JP4119513B2 - クローン動物の作出方法 - Google Patents
クローン動物の作出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4119513B2 JP4119513B2 JP03876198A JP3876198A JP4119513B2 JP 4119513 B2 JP4119513 B2 JP 4119513B2 JP 03876198 A JP03876198 A JP 03876198A JP 3876198 A JP3876198 A JP 3876198A JP 4119513 B2 JP4119513 B2 JP 4119513B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- mammary
- minutes
- fcs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳より分離した乳腺由来の細胞をG0 期に同調した後、30〜120分間トリプシン処理を行った細胞を用いて核移植することを特徴とする、クローン動物の作出方法に関する。本発明方法は、クローン動物の作出において乳中に含まれる乳腺由来の細胞を用いることから、動物を屠殺あるいは生体を傷つけることが無く乳腺由来の細胞を得ることができ、さらに30〜120分間のトリプシン処理により、除核した未受精卵との細胞融合率を高めることができることから、効率的にクローン動物を作出する優れた方法として有用である。
【0002】
【従来の技術】
核移植は、ある1個の細胞の核を他の細胞に移植する操作であり、受精卵(核供与胚)の細胞(核体)1個を他の核を除いた卵子(除核卵子)に細胞融合して核移植胚を作製し、これを体内又は体外培養し、さらに受卵雌の子宮に移植することで産子を得ることができる。この技術を用いることにより、同一遺伝情報を持つ複数の個体(クローン動物)を得ることが可能となる。家畜における核移植(Nuclear transplantation)は、1986年、S.M.Willadsen がヒツジにおいて、8 -16 細胞期の受精卵を核供与胚として、未受精卵より核を除去した細胞質に移植し、電気的な細胞融合法によって初めて成功した(Nature,320,63-65,1986) 。ウシでは、1987年、R.S.Prather らが同様の方法で成功している(Biology of Reproduction 37,859-866,1987) 。以来、核移植については多数の報告がある。しかしながらこの方法では、受精卵を核体に用いることから数に限りがある。そこで、より多くのクローン動物を得るため、一度に大量の核体を供給できる培養細胞を利用する試みがなされてきた。1993年、M.M.Simsらはウシ胚盤胞期受精卵の内部細胞塊を27日間培養後、これを用いて核移植を行い、産子を得ることに成功した(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 90, 6143-6147(1993))。さらに1996年には、K.H.S.Campbellらはヒツジにおいてembryonic disc由来の培養細胞(継代6-13代)を血清飢餓状態にし、この細胞を核移植することにより、産子の獲得に成功した(Nature,380,64-66,1996) 。又、1997年には、I.Wilmutらがヒツジにおいて、培養した乳腺細胞及び線維芽細胞を血清飢餓状態にし、同様に産子を獲得した(Nature,385,810-813,1997) 。これは、体細胞までに分化した細胞からは、核移植を行っても個体は発生しないという従来の考え方を覆す結果となり、画期的な成果であった。さらに、乳腺細胞を提供する個体と同一の遺伝子を持ったクローン動物を作出する結果となった。しかしながらこの場合、得られた頭数は、乳腺細胞では277回試みて1頭(0.4 %)、胎仔線維芽細胞の場合で172回試みて3頭(1.7 %)と非常に少なく、未だ確立した技術とは言い難い。特に乳腺細胞は、線維芽細胞と比較して効率が悪く、その原因は核移植後の融合率及びその後の発生率が低いためである。しかし、線維芽細胞では、例えばヒト遺伝子を導入し、乳腺で発現させて乳中に目的物質を分泌させるトランスジェニック動物を作出した時に、遺伝子の導入は確認できても、動物の個体に導入しなければ遺伝子の発現レベルを確認することはできない。一方、乳腺細胞では、導入した遺伝子の発現レベルを核移植前に予めin vitroで確認することができるため、効率的に目的物質の生産性が高い動物を作出することが可能である。そのため、乳腺細胞を用いたクローン動物作出法の確立は不可欠であり、その過程において乳腺細胞分離、培養の効率化、移植した細胞の融合率向上、及び発生率の向上が重要である。特に、乳腺細胞を得る段階においては、通常屠殺した動物を利用するか、あるいは生体を傷つけることで分離することになるため、効率や危険性の面で問題があった。又、組織から分離する場合、単一種類の細胞を分離することが極めて難しい。その上、高泌乳牛のように産業上有益な動物を屠殺したり、体を傷つけるのは困難である。
【0003】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上述の状況に鑑み鋭意研究を重ねた結果、生体を傷つけたり屠殺した動物から分離するなどの煩わしい操作なく、その上ウシの能力、例えば産乳量を確認した上で乳から細胞を分離し、さらに分離した細胞を培養後、除核した体外培養由来の未受精卵に核移植し、体外で培養することにより胚盤胞を得て、これを受卵雌の子宮に移植することで妊娠せしめることに成功し、本発明を完成させた。即ち本発明は、乳より分離した乳腺由来の細胞をG0 期に同調した後、30〜120分間トリプシン処理を行った細胞を用いて核移植することを特徴とする、クローン動物の作出方法を提供することを課題とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明は、乳より分離した乳腺由来の細胞をG0 期に同調した後、30〜120分間トリプシン処理を行った細胞を用いて核移植することを特徴とする、クローン動物の作出方法に関する。詳しくは、哺乳動物の乳から分離した細胞を培養後G0 期に同調した後、さらにその細胞に30〜120分間トリプシン処理を行い、得られた細胞を除核した体外培養由来の未受精卵に核移植し、さらに体外で培養することにより胚盤胞を得て、これを受卵雌の子宮に移植することで妊娠せしめることを特徴とする、クローン動物の作出方法に関する。本発明方法は、クローン動物の作出において乳中に含まれる乳腺由来の細胞を用いることから、動物を屠殺あるいは生体を傷つけること無く乳腺由来の細胞を調製することができ、さらに30〜120分間のトリプシン処理により、除核した未受精卵との細胞融合率を高めることができることから、効率的にクローン動物を作出する優れた方法として有用である。
【0005】
【発明の実施の形態】
本発明において対象となる細胞は、乳から分離した乳腺由来の細胞であれば特に限定されない。又、動物種、使用する乳についても限定されないが、好ましくは分娩後7日以内、特に好ましくは1日以内に採取したウシの初乳から分離した乳腺上皮細胞が挙げられる。分離した乳腺上皮細胞を、常法に従い培養する。必要に応じて継代を行い、増殖した細胞は通常、一般的に行われる方法により凍結保存することも可能である。細胞の継代数も、特に限定されるものではない。移植に使用する細胞は、コンフルエントに至るまで培養する。次いで5%以下、好ましくは1%のウシ胎仔血清(FCS)を含む培地、特にDMEM培地を用いて5日間以上、特に好ましくは6日間培養する。このように培養することにより、乳腺上皮細胞の細胞周期はG0 期に同調される。次にこのG0 期に同調された細胞を好ましくは30〜120分間、特に好ましくは60分間、0℃〜50℃の温度でトリプシン処理する。この処理により、細胞は培養器から剥がされ、単離される。又,コラーゲンなどの細胞外マトリックスなども細胞から分離し、細胞表面は滑らかとなり、さらに細胞膜も十分に軟化し、融合しやすくなる。このように処理した細胞を、屠殺された雌ウシ卵巣から採取し、体外にて成熟培養後、10〜50時間、好ましくは19〜20時間経過した未受精卵から核染色体物質を除去して調製した卵子(除核卵子)の囲卵腔に注入用ピペットにて挿入後、細胞融合液中で、保持用ピペットにて誘導し、微小(100〜150μm)な電極を用いて10〜100V/mm、10〜50マイクロ秒間、1回以上の電気パルス、好ましくは30V/mm、20マイクロ秒間、1回の電気パルスにより、挿入した乳腺上皮細胞と除核卵子を融合する。この際、除核卵子を活性化させる必要があるが、活性化を行うのは細胞融合前あるいは融合後のどちらでも良い。さらに、除核卵子と同様の活性化処理を乳腺細胞に施しても良い。融合後、さらに、化学合成培地、好ましくはウシ血清あるいはウシ血清アルブミンを含む修正合成卵管液培地で0〜15日、好ましくは7日間、体外で培養する。その結果、胚盤胞まで発生が進み、次いで受卵雌ウシの子宮に移植することにより、乳腺由来の細胞を提供した個体と核内の遺伝子情報が同一である動物(個体)を効率良く作出することができる。
【0006】
【実施例】
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【0007】
【実施例1】
初乳からの乳腺上皮細胞の分離・培養法
分娩後1日以内に採取した初乳500mlを滅菌したpH7.0のリン酸緩衝液(PBS)で2倍に希釈後、遠心分離(1000rpm以下、5分間)した。沈殿をPBSで懸濁し再度、同条件で遠心分離した。このPBSによる洗浄操作を3回以上繰り返し、得られた沈殿を15%のウシ胎仔血清(FCS)と通常の10倍濃度の抗生物質(ペニシリン(明治製菓社)2500unit/ml、ゲンタマイシン(Sigma 社)500μg /ml、ストレプトマイシン(明治製菓社)10mg/ml、ポリミキシンB(Sigma 社)500unit/ml、ファンギゾン(GIBCO BRL 社)25μg /ml)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、GIBCO BRL 社)に懸濁した。この懸濁液を初代培養用フラスコ(プライマリア、ファルコン製、25cm2 )に入れて24時間〜48時間、37℃、5%CO2 存在下で培養した。次いで、通常濃度の抗生物質と10%FCSを添加したDMEMに交換し、さらに培養を続けた。その結果、7〜14日で乳腺上皮細胞のコロニーが観察され、以後活発な増殖が認められた。コンフルエントに至るまで培養後、継代培養を繰り返し、核移植に使用するもの以外は、常法に従って液体窒素中で凍結保存した。
【0008】
【実施例2】
G 0 期に同調された細胞の調製法
コンフルエント状態まで増殖培地(10%FCSを含むDMEM)で培養後、培地を捨て、PBSで細胞を3回洗浄した後、増殖培地培養群と血清制限培地培養群に分けて、さらに培養した。血清制限培地には、1%FCSを含むDMEMを用いた。1、2、3、4、5、6、8日間培養後にそれぞれの群の細胞よりRNAを抽出し、ウシチミジル酸シンターゼmRNAのアンチセンスプライマー(配列表配列番号1)を用いてcDNAを合成し、配列表配列番号2に示されるオリゴヌクレオチドをセンスプライマーに、配列表配列番号1に示されるオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーに用いて、PCRを行った。同様に、ウシ塩基性タイプ2−コンポーネント3型ケラチンmRNAのアンチセンスプライマー(配列表配列番号3)を用いてcDNAを合成し、配列表配列番号4に示されるオリゴヌクレオチドをセンスプライマーに、配列表配列番号3に示されるオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーに用いて、PCRを行った。PCR増幅産物を2%アガロースゲル電気泳動にて分離後、エチジウムブロマイド染色により可視化し、スキャナーでコンピューターへ取り込み、画像解析ソフトにより試料中のウシチミジル酸シンターゼの目的バンド及びケラチンの目的バンドの染色強度を数値化した。この数値を用いて、Go 期に同調されたことを確認するための指標であるケラチンバンド強度に対するチミジル酸シンターゼバンド強度の比を求めた。各試料における比の値をグラフにしたものを図1に示した。この結果より血清制限培地で培養した細胞は、培養5日目以降でチミジル酸シンターゼの発現が減少し、6日目以降にはほとんどプラトーになることが確認された。よって、血清制限培地で6〜8日間培養することにより、ウシ乳腺上皮細胞がG0 期に同調されたことが確認された。
【0009】
【実施例3】
細胞融合条件の検討
ウシ乳腺上皮細胞のトリプシン処理時間による、除核した未受精卵との細胞融合条件の検討を行った。即ち、ウシ屠体卵巣から小卵胞を吸引して、卵子卵丘細胞複合体を採取し、10%FCS、0.02AU/ml卵胞刺激ホルモン(デンカ製薬社)、1μg /mlエストラジオール17β(Sigma 社)、0.5mMピルビン酸ナトリウム(ナカライテスク社)及び1%抗菌・抗真菌剤(ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンB)を添加したm−199中で、39℃、5%CO2 、95%空気及び飽和湿度下で19〜20時間成熟培養した。次いで、卵子の卵丘細胞を、1mg/mlヒアルロニダーゼ(Sigma 社)を添加した10%FCSを含むリン酸緩衝液(FCS−PBS)中で、ボルテックスミキサーで5分間攪拌することにより除去した。卵子を5μg /mlサイトカラシンB(Sigma 社)を含むFCS−PBS中で、顕微操作により第1極体とともに周辺の細胞質を一部吸引し、5μg /mlヘキスト33342(Sigma 社)に3分間浸漬後、蛍光顕微鏡下で数秒間観察し、染色体の見られなかった卵子を除核卵子とした。さらに、除核卵子を50μMイオノマイシン(CALBIOECHEM 社)を添加したカルシウム及びマグネシウムイオンを含まないヘペス緩衝タイロード培地(TL−HEPES)に45秒間浸漬し、20%FCSを含むTL−HEPES(FCS−TL−HEPES)に15分間浸漬した。さらに、10μg /mlシクロヘキシミドを含むFCS−TL−HEPESに5時間浸漬することにより活性化した。次いで、実施例2で得られたG0 期に同調された乳腺上皮細胞をPBSで3回洗浄後、CaCl2 、MgCl2 ・6H2 O、MgSO4 ・7H2 O 不含のハンクス平衡塩類緩衝液に溶解した0.25%トリプシン(GIBCO BRL 社)、1mM EDTA・4Naを用いて、37℃で5、30、60、120、240分間それぞれ処理し、単離した細胞を、100μg / ml フィトヘマグルチニン(Sigma 社)を添加した0.1%ポリビニルアルコール(PVA)を含むm199中で顕微操作により1個ずつ活性化した除核卵子の囲卵腔に注入し、細胞質に接着して核移植胚を作製した。融合は、顕微操作が可能な微小電極と融合装置を用いて、チンマーマン融合液(Membrane Biol., 67, 165-182 (1988); Theriogenology, 37, 5-15 (1992))中で、30V/mmの直流電流を20マイクロ秒間で、1回通電することにより行った。結果を表1に示す。この結果、トリプシン処理を30〜120分間、特に好ましくは60分間行うことにより、融合率を高めることができることを確認した。
【0010】
【表1】
【0011】
【実施例4】
培養ウシ乳腺上皮細胞の核移植及び胚の培養
実施例2と同様の方法で得られたG0 期に同調した乳腺上皮細胞と、実施例3と同様の方法で得られた除核卵子を細胞融合した。融合は、顕微操作が可能な微小電極と融合装置を用いて、チンマーマン融合液中で、30V/mmの直流電流を20マイクロ秒間で、1回通電することにより行った。結果を表2に示す。この融合した胚を10%FCSを含む修正合成卵管液培地(FCS−SOF)中で、39℃、5%CO2 、90%N2 及び飽和湿度下で7〜8日間培養した。結果を表3に示す。その結果、胚盤胞まで発生が進み、次いで受卵雌ウシの子宮に移植することにより、妊娠が確認された。
【0012】
【表2】
【0013】
【表3】
【0014】
【発明の効果】
本発明は、乳より分離した乳腺由来の細胞をG0 期に同調した後、30〜120分間トリプシン処理を行った細胞を用いて核移植することを特徴とする、クローン動物の作出方法に関する。本発明方法は、クローン動物の作出において乳中に含まれる乳腺由来の細胞を用いることから、動物を屠殺あるいは生体を傷つけることが無く乳腺由来の細胞を得ることができ、さらに30〜120分間のトリプシン処理により、除核した未受精卵との細胞融合率を高めることができることから、効率的にクローン動物を作出する優れた方法として有用である。
【0015】
【配列表】
【0016】
【0017】
【0018】
【図面の簡単な説明】
【図1】 ウシ初乳から分離した乳腺上皮細胞を血清制限培地(1%FCS添加DMEM培地)及び増殖培地(10%FCS添加DMEM培地)で培養した場合の、チミジル酸シンターゼ発現量の消長を示す。
Claims (1)
- 非ヒト哺乳動物乳より分離した非ヒト哺乳動物乳腺由来の細胞をG0期に同調した後、30〜120分間トリプシン処理を行った核ドナー細胞を用いて、除核した当該非ヒト哺乳動物の未受精卵に細胞融合させることによって核移植することを特徴とする、クローン非ヒト哺乳動物の作出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP03876198A JP4119513B2 (ja) | 1998-02-20 | 1998-02-20 | クローン動物の作出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP03876198A JP4119513B2 (ja) | 1998-02-20 | 1998-02-20 | クローン動物の作出方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11341935A JPH11341935A (ja) | 1999-12-14 |
JP4119513B2 true JP4119513B2 (ja) | 2008-07-16 |
Family
ID=12534277
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP03876198A Expired - Fee Related JP4119513B2 (ja) | 1998-02-20 | 1998-02-20 | クローン動物の作出方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4119513B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010075099A (ja) * | 2008-09-26 | 2010-04-08 | Japan Science & Technology Agency | 哺乳動物核移植胚のスクリーニング方法、非ヒト哺乳動物核移植胚、クローン非ヒト哺乳動物、及びスクリーニングキット |
JP6232907B2 (ja) * | 2013-10-09 | 2017-11-22 | 富士レビオ株式会社 | 融合細胞およびその作製方法 |
-
1998
- 1998-02-20 JP JP03876198A patent/JP4119513B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH11341935A (ja) | 1999-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6215041B1 (en) | Cloning using donor nuclei from a non-quiesecent somatic cells | |
EP0739412B1 (en) | ungulate EMBRYONIC STEM CELLS AS NUCLEAR DONORS AND NUCLEAR TRANSFER TECHNIQUES TO PRODUCE CHIMERIC AND TRANSGENIC ANIMALS | |
JP4102450B2 (ja) | 胎仔線維芽細胞による効率的な核移入 | |
JP2007167078A (ja) | 分化した胎仔および成体ドナー細胞による核移植 | |
JP2006217913A (ja) | 核移植用の静止状態の細胞集団 | |
US20050273870A1 (en) | Preparation and selection of donor cells for nuclear transplantation | |
RU2205536C2 (ru) | Способ получения клонированной коровы | |
Akshey et al. | Hand-made cloned goat (Capra hircus) embryos—a comparison of different donor cells and culture systems | |
JP2003513673A (ja) | 体細胞核移植によるブタクローン胚の改善された生産方法 | |
Miyoshi et al. | In vitro development of cloned embryos derived from miniature pig somatic cells after activation by ultrasound stimulation | |
NZ337792A (en) | Nuclear transfer and use in cloning | |
JP4119513B2 (ja) | クローン動物の作出方法 | |
JP2003518936A (ja) | 長期間培養された雄または雌の体細胞核の、人為的に誘導される遺伝子改変を含む、除核レシピエント細胞への移植による、標的遺伝子改変を有する動物をクローニングする方法。 | |
Eyestone et al. | Nuclear transfer from somatic cells: applications in farm animal species | |
JPH0614945A (ja) | 豚の繁殖方法 | |
US20040077077A1 (en) | Novel methods for the production of cloned mammals, mammals cloned according to the methods, and methods of use of same | |
JP2000325077A (ja) | 細胞融合方法 | |
US20060174358A1 (en) | Method for cloning animals with targetted genetic alterations by transfer of long-term cultured male or female somatic cell nuclei, comprising artificially-induced genetic alterations, to enucleated recipient cells | |
JP3955931B2 (ja) | クローンウシの生産方法 | |
Spell et al. | Somatic cell cloning in the beef industry | |
Lee et al. | Production of cloned sei vhale (Hgrgktuvzkxg&huxkgroy) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes | |
Stice | Cloning using donor nuclei from a non-quiesecent somatic cells | |
JP2002125669A (ja) | 多重包埋処理胚 | |
PL220877B1 (pl) | Sposób klonowania somatycznego ssaków | |
MXPA00000201A (en) | Cloning using donor nuclei from non-serum starved, differentiated cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050125 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071121 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080104 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080129 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080324 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080418 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080425 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110502 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120502 Year of fee payment: 4 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120502 Year of fee payment: 4 |
|
R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120502 Year of fee payment: 4 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120502 Year of fee payment: 4 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120502 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130502 Year of fee payment: 5 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |