KR100767289B1 - 배아줄기세포 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배아줄기세포를 효과적으로 얻기 위해 정상적인 배아줄기세포로 분화가 된 인공수정,복제수정란에서 얻어지는 배아줄기세포의 파형을 측정한 후 그 측정값을 그대로 보관하여 다른 배아줄기세포의 배양 시 저장된 파형 값을 그대로 통전하면서 배양, 효과적 배아줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명의 체세포 복제 수정란 또는 인공수정 후 배반포에서 얻어진 내세포괴(ICM)를 배아줄기세포주로 효과적 확립을 하는 방법과 증식효율을 향상시키는 작용효과를 나타낸다.

이러한 본 발명의 배양방법은 다양한 세포로 분화할 수 있는 배아줄기세포를 다량으로 수득할 수 있어 체세포 복제동물 생산 및 배아줄기세포를 이용한 치료 및 연구 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

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Description

배아줄기세포 배양방법 {embryonic stem cell culture method}

도 1은 다수의 전극이 형성된 배양면 접시를 나타낸 도이다.

도 2는 난자로부터 얻어진 내세포괴(ICM)에서 한개 세포로부터 미세유리전극으로 세포의 전기적 파형 측정을 나타낸 도이다.

도 3은 내세포괴(ICM) 배양 이틀 후 배양 형태 사진이다.

도 4는 배양된 내세포괴(ICM)에서 단일 세포의 파형을 측정한 도이다.

도 5는 내세포괴(ICM) 배양 후 5일된 사진이다.

도 6은 인공수정 후 얻어진 내세포괴(ICM)를 배양하여 전극이 형성된 배양면에서 다수의 세포들의 전기적 파형을 측정 한 파형 사진이다.

도 7은 내세포괴(ICM)를 전극과 세포지지층이 형성된 배양면에서 배양하는 모습을 나타낸 도이다.

도 8은 도 1의 배양면전극격자(50)을 확대한 모습과 실제 배양되는 배양장치를 나타낸 도이다.

도 9는 전극에서 얻어진 전기적 신호가 저장되는 흐름도를 나타낸 도이다.

도 10은 저장된 세포들의 파형을 배양을 원하는 세포에 전기적 신호를 출력하기 위한 장치의 회로 흐름도를 나타낸 도이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

10: 배양면 경계구분 디쉬 20: 연결선 30: 연결접점 40: 배양면

50: 배양면 전극 격자 50‘ : 배양면 전극 격자확대

55: 배양 중 배아줄기세포

60: 주파수 발생 61: 제어수단 62: 수치입력 수단

63: 저장된 세포의 전기적 파형 64: 디지털 아날로그 변환기

65: 출력 전원 공급부 66: 펄스 증폭기

67: 교류전원 68: 전원공급 수단기 69: 출력

83: 세포지지층 (Poly-D-lysine) 85: 절연층 (polysiloxane : DowCorning DC648)

88: 유리판 1mm 90: 금속성 필름형태 연결선

93: 배양액 94: 배양 실시 예

본 발명은 체세포 복제 수정란 또는 인공수정 후 얻어진 내세포괴(ICM)의 체외배양방법 및 배아줄기세포 배양방법에 관한 것이다.

최근 생명공학 또는 유전자 조작 기술의 발달에 따라 체세포 복제동물 생산 및 배 아줄기세포배양에 성공하는 사례들이 보고되고 있다.

일반적으로, 체세포 핵을 이식한 수정란 제작 및 이로부터 생산된 복제동물/배아줄기세포(embryonic stem cell) 제작은 아래와 같은 과정으로 진행된다.

1) 수핵난자의 준비, 2) 체세포의 휴지기(G0)로의 유도를 통한 공여핵의 준비, 2) 수핵난자에서 난구세포 제거, 3) 수핵난자의 투명대 절개, 4) 수핵난자에서의 탈핵, 5) 공여 핵을 수핵난자 내 이식하여 체세포 복제 수정란 제작, 6) 전기자극 등을 이용한 체세포 복제 수정란의 세포융합, 7) 전기자극 또는 칼슘이온 운반체+단백질합성억제제 병행처리를 통한 체세포 복제 수정란 세포질 활성화, 8) 체세포 복제 수정란의 체외배양, 9-1) 대리모에의 이식 및 산자생산 또는 9-2) 체외 배양 후 배아줄기세포 배양.

상기 과정에서 이식된 공여핵이 수핵난자의 세포질과 조화롭게 융합하고 활성화되어, 리프로그래밍(reprogramming)이라고 하는 일반적인 수정란에서 나타나는 분할 및 이후의 발생과정이 정상적으로 진행되는 것이 중요하다. 리프로그래밍이 순조롭게 이루어진 체세포 복제 수정란의 경우 배반포기(blastocyst)까지 체외에서 배양하며, 이후 대리모 이식을 통하여 개체로 발생시키거나, 배반포에서 내세포괴(inner cell mass, ICM)를 분리하여 배아줄기세포를 배양하게 된다.

따라서, 체세포 복제 수정란의 정상적인 리프로그래밍을 유도하기 위해서, 즉 체세포 복제 수정란의 배발생의 기준 지표인 배반포 발달율을 증가시키기 위해서 많은 연구가 진행되고 있다.

한국공개특허공보 제10-2004-60348호는, 체세포 복제 수정란의 체외배양시 배양액 에 항산화제 및 산화질소 제거자를 함유시킴으로써 체세포 복제 수정란의 배발달 단계에서 배아 할구의 아폽토시스 발생을 효과적으로 저하시켜 배반포 발달율을 효과적으로 향상시키는 효과를 나타냄을 개시하고 있다.

한국공개특허공보 제2005-81524호는 양수세포를 인간배아 줄기세포 배양을 위한 영양세포층으로 이용하는 방법과, 양수세포를 배양한 후 수거한 배양액을 인간배아 줄기세포의 배양액으로 이용하는 방법을 개시하고 있다. 이러한 방법으로 배양된 인간배아줄기세포는 미분화 세포의 세포학적, 면역학적, 유전학적 특징을 유지하고, 분화 조건에서 배아체를 잘 형성하여, 다양한 조직으로 분화되는 능력을 지니는 것으로 기재되어 있다.

그러나, 현재까지 복제 수정란 과 인공수정 후 얻어진 수정란배반포에서 얻어진 내세포괴를 배아간세포주로 효과적으로 향상시키는 기술이 확립되어 있지 않으며, 최적의 조건 및 배아줄기세포 배양기술의 개발이 요구되고 있다.

줄기세포란 인간의 몸을 구성하는 서로 다른 세포나 장기로 성장하는 일종의 모세포로, 간세포(幹細胞)라 불리기도 한다. 이 줄기세포에는 사람의 배아를 이용해 만들 수 있는 '배아줄기세포(복수기능줄기세포)'와 혈구세포를 끊임없이 만드는 골수세포와 같은 '성체줄기세포(다기능줄기세포)'가 있다. 성체줄기세포(Adult Stem cell)는 제대혈(탯줄혈액)이나 다 자란 성인의 골수와 혈액 등에서 추출해낸 것으로, 뼈와 간.혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포다. 여기에는 조혈모세포(Hematopoietic Stem Cell)와 재생의학의 재료로 각광 받고 있는 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell), 신경줄기세포(Neural stem cell) 등이 있다. 제 대혈(탯줄혈액)은 조혈모세포를 다량 함유하고 있으며, 뼈속의 골수에서 발견되는 골수세포는 혈액 및 임파구를 생산할 수 있는 조혈모세포를 비롯하여 중간엽 줄기세포 등 여러종류의 줄기세포를 가지고 있다.

성체 줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 여러 종류의 성체 줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있다.

또한 성체 줄기세포는 인간 배아에서 추출한 배아 줄기세포와 달리 골수나 뇌세포 등 이미 성장한 신체조직에서 추출하기 때문에 윤리논쟁을 피할 수 있는 장점이 있다. 이에 본 발명자들은 인공수정과 복제수정란 배반포 발달 후 배아줄기세포 증식율을 높일 수 있는 방법을 개발하고자 꾸준히 연구한 결과, 성장이 성공적으로 이루어진 배아줄기세포주의 전기적파형을 그대로 저장한 후에 새롭게 배양하고자 체세포 복제 수정란 또는 인공수정 후 얻어진 내세포괴 배양 시 저장된 배아줄기세포 전기적 파형을 가하면서 배양하면 배아줄기세포로써 증식율이 향상됨을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 성장이 성공적으로 이루어진 인공수정 배아줄기세포 또는 체세포 복제수정란 배아줄기세포에서 정상적인 세포의 전기적파형을 그대로 저장하여 그 측정값을 복제수정란 및 인공수정 후 얻어진 내세포괴(ICM) 배양 시 저장된 전기적 파형을 동시에 가하며 배양하여 배아줄기세포주로 효과적 확립하는 배양방법을 제공하 고자 한다.

본 발명은 정상적인 배아줄기세포주의 전기적 파형을 저장한 후에 새롭게 배양하려는 체세포 복제수정란 또는 인공수정란의 내세포괴( ICM )에 저장된 전기적 파형을 가하면서 배양하는 배아줄기세포 체외배양방법을 제공한다.

1) 체세포를 배양한 후 단일세포로 분리하여 공여핵 체세포를 준비하는 단계, 2) 채취한 난자를 체외성숙시키는 단계, 3) 체외성숙난자에서 난구세포를 제거하는 단계, 4) 상기 3)단계의 난자에서 탈핵시켜 수핵난자를 준비하는 단계, 5) 수핵난자에 공여핵을 이식하여 공여핵 이식란을 제조하는 단계, 6) 공여핵 이식란을 세포융합하여 체세포 복제 수정란을 제조하는 단계, 7) 체세포 복제 수정란을 활성화시키는 단계 및 8) 체세포 복제 수정란을 체외배양하는 단계로 이루어진다.

본 발명에서 사용된 '체세포'는 생식세포 이외의 세포를 의미한다.

본 발명의 '공여핵 체세포'는 체세포의 핵 이식시 수핵난자로 핵 내 유전물질을 제공하는 세포를 의미한다.

본 발명의 '수핵난자'는 체세포의 핵 이식시 공여핵 체세포로부터 핵을 이식받는 난자로서, 공여핵 체세포의 핵 이식을 위하여 난자 내 핵이 제거되고 세포질을 제공하는 난자를 의미한다.

본 발명의 '체세포 복제 수정란'은 체세포의 공여핵을 핵이 제거된 수핵난자에 주입한 후, 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 핵과 세포질이 융합된 난자를 의미한 다.

본 발명의 '체세포'는 동물세포로, 어류, 양서류, 조류 및 포유동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 포유동물, 예컨대, 인간을 포함한 영장류, 소, 돼지, 곰, 고양이, 개, 말 및 설치류 등의 체세포이고, 가장 바람직하게는 소 또는 인간의 체세포이다.

본 발명의 세포 배양시, 세포는 미세전극 간격사이의 전기적 신호 통전 상태에서 배양됨으로써 그 사이에서 흐르는 미리 저장된 정상 배아줄기세포의 전기적 파형의 영향을 받게 된다.

본 발명의 배아줄기세포의 파형을 측정한 후 그 측정값을 그대로 보관하여 다른 배아줄기세포의 배양 시 측정한 파형값을 그대로 통전하면서 배양하는 방법에 대하여 자세히 설명한다.

본 발명의 배아줄기세포 배양방법은, 1) 체세포 복제 수정란을 체외 배양하여 배반포(blastocyst) 상태로 배양하는 단계, 2) 배반포로부터 내세포괴(inner cell mass)를 분리하는 단계, 3) 배양된 바탕 영양세포에 내세포괴를 이식하는 단계 및 4) 내세포괴로 부터 자라서 배아줄기세포주로 성립된 세포로부터 전기적 파형을 미세전극으로 측정하여 저장하는 단계 5) 새롭게 배양 할 내세포괴에 배아줄기세포주로 성립된 세포로부터 얻어진 전기적 파형을 배양하려고 하는 내세포괴 배양 시 통전하면서 배양하는 단계로 이루어진다.

본 발명의 '체세포 복제 수정란'은 체세포의 공여핵을 핵이 제거된 수핵난자에 주입한 후, 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 핵과 세포질이 융합된 난자를 의미한 다.

본 발명의 '세포'는 동물세포로, 어류, 양서류, 조류 및 포유동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 포유동물, 예컨대, 인간을 포함한 영장류, 소, 돼지, 곰, 고양이, 개, 말 및 설치류 등의 세포이고, 가장 바람직하게는 소 또는 인간의 세포이다.

본 발명의 '배반포'는 수정 후 5~6일이 지난 상태로, 100～200개의 세포로 이루어져 있으며, 내세포괴와 이것을 싸는 벽층인 영양배엽으로 된 태생포유류의 특징있는 구조를 의미한다.

본 발명의 배아줄기세포 배양방법에서 체세포 복제 수정란을 배양하고, 이로부터 수득된 내세포괴를 분리하여 배아줄기세포를 배양하는 기본적인 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따른다.

상기 4단계에서 내세포괴는 분화를 억제하면서 미분화세포의 증식만 일어나도록 하는 환경 안에서 배양이 되며, 이때 분화억제인자 및 이를 만들어내는 영양세포 또는 특정 지지체, 영양세포배양액이 이용된다. 이를 위해 본 발명에서는 바탕영양세포(feeder cell)를 사용하고, 특히 쥐 태아섬유아세포를 이용하는 것이 바람직하며, 이는 사전에 방사능 처리 또는 마이토마이신 C와 같은 화학적 처리를 하여 분화능력을 떨어뜨린 세포이다. 이러한 세포는 자체 증식이 되지 않으면서 배아줄기세포의 분화억제 및 증식을 돕는 바탕영양세포(feeder cell)로서의 역할을 한다.

상기 4단계를 거쳐 내세포괴가 배양이 되어 세포가 증식이 되고, 이의 밀도 및 크기가 증가하게 되면, 이를 배아줄기세포주가 성립된 것으로 판단한다. 그 다음 배 아줄기세포를 더 작은 세포집합체로 분리하고, 이를 다시 같은 조건의 새로운 배양접시로 옮겨 계대배양을 반복하면 미분화 상태를 유지한 채 계속 증식한다. 이와 같은 과정을 반복함으로써 많은 양의 배아줄기세포를 만들어내고 유지시킬 수 있다. BD Biosciences Discovery Labware( BD Matrigel : Cat no 354602 ) 배양디쉬 처럼 쥐 태아섬유아세포(바탕영양세포)가 없이 배양하는 배양디쉬도 계대배양에 많이 이용이 되고 있으며 사용되는 목적에 따라 배양하는 방법을 선택하게 된다.

본 발명자는 대한민국 공개특허 제 2002-0080616 호에서 체세포 복제동물 생산방법을 개시한 바 있으며 상기 공개특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어, 본 명세서에 기재되지 않은 본 발명의 특징이 보다 명확하게 설명된다. 또한, 본 발명의 체세포 복제 수정란 제조 및 체외배양, 이로부터 수득된 내세포괴로부터 배아줄기세포를 배양하는 기본적인 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따른다.

이러한 본 발명의 배양방법은 체세포 복제 수정란에서 얻어진 내세포괴로부터 배아줄기세포주로 확립 및 증식효율을 향상시킨다.

따라서, 본 발명의 배양방법을 이용하면 체세포 복제수정란으로부터 다양한 세포로 분화할 수 있는 배아줄기세포를 다량으로 수득할 수 있음으로써 체세포 복제동물 생산 및 배아줄기세포를 이용한 치료 및 연구 분야에서 유용하게 사용될 수 있다. 이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 참고예 1] 본 발명에서 사용한 체세포 복제수정란의 생산방법

본 발명의 체세포 복제수정란의 생산방법을 상세히 설명하면 다음과 같다. 도축장에서 난소를 채취한다. 검란 준비를 위해서 1㎝ 간격의 격자 눈금을 그은 60㎜ 디쉬와 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 인산염완충용액을 준비한다. 채취한 난소로부터 18게이지 바늘이 장착된 l0㎖ 일회용 주사기를 사용하여 2～6㎜의 난포를 흡입한다. 먼저 난구세포가 충분히 부착되어 있고 세포질이 균질한 난자를 선발하여 2～3회 10% 혈청(Gibco BRL Cat No. 20012-027) 및 1% 항생제가 첨가된 인산염완충용액에서 세정을 한 후 최종 배양인 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에 골라 놓고 500㎕ 당 70～80개의 난자를 넣은 후 미네랄오일(SIGMA, m-3516)로 도포한다. 난구세포 및 체세포를 채취한 후 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 4~5일 동안 배양을 실시하고 인산염완충용액으로 1~2회 세척한 후 0.05% 트립신, 1mM EDTA 용액(Gibco BRL Cat No. 15400-054)을 첨가하여 배양기 안에서 5분간 정치하면 바닥에 붙은 세포가 떨어지게 되는데, 이 세포를 인산염완충용액으로 세정 후 회수하여 원심분리 세척하여 적당량을 새로운 페트리디쉬에 분주하고 배지를 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양한다. 페트리디쉬에 세포가 가득 차면 적당량을 분주하여 동결튜브에 나누어서 동결저장을 시키고 필요할 때 하나씩 꺼내어 사용한다. 체외성숙은 5% CO2, 95% 습도로 조정된 배양기 내에서 20～22시간 배양한다. 세정용 마우스 피펫(내경 200㎛이상)을 이용하여 TCM-199 배양액에 있던 난 자(oocyte) 20~25개 정도를 1개 군으로 하여 PHA-P가 첨가된 TCM-199 배양액으로 이동시킨다. 2개의 피펫을 움직여서 고정용 피펫의 12시 방향에 제1극체(The first polar body)가 위치하도록 하고, 고정용 피펫을 난자의 9시 방향에 밀착시킨 뒤 유압을 걸어 난자를 고정시킨다. 절개용 피펫을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 뒤 세포질이 다치지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시킨다. 고정용 피펫에 양압을 걸어 난자를 분리하고 고정용 피펫을 절개용 피펫이 통과한 제1극체 상단부의 투명대에 접촉시키고 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개한다. 절개한 난자에 고정용 피펫을 이동시키고 난자의 절개창을 고정용 피펫의 내경에 위치시킨 후 제 1극체를 포함하여 세포질 20~30%를 음압을 주어서 탈핵을 실시한다. 절개창을 양 피펫과 1시 방향에 수직으로 놓고 고정용 피펫으로 고정한다. 이식용 피펫을 절개창으로 주입하고, 유압을 걸어 한 개의 공여핵 세포를 주입시킨다. 주입시 난자의 세포질이 다치지 않도록 주의한다. 핵 이식된 난자를 융합할 때 비전해질 용액인 짐메르만 세포융합 배지를 사용하는데, 4-웰 디쉬의 1번 웰에 짐메르만 세포융합 배지 : TCM-199 = 7:3, 2번 웰에 9:1 로 만들어 분주하고 나머지 2개의 웰에는 100% 짐메르만 세포융합 배지를 분주하여 핵 이식된 난자를 1번→2번→3번→4번 순으로 이동시키면서 평형시킨다. 바늘은 끝 부분이 구부러지지 않은 것을 사용한다. 전기의 방향은 융합할 두 개의 세포막에 직각이 되도록 해야 하며, 융합판에 핵이 치환된 난모세포를 유리관으로 흡입하여 융합판에 올려놓는다. (+)극에 체세포가 위치하도록 하고, (-)극에 세포질이 위치하도록 정렬한 후, 짐메르만 세포융합 배지에서 바로 양압을 주면서 전기를 가한다. 공여핵을 (+)극으로 누른 후 세포질과 밀집성을 높인 다음에 통전을 시키면 융합률이 높아진다. 보통 공여핵이 있는 부분에 직류전기(+)를 가하며, 세포질에 공여핵이 상당히 눌러진 상태가 아닌 자연스런 접촉을 보이는 시점에서 통전을 한다. 전압과 공여핵 크기, 공여핵과 세포질과의 밀착성, 전극과 공여핵과의 위치 등이 융합을 시도하는 체세포 복제 수정란에서 중요한 요소이며, 전압의 세기, 전기를 가하는 횟수 및 지속기간도 중요한 요소이다. 상기 조건들 외에 공여핵과 전극과의 방향성, 공여핵의 크기에 따른 난모세포와의 밀착성 및 공여핵의 G0, G1기 상태의 유도세포 여부도 중요한 요소이다. 많은 실험을 통해 융합이 잘되는 전압과 간격, 시간의 분포는 대략 융합이 잘되는 전압은 난자의 크기 평균인 135㎛에서 전압이 24.3 volt이다.

체세포 복제 수정란의 체외배양

1-1) 시료의 준비

1-1-가. 세포배양액의 준비

본 발명에서 사용하는 배양액은 다음과 같다.

체세포 배양액은 DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium, Gibco BRL Cat No. 11995-065)에 10% FBS(Gibco BRL Cat No. 16000-044)와 1% 항생제(Gibco BRL Cat No. 15240-062)를 첨가하여 사용한다.

난구세포 제거에 사용하는 0.1% 하이알루로니데이즈(Hyaluronidase; SIGMA, H-3506) 용액은 100㎖의 인산염완충용액(PBS; Gibco BRL Cat No. 14190-144)에 하이알루로니데이즈 0.1g을 첨가하여 만들고, 만들어진 액을 2㎖씩 캡튜브에 분주하여 냉동실(-70℃)에 보관하면서 사용한다.

전기융합배지(Electrofusion media) 제조를 위해서는 수크로즈(SIGMA, s-1888) 47.92g, 마그네슘 아세테이트(SIGMA, m-2545) 0.0535g, 칼슘 아세테이트(SIGMA, c-4205) 0.008g, K2HP04(SIGMA, p-3786) 0.087g, 글루타치온(SIGMA, g-6013) 0.0155g 및 BSA(SIGMA, a-4919) 0.005g 으로 이루어진 짐메르만 세포융합배지(Zimmerman Cell Fusion Medium; ZCFM)를 염산으로 최종 pH를 7.2~7.4로 맞추어 냉장실에서 15일 동안 보관하며 사용한다.

탈핵 및 체세포 주입에 사용하는 PHA-P(Phytohematoglutinin; L-9132) 용액은 PHA-A 5㎎을 인산염완충용액 10㎖에 섞어 100㎕씩 에펜도르프 시험관에 분주한 다음, 실험에 사용할 경우 에펜도르프 시험관에 400㎕의 TCM-199를 첨가하여 작업용 미세소적을 만들어 사용한다. 이때 최종 농도는 100㎕/㎖이 되도록 한다.

체세포 주입 후 난자 활성화를 위한 6-DMAP(SIGMA D-2629)는 CR1aa용액 10㎖에 6-DMAP 0.0031g을 첨가하여 용해 및 여과 후(0.22㎛ 필터사용) 에펜도르프 시험관에 분주시키고 냉동보관(1.9mM)한다.

체세포 주입 후 난자 활성화를 위한 Ca2+-Ionophore(A23187)는 DMSO(SIGMA D-5879) 1.66㎖에 Ca2+-Ionophore(A23187) 1㎎을 녹여 1mM을 제조한 다음 최종농도가 5μM 이 되도록 CR1aa 배지 내에 첨가하여 사용하고 원액을 냉동 보관한다.

체외배양액 제조시 사용되는 파이루베이트 저장액(Pyruvate stock; SIGMA, p-5280)은 파이루빈산(pyruvic acid) 66㎎을 증류수 30㎖에 용해시킨 후 여과하여 1.5㎖씩 캡튜브에 분주하여 냉동보관한다(-20℃).

CR1aa 저장액은 NaCl(Sigma s-5886) 3.772g, KCl(Sigma p-5405) 0.132g 및 NaHCO3(Sigma s-5761) 1.254g을 3차 증류수에 넣어 용해한 후 여과하여 냉장 보관한다.

복제수정란 배양시 배양액(culture medium)은 CR1aa용액[CR1aa stock 57㎖ + Hemicalcium lactate(SIGMA, l-4883) 0.033g + Pyruvate stock 1.2㎖ + BME amino acid(SIGMA, b-6766) 1.2㎖ + L-Glutamin(SIGMA, g-5763) 0.0088g + MEM nonessential amino acid(Gibco BRL 07167 Cat No. 11140-050) 0.6㎖ + 항생제(Gibco BRL Cat No. 15240-062) 600㎕]을 사용한다.

또 다른 배양액으로 5% CO2 , 5% O2 , 고습도 환경용 mSOF가 있으며, 체외 배양액의 조성은 (NaCl (106mM), KCL (7.2mM), NaHCO3 (25mM), KH2PO4 (1.2mM), 소듐락테이트 (6.6mM), CaCl2 (1.7mM), MgCl2 (0.5mM) , 소듐피루베이트 (0.3mM), 글루코오스 (1.5mM), BSA (8mg/ml), MEM 필수아미노산 용액(2% v/v), MEM 비필수 아미노산용액(1% v/v), 글루타민 (1mM), ITS 인슐린, 트렌스페린, 셀레늄 혼합물 (1%,v/v) 이다.

난자 세정용액은 인산염완충용액에 10% FBS(Gibco BRL Cat No. 20012-027)와 1% 항생제를 첨가하여 사용한다. 난자 배양용(IVM) 및 안정화시킬 때는 TCM-199(Gibco BRL Cat No. 12340-030)에 10% FBS와 1% 항생제를 첨가하여 0.22㎛ 주사기 필터를 사용하여 여과시킨 후 사용한다. 탈핵 여부를 확인하기 위해서 사용하는 Hoechst 33342(SIGMA, B-2261)는 25㎎의 Hoechst에 증류수를 5㎖ 섞어 희석(5m/㎖ 의 stock)시킨 다음, Stock 1~2㎕씩 에펜도르프 시험관에 분주, 냉동보관한다. 사용시 에는 시험관에 10% FBS를 첨가하고 CR1aa용액 1㎖를 첨가하여 희석시킨 후 사용한다(최종농도 5~10㎍/㎖). 10~15분간 정치한 다음 형광현미경으로 탈핵 여부를 판단한다.

1-1-나. 피펫의 준비

마이크로 피펫은 풀러(Puller; Narishigae, PC-10), 마이크로포지(Microforge; Narishige, MF-9) 등과 같은 기기들을 사용하여 제작한다.

고정용 유리관(Holding pipette)은 나리시게(Narishige) GD-1을 사용하여 추를 부착하지 않고, 풀링단계(Pulling step, 단계 1)에 고정한 후, 온도를 80℃로 조정한다. 절개용 유리관(Cutting pipette)은 나리시게 G-1을 사용하여 추(소 1개, 대 1개)를 부착하고, 풀링단계(단계 1 - 단계 2)에 고정한 후, 온도를 80~101.5℃로 조정한다.

핵 이식용 유리관(Injection pipette)은 나리시게 G-1을 사용하여 추(소 1개)를 부착하고, 풀링단계(단계 1 - 단계 2)에 고정한 후, 온도를 80~101.5℃로 조정한다. 피펫 내부에 세포가 붙는 것을 방지하기 위해 불화수소(Hydrofluoric acid)로 2~3번 세척한 후 증류수로 세척을 하고 I-Gepal(SIGMA, I-3021)로 코팅한다.

난자의 세정 및 운반용 피펫은 알코올 램프를 이용하여 내경이 300㎛ 이상이 되도록 하고, 한번 사용한 것은 폐기한다.

1-2) 체세포 배양

1-2-가) 공여핵 세포 분리

젖소의 귀 선단에서 1~2㎠ 넓이의 피부 조직을 절제한 다음, 50㎖ 시험관에 인산염완충용액을 준비하여 절제된 조직을 넣어 4℃로 냉장 보관하였다. 다시 인산염완충용액으로 세정한 다음, 멸균된 집게로 고정한 후 체모를 포함한 피부와 연골조직을 멸균된 가위 날(blade)로 분리하여 연골조직과 연한 피부 내측의 조직을 채취하였다. 조직편을 인산염완충용액으로 세정한 후, 칼날로 세절한 다음 2~3회 1800rpm에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 최종 원심세정 후 침전 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM으로 옮겨 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양하였다.

1-2-나) 계대배양

상기 1-1-가)의 세포를 배양하고 있던 페트리디쉬에서 배양액을 버리고 인산염완충용액을 사용하여 1~2회 세척한 후, 0.05% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하고 배양기 안에서 5분간 정치하였다. 이 세포를 인산염완충용액으로 세정 후 회수하여 1800rpm에서 5분 정도 원심분리 세척하여 적당량을 새로운 페트리디쉬에 분주하고 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양하였다.

1-2-다) 혈청 기아 배양

상기 1-1-나)에서 배양, 증식 중인 세포주를 0.5% FBS가 첨가된 배양액으로 교체하여 혈청 기아상태(serum deprivation)를 만들고, 3~10일간 배양 후 체세포핵을 공여핵으로 제공하였다.

1-2-라) 세포주의 동결보존 및 융해

배양 중인 세포를 트립신 3㎖로 처리하여 분리시키고, 0.5% 인산염완충용액 7㎖를 첨가하여 총 10㎖로 만든 후 15㎖ 원심분리관에 넣어 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 동결액[DMEM 45㎖ + D-글루코스 10g(SIGMA, G-7021) + 헤페스 0.1192g(SIGMA, H-9136) + DMSO 4㎖(SIGMA, D-5879) + FBS 30㎖] 10㎖를 첨가하여 이를 cryotube에 1㎖씩 분주하고 -70℃ 냉동고에 넣어 18~24시간 보관한 후 액체 질소 탱크에 넣어 보관하였다.

상기 세포를 다시 배양할 때에는, 액체질소 탱크에서 cryotube를 꺼내어 37℃ 온수에 넣어 융해시키고 융해된 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM으로 옮겨 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양하였다.

1-2-마) 공여핵용 단일 세포의 분리

공여핵 제공용 체세포가 배양된 페트리디쉬 내의 배양액을 버리고 0.05% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 5분 정치시킨 후, 0.5% FBS가 첨가된 인산염완충용액으로 세정 후 회수하여 1200rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 모았다. 상층액을 모두 버리고 세포의 수가 적당량이 되도록 0.5% 인산염완충용액을 첨가하여 세포를 부유한 후 이식용 디쉬에 옮겨 담았다.

1-3) 난자의 체외성숙

도축장에서 채취해 온 난소에서 난포의 직경이 3~5㎜ 크기의 것만 골라 18게이지 주사바늘과 일회용 주사기를 이용하여 난포액과 함께 난자를 뽑은 후 실체현미경 하에서 세포질과 난구세포가 균일한 미성숙 난포란만 선별하여 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액에 넣은 후 20~22시간 동안 5% CO2, 95% 습도로 조정된 배양기 내에서 배양하였다.

1-4) 난구세포 제거

상기 1-3)의 체외성숙시킨 난자를 0.1% 하이알루로니데이즈용액 안에 넣고 5분간 와동(vortexing) 하여 난구세포를 제거하거나, 0.1% 하이알루로니데이즈 용액이 들어있는 4-웰 디쉬 또는 일반 디쉬 안에서 100~200㎕ 피펫을 사용하여 피펫팅을 함으로써 난구세포를 제거하였다. 피펫팅 중간에 난구세포가 제거된 난자는 선별해서 TCM-199 배양액이 있는 다른 디쉬로 옮기고 난구세포가 제거되지 않은 것만 계속 피펫팅을 해주었다. 이 작업 시간은 10~15분 이내로 하였다.

1-5) 수핵난자 절개 및 탈핵

작업용 디쉬에 PHA-P가 첨가된 TCM-199으로 미세소적(micro-droplet)을 만들어 그 안에서 작업을 실시하였다.

1-5-가) 절개 과정

작업용 디쉬를 조작판(manipulator plate) 위에 놓는 다음, 피펫을 장착하였다. 조작장치(Manipulator)의 왼쪽 암(arm)에 고정용 피펫을 장착한 후, 조작장치의 오른쪽 암에 절개용 피펫을 장착하였다. 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고 절개용 피펫은 3시 방향에 위치시켰다. 피펫 조정기를 중립에 놓아 피펫이 상,하 좌우로 자유롭게 움직일 수 있도록 조정하였다. 두 피펫을 작업용 미세소적 내로 상하 이 동시키면서 피펫이 디쉬의 테두리에 닿지 않도록 각도를 조정하고 피펫 끝을 미세소적의 중앙에 위치시켰다. 세정용 마우스 피펫(내경 200㎛이상)을 이용하여 TCM-199 배양액에 있던 난자 20~25개 정도를 1개 군으로 하여 PHA-P가 첨가된 TCM-199 배양액으로 이동시켰다. 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자에 먼저 초점을 맞춘 뒤, 2개의 피펫을 상하로 움직여 초점을 조정하였다. 2개의 피펫을 움직여서 고정용 피펫의 12시 방향에 제1극체(The first polar body)가 위치하도록 하였다. 고정용 피펫을 난자의 9시 방향에 밀착시킨 뒤 유압을 걸어 난자를 고정시켰다. 절개용 피펫을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 뒤 세포질이 다치지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시켰다. 고정용 피펫에 양압을 걸어 난자를 분리하고 고정용 피펫을 절개용 피펫이 통과한 제1극체 상단부의 투명대에 접촉시키고 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개하였다.

1-5-나) 탈핵과정

절개한 난자를 고정용 피펫으로 이동시킨 후 난자의 절개창을 고정용 피펫의 내경에 위치시킨 후 제1극체를 포함하여 세포질 10~30%를 음압을 주어서 탈핵을 실시하였다. 이때 절개한 창은 9시 방향으로 하였다.

다시 양압을 주어 고정되었던 난자와 탈핵된 세포질을 분리시켰다. 탈핵된 난자는 TCM-199으로 2~3회 세척하고 핵 이식 전까지 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에 넣어 보관하였다. 이를 하기에서 공여핵을 이식할 수핵난자로 사용하였다.

1-6) 수핵난자로의 공여핵 이식

작업용 디쉬를 조작판에 위치시켰다. 절개용 피펫을 이식용 피펫으로 교체시키고, 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에서 2~3회 세척 후 주입용 미세소적으로 이동시켰다. 이식용 피펫을 공여핵 세포가 있는 미세소적에 넣고 약 10㎛ 크기의 공여핵 세포를 흡입한 후 피펫을 주입용 미세소적으로 이동시켰다.

유리판에 보통 4~5개의 작업용 드롭을 만들고, 위부터 2개는 탈핵용 미세소적, 2~3개는 이식용 미세소적으로 각각 드롭을 형성시킨 후 미네랄오일로 도포하였다. 탈핵이 끝난 난자를 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에서 안정화시킨 후 이식용 드롭으로 옮겼다.

절개창을 양 피펫과 1시 방향에 수직으로 놓고 고정용 피펫으로 고정한 후, 이식용 피펫을 절개창으로 주입하고, 유압을 걸어 한 개의 공여핵 세포를 주입하였다.

1-7) 세포 융합 ( cell fusion )

120㎜ 디쉬에 짐메르만 세포융합배지를 절반 정도 채운 후 RMX 2010 (www.biofusiontech.com) 융합기와 연결시켰다. 전기의 방향은 융합할 2개의 세포막에 직각이 되도록 하였다. 융합판에 핵이 치환된 난모세포 전체를 유리관으로 흡입하여 융합 판에 올려놓고, 짐메르만 세포융합배지에서 바로 양압을 주면서 전기를 가하였다. 이때 세포융합 조건은 전압이 DC 22V, 횟수는 1회, 시간은 10㎲로 조정하였다. 바늘 이용한 방법은 (+)극에 체세포가 위치하도록 하고, (-)극에 세포질이 위치하도록 정렬하였다.

1-8) 복제수정란의 활성화 처리 ( cell activation )

체세포 복제 수정란의 활성화 처리는 Ca2+-Ionophore(A23187)가 첨가된 mSOF 용액을 이용하여 4분간 활성화시킨 후 6-DMAP가 첨가된 mSOF 용액에서 4시간 동안 활성화 시켰다. 활성화가 끝난 난자를 mSOF 배지에서 2~3회 세척하여 이산화탄소 5%, 산소 5%, 온도 39 ℃, 포화습도 배양기에서 6-9일간 배양을 하였다.

[ 실시예 1] 본 발명의 저장된 파형을 가하면서 배아줄기세포의 배양

2-1) 시료의 준비

배아줄기세포 배양(ICM Culture)을 위한 배양액은 Knockout DMEM(Gibco BRL, Cat No 10829-018)10ml 에 혈청 교체액(serum replacement, Gibco BRL Cat No 10828-028) 15% , 1mM 글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1% 비필수아미노산(non-essential amino acids (NEAAs), Gibco BRL Cat No 11140-050), 4 ng/ml 인간 염기성 섬유아세포 성장인자(human basic fibroblast growth factor(bFGF), R&D Systems.), 10ng/ml Human oncostatin M, 10ng/ml Human stem cell factor ( All R&D Systems.) 를 추가하여 사용하였다. 기타 배양액은 실시예 1의 것과 동일한 것을 사용하였다.

2-2) 배아줄기세포 배양

본 발명의 배아줄기세포 배양은 정상적으로 자라고 있는 배아줄기세포의 전기적 파 형을 미세전극을 통해서 검출 하여 그 파형을 그대로 저장한 후에 새롭게 배양 하고자 하는 배아줄기세포 배양환경에 저장된 전기적파형을 추가하여 배양, 배양환경이 동일할 때 배아줄기세포주 성립확률을 미처리군과 비교하여 그 효능을 평가하였다.

2-2-1 ) 상기 1-9)에서 배양하여 배반포(blastocyst)로 성장한 후기 체세포 복제 수정란, 또는 인공수정을 통해 만든 인공수정란을 0.25% 프로네이즈 (0.25% pronase, sigma P-8811)로 투명대를 녹였다. 이 다음 면역학적인 처리로서 항-인간 혈청 항체(anti-Human Serum Antibody, 1: 20 희석, sigma H8765)로 30 분간 처리 후, 기니피그 혈장 희석액 (Guinea pig complement, 1:10으로 희석, sigma S-1639)에서 2분간 처리하여 내세포괴(inner cell mass, ICM)만 분리하였다.

이렇게 얻어진 내세포괴는 쥐 태아섬유아세포가 자라는 접시에 이식해서 내세포괴가 다른 세포로 변형되지 않고 배아줄기세포 성질을 유지한 채 분화성장하도록 하였다. 상기 쥐 태아섬유아세포는, 임신 10~13일경의 암컷 태아로부터 상기 공여핵원 세포 배양과 동일한 방법으로 조직을 얻어 배양하여 사용하였다.

내세포괴를 쥐 태아섬유아세포에 이식하기 전에, 마이토마이신 씨 (mitomycin C, sigma) 10㎍/㎖ 가 들어 있는 배양액에 쥐 태아섬유아세포(바탕영양세포)를 5-6시간 배양을 하여 분화능력을 떨어트린 후 배아줄기세포 배양액으로 세정하였고, 여기에 내세포괴를 이식하여 5일 정도 배양을 하였다. 그 내세포괴가 접시 밑면에 부착하여 세포 숫자가 2 ~ 2.5배 정도로 증가하였고, 이 배아줄기세포를 4-5등분을 하여서 각각 따로 처음 배양을 시작하듯 배양접시에 배양을 하였다.

상기 과정으로 내세포괴가 배양된 세포를 '배아줄기세포'라고 하며, 계대배양 방식과 동일하게 배아줄기세포 배양액이 들어 있는 분화능력이 떨어진 쥐 태아섬유아세포가 자라는 접시에서 계대배양 방식을 반복하면 미분화 상태를 유지한 채 계속하여 증식하게 된다.

이 위에서 상기와 같은 배양 방법으로 내세포괴를 추출한 후에 이식하였고, 이 내세포괴는 비활성화된 쥐 영양세포에 부착하여 그 크기가 2-4 배정도 커지도록 배양되었으며, 이를 배아줄기세포주로 확립하였다. 이렇게 커진 배아줄기세포주를 작게 분할하여 계대배양을 실시하였다.

3-1) 세포 전기적 파형의 저장

본 발명에 필요한 미세전극을 통해 검출된 전기적 파형을 얻기 위해서는 쥐 태아섬유아세포(바탕영양세포)가 있는 배양상태에서는 배아줄기세포 단독적인 전기적 신호 검출을 할 수가 없다. 여러개의 세포의 전기적 신호가 섞이기 때문이다. 이런 이유로 정상적인 분화를 시작한 배아 줄기세포는 BD Biosciences Discovery Labware( BD Matrigel : Cat no 354602 ) 배양디쉬 처럼 쥐 태아섬유아세포(바탕영양세포)가 없이 배양하는 배양면이 필요하며, 이와 같은 방법은 배양을 하는 배양면에 라미닌(laminin), 콜라겐 타입4 (collagen IV), 헤파란 설페이트 프로테오글리신 (heparan sulfate proteoglycans) , 엔타신 (entactin) 그리고 니도겐 (nidogen). 각각 코팅이되어 있으며 쥐 태아섬유아세포(바탕영양세포)가 자라는 배양면 대신에 사용을 한다. 정상적으로 배양이 이루어지는 상태에서 계대배양을 (BD Matrigel : Cat no 354602) 배양디쉬에서 실시하며 배양을 시작한지 12시간 후-2틀 사이정도 후에 본 발명에서 필요한 전기적 파형을 미세유리관 전극을 통해 검출한다. 도2와 같이 상기와 같은 방법으로 배반포에서 추출된 내세포괴(ICM)에서 미세유리관 전극(AgCl 전극)을 통해 하나의 단일세포의 전기적 파형을 검출하여 저장 (도4) 하며 세포의 전기적 파형을 저장하는 다른 방법으로는 도1에서 보는바와 같이 미세전극이 설치된 배양면(40)에 라미닌(laminin), 콜라겐 타입4 (collagen IV), 헤파란 설페이트 프로테오글리신 (heparan sulfate proteoglycans) , 엔타신 (entactin) 그리고 니도겐 (nidogen)이 각각 코팅 된 배양면(40)에 배양면 전극격자(50)가 두께 2-3 ㎛ ; 160㎛ 간격으로 설치되어 있다. 배양액을 담기위한 배양면 경계구분 디쉬(10)를 설치하였다. 배양면 전극격자(50)는 연결선(20)과 연결접접(30)을 통해 배양면에서 자라는 배아줄기세포들의 전기적 신호를 검출저장 (도6) 하였으며, 도1과 같은 방법은 다수의 또는 한개 세포의 전기적 파형을 그 측정되는 체널 숫자를 조절해 가면서 측정되는 세포들의 숫자를 조절할 수 있다. 이렇게 측정이 된 전기적 파형을 나타내는 도4와 도6의 차이점은 정상적으로 자라는 줄기세포 파형의 단일 세포 파형 (도4) 또는 160㎛ 간격안에서 자라는 배아줄기세포들의 전기적 파형이 섞여진 파형(도6)을 각각 측정한 전기적 신호이다. 금속성 필름형태 연결선(90)에 접촉이 되어 연결된 세포들의 파형은 하나의 파형 또는 여러개의 파형등등을 동시에 각각 전기적 파형 측정장비에 연결해서 저장이 가능하다. 그 선택은 연결된 체널의 숫자와 선택으로 이루어진다.

세포의 전기적 파형을 저장하는 방법에 대해서 더 자세히 설명하자면, 본 실험에 사용되는 장비는 Univ.of North Texas (WWW.CNNS.ORG : 미국 합중국)에서 상업용으로 판매하는 장비들을 구입해 세포들의 파형을 저장하였으며, 저장된 파형을 다른세포에 공급하면서 배양하는 방법은 바이오퓨전텍(www.Biofusiontech.com:한국) 세포융합기의 RMX2010 회로를 변형시켜서 수치입력부분에 저장된 파형을 입력시켜 원하는 전기적 파형을 출력하였다. 상기 2-2-1에서 얻어진 배아줄기 세포주는 도7에서 보는바 같이 다체널 미세전극 배양판 (Multi- channel Electrode Array; (MEA))에서 세포의 파형을 얻기 위해 배아줄기세포와 다체널 미세전극 배양판(MEA)에서 금속성 필름형태 연결선(90)으로 연결이 되어 전기적 파형을 측정 및 저장이 되면서 배양된다. 도8에서 보는바 같이 배양면(50)을 확대하면 배양면(50‘)처럼 구성되며 배양 실시예(94)에서 보는바 같이, 부품번호 HCC2 이름으로 www.CNNS.org에서 판매한 장비에 배양된 세포들이 장착이 되어 실시된다. 즉 도1과 같이 배열된 배양장치는 도8의 배양 실시예 (94)와 같이 실제 연결이 되어 배양이 실행된다. 도8에서 배양면전극격자 확대 MEA (50’) 부분의 세포배양방법에 대해 설명하자면 도7에서 보는바 같이 배양액(93)을 담기 위한 배양면 경계구분 디쉬 (10)를 통해 외부로 연결선이 연결되어 있으며 1mm 유리판(88) 위에 세포의 파형을 저장하기 위해 배양액과 세포 사이 전기적 흐름이 가능하도록 배양면 전극 격자(50)가 세포지지를 위한 지지층 밖으로 노출이 되어져 있는 금속성 필름형태연결선(90)이 연결이 되어 있고 그 위로 연결선들 사이의 절연을 위해 각각 절연층(85) ( polysiloxane ; Dow Corning DC-648 (미합중국)) , 세포들의 정착을 위해 라미닌(laminin), 콜라겐 타입4 (collagen IV), 헤파란 설페이트 프로테오글리신 (heparan sulfate proteoglycans) , 엔탁신 (entactin) 그리고 니도겐 (nidogen)으로 이루어진 세포 지지층(83) 위에 2-2-1에서 배양된 배양 중 배아줄기세포(55)가 배양된다. 이렇게 배양되어 지는 과정 중의 배양 중 배아줄기세포(55)의 전기적 파형은 배양액에 노출이 되어 세포의 전기적 파형 전달이 가능한 금속성 필름형태의 연결선(90)을 따라서 저장되어 지며 저장이 되는 장비는 상업용 장비를 구입해서 사용하였다. 세포의 전기적 파형을 저장하기 위한 상업용 장비의 모식도는 도9에서 보는바 같이 나타내 지며 저장되는 채널의 숫자는 가변형태로 변화가능하며 셈플링 측정수치는 채널당 최소한 20 kSPS로 이루어진다. 본 실험에서는 20MSPS 가 능한 상업용 보드를 구입해 사용했다. 도9에서 보는바 같이 금속성 필름형태연결선(90)으로 전달된 신호는 각각 필터엠프를 통과 다중체널 선택기(MUX)와 상업용으로 쓰이는 디지틀신호 처리기 (ADC/DSP) 보드를 거쳐 저장되며 파형의 저장과정 도9의 각각 부분에 대해 설명하자면 다중체널선택기 MUX ( 8 x 74hc4051 : 아나로그 8체널 추가확장 가능 ), ADC ( 두쌍의 4체널 12 Bit ADC 모듈;(20 MSPS)), 디지틀 신호처리기 DSP ( TI C6201 가 장착된 DSP 보드 ;(최대 1600MIPS))를 거쳐서 개인용컴퓨터 PC 에 PCI버스 연결 방식으로 된 연결선에 따라 컴퓨터에 저장이 된다. 이러한 일련의 과정은 여러 체널당 각각의 파형을 저장하기 위해 사용되는 장비들을 나타낸 것이며 각 장비들은 여러개의 체널을 통해 각각의 세포들의 파형을 저장할 수 있다. 대부분의 전기적 파형을 저장하기 위한 장비는 Univ.of North Texas (WWW.CNNS.ORG : 미국 합중국)에서 판매용으로 판매되는 장비를 구입해 사용하였으며 셈플링 되는 세포들의 파형 숫자는 체널의 숫자를 늘이거나 줄여서 각각 저장 되어지는 세포들의 파형 숫자를 조절한다. 도3,또는 도7에서 보는바 같이 배양면 전극격자(50)에 장착된 금속성 필름형태 연결선(90)를 통해 전기적 신호를 측정하면 도6과 같은 배아줄기세포들의 전기적 파형을 얻을 수 있으며 또한 단일세포의 전기적 파형을 얻기 위해서 미세유리관 전극( AgCl electrode )을 이용해 전기신호측정 장비에 하나의 체널만 연결하여 측정하면 하나의 배아줄기세포의 전기적 파형(도4) 도 얻을 수 있다. 파형은 모두 컴퓨터에 PCI 방식으로 연결된 대용량 저장장치인 하드디스크에 저장이 되었으며 베아줄기세포가 배양을 시작한지 24시간 후 에 그 숫자가 100 이라 할때 배양을 시작한 후 48시간 사이에 베아줄기세포의 숫자가 160 정도가 됨으로 베아줄기세포의 전기적 측정을 한 시각은 배양이 시작된 지 12시간 후부터 24 시간 사이의 시간 안에서 그 전기적 파형을 저장하여 사용하였다.

3-2) 저장된 전기적 파형을 통전하면서 배아줄기세포 배양

배아줄기세포 배양을 시작한지 12시간 후부터 24시간 사이의 전기적 신호를 모두 저장하였으며 본 실험에 저장된 파형을 이용 시 12시간 동안 저장된 전기적 신호들을 한 주기로 저장된 전기적 신호를 반복, 통전하며 본 실험에 이용하였다. 저장된 세포들의 파형 전압분포는 최대 +100mV, 최소 -100mV 사이에 있으며 도7에서 보는바와 같이 세포들의 전기적 파형 검출하여 저장 또는 세포들을 배양하려고 하는 전기적 파형을 통전하는 두 가지 기능은 다체널 미세전극 배양판 (Multi- channel Electrode Array; (MEA))을 이용해 이루어진다. 금속성 필름형태 연결 선(90)과 배양액(93)사이에 연결된 연결선 사이에 배양하고자 하는 세포에 저장된 세포들의 전기적 파형을 가하면서 배양, 그 배아줄기세포 성립여부를 비교하여 그 효능을 비교분석 하였다. 정상적인 배아줄기세포의 단일세포 전기적 파형(도4), 정상적인 배아줄기세포의 다수의 줄기세포 전기적 파형이 섞인 상태에서 측정한 전기적 파형(도6)은 본 발명에서 새롭게 배양하고자 하는 복제된 배아내세포괴에 저장된 전기적 신호를 가하면서 동시에 배양을 하게 되며, 미처리군과 비교하여 그 배아줄기세포 배양에 미치는 영향을 확인하였다. 세포들의 파형을 저장하는 장비는 그 저장을 원하는 각각의 세포숫자만큼 체널이 필요하며 이렇게 저장된 파형은 다시 배양을 원하는 세포에 출력하면서 배양을 하는데 출력을 가하는 전기적 회로는 도10에서 보는바 같이 www.Biofusiontech.com에서 판매하는 전기세포융합기 (등록특허 10-04586620) RMX2010 장비를 수치입력수단 부분에 본 실험에서 저장된 세포들의 전기적 파형을 입력값으로 바꾸어 입력하며, 출력전원 공급부의 전압을 최소 -100mV, 최대 +100mV 로 하여 본 실험에 사용하였다. 도10을 자세히 설명 하자면 개인용 컴퓨터에 저장된 세포들의 전기적 파형은 각각 저장된 세포들의 전기적 파형을 각 체널당 전부 각각 다르게 출력하려면 출력부분도 각각 모두 독립된 전기적 회로가 필요로 한다. 이렇게 출력 부분을 각각 입력된 체널 파형 형태로 다르게 출력 가능 하지만 기계의 복잡성 때문에 본 실험에서는 저장된 세포들의 파형 중 중간값의 파형을 하나 선택하여 배양하고자 하는 세포들 전체에 동일한 전기적 파형을 가하면서 배양하였다. 간추려 말하자면 각각 체널당 저장된 파형신호들의 주기 및 전압차등을 일률적으로 일정하게 늘이거나 줄여서 배양하고자 하는 세포에 입력된 체널 숫자만큼 각각 분리해서 출력 또한 가능 하지만 본 실험에서는 저장된 신호 중 한개의 신호를 선택해서 그 신호 그대로를 배양하고자 하는 세포 전체에 출력하면서 실험에 사용하였다. 첨부된 도면에 의해 자세히 설명하면, 교류전원(67)은 전원공급 수단기(68)에 의해 제어수단(61), 출력전원공급부(65), 출력신호 제어장치(70)에 공급이 된다. 주파수 발생장치(60)에 의해 발생된 신호는 제어수단(61)을 통제하며 제어수단은 각각 수치입력수단(62)과 디지틀 아나로그변환기(64)를 각각 제어한다. 상기 위 실험에서 컴퓨터에 입력되어진 저장된 세포의 전기적 파형(63)은 입력 값으로 수치입력수단(62)에 입력이 되며 이렇게 입력되어진 저장된 세포의 전기적 파형(63)은 출력신호 제어장치(70)에 의해 펄스증폭기(66)를 통과 하면서 저장된 세포의 전기적파형(63)을 출력전원 공급부(65)로부터 전원을 공급받아 출력(69)하게 된다. 이상 세포의 전기적 파형을 저장하고 다시 저장된 전기적 파형을 출력하면서 배양하는 본 발명으로 배양된 쥐 태아섬유아세포(바탕영양세포)가 없는 상태에서 배양된 배아줄기세포는 도5와 같은 모습으로 자라나게 된다.

처리	내세포괴 (갯수)C	증식성공 (갯수)	배아줄기세포주 (갯수)D	배아줄기세포주 배양 성공률
무처리 내세포괴 (ICM)	38	6	6	15.7 %
단일 세포의 파형 통전 환경 내세포괴(ICM)	34	10	10	29.4 %
다수세포의 파형 통전 환경 내세포괴(ICM)	36	9	9	25 %

상기 내세포괴는 쥐 태아섬유아세포(바탕영양세포)가 없는 BD Biosciences Discovery Labware( BD Matrigel : Cat no 354602 ) 배양디쉬 또는 다우코닝 DowCorning DC 648 (polysiloxane) 에 라이신과 라미닌을 코팅한 디쉬를 이용하여 배양을 하였으며 처리군은 도1과 같이 다수의 미세전극을 더 설치하여 무처리 내세포괴와 처리군 내세포괴의 배아줄기세포주 배양 성공률을 비교하였다. 본 발명에서 언급한 저장된 정상세포의 파형을 가하면서 배양하는 배양법에서는 배양하려고 하는 세포의 방향성, 다른 세포로 분화가능성, 성장속도, 통전하는 전기적 파형의 전압, 주기조절 등등을 추가하여 비교분석이 가능하지만 본 발명에서는 배아줄기세포주의 성공률만을 비교하였다. 상기 표 1 에서 보는 바와 같이 추출된 내세포괴는 무처리군에 비해 증식성공율이 유의적으로 높으며, 정상적으로 배양과정 중 하나의 세포에서 전기적 신호를 추출하여 저장한 전기적 파형을 통전하면 배양하는 실험군에서 유의적으로 높은 배양효과를 나타내었으며 (단일 세포의 파형 통전 환경 내세포괴(ICM), 29.4%), 배아줄기세포주 배양성공률이 무처리군에 비해 유의적으로 높았다. 따라서 본 발명의 저장된 정상세포의 전기적 파형을 배아줄기세포에 통전하면서 배양하는 방법이 내세포괴에서 배아줄기세포로의 증식성공률을 증가시킴을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 정상적으로 배양중인 세포의 전기적 파형을 저장한 후에 저장된 전기적 파형을 새롭게 배양하는 배반포의 내세포괴를 배양 시 통전하면서 배양하는 방법은 배아줄기세포의 확립 및 증식효율을 향상시킨다. 따라서 본 발명의 배양방법을 이용하면 다양한 세포로 분화할 수 있는 배아줄기세포를 다량으로 수득함으로써 배아줄기세포를 이용한 치료 및 연구 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (3)

1. 배아줄기세포를 효과적으로 얻기 위해 인공수정, 복제수정란 후 얻어지는 배아줄기세포의 전기적 파형을 측정, 저장 한 후 그 측정값을 그대로 보관하여 복제수정란 또는 인공수정 후 얻어진 내세포괴를 배아줄기세포로 배양 시 저장된 전기적 파형값을 그대로 통전하면서 배양, 하기 단계로 이루어지는 효과적 배아줄기세포의 배양방법;

   1) 체세포를 배양한 후 단일세포로 분리하여 공여핵 체세포를 준비하는 단계, 2) 채취한 난자를 체외성숙시키는 단계, 3) 체외성숙난자에서 난구세포를 제거하는 단계, 4) 상기 3)단계의 난자에서 탈핵시켜 수핵난자를 준비하는 단계, 5) 수핵난자에 공여핵을 이식하여 공여핵 이식란을 제조하는 단계, 6) 공여핵 이식란을 세포융합하여 체세포 복제 수정란을 제조하는 단계, 7) 체세포 복제 수정란을 화학적 방법으로 활성화시키는 단계 , 8) 체세포 복제 수정란을 체외배양하는 단계,9) 체세포 복제 수정란을 체외 배양하여 배반포(blastocyst) 상태로 배양하는 단계, 10) 배반포로부터 내세포괴(inner cell mass)를 분리하는 단계, 11) 배양된 쥐 태아섬유아세포에 내세포괴를 이식하는 단계 , 12) 배양된 내세포괴를 쥐 태아섬유아세포가 없는 배양접시에서 배양한 후 미세유리전극 또는 미세전극으로 세포의 전기적 파형을 저장하는 단계, 및 13)저장된 전기적 파형을 새로 배양하려고 하는 내세포괴에 통전하면서 배양하는 단계로서;

   상기 세포는 인간을 제외한 동물의 세포임을 특징으로 하는 배아줄기 세포의 배양방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 12단계에서 배아줄기세포의 전기적 파형을 저장하기 위해 미세유리전극 또는 미세전극 격자를 이용하여 배양과 동시에 배아줄기세포의 전기적 파형 저장을 특징으로 하는 배아줄기세포 배양방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 13단계에서 저장된 배아줄기세포의 전기적 파형을 새로 배양하려고 하는 내세포괴에 미세유리전극 또는 미세전극 격자를 이용, 통전하면서 배양함을 특징으로 하는 배아줄기세포 배양방법.

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