CN114410573A - 一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用 - Google Patents

一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用，所述添加剂为α‑酮戊二酸二甲酯。本发明的卵母细胞体外成熟培养液添加剂添加到卵母细胞体外成熟培养液中用于体外培养卵母细胞，以显著提高卵母细胞成熟率和质量、显著提高体外受精率及囊胚率、显著降低氧化损伤后卵母细胞ROS含量、显著提高氧化损伤后卵母细胞内GSH含量。应用于家畜辅助生殖技术上，可以提高胚胎工程的成功率和质量。

Description

一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用。
背景技术
辅助生殖技术的应用包括体外成熟、体外受精、胚胎移植等，这一技术有利于畜牧业的发展和男性和女性不孕症的临床治疗。尽管在过去的几十年中辅助生殖技术得到一定程度发展，但在家畜胚胎移植结果方面，并未取得实质性改善。卵母细胞体外培养质量是决定胚胎发育的关键因素，但家畜卵母细胞体外培养的成熟效率和质量至今未得到较大的提升。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是影响卵母细胞体外培养效率的一个重要因素。由于细胞内ROS的产生和消除之间的不平衡，氧化应激对哺乳动物卵母细胞的发育潜能和线粒体功能的负面影响导致卵母细胞质量下降、后续胚胎发育不良。
因此，有必要开发一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及培养液以提高卵母细胞成熟率和质量。
发明内容
本发明目的是提供了一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂添加到卵母细胞体外成熟培养液中用于体外培养卵母细胞，以显著提高卵母细胞成熟率和质量、显著提高体外受精率及囊胚率、显著降低氧化损伤后卵母细胞ROS含量、显著提高氧化损伤后卵母细胞内GSH含量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了提供一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂，所述添加剂包括α-酮戊二酸二甲酯。
进一步地，所述α-酮戊二酸二甲酯的添加终浓度为2.5～3.5mmol/L。
进一步地，所述α-酮戊二酸二甲酯的添加终浓度为2.8～3.2mmol/L。
进一步地，所述α-酮戊二酸二甲酯的添加终浓度为3mmol/L。
本发明的第二方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液，所述卵母细胞体外成熟培养液含有所述的卵母细胞体外成熟培养液添加剂。
进一步地，所述卵母细胞体外成熟培养液还包括：卵母细胞基础培养液、丙酮酸钠、谷胱甘肽、雌二醇、胎牛血清、半胱氨酸、表皮生长因子、孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素。
进一步地，所述丙酮酸钠的浓度为0.2～0.4mM；所述谷胱甘肽的浓度为1～3mM；所述雌二醇的浓度为0.5～1.5μg/mL；所述胎牛血清的体积分数为8～12％；所述半胱氨酸的浓度为90～110μM；所述表皮生长因子的浓度为8～12ng/mL；所述孕马血清促性腺激素的浓度为8～12IU/mL；所述人绒毛膜促性腺激素的浓度为8～12IU/mL。
进一步地，所述丙酮酸钠的浓度为0.3mM；所述谷胱甘肽的浓度为2mM；所述雌二醇的浓度为1μg/mL；所述胎牛血清的体积分数为10％；所述半胱氨酸的浓度为100μM；所述表皮生长因子的浓度为10ng/mL；所述孕马血清促性腺激素的浓度为10IU/mL；所述人绒毛膜促性腺激素的浓度为10IU/mL。
在本发明的第三方面，提供了所述的卵母细胞体外成熟培养液添加剂在提高卵母细胞成熟率和质量、提高体外受精率及囊胚率、降低氧化损伤后卵母细胞ROS含量、提高氧化损伤后卵母细胞内GSH含量中的应用。
在本发明的第三方面，提供了所述的卵母细胞体外成熟培养液在提高卵母细胞成熟率和质量、提高体外受精率及囊胚率、降低氧化损伤后卵母细胞ROS含量、提高氧化损伤后卵母细胞内GSH含量中的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用，将卵母细胞体外成熟培养液添加剂添加于卵母细胞体外成熟培养液中用于体外培养卵母细胞，可以显著提高卵母细胞成熟率和质量、显著提高体外受精率及囊胚率、显著降低氧化损伤后卵母细胞ROS含量、显著提高氧化损伤后卵母细胞内GSH含量。应用于家畜辅助生殖技术上，可以提高胚胎工程的成功率和质量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是不同浓度α-酮戊二酸二甲酯处理对卵母细胞成熟率的影响；
图2是不同浓度α-酮戊二酸二甲酯处理对卵母细胞体外受精后胚胎卵裂率的影响；
图3是不同浓度α-酮戊二酸二甲酯处理对卵母细胞体外受精后胚胎囊胚率的影响；
图4是α-酮戊二酸二甲酯对氧化损伤后卵母细胞ROS水平的影响；
图5是α-酮戊二酸二甲酯对氧化损伤后卵母细胞GSH水平的影响。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本发明实施例提供一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用，总体思路如下：
本申请发明人通过实验发现α-酮戊二酸二甲酯可以显著提高卵母细胞成熟率和质量、显著提高体外受精率及囊胚率、显著降低氧化损伤后卵母细胞ROS含量、显著提高氧化损伤后卵母细胞内GSH含量。基于此，α-酮戊二酸二甲酯可用于制备卵母细胞体外成熟培养液添加剂或卵母细胞体外成熟培养液。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂，所述添加剂包括α-酮戊二酸二甲酯。
优选地，所述α-酮戊二酸二甲酯的添加终浓度为2.5～3.5mmol/L。α-酮戊二酸二甲酯的添加终浓度过小或过高都不利于提高卵母细胞成熟率和质量。
更为优选地，所述α-酮戊二酸二甲酯的添加终浓度为2.8～3.2mmol/L。
最为优选地，所述α-酮戊二酸二甲酯的添加终浓度为3mmol/L。添加3mM浓度的α-酮戊二酸二甲酯体外培养的卵母细胞的成熟率最佳，质量最好。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液，所述卵母细胞体外成熟培养液含有所述的卵母细胞体外成熟培养液添加剂。
上述技术方案中，所述卵母细胞体外成熟培养液还包括：卵母细胞基础培养液、丙酮酸钠、谷胱甘肽、雌二醇、胎牛血清、半胱氨酸、表皮生长因子、孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素。
作为一种优选的实施方式，所述的卵母细胞体外成熟培养液包含：卵母细胞基础培养液、0.2～0.4mM丙酮酸钠、1～3mM谷胱甘肽、0.5～1.5μg/mL雌二醇、体积分数8～12％胎牛血清、90～110μM半胱氨酸、8～12ng/mL表皮生长因子、8～12IU/mL孕马血清促性腺激素和8～12IU/mL人绒毛膜促性腺激素、2.8～3.2mmol/Lα-酮戊二酸二甲酯。
作为一种更为优选的实施方式，所述的卵母细胞体外成熟培养液包含：卵母细胞基础培养液、0.3mM丙酮酸钠、2mM谷胱甘肽、1μg/mL雌二醇、体积分数10％胎牛血清、100μM半胱氨酸、10ng/mL表皮生长因子、10IU/mL孕马血清促性腺激素和10IU/mL人绒毛膜促性腺激素、3mmol/Lα-酮戊二酸二甲酯。
所述卵母细胞基础培养液具体可以为购自GIBCO的TCM-199。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了所述的卵母细胞体外成熟培养液添加剂在提高卵母细胞成熟率和质量、提高体外受精率及囊胚率、降低氧化损伤后卵母细胞ROS含量、提高氧化损伤后卵母细胞内GSH含量中的应用。
由此可知，所述的卵母细胞体外成熟培养液添加剂可以大大提高卵母细胞的体外成熟率和质量，进而应用在体细胞克隆技术上，可以提高体细胞克隆胚胎的成功率和质量。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用进行详细说明。
实施例1
该实施例的卵母细胞体外成熟培养液包括：
浓度体积比为75％～85％的卵母细胞基础培养液(购自GIBCO的TCM-199)；
0.3mM丙酮酸钠；
2mM谷胱甘肽；
1μg/mL雌二醇；
体积分数10％胎牛血清；
100μM半胱氨酸；
10ng/mL表皮生长因子；
10IU/mL孕马血清促性腺激素；
10IU/mL人绒毛膜促性腺激素；
添加α-酮戊二酸二甲酯，使得α-酮戊二酸二甲酯的终浓度为3mM。
实施例2
该实施例中，除α-酮戊二酸二甲酯的终浓度为2.8mM外，其他均同实施例1。
实施例3
该实施例中，除α-酮戊二酸二甲酯的终浓度为3.2mM外，其他均同实施例1。
对比例1
该对比例中，除步骤1中卵母细胞体外成熟培养液的配制时不添加α-酮戊二酸二甲酯外，其余步骤均同实施例1。
对比例2
该对比例中，将实施例1卵母细胞体外成熟培养液中替换为浓度为500微摩尔的H2O2，其余步骤均同实施例1。
对比例3
该对比例在实施例1卵母细胞体外成熟培养液的基础上还添加浓度为500微摩尔的H2O2，其余步骤均同实施例1。
对比例4
该对比例中，除步骤1中α-酮戊二酸二甲酯的浓度改为1.5mmol/L外，其余步骤均同实施例1。
对比例5
该对比例中，除步骤1中α-酮戊二酸二甲酯的浓度改为4.5mmol/L外，其余步骤均同实施例1。
实验例1
1、卵母细胞收集和成熟培养
从屠宰场收集绵羊卵巢后，将其保存在补充有75μg/mL青霉素G钾和50μg/mL硫酸链霉素的生理盐水中运送至实验室。首先用75％酒精对卵巢表面进行消毒，其次用37℃预热的生理盐水彻底清洗卵巢。随后将卵巢转移至含有TCM-199培养基、1mM HEPES、2μg/mL肝素钠、4mg/mL牛血清白蛋白和100IU/mL青霉素/链霉素的100mm培养皿中。用手术刀片割破卵巢表面卵泡，将卵泡中的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulusoocyte complexes,COCs)释放至液体中并收集，利用沉降法分离下层沉淀COC和上清卵泡液。丢弃上清，用上述液体清洗沉淀三遍后，在体视显微镜下收集具有3-4层卵丘细胞的发育良好的COCs。在成熟培养液中清洗三次后，将COCs转移到含有500μL下述不同分组的且在38.5℃、5％CO2、5％O2、饱和湿度的培养箱中平衡2h的成熟培养液中。将培养皿放入38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱成熟培养。24小时后将卵丘卵母细胞复合体移入0.1％(w/v)透明质酸酶中作用5min，用配有适当直径玻璃针的口吸管反复吹打COCs，直至卵丘细胞被去除。在体视显微镜下对卵母细胞进行挑选，卵周隙明显且无杂质、胞质均匀、明显排出第一极体的卵母细胞为成熟卵母细胞，无卵周隙、胞质发散视为死亡的卵母细胞。
采用实施例1的成熟培养液和对比例1、对比例4和对比例5的成熟培养液分别对所述卵母细胞进行培养，经24h成熟培养后结果如图1所示。
由图1可知，与对比例1、对比例4和对比例5相比，实施例1(3mM组)细胞第一极体的排出率显著提高(P＜0.05)，实施例1的成熟培养液(添加了3mMα-酮戊二酸二甲酯)可显著提高卵母细胞的成熟率(P＜0.05)。
2、成熟卵母细胞ROS水平检测
应用绵羊MII卵母细胞的2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色来确认补充α-酮戊二酸二甲酯对绵羊MII卵母细胞ROS产生的改善作用。随机收集每组MII卵母细胞(每组n＝30)，用DPBS洗涤一次，并与10μM DCFH-DA溶液在38.5℃下孵育30分钟，清洗卵母细胞后对其进行细胞压片。显微镜检查后，通过Image J软件进一步计算实施例1、对比例1、对比例2和对比例3的DCFH-DA荧光强度。
结果如图4所示，可知，与对比例1-对比例3相比，实施例1的成熟培养液(添加了3mMα-酮戊二酸二甲酯)显著降低了氧化损伤后卵母细胞ROS含量(P<0.05)。
3、成熟卵母细胞GSH水平检测
随机收集不同组(每组n＝30)的MII卵母细胞(实施例1、对比例1、对比例2和对比例3)，分别与10μM 4-氯甲基-6,8-二氟-7-羟基香豆素细胞示踪蓝染料在38.5℃下孵育20分钟。镜检后，用Image J软件进一步记录和计算实施例1和对比例1的GSH水平。
结果如图5所示，可知，与对比例1-对比例3相比，实施例1的成熟培养液(添加了3mMα-酮戊二酸二甲酯)显著提高氧化损伤后卵母细胞内GSH含量。
4、卵母细胞体外受精、体外培养与囊胚细胞计数
将四组成熟后的卵母细胞(实施例、对比例1、对比例4和对比例5)在受精液中清洗三次后移入提前放入培养箱预平衡2小时且每孔装有500μL受精液(SOF+2％发情绵羊血清+2mM丙酮酸钠+10g/mL肝素+1mM咖啡因)的四孔板中。将冷冻的精液管从液氮中取出，并在38.5度水浴中快速搅拌15s。用percoll溶液离心收集精子并计数精子后，用受精培养基将精子稀释到终浓度为1×106精子/mL并转移到含有上述MII卵母细胞的受精滴中，将受精孔板置于38.5℃、5％CO2、5％O2的饱和湿度培养箱中。受精18h后，随机收集受精卵母细胞，反复吹打除去附着在胚胎表面的精子并将其转移至包含胚胎培养基(SOF培养基中添加0.5mM柠檬酸钠、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM GlutaMAX、2％必需氨基酸、2.8mM肌醇、4mg/mL BSA)液滴的35mm培养皿中，表面覆盖矿物油，放入38.5℃、5％O2、5％CO2饱和湿度的培养箱中。48小时后，在显微镜下检查卵裂率，并进一步计算每组的卵裂率。每隔一天更换培养基。胚胎培养7天后，用显微镜检查并计算每组的囊胚发育率，即存活囊胚/受精MII卵母细胞的百分比。最后，收集各组囊胚，用5μg/mL Hoechst 33342溶液室温孵育10分钟，然后进行囊胚固定和显微镜检查，进一步记录每个囊胚的细胞数。
结果如图2和图3所示，可知，实施例1中成熟培养液(添加3mMα-酮戊二酸二甲酯组)中培养成熟的卵母细胞，体外受精后卵裂率、胚胎囊胚率显著高于对比例1、对比例4和对比例5(P＜0.05)。
综上可知，α-酮戊二酸二甲酯添加于卵母细胞体外成熟培养液中用于体外培养卵母细胞，可以显著提高卵母细胞成熟率和质量、显著提高体外受精率及囊胚率、显著降低氧化损伤后卵母细胞ROS含量、显著提高氧化损伤后卵母细胞内GSH含量。应用于家畜辅助生殖技术上，可以提高胚胎工程的成功率和质量。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂，其特征在于，所述添加剂包括α-酮戊二酸二甲酯。
2.根据权利要求1所述的卵母细胞体外成熟培养液添加剂，其特征在于，所述α-酮戊二酸二甲酯的添加终浓度为2.5～3.5mmol/L。
3.根据权利要求1所述的卵母细胞体外成熟培养液添加剂，其特征在于，所述α-酮戊二酸二甲酯的添加终浓度为2.8～3.2mmol/L。
4.根据权利要求1所述的卵母细胞体外成熟培养液添加剂，其特征在于，所述α-酮戊二酸二甲酯的添加终浓度为3mmol/L。
5.一种卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述卵母细胞体外成熟培养液含有权利要求1-4任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液添加剂。
6.根据权利要求5所述的卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述卵母细胞体外成熟培养液还包括：卵母细胞基础培养液、丙酮酸钠、谷胱甘肽、雌二醇、胎牛血清、半胱氨酸、表皮生长因子、孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素。
7.根据权利要求6所述的卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述丙酮酸钠的浓度为0.2～0.4mM；所述谷胱甘肽的浓度为1～3mM；所述雌二醇的浓度为0.5～1.5μg/mL；所述胎牛血清的体积分数为8～12％；所述半胱氨酸的浓度为90～110μM；所述表皮生长因子的浓度为8～12ng/mL；所述孕马血清促性腺激素的浓度为8～12IU/mL；所述人绒毛膜促性腺激素的浓度为8～12IU/mL。
8.根据权利要求6所述的卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述丙酮酸钠的浓度为0.3mM；所述谷胱甘肽的浓度为2mM；所述雌二醇的浓度为1μg/mL；所述胎牛血清的体积分数为10％；所述半胱氨酸的浓度为100μM；所述表皮生长因子的浓度为10ng/mL；所述孕马血清促性腺激素的浓度为10IU/mL；所述人绒毛膜促性腺激素的浓度为10IU/mL。
9.权利要求1-4任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液添加剂在提高卵母细胞成熟率和质量、提高体外受精率及囊胚率、降低氧化损伤后卵母细胞ROS含量、提高氧化损伤后卵母细胞内GSH含量中的应用。
10.权利要求5-8任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液在提高卵母细胞成熟率和质量、提高体外受精率及囊胚率、降低氧化损伤后卵母细胞ROS含量、提高氧化损伤后卵母细胞内GSH含量中的应用。
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