KR20080077779A

KR20080077779A - 돼지 배아의 체외배양 방법

Info

Publication number: KR20080077779A
Application number: KR1020070017410A
Authority: KR
Inventors: 김남형; 시앙 쑨 추이; 싱후이 센; 용 진; 정학재; 김종무; 이승은; 용난 주; 싱유 이; 김지회
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2007-02-21
Filing date: 2007-02-21
Publication date: 2008-08-26

Abstract

본 발명은 돼지 배아의 체외배양 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 돼지의 단위발생 및 탈핵된 돼지 난자에 태아의 섬유아세포를 이식하여 만들어진 체세포 복제 수정란의 체외 배양액에 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652) 을 첨가하여 소혈청 알부민이 없는 조건에서 단위발생 및 복제 수정란의 체외 발달체계를 개선시키는 돼지 배아의 체외배양 방법에 관한 것이다.

이러한 본 발명에 의하여 기본 배지 (NUSU23)에 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652) 을 첨가하여 단위발생 및 복제 수정란을 배양하는 방법을 제공함으로서 수정란의 체외발달에 있어 체외배양체계를 개선하여 세포의 생존율을 증가하며 세포사멸을 감소시키는 방법을 제공할 수 있는데 그 특징이 있다.

돼지 단위발생 및 복제 수정란, 체외배양, 재조합 고 운동성 군 상자-비1, 세포사멸 억제

Description

돼지 배아의 체외배양 방법{A method to improve in vitro production of pig embryos}

본 발명은 돼지 배아의 체외 배양 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 소혈청 알부민이 없는 기본 배지에 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652) 을 첨가하여 기존의 돼지 단위발생 및 복제 수정란의 체외배양체계와 비교하여 보다 효과 있는 배양체계를 제공하기 위한 돼지 배아의 체외 배양 방법에 관한 것이다.

최근 가축의 형질전환기술 및 복제동물 생산 실험이 전 세계에서 행해지고 있다. 이들 실험에서는 수정란을 체외에서 조작하는 것이 필수적인 과정이다. 따라서 보다 효과적이고 안정적인 체외배양체계를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 돼지의 경우 그 장기가 인간의 장기와 유사한 관계로 장기이식동물로 주목받고 있다. 하지만, 다른 가축 종에 비해 수정란을 생산하는 과정에서의 다정자 수정이 일어날 가능성이 높으며, 세포가 자연적으로 사멸하여 생존율이 현저히 낮아 그 개선 방법에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

현재, 수정란 체외배양에 있어서 기본 배지에 혈청과 같은 단백질 첨가제를 첨가하여 배양시키는 방법이 일반적으로 이용되고 있다. 그러나 혈청과 같은 단백질 첨가제들은 그 조성에 대해 완전히 알지 못해 배지에서 다른 조성물과의 상호작용에 의한 비정상적인 발달의 원인을 알 수가 없다.

본 발명은 돼지 단위발생 및 복제 수정란의 체외배양에 있어서 발생하는 세포사멸과 그에 따른 낮은 생존율에 대한 문제점을 해결하기 위함에 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 돼지의 단위발생 및 복제 수정란을 소혈청 알부민이 없는 기존의 기본 배지(NCSU23)에 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652) 을 첨가함으로써 수정란의 세포사멸을 억제하여 착상전 초기배아의 배반포기까지의 수정란의 생존율을 향상시켰다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 단위발생 및 복제 수정란을 소혈청 알부민이 없는 기본 배지에 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652) 을 첨가하여 돼지의 수정란을 배반포기까지 배양하는 특징을 가지고 있다.

종래의 방법에서는 수정란을 0.4%의 소혈청알부민이나 글루타티온 (GSH, Sigma, G2140)이 첨가된 기본배지 (NCSU23) 에서 배양시켜 왔다. 그러나 이러한 소혈청알부민 (BSA, Sigma, A8806)만 포함된 배지에서는 세포사멸을 억제하지 못하며, 글루타티온과 같은 화학적 제제를 사용하였을 경우에는 발달율이 좋지 못했다.

그러나 본 발명에서는 상기의 돼지의 수정란을 소혈청알부민 (BSA, Sigma, A8806) 이 포함되지 않은 기본배지 (NCSU23)에 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652) 을 첨가하는 본 발명의 방법에 의하여 그 조성에 대한 확인이 가능할 뿐 아니라 생존율이 향상되고 세포사멸이 현저하게 감소하였다.

이러한 방법은 종래의 소태아 혈청을 사용한 수정란 배양법보다 결과 해석이 용이할 뿐만 아니라, 그 효율도 뛰어난 수정란 체외배양법을 제공하고 있다.

이하, 이와 같은 본 발명을 다음 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠지만, 본 발명이 다음 실시 예에 한정된 것은 아니다.

실시 예 1 : 돼지 단위 발생란의 생산

제 1 단계 : 체외성숙

체외성숙(In vitro maturation)을 위한 배지는 다음과 같이 준비하였다.

세척용 dPBS(GIBCO BRL사, Cat. No.: 14190-144);

배양(culture)용 TCM199(GIBCO BRL사, Cat. No.:31100-035);

EGF(Epidermal Growth Factor)(미국 Sigma사, Cat. No.: E4127);

L-cysteine(미국 Sigma사, Cat. No.: C7477);

hCG(미국 Sigma사 Cat. No.: C8554);

PMSG(미국 Sigma사 Cat. No.: G4877)

상기 배양액을 미리 stock 으로 준비하여 냉장 혹은 냉동에 보관한다.

25℃의 생리식염수를 이용해 도축장으로부터 난소를 실험실로 운반하여 18G의 바늘을 이용하여 난소로부터 미성숙난자를 회수한 다음, 상기 세척용 D-PBS (GIBCO BRL사, Cat. No.: 14190-144)배지에서 3회 세척 후, 성숙배지용 TCM199 (GIBCO BRL사, Cat. No.:31100-035)배지에서 3회 세척하여 수집한다.

체외성숙 배양액은 Tissue culture medium 199에 0.57 mM cysteine , 10 ng/ml EGF, 10 IU/ml PMSG 와10 IU/ml hCG 를 첨가한다. 배양액은 난자를 배양 전에 미리 5%의 CO2가 있는 39 ℃의 인큐베터에서 2시간 동안 온도와 이산화탄소의 농도를 맞춰준다. 수집된 난자들은 4-웰(well) 디쉬(dish)에 들어있는 성숙배지에 웰당 50개 정도의 난자를 넣어 약 44동안 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양한다.

제 2 단계 : 난자의 단위발생 및 활성화 과정

상기 제 1 단계에서 약 44시간동안 성숙된 난자들을 하이알루로니데이즈를 이용하여 난구세포를 제거한 후, 20 uM의 칼슘아이오노포(Calcium ionophore)(SIGMA사, Cat. No.:10634)가 들어있는 배양액에서 5분동안 배양하여 화학적인 방법으로 단위발생 및 활성화를 유발한다.

제 3 단계: 단위발생란의 배양

활성화를 시킨 체외성숙 된 난자는 7.5 ug/ml의 CCB가 들어있는 체외배양배지에서 3시간동안 배양시킨다. 다음 NCSU23에서 세 번 세척후 BSA가 포함지 않은 NCSU 기본배지의 배양액에서 배양한다. 48시간 후에 세포질이 좋은 4세포기의 난자를 선택하여 대조군 및 HMGB1이 첨가된 배양액에서 각각 5일간 (활성화=0일) 배양하였다.

실시 예 2 : 돼지 복제 수정란의 생산

제 1 단계 : 체외성숙

돼지 복제란의 생산을 위한 체외성숙은 실시 예 1에서와 같은 방법으로 실시하였다.

제 2 단계 : 돼지의 귀(ear)로부터 세포를 분리하여 체세포 주를 확립하는 단계

성체의 귀 선단에서 떼어 낼 부위 주변의 체모를 깎고, 소독용 알코올과 베타딘으로 소독한다. 멸균된 기구로 1~2 cm 넓이의 피부 조직을 절제한 다음, 50 ml 시험관에 PBS용액을 준비하여 절제된 조직을 넣어 4℃로 냉장 보관하여 실험실로 운반한다. 실험실로 가져와서 다시 PBS 용액으로 세정한 다음, 멸균된 집게로 고정한 후, 체모를 포함한 피부와 연골조직을 멸균된 가위나 칼날(blade)로 분리하여, 연골조직과 연한 피부내측 조직을 채취한다. 조직편을 다시 PBS용액으로 세정 후 킬날(blade)로 세절한 다음, trypsin-EDTA용액을 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양한다. 정치 후, 원심 분리용 시험관에 옮겨 와동(vortexing)과 피펫작업(pipetting) 후, PBS용액을 첨가하여 100 x g에서 5분간 원심 세정한다. 최종 원심세정 후, 침전 세포를 15% FBS(GIBCO BRL사, Cat. No.:16141-079)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium, GIBCO BRL사, Cat. No.:12100-046)에 부유시킨 후, 세포 배양용 페트리디쉬로 옮겨 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양한다.

세포가 배양접시 바닥 면에 부착하여 분열 증식하여 단층이 형성되면 이를 1차 세포주의 성립으로 간주한다. 단층이 형성된 1차 세포 주는 계대배양을 다음과 같이 실시한다. 페트리디쉬의 배양액을 버리고, 0.25% 트립신, 1 mM EDTA 용액을 첨가하여 3분 동안 정치 후, 15% FBS(GIBCO BRL사, Cat. No.:16141-079)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium, GIBCO BRL사, Cat. No.:12100-046)이 들어있는 원심분리용 시험관으로 옮겨 800 x g에서 5분간 원심분리 시킨다. 상등액을 버리고 새로운 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium, GIBCO BRL사, Cat. No.:12100-046)용액을 넣어 재부유시킨 후, 적당량을 새로운 페트리디쉬에 분주한 후, 배지를 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양한다.

제 3 단계 : 난구세포 제거와 탈핵을 실시하는 단계

성숙시킨 난구세포로 둘러싸여 있는 수핵 난자는 미세조작을 위해 하이알루로니데이즈를 이용하여 난구세포를 제거해준다. 탈핵을 위해 칼슘이 들어있지 않은 D-PBS(GIBCO BRL사, Cat. No.: 14190-144)에 10% FBS(GIBCO BRL사, Cat. No.:16141-079)와 사이토칼라신 B(cytochalasin B, CCB, 7.5 ug/ml)를 첨가한 배지로 작업용 디쉬에 미소적을 만든다. 작업용 디쉬를 조작판위에 위치하도록 놓은 다음, 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고, 탈핵용 피펫은 3시 방향에 위치시키다. 고정용 피펫을 흡입하여 난자를 약간 고정시킨 후, 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자의 초점을 맞춘다. 탈핵용 피펫을 상하로 움직여 제 1극체와 초점이 같도록 맞춘다. 탈핵용 피펫을 투명대를 통해 찔러 넣어 제 1극체와 주변의 약간의 세포질을 흡입하여 제거한다.

제 4 단계 : 미리 준비해 둔 공여세포를 탈핵된 난자에 이식하는 단계

이식을 위해 미리 칼슘이 들어있지 않은 D-PBS(GIBCO BRL사, Cat. No.: 14190-144)에 10 % FBS(GIBCO BRL사, Cat. No.:16141-079)만 첨가한 이식용 배지로 작업용 디쉬에 미소적을 만들어 배양기에 넣어 놓는다. 탈핵이 끝나면 세정용 피펫을 이용하여 탈핵된 난자들을 이식용 배지로 옮긴다. 탈핵용 피펫을 이식용 피펫으로 바꾼 후, 7~8개의 공여세포를 주입한다. 탈핵시킬 때와 같은 방법으로 탈핵 시 생긴 절단부위를 3시 방향에 맞춘다. 이식용 피펫을 절단부위로 넣어, 유압을 걸어 1개의 공여세포를 주입시킨다. 이식이 끝난 난자들을 전기융합 시까지 3회 세척 후, 체외배양 배지에 넣어 정치시킨다.

제 5 단계 : 재구성란의 융합 및 활성화 단계

전기융합에는 칼슘이 들어있지 않은 만니톨 배지를 이용한다. 2개의 전극이 있는 작업용 판(1 mm chamber)에 만니톨을 60 ul를 넣고 BTX-세포조작기와 연결시킨다. 세포융합은 직류전압으로 전압은 150 V/mm이며, 횟수는 2회, 시간은 50 us의 조건으로 융합시킨다. 융합시킨 난자들은 활성화시킬 때까지 체외배양 배지에서 배양시킨다. 융합 후 1시간째에, 칼슘이 들어있는 만니톨을 사용하여 활성화 시킨다. 재구성 난자들을 융합시킬 때와 같이 BTX-세포 조작기와 연결된 작업용 판에서 직류전압으로 전압은 100 V/mm, 횟수는 2회, 시간은 20 us의 조건에서 활성화시켰다. 활성화시킨 난자들은 7.5 ug/ml의 CCB가 들어있는 체외배양배지에서 3시간동안 배양시킨다.

실시 예 3 : 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652)의 단위발생란의 발달에 대한 효과

상기 실시 예 1에서 생성된 복제 수정란은 다음과 같은 배지에서 배양되었다.

(1) 기본배지(NCSU23) + 0.1 PVA(polyviny alcohol)

(2) 기본배지(NCSU23) + 0.1 PVA(polyviny alcohol) + 1 ng/ml의 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652)

(3) 기본배지(NCSU23) + 0.1 PVA(polyviny alcohol) + 10 ng/ml의 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652)

(4) 기본배지(NCSU23) + 0.1 PVA(polyviny alcohol) + 100 ng/ml의 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652)

(5) 기본배지(NCSU23) + 0.1 PVA(polyviny alcohol) + 1000 ng/ml의 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652)

4세포기의 세포질이 좋은 돼지 단위발생란을 선택하여 상기의 각각의 배양액에서 5일간 더 배양한다. 5일 후에 각 배양액에서의 배반포까지의 발달율을 조사하였다.

이렇게 실시예 2 및 실시예 3에서 배양생산된 단위발생 및 복제수정란을 7일 동안 상기 5가지 종류의 배지에서 배양한 결과, 표1 및 표2에서 보는바와 같이 0.1% PVA가 포함된 배양액에서 돼지 단위발생란의 발달율에서 HMGB1을 10ng/ml과 100ng/ml 첨가한 처리군에서 배반포까지의 발달율이 향상됨을 나타냈다(표1과

표 2; P<0.05).

실시 예 4 : 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652) 의 돼지 복제 수정란의 발달에 대한 효과

상기 실시 예 2에서 생성된 복제 수정란은 실시 예 3에서와 같은 처리군의 배양액에서 각각 배양되었다.

복제수정란은 7.5 ug/ml의 CCB가 들어있는 체외배양배지에서 3시간동안 배양시킨 다음 난자의 세포질과 이식한 체세포의 융합을 확인한다. 융합된 수정란은 상기의 5가지 배양액에서 각각 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 7일 동안 배양한다. 복제수정란의 배반포기배의 발달율을 조사하기 위하여 체외배양 7일째 되는 날에 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652)을 첨가하여 배양한 처리군과 대조군에서의 배반포까지의 발달율을 확인한다.

실시 예 5 : 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652) 의 배반포기의 세포수와 세포사멸에 대한 효과

7일동안 배양한 배반포를 회수하여 3.7% 포르말린(formalin) 용액에서 10분간 고정한 후, 2.5 mg/ml의 소디움아지드(sodium azide)와 2.5 ug/ml의 Hoechst 33342(Sigma사, Cat. No.:B2261)가 함유된 글리세롤(3):PBS(1)의 용액으로 염색하였다.

이때 난자의 염색과정은 다음과 같다. 슬라이드글라스의 1/3 부위에 4군데에 파라핀 점적을 형성시킨 다음, 난자를 4군데의 점 가운데에 마우스피펫으로 4-10개 정도 올려놓고 커버글라스를 덮는다. 다음, 볼펜이나 피펫팁 등의 가는 물건을 이용하여 난자를 누른다. 그리고, Hoest 33342(Sigma사, Cat. No.:B2261)가 포함된 용액을 흘려보내고 거름종이를 반대편에 대어 용액을 통과시킨다.

상기 5가지 배양액에서 배양한 돼지 단위발생란의 배반포기의 세포사멸률을 조사하기 위하여 세포사멸확인키트(in situ Cell Death Detection Kit)를 이용하였다. 체외배양 7일째 되는 날에 3.7% 포르말린(formalin) 용액에서 1시간 고정한 후, PVP가 함유된 PBS로 세척하였다. 그리고 0.5% Triton-X-100에서 1시간 동안 침투시킨 후 세척하고 fluorescein-conjugated dUTP와 terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme을 37℃, 암실에서 1시간동안 반응시켰다. 또한 세포 생존율을 확인하기 위하여 40 ug/ml propidium iodide(PI)와 40 ug/ml RNase A를 처리하여 37℃, 암실에서 1시간동안 반응시킨 후 형광현미경 하에서 관찰하였다.

상기 실시예 4 및 실시예 5에서 생산된 돼지 단위발생란을 상기 5가지 배지에서 배양시킨 결과 표 3에서 보는 바와 같이 7일 동안 HMGB1을 첨가한 배양액에서의 배양한 세포 생존율 증가에 따른 효과는 0.1% PVA가 첨가된 배양액에 HMGB1을 10ng/ml과 100ng/ml 처리 하였을 때 유의적으로 높은 할구세포의 생존율 즉 배반포에서 많은 세포수를 보였으며(표 4), 또한 세포사멸이 현저하게 감소함을 보였다(표 4).

*, P<0.05

*, P<0.01

실시 예 6 : 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652) 의 세포사멸 관련 유전자 발현에 대한 효과

배반포까지 발달한 단위발생 수정란을 대조군과 처리군에서 각각 10개씩 회수하여 튜브에 모은다. 다음 액체질소에서 급속히 동결시킨 후 -70℃에 분석시 까지 보관한다. 난자의 mRNA는 Dynabeads mRNA Direct Kit (Dynal Asa, Oslo, Norway) 를 이용하여 회사의 프로토콜에 따라 분리를 한다. cDNA 는 추출한 mRNA로부터 Oligo (dT)12-18 (Invitrogen Co., Grand Island, NY) 와 Superscript reverse transcriptase enzyme (Invitrogen Co., Grand Island, NY)을 이용하여 합성한다. 본 실험에서 histome H2a mRNA를 internal standard 로 사용하여 각 유전자의 상대적 발현양을 구한다. 다음 실시간 역전사효소 중합연쇄반응에 의해 40cycle 씩 증폭한다.

분석은 3반복을 진행한 후 SAS GLM 프로그램의 Tukey's Multiple Range Test에 의해 유의성을 검증한다. 데이타는 평균±표준오차로 값을 나타내며 P<0.05이면 유의성이 있는 것으로 판정한다.

상기 실시예 6에서 생산된 돼지 단위발생란을 상기 5가지 배지에서 배양시킨 결과, 표 5에서 보는 바와 같이 HMGB1의 세포사멸 유전자 표현에 대한 효과는 소혈청알부민이 첨가되지 않은 기본 배지에 10ng/ml과 100ng/ml IGF-1을 처리하였을 때 세포사멸을 유발하는 유전자 발현이 유의적으로 낮음을 보였다(P<0.05).

본 발명의 실시예에서 사용된 돼지 체세포 핵이식 수정란의 체외배양용 기본배지(NCSU23)의 성분은 다음과 같다.

성분 농도

Na Cl(Sigma사 S5886) 8.73 mM KCl (Sigma사 P5405) 4.78 mM KH₂PO₄ (Sigma사 P5655) 1.19 mM MgSO₄ 7H₂O (Sigma사 S5886) 1.19 mM CaCl₂ 2H₂O (Sigma사 S5886) 1.70 mM NaHCO₃ (Sigma사 S5761) 25.07 mM Glucose (Sigma사 G6152) 5.55 mM Glutamine (Sigma사 G6392) 0.073 mM Taurine (Sigma사 T7146) 7.00 mM Hypotaurine (Sigma사 H1384) 5.00 ug/ml Penicillin G (Sigma사 P4687) 100 IU/ml Streptomycin (Sigma사 S9137) 50 ug/ml

상기 설명한 바와 같이, 본 발명은 돼지 단위발생 및 복제 수정란을 체외에서 배양할 때 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652) 을 첨가함으로써 세포 생존율(배반포에서의 세포수)을 증가시키고, 세포사멸을 억제하며 세포사멸을 유발하는 유전자의 발현을 감소시켜 보다 양질의 배반포기배로 발달시킬 수 있는 간편한 배양법을 제공하고 있다. 또한, 본 발명은 지금까지 주로 이용하고 있는 단백질 첨가에 의한 배양법보다도 효과적인 배 발생 결과를 보여주고 있다.

따라서, 본 발명은 수정란의 체외배양 과정을 필수적으로 요구하고 있는 형질 전환 동물 및 복제동물의 생산효율을 개선할 수 있는 매우 유용한 발명이다.

Claims

돼지의 체외 배양방법에 있어서,

소혈청알부민이 첨가되지 않은 기본배지(NCSU23)에 재조합 고 운동성 군 상자-비1 (HMGB-1: High Mobility group box-1, 미국 Sigma사, Cat. No.: H-4652) 을 첨가하여 체외에서 착상전 초기 단위발생 및 복제 수정란을 배반포기배로 배양하는 것을 특징으로 하는 돼지배아의 체외배양 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 수정란은 돼지의 수정란인 것을 특징으로 하는 돼지배아 체외배양 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 수정란은 돼지의 단위발생 및 복제 수정란인 것을 특징으로 하는 돼지배아의 체외배양 방법.