CN1407851A - 一种改进的通过体细胞核转移制备猪克隆胚胎的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种改进的通过体细胞核移植大规模生产猪胚胎克隆的方法。详细地说，从屠宰场来源的卵巢制备卵母细胞，然后体外成熟。在体外成熟(IVM)完成之后，卵母细胞去核并通过电刺激单个地与体细胞融合。重建的卵通过第二次电刺激激活，然后在体外培养。本发明试图建立激活重建的卵母细胞的最佳条件，以及提高核转移(NT)胚胎的活力，最终得到可成活的克隆胚胎和克隆动物。所以，本发明猪体细胞核转移可应用于扩大原种猪以及培育用作异种移植或作为疾病模型的转基因猪。

Description

一种改进的通过体细胞核转移制备猪克隆胚胎的方法
发明背景
技术领域
本发明涉及一种经核转移制备克隆胚胎的方法，尤其是一种改进的通过新的体细胞核转移技术大规模生产克隆胚胎方法，包括利用电刺激将去核受体卵母细胞与体细胞或体细胞核进行融合，卵母细胞重建，以及通过二次电刺激激活所述重建的卵母细胞。
现有技术
传统的改进特定动物物种如家畜性状的方法多数依靠将具有优良表型的动物杂交。但是，由于这种方法通常需要大量时间来产生遗传上优良的后代，不能快速地再生所选择动物，所以不是非常有利的方法。但自从一种称为“核转移(NT)”的新的利用指定动物体细胞的科学方法被介绍后，在绵羊(Schnieke等，Science，278：2130-2133(1997)；Wilmut等，Nature，385：810-813(1997))，山羊(Baguisi等，Nature Biotechnology，17：456-461(1999))，小鼠(Wakayama等，Nature，394：369-374(1998))，牛(Cibelli等，Science，280：1256-1258(1998)；Kato等，Science，282：2095-2098(1998)；Wells等，Biol.Reprod.，60：996-1005(1999))和猪(Onishi等，Science，289：1188-1190(2000)；Polejaeva等，Nature，407：505-509(2000))中的动物克隆已经成功进行。事实上，来源于卵丘或输卵管(Wakayama等，Nature，394：369-374(1998)；Kato等，Science，282：2095-2098(1998))，粒细胞(Wells等，Biol.Reprod.，60：996-1005(1999))，哺乳动物上皮细胞(Wilmut等，Nature，385：810-813(1997))，胎儿成纤维细胞(Schnieke等，Science，278：2130-2133(1997)；Baguisi等，Nature Biotechnology，17：456-461(1999)；Cibelli等，Science，280：1256-1258(1998))以及耳表皮细胞(Zakhartchenko等，Mol.Reprod.Dev.，54：264-272(1999))的多种体细胞都已经作为良好的核供体进行了使用。
但是，尽管不断地试验，长期以来使用猪体细胞进行的核转移技术一直未能成功(Du等，Theriogenology，51：201(1999)；Tao等，Cloning，1：55-62(1999))，只有一篇关于带有4-细胞期细胞核的NT胚胎产生小猪的报道(Prather等，Biol.Reprod.，41：414-418(1989))。所以，使用体细胞克隆猪被认为是难以实现的任务，直到最近几年报道的一些成功的进展(Onishi等，Science，289：1188-1190(2000)；Polejaeva等，Nature，407：505-509(2000))，这些进展是通过体内来源的卵母细胞作为受体胞质而实施的。
已知离子载体A23187是一种良好的哺乳动物卵通用激活剂(Steinhardt等，Nature，252：41-43(1974))，因为它可诱导几种动物卵母细胞中皮层颗粒的胞外分泌，第二极体排出以及前核的形成(Marcus，Mol.Reprod.Dev.，16：1384-1391(1990)；Liu等，Mol.Reprod.Dev.，49：298-307(1998)；Wang等，Mol.Reprod.Dev.，51：346-353(1998))。离子载体处理过的猪卵母细胞也显示可形成前核和孤雌发育至胚泡阶段(Funahashi等，Biol.Reprod.，50：1072-1077(1994)；Wang等，Biol.Reprod.，60：1020-1028(1999))。
通常，组合的化学试剂如Ca-离子载体/6-DMAP(Cibelli等，Science，280：1256-1258(1998)；De Sousa等，Cloning，1：63-69(1999))，离子霉素/6-DMAP(Wells等，Biol.Reprod.，60：996-1005(1999))或者放线菌酮/细胞松弛素B(Zakhartchenko等，J.Reprod.Fertil.，115：325-331(1999))，已经应用于激活用体细胞重建的牛卵母细胞。在猪试验中，一些重建的卵通过暴露在乙基汞硫代水杨酸钠/二硫苏糖醇中而被激活，这些卵显示发育成推定胚泡(Tao等，Cloning，1：55-62(1999))。
电刺激也是一种已知的有效的猪卵母细胞激活剂(Jolliff和Prather，Biol.Reprod.，56：544-548(1997)；Wang等，Mol.Reprod.Dev.，51：346-353(1998))。当成纤维细胞和猪NT卵被通过电刺激激活并且同时融合时，一些胚胎发育成胚泡(Du等，Theriogenology，51：201(1999))。
在核转移中，使用胚胎或体细胞，通常可观察到在去核过程中一部分卵母细胞细胞质被去除。最后得到的体积减少的细胞质造成随后的发育潜能的退化以及牛中NT胚胎细胞数目的减少(Peura等，Mol.Reprod.Dev.，50：185-191(1998))。注射了成纤维细胞的牛NT胚胎显示了相对低的发育率，在实验中，只有12％的胚胎达到胚泡阶段(Cibelli等，Science，280：1256-1258(1998))，而注射了壁或丘粒的胚胎细胞则导致相对较高的体外发育率，显示约有50％胚胎达到胚泡阶段(Kato等，Science，282：2095-2098(1998)；Wells等，Biol.Reprod.，60：996-1005(1999))。这两种实验的不同结果暗示每种不同细胞类型作为核供体可能具有不同的发育潜能，但是，NT猪胚胎在体外发育能力的详细情况至今还没有清楚的解释，仍需进一步阐明。
体细胞核转移已成为产生转基因动物，特别是转基因家畜动物的一种有效工具。克隆的转基因动物也已从转染的成纤维细胞中产生(Schnieke等，Science，278：2130-2133(1997)；Cibelli等，Science，280：1256-1258(1998))。但是，仍需注意到利用以上提及的核转移技术产生这些转基因猪的一个先决条件是在体细胞上进行了基因修饰。尽管近来使用各种体细胞类型作为核供体在绵羊，牛，小鼠，山羊和猪中取得了成功，但体细胞核转移的效率仍然非常低，仅有不到2％。所以，长期以来渴望发展一种更先进的核转移技术能更广泛地应用于动物工业和生物医学领域。
发明概述
本发明的目的是提供一种改进的通过体细胞核转移大规模生产克隆胚胎的方法。作为一种改进通过体细胞核转移法产生的克隆卵母细胞相对较低的体外发育率的方法，本发明的发明人发展了一种新的方法生产克隆胚胎，其中成熟的去核卵母细胞与培养体细胞来源的细胞核通过电刺激进行融合，允许重建1-2小时，然后通过第二次电刺激进一步激活，以增加所述胚胎的生活力并介导持续的体外发育。本发明还可帮助建立一种明确的用于在克隆猪中实施移植的方法，并可用于产生转基因动物，为人类提供可替换的器官。
附图说明
图1显示本发明猪克隆胚胎的产生方法示意图。
图2举例说明本发明建立转基因细胞系和克隆的转基因胚胎的实施方案。在成纤维细胞(A)和NT胚泡(C)中GFP的表达。在光学显微镜下观察到相同的NT胚胎(B)。
发明详述
本发明涉及一种改进的通过体细胞核转移大规模生产猪克隆胚胎的方法，包括以下步骤：(a)去除受体卵母细胞的核；(b)在体外培养核供体体细胞；(c)将体细胞注射到去核的卵母细胞中；(d)将每个去核卵母细胞与供体体细胞进行电融合；(e)通过第二次电刺激激活重建的胚胎；(f)在体外培养NT胚胎并将NT胚胎转移至受体猪。
以下进一步说明本发明。
首先，本发明的特征在于在卵母细胞去核和所述卵母细胞与体细胞通过电刺激融合后，具有一个1-2h(小时)的卵母细胞重建期。通常，除了那些来自人类的外，推荐使用哺乳动物体细胞作为核供体，尤其优选取自猪，奶牛，绵羊和小鼠等动物的成纤维细胞或丘细胞。在本发明中，受体卵母细胞收集自青春期前的猪卵巢，并且不成熟的卵母细胞在体外孵育成熟。然后，仅选择出那些具有第一极体的成熟卵母细胞，然后进行去核，待用。单个供体体细胞分别被注射到每个去核的卵母细胞中，暴露在160V/mm电脉冲的初次电刺激下30μsec，诱导每个卵母细胞的细胞质与每个供体体细胞的细胞核之间分别融合。这样得到的卵母细胞通过在含有胎牛血清的磷酸盐缓冲液(PBS)中培养进行1-2h的重建。
上述重建的卵母细胞再进行第二次电刺激激活，其中所述卵母细胞暴露在120-150V/mm电脉冲下30μsec。如果电刺激低于120V/mm，激活率降低，当超过150V/mm时，卵母细胞受伤的风险就会增加。然后这些卵母细胞在体外进行进一步发育。在传统的核转移方法中，仅对卵母细胞进行一次电刺激，在体外发育率通常小于5％；与此相反，本发明通过导入第二次电刺激可以显著地改进所述卵母细胞的发育率，使其达到11.6％，即，与那些传统方法相比具有130％的增加。
重建卵母细胞的激活是在体细胞核转移至受体细胞质中后实施。几种组合的化学处理，例如钙离子载体/6-DMAP或乙醇/放线菌酮/细胞松弛素B，已经用于激活带有体细胞的牛NT卵母细胞。但是，当单独使用A23187或使用组合试剂A23187/6-DMAP处理猪NT卵母细胞时，它们显示出相对较低的激活率。通常，当用一种单独的化学试剂处理时，猪卵母细胞显示出较低的激活率，而当用一种结合的化学试剂，乙基汞硫代水杨酸钠/DTT处理时，猪卵母细胞发育成胚泡，尽管它们的发育率很低。在另一报道中，用巯基试剂激活时，显示出低卵裂率，这就导致随后能够发育成胚泡的猪NT卵母细胞的发育率很低。根据本发明，电刺激激活的猪NT胚胎与用化学试剂处理的相比，显示相对较高的发育率。
测定电融合后不同水平电压诱导的猪NT卵发育能力，结果显示，电脉冲(120V/mm DC脉冲)对于激活带有体细胞的猪NT胚胎十分有效。
当用乙基汞硫代水杨酸钠/二硫苏糖醇激活时，约有70％用猪成纤维细胞重建的胚胎未能分裂(Tao等，Cloning，1：55-62(1999))。在本发明中，用一次电刺激激活的猪NT卵的平均卵裂率与那些单性生殖的以及体外来源的受精来源(IVF)胚胎相似。这样，本发明说明一次电刺激足够介导使用体细胞的猪NT胚胎的发育。
本发明提供了在电融合之后，用体细胞重建的卵最佳的激活时间。在牛中，NT胚胎在供体细胞与MII期细胞质融合后4到8h激活，显示在胚胎发育中有所改善(Stice等，Biol.Reprod.，54：100-110(1996)；Well等，Reprod.Fertil.Dev.，10：369-378(1998))。延长被转移的核暴露在卵母细胞细胞质因子中的时间也促进了核改建(remodeling)和重新编程(DiBerardino等，Science，224：946-952(1984)；Ware等，Gamete Res.，22：265-275(1989))。所以，这暗示着，在激活之前使重建的卵母细胞经历几个小时的滞后期，会促进核改建或重新编程，尽管其机理还不清楚。为测定卵母细胞激活的最佳条件，检测电融合后不同激活时间诱导的猪NT卵的发育能力。在本发明中，融合后1-2h激活的猪NT胚胎与融合后经更短时间(0和0.5h)或更长时间(4和6h)激活的相比，显示出改善的发育。这可能归因于不同的物种中，基因组激活的时间不同。在猪中胚胎基因组的激活通常发生在4-细胞期，而在绵羊和牛中是在8到16-细胞期(Kopscny，Reprod.Nutr.Dev.，29：589-600(1989))。这就暗示着电融合后重建的猪卵母细胞的激活时间在体细胞核转移后产生可成活胚胎的过程中具有决定性的作用。进一步的，还暗示着融合后供体核在受体细胞质中的改建和重新编程所需的时间可能因物种不同而不同。
本发明还公开了核转移后，从体外成熟的卵母细胞成功地产生猪克隆胚胎的方法。通过将体细胞细胞核转移到去核的体内来源的卵母细胞，产生NT胚胎，已经发育得到了除牛之外，如绵羊，山羊，小鼠和猪等大多数克隆动物。体内来源卵母细胞通过冲洗促性腺激素处理后超排卵动物的排卵管得到，该激素在各个物种中不同。但是，体内来源卵母细胞数目大体上都在一定的限度内，因为该方法费力耗时。作为替代，许多作为受体细胞质的卵母细胞可在体外制备。优质的未成熟卵母细胞可从屠宰场来源的卵巢中得到，体外成熟并在去核后用作受体细胞质。最近，还有报道称体内来源的卵母细胞可产生克隆猪(Onishi等，Science，289：1188-1190(2000)；Polejaeva等，Nature，407：505-509(2000))。但是，本发明提供一种使用体外来源卵母细胞在体细胞核转移后产生猪NT胚胎的方法。
已有研究暗示带有体细胞的NT胚胎发育能力可能根据哺乳动物中细胞类型而不同(Kato等，Science，282：2095-2098(1999)，Zakhartchenko等，Mol.Reprod.Dev.，54：264-272(1999))。本发明中，用作供体核的丘细胞和胎儿成纤维细胞支持NT猪胚胎发育到植入前阶段，这暗示着本发明的激活体系在核转移中可适用于各种不同细胞类型。
成功的猪体细胞核转移暗示该技术可用于产生用于异源移植的或作为疾病模型的转基因猪；事实上，本发明还成功的将外源DNA导入到猪体细胞内。在本发明中，用转染细胞产生的NT胚胎与那些用未转染供体细胞制得的相比，具有相似的发育能力。并且，在用转染细胞制得的所有NT胚胎早期发育阶段中转基因的表达很强烈，这加强了从在核转移后用转染细胞制得的NT胚胎产生转基因胚胎或转基因动物的可能性。实验详述体外成熟(IVM)和体外受精(IVF)
从当地屠宰场收集青春期前的猪卵巢，转移到实验室并在25-30℃，在75μg/ml青霉素G钾和50μg/ml链霉素硫酸盐补充的0.9％(w/v)盐水中保存直至使用。使用与10ml一次性注射器连接的18号针头收集来自直径3-6mm猪卵泡的丘-卵母细胞复合物(COC)。COC用Tyrode’s乳酸盐(TL)-Hepes培养基清洗3遍。在39℃，含有5％CO2的空气下，在4孔多用板(Nunc，Roskilde，Denmark)上分别含有500μl成熟培养基的每个孔中培养约50个COC。在20到22h培养后，用TL-Hepes培养基清洗卵母细胞3遍，然后在没有孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒膜促性腺激素(hCG)补充的成熟培养基中进一步培养22h。培养物用温热的石蜡油(轻矿物油)覆盖，使用前在39℃，含有5％CO2的空气下平衡至少2h。卵母细胞成熟培养基是不含牛血清白蛋白(BSA)的NorthCarolina State University(NCSU)23培养基，用10％(v/v)猪卵泡液，0.57mM半胱氨酸，25μg/ml庆大霉素，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10IU/ml PMSG和10IU/ml hCG补充。猪卵泡液收集自3-6mm直径的卵泡，1600×g离心30min，通过1.2μm注射器式滤器过滤，以等份试样保存在-20℃直至使用。
IVF所用的基础培养基基本与Abeydeera和Day(Biol.Reprod.，57：729-734(1997))描述的相同。这种IVF培养基，设计为改良Tris-缓冲培养基(mTBM)，由113.1mM NaCl，3mM KCl，7.5mM CaCl2·2H2O，20mMTris(结晶的游离碱；Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ)，11mM葡萄糖，5mM丙酮酸钠构成，并且不含抗生素。新鲜猪精液由Darby Pig AICenter(Acseong，Korea)每周一次惠赠，并在17℃保存5天。上述精液通过在1mg/ml BSA(V组分)，100μg/ml青霉素和75μg/ml链霉素补充的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(DPBS)中离心进行清洗，清洗后，将精子重悬在Tris缓冲培养基中(pH7.8)。IVM结束后，通过用0.1％(w/v)透明质酸酶在NCSU23培养基中处理去除卵母细胞的丘细胞。裸露的卵母细胞用2.5mM咖啡因和4mg/ml BSA补充的mTBM清洗3遍，然后置于覆盖在石蜡油下的50μl mTBM中。将50微升稀释的精子加入到50μl含有卵母细胞的受精培养基中，使精子的终浓度为5×105细胞/ml。卵母细胞与精子在39℃，含有5％CO2的空气下共孵育6h。制备体细胞
为制备丘细胞，从单个猪卵巢中收集COC。经过46h IVM培养后，用0.1％(w/v)透明质酸酶补充的TL-HEHES培养基处理，使丘细胞散开。在微型离心机(Vision Scientific Co.，Korea)中以700×g离心5分钟沉淀丘细胞。细胞沉淀在不含Ca2+，Mg2+的磷酸盐缓冲液(DPBS(-))中重悬，然后细胞悬浮液在用作供体核之前，在室温保存2小时以上。胎儿成纤维细胞分离自妊娠期40天的韩国当地猪(Sus scrofa domesticusL.，)胎儿。简单地，猪胎用DPBS(-)清洗3遍，鸢尾剪去除猪胎头部，用2把watch-maker’s镊子去除肝脏和肠上的软组织。用DPBS(-)清洗2遍后，将材料用解剖刀在100mm培养皿上切碎。切碎的组织在10ml(w/v)胰蛋白酶/3.65mM EDTA溶液中，在39℃下孵育30min。加入等体积的以15％胎牛血清(FBS；Gibco，Life Technologies Inc.，Grand Island，NY)补充的细胞培养基抑制胰蛋白酶活性。细胞培养基由Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM；Gibco)，15％FBS，1000单位青霉素和1000μg/ml链霉素(Gibco)构成。经过剧烈吸吹后，上清以150×g离心5min。重悬细胞，调整使其终浓度达到2×106细胞/ml，然后在39℃，含有5％CO2的空气下，在含有10ml培养基的175cm2组织培养瓶(Nunc，Roskide，Denmark)中进行培养。胎儿成纤维细胞在用作供体核来源之前经历3次传代。外源DNA转染至体细胞
1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)/二甲基亚砜(DMSO)-介导的转染(Kawai和Nishizawa，Mol.Cell Biol.，4：1172-1174(1984))按下述实施：将在30μg/ml 1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Aldrich，Milwaukee，WI，USA)补充的1ml培养基中的10μg pLNβ-eGFP质粒DNA加入到前一天平板培养(5×105细胞/60mm皿)的基于长臂猿白血病病毒的PG13包装细胞中。37℃含有5％CO2的空气下经过6h孵育后，DNA-培养基混合物被吸出，加入2ml含有25％DMSO的培养基使包装细胞休克，然后孵育1min。用培养基清洗3次后，用5ml培养基饲养细胞并在分裂转染细胞前孵育过夜。胎儿成纤维细胞靶细胞的感染按改良的Miller和Rosman方法(Biotechniques，7：980-982(1989))进行；3ml含病毒培养物经过0.22μm孔径滤器过滤，然后向前一天平板培养的靶细胞中加入1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(终浓度5μg/ml)。靶细胞暴露在混合物中的时间只允许1hr。含病毒培养基收集自前一天用非选择培养基饲养的产病毒细胞。感染后培养1天，感染细胞用胰蛋白酶处理，然后在非选择培养基中分裂(splitting)。在转染和感染过程中，在分裂后第二天加入G418选择培养基(600μg/ml)。转染的细胞在用作核供体源之前传代14次。猪卵母细胞的去核
IVM 44-46h后，卵母细胞转移到500μl补充0.1％透明质酸酶的TL-Hepes培养基中，并通过涡旋3min去除丘细胞。按Tsunoda等人(J.Exp.Zool.，240：119-125(1986))的描述，用细玻璃针将卵母细胞的透明带部分分裂。卵母细胞的操作，包括去核和细胞注射，通过使用配有倒置显微镜的显微操作仪(Leitz，Ernst Leitz Wetzlar GmbH，Germany)进行。用于卵母细胞操作的培养基是含有7.5μg/ml细胞松弛素B的DPBS(-)。第一极体以及推定含有分裂中期II染色体的部分细胞质通过使用内径20μm的微量加样器共同取出。去核后，卵母细胞用5μMbisbenzimide(Hoechst 33342)染色5min，然后在落射荧光显微镜下观察(Olympus，Tokyo，Japan)。细胞注射，电融合以及激活
单个的成纤维细胞被分别转移进每个去核的卵母细胞中。带有光滑表面的小细胞用作核供体源。重建的胚胎在50μl细胞融合培养基液滴中平衡10-20sec，然后转移到带有两个分开1mm的电极、并覆盖有细胞融合培养基的融合室中。细胞融合培养基由0.3M甘露醇，0.5mM Hepes，0.01％BSA，0.1mM CaCl2和0.1mM MgCl2构成。使用BTX Electro-cellManipulator 2001(BTX，San Diego，CA，USA)，用160V/mm单直流脉冲诱导细胞融合30μsec。电融合后，经过3V/mm交流电脉冲5sec后再用120V/mm直流电脉冲30μsec激活胚胎。猪卵母细胞的单性生殖激活
猪卵母细胞的单性生殖激活如前所述实施(Wang等，Mol.Reprod.Dev.，51：346-353(1998))。简言之，去除丘细胞的卵母细胞在0.5mMHepes，0.01％BSA(无脂肪酸)，0.01mM CaCl2和0.01mM MgCl2补充的0.3M甘露醇溶液中平衡1min，然后转移到带有两个分开1mm的电极并覆盖有激活溶液的室中。卵母细胞经过3V/mm单交流电脉冲5μsec后再用180V/mm单直流电脉冲30μsec处理。NT胚胎的体外培养
在所有的试验中，被激活的卵在37℃含有5％CO2的空气下，在4mg/mlBSA补充的50μl NCSU23培养基液滴中培养。经过72h培养后，选择出处于分裂期的胚胎。40到50分裂的胚胎在37℃含有5％CO2的空气下，在10％FBS补充的50μl NCSU23培养基液滴中共培养3天。经过6天的培养，观察到胚泡的形成，Hoechst 33342(2.5μg/ml)染色后在荧光显微镜下计数胚泡的细胞数。NT胚胎的细胞数目
所有使用体细胞从NT胚胎发育得到的胚泡在Hoechst染色后计数细胞核。简言之，室温下，胚胎用1％甲醛在PBS中固定10min，然后将其置于载玻片上的一滴封固培养基中。封固培养基由25％(v/v)甘油在含有2.5mg/ml叠氮化钠的PBS中和2.5μg/ml Hoechst 33342构成。用盖玻片覆盖到胚胎上，盖玻片的边缘用指甲油密封。在落射荧光显微镜(Olympus，Japan)下计数核数目。
本发明在以下实施例中更加具体地说明，但不能将本发明保护范围限定于此。
实施例1
检验在电融合后不同的激活处理对于体外NT猪胚胎发育到胚泡阶段的影响。电融合后2-3h，约三分之一的重建胚胎同时划分为3组不同激活组：1)胚胎用3V/mm交流电脉冲处理5sec后再用120V/mm直流电脉冲处理30μsec，2)胚胎用钙离子载体(A23187，5μM，5min)处理激活，以及3)胚胎用钙离子载体(A23187，5μM，5min)处理后，在2mM6-DMAP补充的NCSU23培养基中孵育4h。激活处理后，每组重建的胚胎清洗4次，然后在含有4mg/ml BSA的NCSU23培养基中培养。如表1所示，在各组中检测到不同的卵裂率(58.1±13.9，60.7±6.3和74.9±7.5％)和胚泡发育率(2.2±2.28，2.2±1.5和11.0±4.1％)(P＜0.05)。但是，观察到胚泡平均细胞数没有显著差别(20.5±3.5，26.6±4.5和26.3±10.3)。结果说明，与单独A23187或A23187/6-DMAP处理相比，电脉冲可以诱导更高的NT胚胎体外发育。
表1.不同激活处理对于用丘细胞制得的NT猪胚胎体外发育的影响
处理 测定的卵数目 分裂卵百分比(％) 胚泡百分比(％) 细胞数目(平均数±标准差)
A23187A23187+6-DMAP电脉冲 128121129 58.1±13.9a(71)60.7±6.3a(75)74.9±7.5b(95) 2.2±2.8a(2)2.2±1.5a(3)11.0±4.1b(13) 20.5±3.526.6±4.526.3±10.3
这些实验每组同时分别重复5次。
ab栏中不同的上标表示差异显著(P＜0.05)。
检测的胚胎数目在圆括号中显示。
实施例2
检测激活电压对于NT胚胎体外发育到胚泡期的影响。电融合后2-3h，重建的胚胎用3V/mm交流电脉冲处理5sec后再用120V/mm或150V/mm直流电脉冲处理30μsec。在这两组间，卵裂率没有显著差别。用120V/mm场强度处理的NT胚胎的胚泡发育率(11.6±1.6％，14/121)明显高于150V/mm组(6.5±2.3％，8/121)(P＜0.05)。但是，胚泡的平均细胞数目在这两组中是相似的(分别为29.5±11.3和27.6±10.5)(P＞0.05)。接下来的实验中，用120V/mm单个直流电脉冲进行激活(表2)。进行实验以确定电融合后最佳激活时间(表3)。还研究了电融合后的激活时间是否影响NT胚胎的发育能力。约三分之一的融合卵在融合后不同时间(2，4或6h)，用3V/mm交流电脉冲处理5sec后再用单个120V/mm直流电脉冲处理30μsec而被激活。在2h和4h组中，NT胚胎的卵裂率高于6h组。电融合后2h激活的NT胚胎相比于4h(6.6±2.3％，11/190)和6h(8.3±3.3％，14/184)组，有更高比例(11.6±2.9％，20/187)发育到胚泡阶段。2，4和6h组中NT胚胎的平均细胞数分别是30.4±10.4，24.6±10.1和16.5±7.4。观察到2h和6h组的差异显著(P＜0.05)。当重建胚胎在电融合后0，30min和1h激活时，在随后的实验中，胚胎发育到胚泡阶段的发育率分别是2.1％(2/97)，3.2％(2/85)和10.4％(11/106)。这些结果暗示电融合后的激活时间选择可以影响猪NT卵的发育潜能。
表2.激活电压对于用体细胞制得的猪NT胚胎体外发育的影响
组(V/mm DC) 测定的卵数目 分裂卵百分比(％*) 胚泡百分比(％**) 核数目(平均数±标准差)
120150  121121 71.4±10.9(86)63.7±8.1(78) 11.6±1.6a(14)6.5±2.3b(8) 29.5±11.327.6±10.5
％*：分裂卵数目/检测的卵数目×100。％**：胚泡数目/检测的卵数目×100。ab栏中不同的上标表示差别显著(P＜0.05)。检测的胚胎数目在圆括号中显示。
表3.电融合后不同时间激活的猪NT胚胎的体外发育
激活时间 测定的卵数目 分裂卵百分比(％) 胚泡百分比(％) 核数目(平均数±标准差)
2h4h6h  187190184 71.8±13.2a(140)76.5±6.8a(140)59.4±4.9b(110) 11.6±2.9a(20)6.6±2.3b(11)8.1±3.3ab(14) 30.4±10.4a24.6±10.1ab16.5±7.4b
ab栏中不同的上标表示差别显著(P＜0.05)。检测的胚胎数目在圆括号中显示。
实施例3
比较用胎猪成纤维细胞制得的NT胚胎的发育能力与单性生殖的以及IVF来源的猪胚胎发育能力。同样，比较用丘细胞或成纤维细胞制得的NT猪胚胎与IVF来源的胚胎的发育潜能。
相较于IVF来源的(21.4±1.9％，43/201)或单性生殖的胚胎(22.4±7.2％，43/201)，使用成纤维细胞的NT胚胎显示更低的胚泡发育率(9.4±0.9％，20/289)(p＜0.01)，尽管在各实验组间胚胎的卵裂率没有显著差别(表4)。培养6天后，多数来自NT胚胎的胚泡(16/20)被孵化(图1)，尽管核平均数小于IVF来源的胚泡(图2)。NT胚泡早期孵化的原因似乎归因于去核过程中透明带的部分剖分。NT胚胎的平均细胞数(28.9±11.5，范围从14到61，n＝18)小于IVF来源的胚泡平均细胞数(36.2±9.7，范围从18到67，n＝22)(P＜0.05)，而与单性生殖胚胎平均细胞数(29.9±12.1，范围从13到50，n＝24)相似(表4)。这些结果代表使用成纤维细胞的猪NT胚胎可以体外发育成胚泡，尽管相比于IVF来源的胚胎，它们的发育能力较低。
比较使用丘细胞(NT+)或/和成纤维细胞(NT)进行核转移得到的猪卵母细胞与IVF来源胚胎的发育潜能(表5)。电融合后与丘细胞或成纤维细胞重建的去核卵母细胞融合率分别为67％(257/374)或69％(273/396)。这样在2种供体细胞类型之间NT胚胎的卵裂率没有显著差别。但是，来自两种细胞类型的NT胚胎显示胚泡发育率低于IVF来源的胚胎(P＜0.01)。IVF来源的，NT+，NT的胚泡平均核数目分别是38.6±10.4(范围从23到65)，28.9±11.4(范围从17到51)和30.2±9.9(范围从18到51)。这样，NT胚胎含有的核数目小于IVF来源的胚胎含有的核数目(P＜0.05)。
表4.对比NT猪胚胎与IVF来源或单性生殖胚胎的体外发育。
组别 测定的卵数目 分裂卵百分比(％) 胚泡百分比(％) 核数目(平均数±标准差)
IVF单性生殖NT  201189212 74.5±1.7(150)71.0±4.9(133)67.0±7.6(141) 21.4±1.9a(43)22.4±7.2a(43)9.4±0.9b(20) 36.2±9.7a(22)29.9±12.1b(24)28.9±11.5b(18)
ab栏中不同的上标表示差异显著，对胚泡P＜0.01，对核数目P＜0.05。检测的胚胎数目在圆括号中显示。
表5.对比IVF或用丘细胞制得的NT猪胚胎的体外发育
组别 测定的卵数目* 分裂卵百分比(％) 胚泡百分比(％) 细胞数目(平均值±SD)
IVFNT+NT  270257273 78.0±3.6(210)70.6±9.9(188)73.8±5.3(202) 22.9±3.5a(62)9.9±2.4b(26)9.8±1.6b(27) 38.64±10.4a28.9±11.4b30.2±9.9b
*每组分别同时进行六次实验。+用丘细胞制得的NT猪胚胎；用成纤维细胞制得的NT猪胚胎。ab带不同上标的值差异显著，胚泡P＜0.01，核数目P＜0.05。检测的胚胎数目在圆括号中显示。
实施例4
检测用转染细胞制得的猪NT胚胎是否发育至胚泡以及早期发育过程中转基因是否表达。表达GFP基因的成纤维细胞被转移到去核卵母细胞中，通过160V/mm单直流电脉冲处理30μsec融合重建卵母细胞。融合的胚胎按实施例2中所述被激活，然后培养。在落射荧光显微镜(Olympus)下观察NT胚胎中GFP的表达。比较用转染细胞与非转染细胞制得的猪NT卵母细胞的发育潜能。
还检测在猪中转染细胞在核转移后是否具有发育潜能。通过逆转录病毒感染将外源β-肌动蛋白启动子/GFP基因导入猪成纤维细胞，G418处理约2周后得到存活的集落。落射荧光显微镜下证实了转染的成纤维细胞中GFP的表达(图1A)。转染成纤维细胞制得的NT卵母细胞融合率(67％，195/292)与非转染细胞的融合率相似(71％，197/277)。转染与非转染细胞的NT胚胎胚泡发育率也相似(表6)。所有来源于转染细胞的NT胚胎如图1C所示，显示出强烈的GFP表达。结果显示用转染细胞与非转染细胞制得的猪NT胚胎具有相似的发育潜能。这样，我们发明的激活NT胚胎的方法可应用于从转染细胞产生转基因NT胚胎。
表6.用转染细胞制得的猪NT胚胎的体外发育
组别 融合的卵数目* 分裂卵百分比(％) 胚泡百分比(％) 表达率(％)
正常转染的 197195 73.0±4.2(144)75.7±4.8(148) 10.1±0.6(20)9.7±0.5(19) -100
*每组分别同时进行四次实验。检测的胚胎数目在圆括号中显示。

Claims (8)

1.一种通过核转移大规模生产猪克隆胚胎的方法，包括：
(a)重建去核猪卵母细胞的步骤，该卵母细胞通过电刺激与被注射到所述去核卵母细胞中的供体体细胞或供体体细胞细胞核进行融合；
(b)通过第二次电刺激激活所述重建的猪卵母细胞的步骤。
2.权利要求1的通过核转移大规模生产猪克隆胚胎的方法，其中被注射到所述去核卵母细胞中的所述供体体细胞或所述供体体细胞细胞核是从除人之外的哺乳动物的成纤维细胞或丘细胞制备的转染体细胞或转染体细胞细胞核。
3.权利要求2的通过核转移大规模生产猪克隆胚胎的方法，其中所述哺乳动物是猪，牛，绵羊和小鼠。
4.权利要求1的通过核转移大规模生产猪克隆胚胎的方法，其中所述重建期进行1-2h。
5.权利要求1的通过核转移大规模生产猪克隆胚胎的方法，其中所述作为受体胞质体的猪卵母细胞在去核前进行体外成熟。
6.权利要求1-3的通过核转移大规模生产猪克隆胚胎的方法，其中所述供体细胞或供体细胞核制备自胎儿或成年组织。
7.权利要求1的通过核转移大规模生产猪克隆胚胎的方法，其中所述第二次电刺激是应用120-150V/mm的单个直流电脉冲处理30μsec。
8.权利要求1-3和6的通过核转移大规模生产猪克隆胚胎的方法，其中所述猪供体体细胞或供体体细胞核制备自韩国当地猪(Sus scrofadomesticus L.)。
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