1172247533到172251541之间，FNDC3B-circRNA的碱基序列结构，FNDC3B是该circRNA的覆盖基因。
本发明提供了鉴别可能患有结直肠癌的对象或结直肠癌的分期，再或者对先前经鉴别患有结直肠癌的对象的预后进行确定的方法及其引物序列结构、PCR产物识别序列。
所述方法包括检测来自所述对象的样品中的FNDC3B-circRNA量，其中较低量的FNDC3B-circRNA与所述对象患有结直肠癌的可能性增加或者结直肠癌预后不佳的可能性增加相关。
本发明的有益效果有：1)提出了FNDC3B-circRNA的用途；2)本发明的研究表明异常的量的FNDC3B-circRNA与所述对象患结直肠癌的可能性增加或者可能提示结直肠癌预后不佳。3)circRNA具有结构稳定、丰度高和组织特异性表达等特征。且circRNA在结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织中表达量存在差异，因此FNDC3B-circRNA具有成为结直肠癌生物标志物的应用前景。
附图说明
图1为FNDC3B-circRNA的PCR识别序列与PCR产物测序结果的对比图。
图2为FNDC3B-circRNA的简易结构及引物位置图。
图3为使用FNDC3B-circRNA筛查引物对病人组织样品表达量筛查的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实验步骤对本发明进行进一步描述。
1.实验材料：
临床样品：28例结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织样品由301医院所提供。
试剂：FNDC3B-circRNA筛查引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京引物合成部合成；Trizol(货号15596-018)购自Invitrogen；氯仿(货号20100927)购自北京化工，异丙醇(货号1205031)购自西陇化工，乙醇(货号101860)购自北化经销；Random primers(货号C1181)，M-MLV(货号M1705)，Ribonuclease Inhibitor(货号2511)，Nuclease-Free Water(货号2511)，dNTP mix(货号P1195)均购自Promega；PremixEx TaqTM II(货号DRR081A)购自Takara；Mineral oil(货号D7295)购自Sigma。
2.实验方法：
1)结直肠癌癌变组织/癌旁组织RNA提取
称取1克组织材料，液氮研磨后，转移至1.5毫升RNase-free的离心管中，混匀后室温静置5分钟左右。加入200微升的氯仿，混匀。11000转每分钟离心10分钟。取上清加入200ul的氯仿抽提，11000转每分钟离心10分钟。取上清加入500微升的异丙醇，-20℃沉淀10分钟。11000转每分钟离心15分钟，将沉淀转移至1.5毫升RNase-free离心管中，预冷的75％乙醇洗涤2遍，晾干，RNase-free水溶解(根据情况适当溶解，一般是20-35微升)。Nanodrop测算所得粗提液的OD值以及浓度。
2)表达量筛查
a.cDNA合成
1-2微克RNA到14微升RNase-free水中，再加1微升random primer轻柔混匀后加入0.2ml PCR管中。PCR仪70℃孵育5分钟。快速放在冰上2分钟。
配置反应混合物：
42℃孵育1小时，70℃孵育15分钟，4℃保温。
b.Real-time PCR
cDNA中加入50ul的ddH2O。
在冰上制备QPCR混合物：
每管中加入10微升矿物油。离心机1000转每分钟离心1分钟。将样品放置入ABI7300荧光定量PCR仪中运行，程序如下：
3)实验数据分析：根据qRT-PCR扩增情况，得到的FNDC3B-circRNA的Ct值，根据内参基因GAPDH的扩增情况，计算出相对组织自身GAPDH的相对表达，再根据2-ddct法计算出肿瘤组织中FNDC3B-circRNA相对同一患者癌旁正常组织的表达水平差异。
3.实验结果：
参见图1和图3，图1为FNDC3B-circRNA的PCR识别序列与PCR产物测序结果的对比图。实验结果表明FNDC3B-circRNA的PCR识别序列与PCR产物测序结果比对成功，FNDC3B-circRNA在结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织中表达。图3为使用FNDC3B-circRNA筛查引物对病人组织样品表达量筛查的结果图。以患者自身癌旁正常组织为对照，计算出FNDC3B-circRNA在肿瘤组织中的相对表达水平。将实验结果表明FNDC3B-circRNA在结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织中的表达差异较大，癌组织相对于癌旁组织下调存在着从0.06502513倍到0.89161637倍的变化，其中20/28的病人下调倍数在0.5以下；上调存在1.371935199倍到3.649925677倍的表达量变化，其中5/6的病人上调倍数在3倍以内，1/6的病人上调在3倍以上。如此大的表达差异给了FNDC3B-circRNA作为结直肠癌生物标志物的应用前景。

Claims (9)

1.环状RNA(Circular RNA\circRNA)FNDC3B-circRNA在结直肠癌生物标志物中的应用，英文名FNDC3B-circRNA，FNDC3B-circRNA长4009bp，位于人类的第3号染色体1172247533到172251541之间，FNDC3B-circRNA的碱基序列结构，FNDC3B是该circRNA的最好覆盖基因。
2.鉴别可能患有结直肠癌的对象或结直肠癌的病理分型，再或者对先前经鉴别患有结直肠癌的对象的预后进行确定的方法及其引物序列结构、PCR产物识别序列，所述方法包括检测来自所述对象的样品中的FNDC3B-circRNA量，其中较低量的FNDC3B-circRNA与所述对象结直肠癌预后不佳的可能性增加相关。
3.权利要求2的方法用于追踪对象中结直肠癌的治疗，例如在治疗后较低水平的FNDC3B-circRNA表示治疗起作用。
4.权利要求2或3的方法，其中FNDC3B-circRNA的量是样品中癌组织与癌旁组织的绝对量。
5.权利要求2-4的方法，其中所述FNDC3B-circRNA是在来自对象的血清样品中确定的。
6.权利要求2-4的方法，其中所述FNDC3B-circRNA是在来自对象的血浆样品中确定的。
7.用于权利要求2-5的方法中的检测引物和PCR产物识别序列，其另外包含用于该方法的使用说明。
8.权利要求6的检测引物，其另外包含癌旁组织表达量，使用所述检测引物获得的癌症组织的FNDC3B-circRNA的表达量与癌旁组织表达量的对比指示对象中患结直肠癌的风险增加或预后不良。
9.根据权利要求1-8所述的应用，其特征是：制备的检测试剂盒是由FNDC3B-circRNA与用于鉴定其的引物、探针、引物组合或探针组合。
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