KR20080085426A

KR20080085426A - 돼지 난자의 체외 성숙 방법

Info

Publication number: KR20080085426A
Application number: KR1020070026925A
Authority: KR
Inventors: 박창식; 김명철; 진동일; 이영주
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2007-03-20
Filing date: 2007-03-20
Publication date: 2008-09-24

Abstract

본 발명은 돼지 미성숙난자를 체외성숙배지에서 배양하는 체외성숙 방법에 있어서, 체외성숙배지에서 난포막을 첨가하여 36~48시간 체외배양하는 것을 특징으로 하는 돼지 난자의 체외성숙 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면 돼지 미성숙 난자의 체외 성숙율을 높일 수 있다. 뿐만 아니라 본 발명의 방법에 의해 체외성숙된 돼지 난자를 사용하여 체외수정할 경우, 다정자 침입율을 낮추고 정상 수정율을 높일 수 있으며, 수정란을 체외수정할 때 배반포 형성율을 크게 높일 수 있다.

돼지, 수정란 이식, 난모세포, 체외성숙, 난포란

Description

돼지 난자의 체외 성숙 방법{Method for in vitro maturation of porcine oocyte}

도 1은 돼지의 난소 중 미성숙 난자의 체외성숙 시 사용된 난포막을 보여주는 사진.

도 2는 본 발명에 의해 체외 성숙된 난자를 체외 수정한 후 배양하여 얻어진 배반포의 사진.

본 발명은 돼지 난자의 체외 성숙 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지 난자의 체외성숙율과 수정 후 배반포 형성율을 향상시킬 수 있는 난포막을 이용한 돼지 난자의 체외 성숙 방법에 관한 것이다.

오늘날까지 돼지의 번식학적 측면에서의 개량은 주로 우수한 수퇘지를 이용 한 인공수정에 의존하여 왔으나, 인공수정만으로는 돼지 개량의 한계점에 와있다. 따라서 우수한 암퇘지를 이용한 돼지 개량에 눈을 돌리게 되었고, 이러한 필요성에 의하여 개발된 기술이 수정란 이식(embryo transfer)이다. 수정란 이식은 돼지의 유전적 개량뿐만 아니라, 성비조절, 일란성 단태생산, 핵이식, 외래유전자의 도입, 배아의 초기발생과 유전자 발현의 기전 구명, 질병의 조절 등의 연구에도 크게 기여할 수 있다는 측면에서 중요시 되고 있다.

포유동물의 수정란 이식을 최초로 성공한 사람은 영국의 Heape(1890, Proc. Roy. Soc. 48: 457)로서 그는 순종 앙고라 토끼의 수정란을 벨지안종 암토끼에 이식하여 앙고라종 자토를 생산하는데 성공하였다. 돼지의 수정란 이식은 Kvansnickii(1951, Interbreed ova transplantation. Sovetsk, Zootech. 1: 36)에 의하여 최초로 성공하였으며, 오늘날 대부분의 실험실에서 많이 사용되고 있는 수정란의 회수와 이식방법이 1960년대 Hancock과 Hovell (1962, J. Reprod. Fert. 4: 195), Dziuk 등 (1964, J. Anim. Sci. 23: 37), 그리고 Vincent 등 (1964, J. Anim. Sci. 23: 1084)에 의하여 개발된 이래 주로 실험실 내에서의 연구에 한정되어 왔다.

그러나 최근 생체내 (in vivo)에서 성숙된 난자를 체외수정시켜 정상자돈을 생산한 결과가 Cheng(1985, In vitro fertilization of farm animal oocytes. Ph. D. Thesis. Council for Nation Academic Awards), Yoshida(1987, Jpn. J. Vet. Sci. 49: 711; 1989, Jpn. J. Anim. Reprod. 35: 34), Nagai 등(1988, J. Reprod. Fert. 84: 585)에 의하여, 생체외 (in vitro)에서 성숙시킨 난자를 체외수정시켜 정상자돈을 생산한 결과가 Mattioli 등(1989, Theriogenology 31: 1201)에 의해서 보고됨으로써 돼지 수정란 이식 기술의 실용화 가능성을 나타내었다. 우리나라에서는 이 등(1988, 한국축산학회지 30(7): 403)이 5두의 공란돈으로부터 67개의 수정란을 회수한 후 5두의 수란돈에 이식하여 18두의 자돈을 생산함으로써 돼지 수정란 이식의 역사가 시작되었다.

Kikuchi 등(2002, Biology of Reproduction 66:1033)은 체외에서 성숙시킨 돼지 난자를 체외수정 시킨 후 5일과 6일동안 체외배양 시키고 배양 후 발달한 양질의 배반포만을 선별하여 3마리의 대리모에 각각 50개의 배반포를 이식한 결과 총 19마리의 자돈을 생산하였다. 또한 Suzuki 등(2006, Theriogenology 65:374)은 우태아혈청을 첨가한 배지에서 체외성숙시킨 난자를 체외수정시켜 6일간 배양시킨 후 생산된 배반포를 두 마리의 대리모에 이식하여 7마리의 자돈을 생산하였다. 그러나, 기존의 보고들은 많은 수의 배반포를 얻기 위하여 많은 난자를 준비해야 하고, 수정란을 5-6일간 배양한 후 이식하여야 하는 번거로움이 있다.

수정란 이식에 의한 돼지의 생산에 있어, 수정에 사용된 난자의 질은 단순히 인공수정의 성공 여부 뿐 아니라, 수정란의 이식에 의한 돼지의 생산 자체의 성공에 결정적인 역할을 한다. 특히 체외수정의 경우에는 수정란 이식을 위하여 많은 수의 난자가 필요하기 때문에 최근에는 도축장에서 도축되는 돼지들로부터 회수한 난자를 체외성숙시켜 사용하고 있다. 따라서 체외성숙된 난자들이 자연 배란된 난자와 같은 수준의 질을 갖도록 할 수 있는 체외성숙 방법의 개발이 요구되고 있다.

난포막(follicle shell)은 돼지 미성숙 난자의 세포질 성숙을 향상시키고(Mattioli 등, 1989, Theriogenology 31:1201), 미성숙 난자내 cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 농도와 glutathione 농도를 증가시켜 체외수정 후 초기 배아 발달을 촉진시킨다(Abeydeera 등, 1998, Biol Reprod 58:213)고 알려져 있다. 이를 이용하기 위하여 Abeydeera 등(Biol Reprod 58:213, 1998)은 난포로부터 주사기로 난포액을 채취하고, 현미경하에서 난포액에 포함되어 있는 난포막 조각(follicle shell piece)을 실험자가 주관적으로 선택한 후 세척하여 미성숙 난자의 체외 배양 시 첨가하여 이용하였다. 그러나 이는 처리과정의 번거로움으로 인하여 실용화 되지 못하였다. 따라서 보다 간편한 방법에 의해 난포막의 효능을 난자의 체외성숙 시 이용할 수 있는 방안이 요구되어진다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 체외 성숙율과 수정 후 배반포 형성율을 높일 수 있는 돼지 난자의 체외성숙 방법을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 돼지 난자의 체외성숙 방법은 돼지 미성숙난자를 체외성숙배지에서 배양하는 체외성숙 방법에 있어서, 체외성숙배지에서 난포막을 첨가하여 36~48시간 체외배양하는 것을 특징으로 한다.

상기 난포막은 도축장에서 수집된 난소에서 도 1에 표시된 부분의 볼록한 부분을 4-6 mm 직경으로 자르는 것에 의해 간단하게 준비할 수 있다. 난소의 난포막을 수술용 가위로 잘라, 성숙배지에 넣고 돼지 미성숙 난자와 배양시켰다. 2mL의 배지에 난포막을 첨가하고 체외성숙한 후 성숙난자율을 조사한 결과 난포막이 2개 첨가되었을 경우 유의적으로 성숙난자율이 증가하였다. 그러나 난포막을 첨가한 상태에서 배양한 난자를 체외수정한 결과 배반포율이 모두 유의적으로 향상되어 난포막의 첨가가 단순히 난자의 성숙율을 증가시킬 뿐만 아니라 난자의 질의 향상에 기여함을 확인할 수 있었다. 상기 난포막의 첨가 수는 4~6mm 난포막을 기준으로 하였을 때 성숙난자율과 배반포율의 향상 효과로 보아 2mL 배지당 1~6개가 첨가되는 것이 바람직하며, 그 중에서도 2개가 첨가되는 것이 가장 바람직하다. 그러나 이는 4~6mm 난포막을 기준으로 하는 것으로서, 사용한 난포막의 크기가 작을 경우에는 그에 적절하게 조절하는 것이 당연하다.

체외 성숙의 효율을 높이기 위해서는 상기 체외 성숙시간은 36~48시간 이루어지는 것이 바람직하다. 돼지 미성숙 난자는 보통 체외배양 후 36시간 이후에는 핵 성숙이 이루어져 난자의 핵은 제 2감수분열 중기(metaphase II)에 이르러서 정자의 자극 (체외수정)전까지 휴지하게 되므로 최소 36시간이상 배양하여야 한다. 그러나, 난자의 성숙이 완전해 지기 위해서는 세포질 성숙도 필요하므로 일반적으로 체외성숙 배양은 44~48시간 정도인 것이 가장 바람직하다. 48시간 이후의 휴지기 성숙 난자는 정자의 자극이 없으면, 스스로 퇴화되어 정상적인 수정이 이루어지지 않는다.

상기 배지는 미성숙 난자의 체외성숙에 사용되는 배지라면, 어느 것을 사용하여도 무방하다. 본 발명의 실시예에서는 표 1에 기재된 조성비를 갖는 배지에 대하여 난포막을 첨가하지 않은 상태에서 미성숙난자를 배양한 결과 배지의 종류에 따라 유의적인 차이가 없었으므로, 그 중 배지 3(조직배양배지(tissue culture medium, TCM) 199 배양배지를 기본 배지로 하여 26.19 mM NaHCO₃, 3.05 mM glucose, 0.91 mM sodium pyruvate, 75 ㎍/ml sodium penicillin G, 50 ㎍/ml streptomycin sulfate 및 0.1% polyvinyl alcohol(PVA)이 첨가된 배지)을 체외성숙 배지로 사용하였으나, 이는 실험의 편의를 위하여 비교적 조성이 단순한 배지를 선택한 것에 불과하며 이에 한정되는 것은 아님은 당연하다.

통상 상기 체외배양은 난포막이 첨가된 2 ml 체외성숙배지에 0.5 ㎍/ml luteinizing hormone (LH), 0.5 ㎍/ml follicular stimulating hormone (FSH), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF), 10% porcine follicular fluids (pFF), 0.57 mM cysteine를 추가로 첨가한 배지에서 38.5^oC, 5% CO₂의 항온기(incubator)에서 20~24시간 배양하고, 그 후 FSH와 LH를 제외한 배지에서 추가로 10~24시간 배양한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 배지 종류에 따른 돼지 미성숙 난자의 성숙율

일반적으로 돼지 미성숙 난자의 체외성숙 시 널리 사용되고 있는 성숙 배지의 종류에 따른 난자의 성숙율의 차이를 확인하기 위하여 표 1의 조성을 갖는 각 배지에서 난자의 체외성숙율을 조사하였다.

보다 구체적으로, 도축장에서 도살 직후 미경산돈의 난소들을 적출하고 30-35^oC의 0.9% 생리식염수에 담아 실험실로 운반하였다. 난포액과 난구세포(cumulus cell)가 부착된 미성숙 난자를 10 ml 주사기에 18게이지 바늘을 장착하여 2-6 mm 직경의 난포로부터 흡입하여 채취하였다.

흡입된 난포액을 37^oC 수조에 정치시키고, 가라앉은 침전물만을 0.1% polyvinyl alcohol(PVA)이 포함된 TL-HEPES-PVA(114 mM NaCl, 3.2 mM KCl, 2 mM NaHCO₃, 0.4 mM NaH₂PO₄, 0.27 mM glucose, 10 mM sodium lactate, 2 mM CaCl₂·2H₂O, 0.5 mM MgCl₂·6H₂O, 10 mM HEPES, 0.03 mM phenol red, 0.25 mM sodium pyruvate, 0.3% bovine serum albumin (BSA), 75 ㎍/ml penicillin G and 25 ㎍/ml gentamycin sulfate)에 취하여 미성숙 난자만을 골랐다. 미성숙 난자는 난구세포가 치밀하게 부착된 것만을 선택하여 TL-HEPES-PVA로 두 번 세척하고 하기 표 1의 성숙배지로 다시 두 번 세척하여 각각을 준비하였다.

체외성숙에는 표 1에 기재된 조성의 배지를 각각 사용하였다. 미성숙 난자는 2 ml 각 체외성숙배지에 0.5 ㎍/ml luteinizing hormone (LH), 0.5 ㎍/ml follicular stimulating hormone (FSH), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF), 10% porcine follicular fluids (pFF), 0.57 mM cysteine을 첨가한 것에 각각 옮겨 38.5^oC, 5% CO₂의 항온기(incubator)에서 22시간 배양하고, 그 후 FSH와 LH를 제외한 성숙배지에서 추가로 22시간 배양하였다.

44시간 체외성숙 후, 미성숙 난자의 성숙율을 조사하였다. 6회의 반복 실험에 대해 평균과 표준편차를 구하고 그 결과를 표 2에 나타내었다. 각 배지에서 미성숙 난자의 성숙율은 평군 82.1~86.8%였으며, 서로 다른 배지간 난자의 성숙율에 대한 유의적인 차이는 없었다.

실시예 2 : 난포막 첨가에 따른 돼지 미성숙 난자의 성숙율

실시예 1에서 배지의 종류에 따라 난자의 성숙율에 큰 차이가 없었으므로 비교적 간단한 조성을 가진 배지 3을 이용하여 난포막 첨가에 따른 미성숙 난자의 성숙율을 조사하였다. 난포막은 도축장에서 수집된 난소에서 도 1에 표시된 → 부분의 볼록한 부분을 수술용 가위로 4-6 mm 직경으로 잘라 성숙배지에 담가 3번 세척한 후 사용하였다.

배지에 0, 2, 4, 6개의 난포막을 각각 첨가하여 미성숙 난자를 체외배양 한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법에 의해 44시간 체외성숙 후 난자의 성숙율을 조사하였다. 실험은 6회 반복하여 실시하였으며, 그 평균과 표준편차를 표 3에 나타내었다.

표 3에서 확인할 수 있듯이 난자성숙율은 2개의 난포막을 배지에 첨가한 경우 가장 높은 92.2%였다. 난자의 체외성숙 배양 22시간 후와 44시간 후에 각각 배지의 pH를 측정한 결과, 난포막의 수가 증가될수록 pH는 유의적으로 감소하였다. 이로 인하여 4개 이상의 follicle shell은 pH를 낮게하여 돼지 난모세포의 성숙률을 감소시키는 것으로 사료된다.

실시예 3 : 난자의 체외성숙 시 난포막 첨가가 체외수정에 미치는 영향

실시예 2의 각 조건에서 체외성숙된 난자를 최외수정하여 난자의 체외성숙 시 난포막 첨가가 체외수정에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.

실시예 2에서 44시간 성숙된 난자를 0.1% hyaluronidase가 첨가된 TL-HEPES-PVA에 옮겨 피펫팅(pipetting)하여 확장된 난구세포를 제거하였다. 난구세포가 제거된 난자를 TL-HEPES-PVA에 세척한 후, 실체 현미경하에서 난자내에 극체(polar body)가 방출된 것만을 선별하였다. 다시 TL-HEPES-PVA와 체외수정 배지로 각각 두 번 세척한 후 500 μl 체외수정 배지에 30-40개의 난자를 넣었다. 체외수정 배지로는 Tris-buffered medium(mTBM; 113.1 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 10.0 mM CaCl₂, 20.0 mM Tris (hydroxymethyl aminomethane), 11.0 mM glucose, 5.0 mM sodium pyruvate, 1.0 mM caffeine, 75 μg/ml penicillin G, 50 μg/ml streptomycin, 0.57 mM cysteine and 1 mg/ml BSA 포함)을 사용하였으며 4-well multi dish(Nunc, Denmark)에 well당 500 μl씩 분주하고 mineral oil로 피복하여 38.5^oC, 5% CO₂의 항온기에서 4시간 이상 평형 시켜둔 것을 사용하였다.

원정액(fresh semen)은 일주일에 1회 듀록 (Duroc) 종모돈으로부터 채취하였다. 사출된 농후정액(sperm rich fraction)은 85% 이상의 운동성과 정상첨체율 (normal acrosome)을 나타내는 것만을 이용하였다. 채취 후 2시간에 걸쳐 원정액의 온도를 서서히 실온으로 내렸다. 원정액을 15 ml 시험관(BD Falcon, USA)에 옮기고 실온에서 800×g, 10분간 원심분리하였다. 상층액은 깨끗이 버리고 남은 정자 (sperm)에 실온의 10 ml LEN(100 ml distilled water에 11.0 g lactose hydrate, 20 ml egg yolk, 0.05 g N-acetyl-D-glucosamine이 포함된 것) 희석액을 넣어 잘 섞고 최종 정자농도가 1.0×10⁹ sperm/ml가 되도록 하였다. 액상정액은 4^oC 냉장고에 넣어 5일간 보존하며 사용하였다.

체외수정을 위하여, 상기의 방법으로 제조한 액상정액 500 μl를 취하여 실온의 TL-HEPES-PVA 5ml를 넣고 잘 섞은 후 800xg에서 3분간 원심분리하였다. 상층액만을 버린 뒤 TL-HEPES-PVA를 넣고 섞은 뒤 다시 원심분리하고 상층액을 버린 뒤 실온의 체외수정 배지 mTBM로 희석하여 잘 섞었다. 위에서 제조한 체외수정배지에 있는 난자에 정자의 농도가 1×10⁶sperm/ml가 되도록 넣은 뒤 38.5^oC, 5% CO₂의 항온기에서 6시간 동안 공배양하였다.

6시간의 체외수정 후, 난자는 체외배양 배지인 NCSU-23 (108.73 mM NaCl, 4.78 mM KCl, 1.19 mM KH₂PO₄, 1.19 mM MgSO₄·7H₂O, 5.55 mM D-glucose, 1.00 mM glutamine, 7.00 mM Taurine, 5.00 mM hypotaurine, 25.07 mM NaHCO₃, 1.70 mM CaCl₂·2H₂O, 75 μg/ml penicillin G, 50 μg/ml streptomycin)에 배지에 50 μM 2-mercatoethanol, 0.17 mM sodium pyruvate, 2.73 mM sodium lactate를 첨가한 것에 옮기고, 7일간 배양하였다.

동일 실험을 6회 반복한 후 정자침입율, 정상수정율 및 다정자침입율에 대한 평균과 표준편차를 구하여 표 4에 나타내었다. 표 4에서 볼 수 있듯이, 각각 0, 2, 4, 6개의 난포막을 첨가한 성숙배지에서 배양시킨 난자를 체외수정 시킨 결과, 4, 6개의 follicle shell 첨가 시 정자침입율과 다정자 침입율이 감소하였으며, 2개의 follicle shell 첨가시 가장 높은 정상 수정율(50.8%)을 보였다.

표 5는 체외수정 후 7일간 체외배양된 수정란 중 수정 후 분할된 난자율, 배반포율 및 배반포당 세포 수를 6회 실험의 평균 및 표준편차로 나타낸 표이다. 2개의 난포막이 첨가된 배지에서 체외성숙된 난자가 체외수정-배양 후에 가장 높은 배반포율 (22.5%)을 나타내었다. 도 2는 얻어진 배반포를 형광염색하여 400x 현미경하에서 촬영한 사진이다.

이상과 같이 본 발명의 돼지 난자 체외성숙 방법에 의하면 돼지의 미성숙 난자의 체외 성숙율을 높일 수 있다. 뿐만 아니라 본 발명의 방법에 의해 체외성숙된 돼지 난자를 사용하여 체외수정할 경우, 다정자 침입율을 낮추고 정상 수정율을 높일 수 있으며, 수정란을 체외수정할 때 배반포 형성율을 크게 높일 수 있다.

본 발명의 돼지 난자의 체외성숙 방법에 의하면 인공수정에 의한 돼지 생산의 효율을 크게 높일 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

돼지 미성숙난자를 체외성숙배지에서 배양하는 체외성숙 방법에 있어서,

체외성숙배지에 난포막을 첨가하여 36~48시간 체외배양하는 것을 특징으로 하는 돼지 난자의 체외성숙 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 난포막은 체외성숙배지 2mL당 2~4mm 크기의 난포막이 1~6개 첨가되는 것을 특징으로 하는 돼지 난자의 체외성숙 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 체외성숙배지는 조직배양배지(tissue culture medium, TCM) 199 배양배지를 기본 배지로 하여 26.19 mM NaHCO₃, 3.05 mM glucose, 0.91 mM sodium pyruvate, 75 ㎍/ml sodium penicillin G, 50 ㎍/ml streptomycin sulfate 및 0.1% polyvinyl alcohol(PVA)이 첨가된 것을 특징으로 하는 돼지 난자의 체외성숙 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 체외배양은 난포막이 첨가된 2 ml 체외성숙배지에 0.5 ㎍/ml luteinizing hormone (LH), 0.5 ㎍/ml follicular stimulating hormone (FSH), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF), 10% porcine follicular fluids (pFF), 0.57 mM cysteine를 추가로 첨가한 배지에서 38.5^oC, 5% CO₂의 항온기(incubator)에서 20~24시간 배양하고, 그 후 FSH와 LH를 제외한 배지에서 추가로 20~24시간 배양하는 것을 특징으로 하는 돼지 난자의 체외성숙 방법.