CN100334205C

CN100334205C - 一种生产水牛可控性别体外胚胎的方法

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Publication number: CN100334205C
Application number: CNB2005100311590A
Authority: CN
Inventors: 卢克焕; 张明; 陆阳清
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2005-01-12
Filing date: 2005-01-12
Publication date: 2007-08-29
Anticipated expiration: 2025-01-12
Also published as: CN1654636A

Abstract

一种生产水牛可控性别体外胚胎的方法，利用屠宰场水牛卵巢回收卵母细胞，经体外成熟培养后，与经流式细胞仪分离的新鲜或冷冻的良种公牛的X或Y精子进行体外受精。受精卵在体外培养发育到囊胚期时回收胚胎冷冻保存待用于移植产生出期望性别的后代。本发明的优点是可使胚胎生产性别化及工厂化，从而加快高产奶水牛扩繁速度。

Description

一种生产水牛可控性别体外胚胎的方法

技术领域

本发明属生物工程技术领域，特别涉及动物性别控制的方法。

背景技术

哺乳动物个体的性别在精子和卵子受精时由不同的染色体重新分配和组合所决定。性别的遗传基础是依赖于精子细胞的表型，若携带X染色体的精子与卵子结合，受精卵的染色体组合为XX则发育为雌性；若携带Y染色体的精子与卵子结合，受精卵的染色体组合为XY则发育为雄性。用分离的X或Y精子给母畜人工授精或与卵母细胞体外受精，在受精之前便可预知后代的的性别，从而达到性别控制的目的。

利用精子分离技术与体外受精相结合来生产动物后代，最早是在英国剑桥生物有限公司(ABC)展开的。Cran等(1993)是最早开展这一研究的人。他们把分离精子受精后产生的胚胎移植到9头受体母牛，其中4头怀孕，并产下6头(3头母犊牛和3头公犊牛)预选性别的犊牛，性别准确率为100％。1995年，Cran等又进行了第二项研究，即用分离的Y精子生产雄性犊牛的实验。他们将由分离的Y精子进行IVF后获得的106枚胚胎冷冻后进行移植，共产下41头犊牛，其中37头为公犊牛，雄性比例为90％。

除了牛的分离精子IVF的研究外，还有人进行了猪的分离精子IVF的研究，通过胚胎移植后成功地产下了仔猪。但用水牛的分离精子进行体外受精，目前国内外还未见有报道。

水牛是我国南方的水牛奶具有很高的营养价值，但就目前我国奶水牛的现状看，其数量和奶产量，还远远满足不了市场的需求。而通过生产可控性别胚胎的胚胎生产技术能迅速增加奶水牛头数，从而提高奶水牛的选择强度，这对加快奶水牛业的发展意义非常重大。

本专利的发明者之一卢克焕博士、教授，是国际知名科学家，1988年在爱尔兰研究成功世界首例试管双犊，在“七五”和“八五”期间曾主持国家“863”重大项目“牛体外受精研究与开发”课题研究。该课题的各项技术指标均达到国际先进水平，并研究成功全国数量最多的“试管牛”群共228头。该课题于2001年获国家科技进步二等奖。此外他与本专利的另一发明者张明博士，教授，曾一起在美国的XY公司从事牛分离精子体外受精的研究。

本发明的目的是利用精子分离技术与体外受精技术相结合这一动物繁殖新技术来生产预知性别的水牛胚胎，以达到控制良种奶水牛后代的性别。同时也为良种奶水牛胚胎工厂化、性别化生产提供技术支撑。生产水牛可控性别体外胚胎这一方法的最大特点是高效、省时、省力及节省费用，因此该方法是目前加快高产奶水牛扩繁速度最为有效的技术手段之一。

发明内容

利用流式细胞仪分离XY精子这一目前国际最先进和有效的精子分离技术结合体外受精，大量生产预知性别的水牛胚胎，以满足市场对可控性别水牛胚胎的需求，从而达到加速良种奶水牛的繁育速度，促进水牛奶业的发展，该技术方法在国际上为首例。具体内容如下：

(1)屠宰场回收水牛卵巢，置于无菌生理盐水中，用保温瓶带回实验室。从清洗干净的卵巢表面抽取卵母细胞，将卵母细胞置于收集液中，在体视显微镜下选取卵母细胞，用收集液洗涤2～3次，再用成熟培养液洗涤一次。

(2)将卵母细胞转入添加有血清、激素和卵泡液及含Hepes(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)的TCM199(组织培养基)培养皿中，放入培养箱中进行成熟培养。

(3)将由流式细胞仪分离的新鲜或冷冻解冻的水牛X或Y精子，通过Percoll(哌可液)梯度离心将精液中死精子与活精子分开。

(4)将体外培养成熟后的卵母细胞从成熟液中拣出，用受精液洗涤2次后转入用受精液制成的受精滴中。精子稀释后将X或Y精子加入到含有卵母细胞的受精滴中，放入培养箱中进行体外受精培养。

(5)体外受精培养6～8小时后，将假定的受精卵洗涤干净，然后置于预先制备好的、含有新生牛血清的牛颗粒细胞单层培养液中，放入培养箱中体外培养6～8天。

(6)在受精后第6、第7和第8天时回收囊胚，将发育良好的优质胚胎进行冷冻保存处理，然后置于液氮罐中贮存。

与目前的体外胚胎生产技术相比，本发明的优点在于：

(1)采用此种方法可使胚胎生产性别化。因为在受精时用通过流式细胞仪分离的X或Y精子有选择地进行体外受精，可以控制胚胎的性别，即如选择X精子与体外成熟的卵母细胞进行受精所产生的胚胎为雌性，而选择Y精子受精所产生的胚胎为雄性，然后用这些可控性别的胚胎进行移植就可产下所期望性别的后代来。

(2)通过这一技术途径可使胚胎生产工厂化。利用本方法可以将从屠宰厂回收的卵巢卵母细胞的30-40％发育成可移植用的胚胎。每年生产可控性别胚胎1000枚以上。

(3)该方法与其他多种现代胚胎生产技术相结合进行奶水牛的繁育，可提高奶水牛的繁育效率，迅速增加良种奶水牛数量，提高奶水牛群质量。因为目前分离XY精子的准确率为90％以上，用X精子受精产生的胚胎移植后90％以上的后代为母牛，显著地改变自然条件下50∶50的性别比例，因此，使用性别控制技术进行繁育奶牛的效率将比无性别控制的提高近一倍，从而可以节省近一半的时间，精力和费用。

具体实施方式

具体实施例：

从屠宰场采集水牛卵巢，置于25℃生理盐水中，用保温瓶带回实验室。用无菌的生理盐水清洗卵巢3-4次，用装有8号的注射器，从卵巢表面直径为2-8mm卵泡中抽取卵母细胞。在体视显微镜下选取有三层以上致密颗粒细胞，且外形明亮细胞质均匀的卵母细胞，用Hepes缓冲的、添加有5mmol/LNaHCO₃(碳酸氢钠、)3％OCS(发情牛血清)的TCM199的卵母细胞收集液洗涤两次，再用成熟液洗涤一次，转入培养皿中进行成熟培养。成熟培养液为Hepes缓冲的TCM199+5％OCS+0.1μg/mL FSH(促卵泡素)+3％BFF(牛卵泡液)。每培养皿的成熟液为1mL，放入卵母细胞50-100枚，39℃，5％CO₂(二氧化碳)的空气及最大湿度的条件下培养21～24小时。

将由流式细胞仪分离的新鲜或冷冻解冻的水牛X或Y精子，将精液放入2mL90％：2mL45％Percoll梯度的离心管中，700xg离心20分钟，弃上清，加入1mL受精液400xg离心5分钟，移去上层悬液，留下约50μl的精液。在显微镜下评价精子活力，并用血球计数板计算精子数以计算精子浓度。将卵母细胞从成熟培养皿中取出，经受精液洗涤2次，转入受精滴中。受精液为修改的Tyrodes(台罗氏液)培养液，添加有10mg/mLBSA(牛血清白蛋白)、40μl/mLPHE(青霉素胺、牛黄酸、肾上腺素混合液)、5mM咖啡因、30μg/mL肝素。受精滴为20μl，每滴放入15-20枚卵母细胞。将稀释后的精子加到受精滴中，使其最终浓度达2×10⁶/ml，在39℃，5％CO₂的空气及最大湿度条件下培养6～8h。

受精后6～7h，在受精滴中用吸管反复吹打假定的受精卵，去掉部分卵丘细胞。将假定的受精卵从受精滴中移出，用体外培养液洗涤两次转入含有黄牛颗粒细胞的共培养系统内进行培养。培养液为Hepes缓冲的TCM199+10％NCS(新生牛血清)+0.11mg/mL的丙酮酸钠，每滴加入培养液25μl，放入50枚受精卵，在39℃，5％CO₂，5％O2.90％ N₂及最大湿度条件下体外培养6～8天，培养期间每两天换液一次，每次换掉1/2液。在受精后第6、第7和第8天时回收囊胚，将发育良好的优质胚胎进行冷冻保存处理，然后置于液氮罐中贮存。

采用上述方法，在水牛体外胚胎生产的过程中，卵母细胞的体外成熟率为70％以上，卵母细胞体外受精后的卵裂率为60％左右，囊胚的发育率为30％左右。

Claims

1.一种生产水牛可控性别体外胚胎的方法，其特征是由下列步骤组成：

(1)从屠宰场回收水牛卵巢，置于20～25℃无菌生理盐水中，用保温瓶带回实验室；从清洗干净的卵巢表面抽取卵母细胞，将卵母细胞置于收集液中，在体视显微镜下选取卵母细胞，用收集液洗涤2～3次，再用成熟培养液洗涤一次；其中，卵母细胞收集液为20～30mMN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲的、添加有2～8mmol/L碳酸氢钠、2～5％发情牛血清的TCM199；

(2)将卵母细胞转入成熟培养液中，放入培养箱中进行成熟培养，培养时间为21～24小时，培养箱内条件为39℃，5％CO₂的空气及最大的湿度；其中，成熟培养液为20～30mMN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲的TCM199+3～8％发情牛血清+0.1μg/mL促卵泡素+2～5％牛卵泡液；

(3)将由流式细胞仪分离的新鲜或冷冻解冻的水牛X或Y精子，通过Percoll梯度离心将精液中死精子与活精子分开；其中，Percoll梯度离心是将精液放入2mL90％：2mL 45％Percoll梯度的离心管中，700xg离心20分钟，弃上清，加入1mL受精液400xg离心5分钟；

(4)将体外培养成熟后的卵母细胞从成熟液中拣出，用受精液洗涤2次后转入用受精液制成的受精滴中；精子稀释后将X或Y精子加入到含有卵母细胞的受精滴中，放入培养箱中进行体外受精培养；其中，受精液为改进的台罗氏液培养液，添加有5～15mg/mL牛血清白蛋自、20～50μl/mL青霉素胺、牛黄酸、肾上腺素混合液、2～7mM咖啡因、30～60μg/mL肝素，受精滴大小为15～30μl，每滴放入卵母细胞15～20枚，将精子加入到受精滴中，使精子浓度达2×10⁶/mL，培养条件为39℃，5％CO₂的空气及最大的湿度，培养时间为6～8小时；

(5)体外受精培养6～8小时后，将受精卵洗涤干净，然后置于预先制备好的、含有新生牛血清的牛颗粒细胞单层培养液中，放入培养箱中体外培养6～8天；其中，培养液为20～30mM N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲的TCM199+5～15％新生牛血清+0.05～0.15mg/mL的丙酮酸钠，并用黄牛颗粒细胞作为单层，在39℃，5％CO₂，5％O₂及最大湿度条件下体外培养6～8天，培养期间每两天换液一次，每次换掉1/2液；

(6)在受精后第6、第7和第8天时回收囊胚，将发育良好的优质胚胎进行冷冻保存处理，然后置于液氮罐中贮存；其中，受精后第6、第7和第8天囊胚，是指具有囊胚腔和内细胞团的胚胎，包括早期囊胚、囊胚、正在扩张和已经扩张囊胚。