CN106434536B - 人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法 - Google Patents

人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人精原干细胞体外分化为功能精子的三维诱导方法，属于生物工程领域。该方法在获得人精原干细胞的基础上，通过Matrigel构建了三维培养体系，添加诱导分化的关键因子，对精原干细胞进行体外诱导分化，获得了具有受精能力的精子细胞，并通过免疫细胞化学法鉴定诱导获得的精子细胞，通过荧光原位杂交技术（FISH）检测诱导获得的精子细胞染色体数目，通过圆形精子显微注射法（ROSI）检测诱导获得的精子细胞的受精与发育能力，本申请不仅为研究人类精子发生的分子机理提供优良的模型，并且，可以为无精症病人提供功能配子，将使男性不育患者拥有自己遗传背景的孩子。

Description

人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法
技术领域
人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法。
背景技术
目前，全世界约有15%育龄夫妇不孕不育，其中男性因素占50%；研究表明，欧洲20%男性不育患者属于无精子症。无精子症在中国男性不育患者中高达25%。而且，因为“晚婚晚育”等社会问题，这一疾病正逐年加剧。因此在体外获得有受精能力的生殖细胞一直是生殖生物学和生殖医学领域的难题和热点。精子发生（Spermatogenesis）是指精原干细胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）自我更新并分化为成熟精子细胞的过程。很多无精症患者有精原干细胞，但由于体内睾丸微环境的缺失或破坏，导致无法获得功能性精子。因此，如果能将精原干细胞体外诱导分化成有功能的精子，可为无精症病人提供种子细胞，治疗男性不育，使男性不育患者拥有自己孩子的梦想得以实现。然而，目前尚未有从精原干细胞体外诱导分化为精子的相关报道。
Sousa等将分离获得的非梗阻性无精子症（Nonobstructive Azoospermic，NOA）病人生殖细胞和体细胞（包括精原干细胞、精母细胞和支持细胞），在肾细胞（Vero细胞）条件培养基中添加促卵泡素（follicle stimulating hormone，FSH）、睾酮，培养2-3周后，检测到6.9%细胞进入减数分裂，22.7%细胞发育至精子细胞；将获得的圆形精子注射到卵母细胞（ROSI），胚胎受精率为37.5%，囊胚率28.6%。
Yang等诱导隐睾病人的精原干细胞体外分化为有受精和发育潜能的精子细胞，但是其起始细胞包含有少量精母细胞，且分化效率比较低。
目前的研究方法起始细胞纯度不够，不是单一的精原干细胞，不能明确表明是精子是从精原干细胞分化而来。
Ribooldi等将非梗阻型无精子症（NOA）病人睾丸细胞中CD49F-阳性细胞与睾丸支持细胞共培养5天后检测到单倍体细胞，但是，CD49F不是特异的人精原干细胞表面标记物，人支持细胞也表达CD49F。并且，其存在以下不足：第一，由于CD49F不是特异的人精原干细胞表面标记物，起始细胞纯度不够；第二，只是检测到了精子，没有明确诱导效率；第三，没有进行功能检测，不能确定诱导获得精子细胞是否具有功能。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，该方法对精原干细胞进行体外诱导，获得了具有受精能力的精子细胞。
本发明采用如下技术方案：
人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，包括如下步骤：
1)称取睾丸组织置于DMEM/F12中，剪成组织小块，用DMEM/F12清洗，除去残留的血细胞；
2）将步骤1）所得睾丸组织剪至半液态，添加DMEM/F12，将睾丸组织转移到容器内；
3）向步骤2）的睾丸组织中加入酶消化液Ⅰ，置于水浴摇床中进行孵育；
4）镜检，确保所有组织块均已消化成单个生精小管，将含有生精小管的消化液转移至另一新的离心管中，加入新鲜的DMEM/F12和10%FBS终止消化；
5）静置，移除上清液，加入新鲜的DMEM/F12，充分清洗生精小管，重复操作数次；
6）向步骤5）得到的生精小管中加入酶消化液Ⅱ；
7）将步骤6）中的混合液转移至另一新的离心管中，置于水浴摇床中进行孵育；
8）消化后，用移液管轻轻吹打数次，镜检，确保生精小管全部消化为单个细胞；
9）加入新鲜DMEM/F12和10%FBS终止消化，静置10min，收集上清液进行离心；
10）弃上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，静置，收集上清液进行离心；
11）弃上清液，加入新鲜的DMEM/F12重悬细胞，滤网过滤，除去细胞团；
12）将步骤11）得到的细胞悬液进行离心，弃上清液，加入新鲜DMEM/F12；
13）将步骤12）得到的细胞悬液进行培养，分离生殖细胞和支持细胞；
14）将步骤13）中分离的生殖细胞经磁珠激活细胞分选术（MACS）分离获得GPR125-阳性精原干细胞；
15) 将步骤14）中分离的GPR125-阳性精原干细胞与丝裂霉素处理过的人支持细胞用DMEM/F12悬浮后，按1：3的比例混合，将混合细胞和Matrigel混合均匀，放入12孔培养板中；
16）将步骤15）中铺好细胞的12孔板放入培养箱孵育，待Matrigel胶凝固后，缓慢加入诱导培养基，培养箱培养，每天更换新的诱导培养基；
17）诱导20天后，采用流式细胞术（FACS）分离得到单倍体精子细胞。
进一步，所述的人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，包括如下步骤：
1)称取0.8~1.5g睾丸组织置于10mL DMEM/F12中，剪成体积约3 × 3 × 3 mm3组织小块，用DMEM/F12清洗3次，除去残留的血细胞；
2）用剪刀将睾丸组织剪至半液态，添加20mL DMEM/F12，然后将组织转移到120mL容器内；
3）向步骤2）的睾丸组织中加入酶消化液Ⅰ，置于34℃水浴摇床中，孵育10~15min；
4）镜检，确保所有组织块均已消化成单个生精小管，将含有生精小管的消化液转移至另一新的50mL离心管，加入30mL新鲜的DMEM/F12终止消化；
5）静置5min，用25mL玻璃移液管移除上清液，加入50mL新鲜的DMEM/F12充分清洗生精小管，重复操作3次；
6）向步骤5）得到的生精小管中加入酶消化液Ⅱ；
7）将步骤6）中的混合液用10mL玻璃移液管转移至另一新的离心管中，置于34℃水浴摇床，孵育15min；
8）消化后，用10mL玻璃移液管轻轻吹打10~15次，镜检，确保生精小管全部消化为单个细胞；
9）加入30mL新鲜的DMEM/F12和10%FBS终止消化，静置10min，收集上清液，用1000rpm离心5min；
10）弃上清液，加入50mL DMEM/F12重悬细胞，静置10min，收集上清液，1000rpm离心5min；
11）弃上清液，加入适量新鲜DMEM/F12重悬细胞，用40µm尼龙网过滤，除去细胞团；
12）将步骤11）得到的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液，加入新鲜DMEM/F12；
13）将0.1%明胶3mL加入到25cm2的培养瓶中，34°C培养箱孵育1小时，去掉明胶后，将步骤12）得到的细胞悬液加入培养瓶中培养3小时后，分离生殖细胞和支持细胞；
14）将步骤13）中分离的生殖细胞经免疫磁珠激活细胞分选术分离GPR125-阳性精原干细胞；
15)将10ng/mL丝裂霉素加入生长密度为80%的人支持细胞上，34°C培养箱孵育2小时，PBS清洗6次后，用0.25%胰酶消化3min，加入10%FBS的DMEM/F12终止，1000rpm离心5min，弃上清液，收集丝裂霉素处理的支持细胞。
16)将步骤14）中分离的GPR125-阳性精原干细胞与步骤15）收集的丝裂霉素处理过的人支持细胞用DMEM/F12悬浮后，按1:3比例混合，0.4mL 106个混合细胞和0.4mLMatrigel于冰上混合均匀，然后放入12孔板中；
17）将步骤16）中接种好细胞的12孔培养板放入34°C培养箱孵育1小时，待Matrigel胶凝固后，缓慢加入1mL诱导培养基，34°C培养箱培养，每天更换新的诱导培养基；
18）诱导20天后，采用流式细胞术分离得到单倍体精子细胞。
其中，步骤3）中所述的酶溶液Ⅰ由终浓度为2mg/mL 的胶原酶溶液和1µg/µl的DNaseⅠ组成，配制后过滤除菌，其中所述胶原酶为IV型胶原酶。
步骤6）中所述的酶消化液Ⅱ由终浓度为4mg/mL的胶原酶溶液、2.5mg/mL的透明质酸酶和2mg/mL的胰蛋白酶组成，配制后过滤除菌，其中所述胶原酶为IV型胶原酶。
步骤13）所述的分离生殖细胞和支持细胞，具体方法如下：将细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，34°C培养3小时，支持细胞首先贴于培养瓶底，而生殖细胞仍悬浮于培养基中，收集培养基后1000rpm离心5min，弃上清液，收集生殖细胞。
步骤14）中所述的免疫磁珠激活细胞分选术（MACS）分离获得GPR125-阳性精原干细胞，具体步骤如下：
a）将步骤13）中得到的生殖细胞重悬于1mL DMEM培养液，在1mL细胞悬液中加入25µL GPR125抗体，4°C旋转培养过夜；
b）孵育后，用0.4%台盼蓝拒染法检测细胞活力，然后用BSA-EDTA-PBS缓冲液将细胞洗涤3次，5min/次，最后将细胞重悬于80µL BSA-EDTA-PBS缓冲液中；
c）将20µL 磁性微珠加入细胞悬液，4°C旋转培养，时间不超过20min，补加400µLBSA-EDTA-PBS缓冲液，终体积为500µL；
d）取5µL 细胞悬液，用0.4%台盼蓝拒染法检测细胞活力；
e）将步骤c）得到的细胞悬液经MACS预分离器过滤后，转入BSA-EDTA-PBS缓冲液平衡的分离柱中，同时将分离柱置于磁场中，BSA-EDTA-PBS缓冲液为含有终浓度0.5%BSA和2mM EDTA的冰冷PBS缓冲液，配制后过滤除菌；
f）用BSA-EDTA-PBS缓冲液冲洗分离柱3次，0.5mL/次，收集未被标记的细胞GPR125-阴性细胞；
g）将分离柱脱离磁场，添加1mL BSA-EDTA-PBS缓冲液，并轻轻按下柱塞避免产生气泡，收集GPR125-阳性精原干细胞，为提高细胞纯度，可将收集的细胞进行二次MACS分离。
步骤17）中所述诱导培养基配置如下：DMEM/F12、10% 血清替代物(KSR)、2µM 视黄酸 (RA)、100ng/mL 干细胞生长因子（SCF）、
100ng/mL BMP4和10-6M 睾酮。
步骤18）中采用流式细胞术分选单倍体精子细胞，具体步骤如下：
a）诱导20天后，将诱导培养基去掉，加入Disperse孵育1.5小时，使细胞从凝胶中分离出来，1200rpm离心5min，弃上清，
b）将步骤a得到的细胞用BSA-EDTA-PBS缓冲液悬浮，加入10μg/mL Hoechst33342，34°C孵育40min；
c）将步骤b的混合细胞通过流式分选仪分选出单倍体精子细胞。
本发明通过免疫细胞化学法鉴定诱导获得的精子细胞，其步骤如下：
a）将收集的单倍体细胞经甩片机，1000rpm，离心5min进行细胞涂片；
b）室温下，用PBS将细胞涂片冲洗2次，3min/次，用200µl 10%正常山羊血清封闭30min；
c）将一抗用100µL PBS按1:200稀释，34°C孵育1小时或4°C孵育过夜，所述一抗为ACROSIN、PRM2、正常兔IgG或小鼠IgG，阴性对照由PBS代替一抗；
d）孵育后，细胞用PBS冲洗3次，200µl/次；
e）细胞用荧光素标记的羊抗兔IgG或罗丹明标记的羊抗兔或罗丹明标记的羊抗小鼠IgG二抗孵育1小时，并用DAPI进行细胞核染色，在荧光显微镜下观察细胞。
本发明通过荧光原位杂交技术（FISH）检测诱导获得的精子细胞染色体数目，其步骤如下：
A）将收集到的单倍体细胞加入固定液，吹匀静置10min，所述固定液为甲醇与乙酸按照体积比3:1配制的混合液；
B）1500rpm离心10min，去上清，再次加入固定液，吹匀静置10min；
C）1500rpm离心10min，去上清，留20µL液体；
D)将步骤C的细胞吹匀，滴到载玻片上，56°C烤片25min；
E)将步骤D的载破片放入下面液体中依次浸泡：1mol/L氢氧化钠 2min，2×SSC10min，75%乙醇2min，85%乙醇2min，100%乙醇2min；
F)将步骤E的载玻片晾干，滴加探针10µL，用18×18盖玻片封片，78°C 8min，42°C过夜进行变性杂交；
G）将步骤F的载玻片放入2×SSC 2min去掉盖玻片，然后依次放入以下液体中处理：50%甲酰胺2min，2×SSC 2min，0.1%NP40 3min，70%乙醇2min，100%乙醇3min；
H）将步骤G的载玻片晾干，DAPI孵育10min，镜检观察。
本发明通过圆形精子显微注射法（ROSI）检测诱导获得的精子细胞的授精能力，其步骤如下：
用0.1%的透明质酸酶将小鼠卵母细胞周围的颗粒细胞去掉，选择带有第一极体的卵子待用，通过带有脉冲仪的显微操作系统将诱导获得的圆形精子细胞注射到卵子中，然后移入37°C培养箱观察胚胎的发育情况。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明利用免疫磁珠激活细胞分选术（MACS）获得了纯度达99%的精原干细胞，并通过Matrigel构建了三维体系，并添加诱导分化的关键因子，对精原干细胞进行体外诱导，获得的了具有受精能力的精子细胞。
建立功能性精子体外发生的三维培养体系不仅可为研究人类精子发生的分子机理提供优良的模型，并且，可以为无精症病人提供功能配子细胞，将使男性不育患者拥有自己遗传背景的孩子。
附图说明
图1为诱导20天后流式分选单倍体精子图；
图2为免疫荧光检测诱导获得的精子的标记物，其中A、D为ACROSIN蛋白染色，B、E为DAPI染色显示的细胞核，C为A和B图的合并结果，F为D和E图的合并结果，G、J为PRM2蛋白染色，H、K为DAPI染色显示的细胞核，I为G和H图的合并结果，L为J和K图的合并结果；
图3为FISH技术检测诱导获得的精子的染色体数目，其中A为细胞中18号染色体的数目，B为细胞中X染色体数目，C为Y染色体的数目，D为DAPI染色显示的细胞核，E为上述4幅图合并的结果；
图4为显微注射验证诱导获得的精子的受精能力，其中A为显微注射6小时后，胚胎发育到原核期，B为胚胎发育到2细胞期，C为胚胎发育到4-8细胞期胚胎。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1
人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，包括如下步骤：
1)称取1.0g睾丸组织置于10mL DMEM/F12中，剪成体积约3 × 3 × 3 mm3组织小块，用DMEM/F12清洗3次，除去残留的血细胞；
2）用剪刀将睾丸组织剪至半液态，添加20mL DMEM/F12，然后将组织转移到120mL容器内；
3）向步骤2）的睾丸组织中加入酶消化液Ⅰ，置于34℃水浴摇床中，孵育10~15min，所述的酶溶液Ⅰ由终浓度为2mg/mL 胶原酶溶液和1µg/µL的DNaseⅠ组成，配制后过滤除菌，其中所述胶原酶为IV型胶原酶；
4）镜检，确保所有组织块均已消化成单个生精小管，将含有生精小管的消化液转移至另一新的50mL离心管，加入30mL新鲜的DMEM/F12终止消化；
5）静置5min，用25mL玻璃移液管移除上清液，加入50mL新鲜的DMEM/F12充分清洗生精小管，重复操作3次；
6）向步骤5）得到的生精小管中加入酶溶液Ⅱ，所述的酶溶液Ⅱ由终浓度为4mg/mL的胶原酶溶液、2.5 mg/mL的透明质酸酶和2mg/mL的胰蛋白酶组成，配制后过滤除菌，其中所述胶原酶为IV型胶原酶；
7）将步骤6）中的混合液用10mL玻璃移液管转移至另一新的离心管中，置于34℃水浴摇床，孵育15min；
8）消化后，用10mL玻璃移液管轻轻吹打10~15次，镜检，确保生精小管全部消化为单个细胞；
9）加入30mL新鲜的DMEM/F12和10%FBS终止消化，静置10min，收集上清液，用1000rpm离心5min；
10）弃上清液，加入50mL DMEM/F12重悬细胞，静置10min，收集上清液，1000rpm离心5min；
11）弃上清液，加入适量新鲜DMEM/F12重悬细胞，用40µm尼龙网过滤，除去细胞团；
12）将步骤11）得到的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液，加入新鲜DMEM/F12；
13）将0.1%明胶3mL加入到25cm2的培养瓶中，34℃培养箱孵育1小时，去掉明胶后，将步骤12）得到的细胞悬液加入培养瓶中培养3小时后，分离生殖细胞和支持细胞，具体方法如下：将细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，34℃培养3小时，支持细胞首先贴于培养瓶底，而生殖细胞仍悬浮于培养基中，收集培养基后1000rpm离心5min，弃上清液，收集生殖细胞；
14）将步骤13）中分离的生殖细胞经免疫磁珠激活细胞分选术（MACS）分离GPR125-阳性精原干细胞，具体步骤如下：
a）将步骤13）中得到的生殖细胞重悬于1mL DMEM培养液，在1mL细胞悬液中加入25µL GPR125抗体，4°C旋转培养过夜；
b）孵育后，用0.4%台盼蓝拒染法检测细胞活力，然后用BSA-EDTA-PBS缓冲液将细胞洗涤3次，5min/次，最后将细胞重悬于80µL BSA-EDTA-PBS缓冲液中；
c）将20µL 磁性微珠加入细胞悬液，4°C旋转培养，时间不超过20min，补加400µLBSA-EDTA-PBS缓冲液，终体积为500µL；
d）取5µL 细胞悬液用0.4%台盼蓝拒染法检测细胞活力；
e）将步骤c）得到的细胞悬液经MACS预分离器（30µm）过滤后，转入BSA-EDTA-PBS缓冲液平衡的分离柱中，同时将分离柱置于磁场中，BSA-EDTA-PBS缓冲液为含有终浓度0.5%BSA和2mM EDTA的冰冷PBS缓冲液，配制后过滤除菌；
f）用BSA-EDTA-PBS缓冲液冲洗分离柱3次，0.5mL/次，收集未被标记的细胞（GPR125阴性细胞）；
g）将分离柱脱离磁场，添加1mL BSA-EDTA-PBS缓冲液，并轻轻按下柱塞避免产生气泡，收集GPR125-阳性精原细胞，为提高细胞纯度，将收集的细胞进行第二次MACS分离；
15)将10ng/mL丝裂霉素加入生长密度为80%的支持细胞上，34°C培养箱孵育2小时，PBS清洗6次后用0.25%胰酶消化3min，加入10%FBS的DMEM/F12终止，1000rpm离心5min，弃上清液，收集丝裂霉素处理的人支持细胞。
16)将步骤14）中分离的GPR125-阳性精原干细胞与步骤15）收集的丝裂霉处理过的人支持细胞用DMEM/F12悬浮后，按1:3比例混合，0.4mL 106个混合细胞和0.4mLMatrigel于冰上混合均匀，然后放入12孔培养板中；
17）将步骤16）中铺好细胞的12孔培养板放入34°C培养箱孵育1小时，待Matrigel胶凝固后，缓慢加入1mL诱导培养基，34°C培养箱培养，每天更换新的诱导培养基，所述诱导培养基配置如下：DMEM/F12、10% 血清替代物(KSR)，2µM 视黄酸 (RA)、100ng/mL 干细胞生长因子（SCF）、100ng/mL BMP4和10-6M 睾酮；
18）诱导20天后，采用流式细胞术（FACS）分离得到单倍体精子细胞，具体步骤如下：
a）诱导20天后，将诱导培养基去掉，加入Disperse孵育1.5小时，使细胞从凝胶中分离出来，1200rpm离心5min，弃上清，
b）将步骤a得到的细胞用BSA-EDTA-PBS缓冲液悬浮，加入10μg/mL Hoechst33342，34°C孵育40min；
c）将步骤b的混合细胞通过流式分选仪分选出单倍体精子细胞。
如图1所示，诱导20天后通过流式分选获得单倍体的效率为17.9％，其中，Hoechst33342为染料名称。
实施例2
通过免疫细胞化学法鉴定实施例1诱导获得的精子细胞，其步骤如下：
a）将收集的单倍体细胞经抹片机，1000rpm，离心5min进行涂片；
b）室温下，用PBS将细胞涂片冲洗2次，3min/次，用200µl 10%正常山羊血清封闭30min；
c）将一抗用100µL PBS按1:200稀释，34°C孵育1小时或4℃孵育过夜，所述一抗为ACROSIN、PRM2、正常兔IgG或小鼠IgG，阴性对照由PBS代替一抗；
d）孵育后，细胞用PBS冲洗3次，200µL/次；
e）细胞用荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG或罗丹明标记的羊抗兔或罗丹明标记的羊抗小鼠IgG二抗孵育1小时，并用DAPI进行细胞核染色，在荧光显微镜下观察细胞。
如图2所示：该图为通过免疫荧光检测获得的单倍体是否是精子，该结果表明，诱导获得的细胞具有精子细胞特异性表达的蛋白ACOSIN和PRM2，为精子细胞。
实施例3
通过荧光原位杂交技术（FISH）检测实施例1诱导获得的精子细胞染色体数目，其步骤如下：
A）将收集到的单倍体细胞加入固定液，吹匀静置10min，所述固定液为甲醇与乙酸按照体积比3:1配制的混合液；
B）1500rpm离心10min，去上清，再次加入固定液，吹匀静置10min；
C）1500rpm离心10min，去上清，留20 µL液体；
D)将步骤C)的细胞吹匀，滴到载玻片上，56°C烤片25min；
E)将步骤D）的载破片放入下面液体中依次浸泡：1mol/L氢氧化钠 2min，2×SSC10min，75%乙醇2min，85%乙醇2min，100%乙醇2min；
F)将步骤E）的载玻片晾干，滴加探针10µL，用18×18盖玻片封片，78°C 8min，42°C过夜进行变性杂交；
G）将步骤F）的载玻片放入2×SSC 2min去掉盖玻片，然后依次放入以下液体中处理：50%甲酰胺2min，2×SSC 2min，0.1%NP40 3min，70%乙醇2min，100%乙醇3min；
H）将步骤G)的载玻片晾干，DAPI孵育10min，镜检观察。
如图3所示，该图为通过FISH技术检测诱导获得的精子的染色体数目，其中A为细胞中18号染色体的数目，B为细胞中X染色体数目，C为Y染色体的数目，D为DAPI染色显示的细胞核，E为上述4幅图合并的结果，该结果表示诱导获得的精子细胞具有正常的染色体数目。
实施例4
通过圆形精子显微注射法（ROSI）检测实施例1诱导获得的精子细胞的授精能力，其步骤如下：
用0.1%的透明质酸酶将小鼠卵母细胞周围的颗粒细胞去掉，选择带有第一极体的卵子待用，通过带有脉冲仪的显微操作系统将诱导获得的圆形精子注射到卵子中，然后移入37°C培养箱观察胚胎发育情况。
如图4所示：将本发明诱导获得的精子显微注射小鼠卵母细胞后，对其胚胎发育情况检测，其中A为显微注射6小时后，胚胎发育到原核期； B为胚胎发育到2细胞期；C为胚胎发育到4-8细胞期胚胎。由图可见，体外诱导获得的精子细胞具有受精的能力。
本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)称取0.8～1.5g睾丸组织置于10mL DMEM/F12中，剪成体积约3×3×3mm3组织小块，用DMEM/F12清洗3次，除去残留的血细胞；
2)用剪刀将睾丸组织剪至半液态，添加20mL DMEM/F12，然后将组织转移到120mL容器内；
3)向步骤2)的睾丸组织中加入酶消化液Ⅰ，置于34℃水浴摇床中，孵育10～15min；
4)镜检，确保所有组织块均已消化成单个生精小管，将含有生精小管的消化液转移至另一新的50mL离心管，加入30mL新鲜的DMEM/F12终止消化；
5)静置5min，用25mL玻璃移液管移除上清液，加入50mL新鲜的DMEM/F12充分清洗生精小管，重复操作3次；
6)向步骤5)得到的生精小管中加入酶消化液Ⅱ；
7)将步骤6)中的混合液用10mL玻璃移液管转移至另一新的离心管中，置于34℃水浴摇床，孵育15min；
8)消化后，用10mL玻璃移液管轻轻吹打10～15次，镜检，确保生精小管全部消化为单个细胞；
9)加入30mL新鲜的DMEM/F12和10％FBS终止消化，静置10min，收集上清液，用1000rpm离心5min；
10)弃上清液，加入50mL DMEM/F12重悬细胞，静置10min，收集上清液，1000rpm离心5min；
11)弃上清液，加入适量新鲜DMEM/F12重悬细胞，用40μm尼龙网过滤，除去细胞团；
12)将步骤11)得到的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液，加入新鲜DMEM/F12；
13)将0.1％明胶3mL加入到25cm2的培养瓶中，34℃培养箱孵育1小时，去掉明胶后，将步骤12)得到的细胞悬液加入培养瓶中培养3小时后，分离生殖细胞和支持细胞；
14)将步骤13)中分离的生殖细胞经免疫磁珠激活细胞分选术分离GPR125-阳性精原干细胞；
15)将10ng/mL丝裂霉素加入生长密度为80％的人支持细胞上，34℃培养箱孵育2小时，PBS清洗6次后，用0.25％胰酶消化3min，加入含10％FBS的DMEM/F12终止，1000rpm离心5min，弃上清液，收集丝裂霉素处理的支持细胞；
16)将步骤14)中分离的GPR125-阳性精原干细胞与步骤15)收集的丝裂霉素处理过的人支持细胞用DMEM/F12悬浮后，按1:3比例混合，0.4mL 106个混合细胞和0.4mL Matrigel于冰上混合均匀，然后放入12孔板中；
17)将步骤16)中接种好细胞的12孔培养板放入34℃培养箱孵育1小时，待Matrigel胶凝固后，缓慢加入1mL诱导培养基，34℃培养箱培养，每天更换新的诱导培养基；所述诱导培养基配置如下：DMEM/F12、10％血清替代物(KSR)、2μM视黄酸(RA)、100ng/mL干细胞生长因子(SCF)、100ng/mL BMP4和10-6M睾酮；
18)诱导20天后，采用流式细胞术分离得到单倍体精子细胞。
2.根据权利要求1所述的人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，步骤3)中所述的酶消化液Ⅰ由终浓度为2mg/mL的胶原酶溶液和1μg/μl的DNase Ⅰ组成，配制后过滤除菌，其中所述胶原酶为IV型胶原酶。
3.根据权利要求1所述的人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，步骤6)中所述的酶消化液Ⅱ由终浓度为4mg/mL的胶原酶溶液、2.5mg/mL的透明质酸酶和2mg/mL的胰蛋白酶组成，配制后过滤除菌，其中所述胶原酶为IV型胶原酶。
4.根据权利要求1所述的人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，步骤13)所述的分离生殖细胞和支持细胞，具体方法如下：将细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，34℃培养3小时，支持细胞首先贴于培养瓶底，而生殖细胞仍悬浮于培养基中，收集培养基后1000rpm离心5min，弃上清液，收集生殖细胞。
5.根据权利要求1所述的人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，步骤14)中所述的免疫磁珠激活细胞分选术(MACS)分离获得GPR125-阳性精原干细胞，具体步骤如下：
a)将步骤13)中得到的生殖细胞重悬于1mL DMEM培养液，在1mL细胞悬液中加入25μLGPR125抗体，4℃旋转培养过夜；
b)孵育后，用0.4％台盼蓝拒染法检测细胞活力，然后用BSA-EDTA-PBS缓冲液将细胞洗涤3次，5min/次，最后将细胞重悬于80μL BSA-EDTA-PBS缓冲液中；
c)将20μL磁性微珠加入细胞悬液，4℃旋转培养，时间不超过20min，补加400μL BSA-EDTA-PBS缓冲液，终体积为500μL；
d)取5μL细胞悬液，用0.4％台盼蓝拒染法检测细胞活力；
e)将步骤c)得到的细胞悬液经MACS预分离器过滤后，转入BSA-EDTA-PBS缓冲液平衡的分离柱中，同时将分离柱置于磁场中，BSA-EDTA-PBS缓冲液为含有终浓度0.5％BSA和2mMEDTA的冰冷PBS缓冲液，配制后过滤除菌；
f)用BSA-EDTA-PBS缓冲液冲洗分离柱3次，0.5mL/次，收集未被标记的细胞GPR125-阴性细胞；
g)将分离柱脱离磁场，添加1mL BSA-EDTA-PBS缓冲液，并轻轻按下柱塞避免产生气泡，收集GPR125-阳性精原干细胞，为提高细胞纯度，将收集的细胞进行二次MACS分离。
6.按权利要求1所述的人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，所述步骤18)中采用流式细胞术分选单倍体精子细胞，具体步骤如下：
a)诱导20天后，将诱导培养基去掉，加入Disperse孵育1.5小时，使细胞从凝胶中分离出来，1200rpm离心5min，弃上清，
b)将步骤a得到的细胞用BSA-EDTA-PBS缓冲液悬浮，加入10μg/mL Hoechst 33342，34℃孵育40min；
c)将步骤b的混合细胞通过流式分选仪分选出单倍体精子细胞。
7.根据权利要求1所述的人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，通过免疫细胞化学法鉴定诱导获得的精子细胞，其步骤如下：
a)将收集的单倍体细胞经甩片机，1000rpm，离心5min进行细胞涂片；
b)室温下，用PBS将细胞涂片冲洗2次，3min/次，用200μl 10％正常山羊血清封闭30min；
c)将一抗用100μL PBS按1:200稀释，34℃孵育1小时或4℃孵育过夜，所述一抗为ACROSIN抗体、PRM2抗体、正常兔IgG或小鼠IgG，阴性对照由PBS代替一抗；
d)孵育后，细胞用PBS冲洗3次，200μl/次；
e)细胞用荧光素标记的羊抗兔IgG或罗丹明标记的羊抗兔或罗丹明标记的羊抗小鼠IgG二抗孵育1小时，并用DAPI进行细胞核染色，在荧光显微镜下观察细胞。
8.根据权利要求1所述的人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，通过荧光原位杂交技术(FISH)检测诱导获得的精子细胞染色体数目，其步骤如下：
A)将收集到的单倍体细胞加入固定液，吹匀静置10min，所述固定液为甲醇与乙酸按照体积比3:1配制的混合液；
B)1500rpm离心10min，去上清，再次加入固定液，吹匀静置10min；
C)1500rpm离心10min，去上清，留20μL液体；
D)将步骤C的细胞吹匀，滴到载玻片上，56℃烤片25min；
E)将步骤D的载破片放入下面液体中依次浸泡：1mol/L氢氧化钠2min，2×SSC10min，75％乙醇2min，85％乙醇2min，100％乙醇2min；
F)将步骤E的载玻片晾干，滴加探针10μL，用18×18盖玻片封片，78℃8min，42℃过夜进行变性杂交；
G)将步骤F的载玻片放入2×SSC 2min去掉盖玻片，然后依次放入以下液体中处理：50％甲酰胺2min，2×SSC 2min，0.1％NP40 3min，70％乙醇2min，100％乙醇3min；
H)将步骤G的载玻片晾干，DAPI孵育10min，镜检观察；
通过圆形精子显微注射法(ROSI)检测诱导获得精子细胞的授精能力，其步骤如下：
用0.1％的透明质酸酶将小鼠卵母细胞周围的颗粒细胞去掉，选择带有第一极体的卵子待用，通过带有脉冲仪的显微操作系统将诱导获得的圆形精子细胞注射到卵子中，然后移入37℃培养箱观察胚胎的发育情况。
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