JP2002125669A

JP2002125669A - 多重包埋処理胚

Info

Publication number: JP2002125669A
Application number: JP2000325845A
Authority: JP
Inventors: Akira Onishi; 彰大西; Hirobumi Hanada; 博文花田; Masaki Iwamoto; 正樹岩元; Atsushi Mimatsu; 淳三松
Original assignee: NATL INST OF ANIMAL INDUSTRY; PRIMETECH KK
Current assignee: NATL INST OF ANIMAL INDUSTRY; PRIMETECH KK
Priority date: 2000-10-25
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2002-05-08

Abstract

(57)【要約】【課題】核移植胚を用いた体細胞核直接注入法による
クローン豚をはじめとするクローン非ヒト動物の作出方
法等に特に有利に用いることができる、クローン胚を効
率よく桑実胚や胚盤胞まで生育させることができる多重
包埋処理胚を提供すること。【解決手段】アルギン酸又は寒天等の包埋剤を用い
て、哺乳動物由来の胚に２回以上、好ましくは３回の包
埋処理を施し多重包埋処理胚を得る。２回以上の包埋処
理を行う際には、包埋剤の濃度を順次高めていく包埋処
理が好ましい。包埋処理が施される胚の具体例として
は、採取した豚等の非ヒト動物の卵子から除核し、該除
核された卵子に非ヒト動物の体細胞核を注入した核移植
胚を挙げることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、複数回の包埋処理
が施された多重包埋胚、詳しくは、核移植胚を用いた体
細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法等に特に
有利に用いることができるアルギン酸等による多重包埋
胚に関する。

【０００２】

【従来の技術】動物の卵子が受精して受精卵が生じ、こ
の受精卵が分裂して発生していく段階の個体は胚（embr
yyo）と呼ばれているが、従来、かかる胚をアルギン酸
や寒天等により包埋する技術は知られている。例えば、
ＣＢ６Ｆ１マウス及びゴールデンシリアンハムスターを
用いて、インビトロにおける胚卵割率、着床率、生児出
生率に関し、齧歯目胚のアルギン酸ナトリウムカプセル
化の影響及びインビボにおけるカプセルの分解速度を調
べ、３．０％アルギン酸ナトリウムによる齧歯目動物胚
のカプセル化は、胚の発達、着床率、又は生存率に対し
て悪影響を与えないことや、挿入後４８時間以内に分解
するので、インビトロにおけるヒトの受精及び胚着床に
有用であることが報告されている（FERTILITY AND STER
ILITY,59,652-656,1993）。

【０００３】ヤギ幼胚の二分割胚の凍結保存における寒
天の影響を調べ、二分割胚を寒天で固定したもの又は固
定しないものの両方を凍結保存し、解凍後、損傷のない
もの及び一部損傷のあるものをレシピエントの子宮に移
植したところ、前者では解凍後も損傷を受けていないも
のが５０％の割合で得られたが、後者では解凍後も損傷
を受けていないものが５％であったことが報告されてい
る（THERIOGENOLOGY,28,317-322）。ホルスタイン雌牛
の二分割胚の凍結解凍時におけるポリリジン／アルギン
酸膜の包埋効果について調べ、二分割胚をポリリジン／
アルギン酸膜で包埋すると、対照に比べて高い形態学上
のスコアを示すことが報告されている（THERIOGENOLOG
Y,29,262,1988）。

【０００４】ウサギ胚の凍結を成功させるためには、凍
結融解に際しての透明帯の割断損傷を回避することが不
可欠であるとし、凍結融解によって生じる非細胞性成分
（透明帯及びムチン被膜）の損傷及びインビボとインビ
トロにおける融解後の胚の生存性に関し、アルギン酸カ
ルシウムゲル封入の保護効果について調べ、２％アルギ
ン酸ナトリウムを含むリンガー液に浸したウサギ桑実胚
を１１０ｍＭの塩化カルシウム溶液の中に投入すること
により得られたアルギン酸カルシウムゲル封入胚は対照
に比べて、胚の非細胞性成分（透明帯及びムチン被膜）
の損傷の発生が減少し、またアルギン酸カルシウムゲル
から解放された凍結融解胚の生存率が向上し、凍結前に
ウサギ胚をアルギン酸ゲルに封入することにより融解後
の移植できる胚の比率が改善されることが報告されてい
る（THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL ZOOLOGY,254,186-19
1,1990）。

【０００５】他方、哺乳類の体細胞からのクローン動物
の作出は困難と考えられていたが、１９９６年にCampbe
llらのグループは羊の胚由来の培養細胞（継代６〜１３
代）を血清飢餓状態にして細胞周期をＧ₀期とし、この
細胞の核を移植することにより産仔の獲得に成功し、ほ
ぼ無限に増やせる培養細胞でもクローン個体を作出する
ことができることを示した(Nature,380,64-66,1996) 。
１９９７年、Wilmutらは同様な手法を用いて、培養した
乳腺細胞及び線維芽細胞を血清飢餓状態にし、一例では
あるがクローン羊ドーリーの作出を報告した(Nature,38
5,810-813,1997) 。クローン羊ドーリーの作出法は、除
核した羊の卵母細胞と雌羊由来の細胞を電気的に融合す
ることにより核移植するものであるが、かかる細胞融合
による核移植では、ドナー細胞の核だけでなく、その細
胞質までも卵子に導入されることが避けられないといわ
れている。その他、細胞融合による核移植に関しては、
乳より分離した乳腺由来の細胞をＧ₀期に同調した後、
電気的融合効率を高めるため３０〜１２０分間トリプシ
ン処理を行い、かかる細胞を用いて核移植するクローン
牛の作出方法が知られている（特開平１１−３４１９３
５号公報）。

【０００６】また、体細胞核を除核卵母細胞に直接注入
するクローン動物の作出については、若山らがクローン
マウスの作出方法について報告している(Nature,394,36
9-374,1998)。このクローンマウスの作出方法は、未受
精卵の透明帯に穴を開けてピペットを差し込み、分裂中
期の染色体を除去した除核卵母細胞に、過排卵を誘発し
たマウスから採取した卵丘細胞、セルトリ細胞、神経細
胞由来の核を細胞膜を破って直接注入（インジェクショ
ン）し、ストロンチウムで活性化処理した後、サイトカ
ラシンＢで極体の放出を抑制しながら偽前核を形成さ
せ、この胚を培養した後、偽妊娠雌マウスの子宮に移植
する方法である。

【０００７】ところで、豚の心臓や膵臓等の臓器はその
大きさからしてヒトの臓器と交換可能性がきわめて高
く、クローン豚の作出は異種移植の問題を解決する手段
として、また、良質な食肉生産点からも期待されていた
が、少なくとも４匹の受精卵が子宮に存しないと妊娠に
失敗することから、活力ある数個の胚を用いる必要があ
ること、豚胚は極めて脆く核移植など取扱中に壊れやす
いことなど、クローン豚作出上の特有の問題があり、多
くの研究者がチャレンジしたがうまくいかなかった。し
かし最近、スコットランドのPPL Therapeutics社のAlan
Colmanらは成体細胞からの細胞融合による核移植でク
ローン豚を作出していたことを報告（Nature,407,505-5
09,2000）し、また本発明者らによっても体細胞核直接
導入法によるクローン豚の作出についての報告（Scienc
e,289,1118-1119,2000）がなされている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】クローン非ヒト動物、
特にクローン豚の作出は異種移植の問題を解決する手段
として、また、良質な食肉生産点からも重要である。す
なわち、クローン豚作出技術と遺伝子組換え技術とを組
み合わせることにより、ヒトへの異種移植のためのドナ
ーの供給が可能となり、選択された表現型をもつ豚をク
ローン技術により増産することは、食肉生産が可能とな
る。しかし、前記のように、豚胚は極めて脆く核移植な
ど取扱中に壊れやすいことなど、クローン豚作出上の特
有の問題があり、効率よくクローン豚を作出する技術は
未だ確立されていない現状にある。

【０００９】また、凍結融解時等の胚の損傷からの保護
を目的として、アルギン酸ゲルや寒天を用いた胚の包埋
技術は知られているが、これら公知の包埋技術は単層包
埋処理、すなわち胚に１回の包埋処理を施したものであ
り、２回の包埋処理を施した多重包埋処理胚、特に卵細
胞からの除核時及び該除核細胞への体細胞核の直接注入
時の２回にわたって、ある意味で胚を積極的に損傷させ
た体細胞核直接注入法における多重包埋処理核移植胚、
については現在に至るまで報告されていない。本発明の
課題は、核移植胚を用いた体細胞核直接注入法によるク
ローン豚をはじめとするクローン非ヒト動物の作出方法
等に特に有利に用いることができる、クローン胚を効率
よく桑実胚や胚盤胞まで生育させることができる多重包
埋処理胚を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、分化した
細胞から豚のクローンを作出するための方法について種
々調査・検討し、除核した卵子に豚の胎児線維芽細胞核
を顕微注入し、電気活性化処理により発生を誘発し、か
かる電気パルス活性化処理後のクローン胚を卵管及び子
宮に移植する際に、順次濃度を高めたアルギン酸ゲルで
３重に包埋し、その後雌豚の卵管に移植したところ、桑
実胚、初期胚盤胞、胚盤胞に健全に生育することを見い
出し、本発明を完成するに至った。

【００１１】すなわち本発明は、包埋剤を用いて、胚に
２回以上の包埋処理を施すことにより得られる多重包埋
処理胚（請求項１）や、２回以上の包埋処理が３回の包
埋処理であることを特徴とする請求項１記載の多重包埋
処理胚（請求項２）や、２回以上の包埋処理が、包埋剤
の濃度を順次高めていく包埋処理であることを特徴とす
る請求項１又は２記載の多重包埋処理胚（請求項３）
や、包埋剤がアルギン酸又は寒天であることを特徴とす
る請求項１〜３のいずれか記載の多重包埋処理胚（請求
項４）や、包埋処理が施される胚が、採取した非ヒト動
物の卵子から除核し、該除核された卵子に非ヒト動物の
体細胞核を注入した核移植胚であることを特徴とする請
求項１〜４のいずれか記載の多重包埋処理胚（請求項
５）や、核移植胚が、体細胞核が注入された卵子に活性
化処理を施した核移植胚であることを特徴とする請求項
５記載の多重包埋処理胚（請求項６）や、包埋処理が施
される胚が、豚由来の胚であることを特徴とする請求項
１〜６のいずれか記載の多重包埋処理胚（請求項７）に
関する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の多重包埋処理胚として
は、包埋剤を用いて胚に２回以上の包埋処理を施すこと
により得られる包埋処理胚であれば特に制限されるもの
ではなく、かかる２回以上の包埋処理により得られる多
重包埋処理胚としては３回の包埋処理により得られる３
重包埋処理胚が、桑実胚や胚盤胞の高い発生率の点で好
ましい。また、２回以上の包埋処理を行うに際しては、
包埋剤の濃度を順次高めていく包埋処理、すなわち外層
膜ほど高濃度の包埋剤を用いて包埋し、その物理的強度
を内層から外層へと順次高めていく包埋処理が胚に直接
かかるストレスを軽減しうる点で好ましい。また、上記
包埋処理が施される胚には卵子や受精卵が便宜上含ま
れ、かかる胚としてはクローン胚が好ましい。

【００１３】包埋処理に用いられる包埋剤としては、公
知の包埋剤を含め特に制限されるものではないが、哺乳
類の卵を覆う透明な卵膜である透明帯の保護機能を有す
るものや、損傷を受けた透明帯の修復機能を有するもの
や、多重包埋処理後の胚を卵管や子宮に移植した後に生
体内での分解機能を有するものや、卵管及び子宮の膜運
動による損耗からの保護機能を有するものや、白血球の
攻撃からの防御機能を有するものや、包埋皮膜を通して
の栄養分の透過・排泄物の排出機能を有するものや、多
重包埋処理後の胚を凍結融解処理したときの凍結融解に
よる影響を排除しうる機能の他、包埋処理時に胚に影響
を与えることなく包埋処理することができるものや、顕
微鏡下で包埋皮膜が確認しやすいものや、顕微鏡下で包
埋胚の操作がし易くなるものなどが好ましい。かかる包
埋剤としては、アルギン酸、寒天等の天然多糖類の他、
ムコタンパク質、ポリアミノ酸などの蛋白質、生分解性
有機高分子等を例示することができるが、上記包埋剤と
しての好ましい機能を備えたアルギン酸が特に好まし
い。その他、包埋剤の使用濃度についても特に制限され
るものではないが、上記包埋剤としての好ましい機能を
十分発揮しうる濃度が好ましい。なお、複数回の包埋処
理を行う場合、例えばアルギン酸と寒天等、包埋剤の種
類を変えて包埋処理をすることもできる。

【００１４】例えば、アルギン酸を包埋剤として３重包
埋処理する方法としては、アルギン酸ナトリウムを所定
濃度（例えば０．５％、１．５％、２．０％）となるよ
うにリンゲル液等に溶解し、あらかじめ滅菌しておき、
この滅菌済みのアルギン酸ナトリウム溶液（例えば０．
５％）に核移植胚を浸漬して十分馴染ませた後、塩化カ
ルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、ア
ルギン酸ゲル包埋胚とした後、この包埋胚を前記アルギ
ン酸ナトリウム溶液よりも高濃度のアルギン酸ナトリウ
ム溶液（例えば１．５％）に浸漬して十分馴染ませた
後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接
触させ、アルギン酸ゲル２重包埋胚とし、次いでこの２
重包埋胚を上記アルギン酸ナトリウム溶液よりも高濃度
のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば２．０％）に浸漬
して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウ
ムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル３重包埋核
移植胚とする方法を具体的に示すことができる。

【００１５】本発明の多重包埋処理胚を調製するときの
対象となる胚としては特に制限されないが、例えば、卵
子、受精卵、核移植胚、二分割胚、桑実胚、胚盤胞等を
例示することができる。これらの中でも、採取した非ヒ
ト動物の卵子から除核し、該除核された卵子に非ヒト動
物の体細胞核を注入した核移植胚、特に体細胞核が注入
された卵子に活性化処理を施した核移植胚が本発明の効
果を有利に享受しうる点で好ましい。また、これら胚の
由来としては、哺乳動物の胚であれば特に制限されるも
のではなく、豚、山羊、羊、ウサギ、ヒト、ウシ、ウ
マ、ラット、マウス、ニワトリ等を具体的に例示するこ
とができるが、前記のように、豚の胚は極めて脆く、核
移植など取扱中に壊れる可能性が大きいことから、本発
明の多重包埋処理胚としては豚由来の胚、特に豚由来の
核移植胚を好適に例示することができる。

【００１６】例えば、豚由来の核移植胚、好ましくは活
性化処理後の核移植胚は、卵細胞からの除核時及び該除
核細胞への体細胞核の直接注入時の２回にわたって損傷
を受けているが、かかる豚由来の核移植胚を卵管又は子
宮へ移植する前に、包埋剤により多重包埋処理を施す
と、該核移植胚の桑実胚や胚盤胞への発生率を高め、ク
ローン豚等のクローン非ヒト動物を効率よく作出するた
めに有用である。以下、かかる体細胞核直接注入法によ
るクローン非ヒト動物の作出方法について、非ヒト動物
が豚の場合を例にとって説明する。なお、上記体細胞核
直接注入法とは、体細胞の核を除核細胞に直接注入（イ
ンジェクション）する方法をいい、かかる体細胞核直接
注入法には、例えば、プライムテック株式会社製のＰＭ
Ｍ三次元マイクロマニピュレーションシステム「ＥＭＭ
−７１５ＯＵＤ」を用いることができる。

【００１７】レシピエント卵子としては、豚の成熟卵子
であれば特に制限されるものではなく、プロスタグラン
ジンＦ２α、クロプロステノール、絨毛ゴナドトロピン
等のホルモン投与による過排卵処理により得られる体内
成熟卵子の他、屠場由来の卵巣から採取した卵子を体外
成熟させたものも使用できるが、着床率の点からして体
内成熟卵子、特に性成熟（６ヶ月齢以上）した雌豚から
採取した体内成熟卵子が好ましい。かかる体内成熟卵子
は、過排卵処理により得られる雌豚の子宮及び卵巣をＰ
ＢＳ溶液等を用いて卵管灌流を行うことにより採取する
ことができるが、卵丘細胞が付着している卵子はヒアル
ロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好
ましい。

【００１８】上記豚のレシピエント卵子からの除核は、
細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンＢ処理を施し
た豚の卵子から除核することが好ましく、より具体的に
はサイトカラシンＢを含有するＮＣＳＵ２３等の培地で
体外成熟卵子等のレシピエント卵子を処理した後、除核
操作用シャーレのサイトカラシン入りドロップに移して
ホールディングピペットで保定し、透明帯を迅速・的確
にに貫通することができる除核用ピペット（外径２５〜
３０μｍ）を用いて、Ｍ（metaphase）II期の染色体を
含む第一極体の付近を極体ごと吸引することにより行わ
れる。なお、吸引した極体を調べることにより除核でき
ていることを確認することが好ましく、また除核卵子か
らはサイトカラシンＢを除去することが好ましい。

【００１９】体細胞核としては、豚体細胞に由来する核
であれば特に制限されるものではないが、例えば胎児線
維芽細胞核を好適に例示することができる。特にレシピ
エントや仮親と毛色の異なる品種の豚をドナーとするこ
とが、毛色からクローン豚であるかどうかを簡便に判定
する上で好ましい。また、核移植に用いるドナー細胞の
細胞周期は特に制限されるものではないが、細胞周期Ｇ
₀／Ｇ₀₁期に同調させた体細胞が好ましい。細胞周期Ｇ₀
／Ｇ₀₁期に同調させた体細胞は、例えばコンフルエント
な状態で培養液の交換なしに、体細胞を１６日間前後培
養し続けることによって得ることができる。線維芽細胞
を用いる場合、トリプシン処理で細胞を分散させたもの
が好ましく、また、培養細胞が線維芽細胞であること
を、サイトケラチンとＳＳＥＡ−１との陰性反応、ビメ
ンチンでの陽性反応、線維芽細胞の特異的プライマーに
よるＰＣＲ分析等により確認することが好ましい。

【００２０】上記体細胞核の除核されたレシピエント卵
母細胞への直接注入は、体細胞の細胞膜を崩壊させて実
質的に体細胞核からなる画分を注入することがドナー細
胞質の影響を排除して核移植胚の発生を良好にする点で
好ましい。これに対して融合法による核の注入は細胞質
を伴って注入することになるので、細胞質による汚染に
対して敏感である豚のクローン作出においては好ましく
ない。また、体細胞核のインジェクションピペットとし
ては、透明帯の貫通が迅速・精確かつ簡単にでき、細胞
質膜へのダメージを最小にすることができるものが好ま
しく、かかるインジェクションピペットとしてはピエゾ
マイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社
製）に取り付けた体細胞注入用ピペット（外径７〜１２
μｍ）を具体的に例示することができる。

【００２１】上記のようにして得られた体細胞核が注入
された卵子には、前記のように、包埋処理に先立って、
活性化処理を施すことが好ましい。かかる活性化処理と
しては、従来公知の核移植胚の活性化処理方法であれば
特に制限されるものではないが、クローン豚の作出にお
いては電気パルス活性化処理を好適に例示することがで
きる。電気パルス活性化処理としては、電荷の大きい１
回の電気パルス、例えば１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μｓ
ｅｃ、１回を印可する方がそれより小さい電荷の電気パ
ルスを２回印可するよりも胚活性の点で好ましく、ま
た、電気パルス活性化処理における培地としてはＮＣＳ
Ｕ２３（J.Reprod.Fertil.Suppl.,48,61,1993）を用い
ることが高い胚盤胞形成率の点で好ましい。また、電気
パルスによる活性化処理の場合、体内成熟卵子の方が体
外成熟卵子に比べて胚盤胞の発生能の点で好ましい。さ
らに、レシピエント細胞として体内成熟卵子を用いる場
合には、過排卵処理のために使用した最初のｈＣＧ投与
後、５０〜６０時間後、好ましくは５４〜５５時間後に
活性化処理をすることが望ましい。

【００２２】活性化処理後に包埋剤による多重包埋処理
をした核移植胚を卵管又は子宮に移植する雌豚としては
特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊
娠２１〜４０日目にプロスタグランジンＦ２α等を用い
て人工流産させ、同期化を行った雌豚を用いることが好
ましい。また、核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植す
るに際し、複数個の受精卵を核移植胚に混合して雌豚の
卵管又は子宮に移植する追い移植法を用いることが好ま
しい。

【００２３】また産仔した豚ドナー体細胞核由来のクロ
ーンであることの確認は、産仔の毛色の他、クローン
豚、クローン豚の仮親の耳から採取したＤＮＡ並びにク
ローン豚を作出するために用いた線維芽細胞等の体細胞
のＤＮＡを採取し、豚のための特異的なマーカーでマイ
クロサテライト分析を行い、クローン豚が体細胞と同一
の遺伝子をもち、仮親と異なる遺伝子をもつことを確認
することにより同定することができる。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を実施例等により詳細に説明す
るが、本発明の技術的範囲は以下の実施例等によって限
定されるものではない。参考例１［体内成熟卵子の採取］卵子はランドレース（白色）の雌、又はランドレース×
大ヨークシャー×デュロックの三元交雑腫（黒斑を有す
る白色）の雌から採取した。成熟卵子は性成熟（６ヶ月
齢以上）又は未成熟の雌豚から採取した。性成熟豚の排
卵処理は以下のようにして行った。人工授精から２１〜
４０日後の性成熟豚に、まずプロスタグランジンＦ２α
のアナログである(+)-クロプロステノール（住友化学社
製「Planate」）０．２ｍｇを筋肉内に注射して流産さ
せた。筋肉内注射の２４時間後に、クロプロステノール
０．２ｍｇとウマ絨毛ゴナドトロピン（ｅＣＧ）１５０
０単位を共に筋肉内に注射した。ｅＣＧを注射してから
７２時間後にヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）５００
単位を筋肉内に注射することにより過排卵処理を行っ
た。一方、未性成熟雌豚の排卵処理は以下のようにして
行った。１５００単位のｅＣＧのみを筋肉内に注射し、
その７２時間後に５００単位のｈＣＧを筋肉内に注射す
ることにより過排卵処理を行った。これら過排卵処理を
行った雌豚は、ｈＣＧを投与してから４５時間後に屠殺
し、子宮及び卵巣を採取した。０．１％ＢＳＡを加えた
カルシウム、マグネシウムを含まないダルベッコのＰＢ
Ｓ溶液を用いて卵管灌流を行って体内成熟卵子を採取し
た。卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処
理を行って、卵丘細胞を除去した。採取した体内成熟卵
子は培養液（ＮＣＳＵ２３）で３８．５℃、５％ＣＯ₂
インキュベーターで核移植操作まで培養した。

【００２５】参考例２［除核操作］上記参考例１で得られたレシピエント卵子（体外成熟卵
子）を、５μｇサイトカラシンＢ／１ｍｌ培養液（ＮＣ
ＳＵ２３）に入れて１５分以上処理した後、核移植（除
核操作）用シャーレのサイトカラシン入りドロップに卵
子を移し、第一極体の位置が１２時、３時、６時のいず
れかにくるようにホールディングピペットで保定し、ピ
エゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会
社製）に取り付けた除核用ピペット（外径２５〜３０μ
ｍ）を用いて透明帯を迅速に貫通することにより、Ｍ
（metaphase）II期の染色体を含む第一極体の付近を極
体ごと細胞質の１／４〜１／３程吸引した。除核処理
は、室温下でサイトカラシンＢが５μｇ／ｍｌ入りＮＣ
ＳＵ２３培養液中で１０〜１５個ずつの卵子を処理し
た。吸引した極体と細胞質を別の５μｇヘキスト３３３
４２／１ｍｌ培養液（ＮＣＳＵ２３）のドロップに移
し、１５分後にＵＶによる蛍光顕微鏡観察を行い、除核
できていることを確認した。除核ができた卵子は、直ち
にサイトカラシンＢの含まれていない培養液ＮＣＳＵ２
３で丁寧に洗浄し、サイトカラシンを除核卵子から除去
し、３８．５℃、ＣＯ₂インキュベーターに戻して培養
した。

【００２６】参考例３［胎児線維芽細胞の分離］梅山豚雌の発情周期を把握した上で人工授精し、妊娠２
４日目の梅山豚×梅山豚（黒色）を屠殺して子宮より一
匹の胎児を採取し、頭部と内臓を除去した後、細切し、
トリプシン処理で細胞を分散させた後、３時間４℃下で
０．２５％トリプシンと１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ
溶液で培養した後、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで洗浄
して初代培養細胞を得た。細胞培養は１０％ＦＣＳ入り
のＤＭＥＭで行い、細胞が飽和状態になる度に２〜６回
の植え継ぎを行い、高密度に細胞をまくことにより安定
をはかった（参考写真１参照）。核移植に用いたドナー
細胞としては、飽和状態で培養液の交換なしに１６日間
培養し続けることによってＧ₀期になったものを用い
た。培養細胞は、３日後ではＰＣＮＡで陽性反応を示す
が、１０日後には免疫反応がなくなるので１６日目には
Ｇ₀期になったことが証明された。かかる培養細胞が線
維芽細胞であることは、培養細胞がサイトケラチンとＳ
ＳＥＡ−１で陰性反応を示し、ビメンチンで強い陽性反
応を示すことにより確認し、胎児の雌雄判別は線維芽細
胞の特異的ＺＦＹ／ＳＲＹプライマーによるＰＣＲ分析
によって行った。また、それぞれの培養細胞の核型が正
常であることはＧ染色で確認した。

【００２７】参考例４［胎児線維芽細胞の準備］核移植予定日（１６日前）に合わせて、新しい培養液
（１０％ＦＣＳ入りＤＭＥＭ）に植え継ぎ、３７℃、５
％ＣＯ₂で培養し、放置した。核移植直前に、ドナー体
細胞である休止状態の胎児線維芽細胞をＰＢＳで洗浄
し、次いで０．２５％トリプシンを用いて細胞を浮遊さ
せた（参考写真２参照）後、トリプシンを１０％ＦＣＳ
入りＤＭＥＭで不活化し、遠心後（１０００ｒｐｍ，５
ｍｉｎ）、上清を除き核移植に用いる培養液（ＮＣＳＵ
２３）に再浮遊させ、核移植（体細胞核注入）用シャー
レのドロップに適量体細胞を浮遊させておいた。

【００２８】参考例５［体細胞核の注入］参考例２の除核処理を行った卵子を、胎児線維芽細胞が
浮遊したシャーレの１つのドロップに１０〜１５個ずつ
入れて体細胞核注入操作を行った。ピエゾマイクロマニ
ピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付け
た体細胞注入用ピペット（外径７〜１２μｍ）により、
浮遊している体細胞を丁寧に数回ピペッティングするこ
とにより細胞膜を崩壊させて実質的に体細胞核からなる
画分を、除核操作による卵子の透明帯の穴に注意しなが
らホールディングピペットにより保定された除核卵子の
細胞質内に注入した。ピエゾマイクロマニピュレーター
は、透明帯の貫通が簡単にでき、細胞質膜へのダメージ
を最小にすることができた。また、マニピュレーション
の間、インジェクションピペットは、１５％ＰＶＰを含
むＮＣＳＵ２３培養液のドロップでまめに洗浄した。注
入後、予め準備しておいた培養用ドロップ（ＮＣＳＵ２
３）に移し、次の活性化処理までの３〜４時間、インキ
ュベーター（３８．５℃、５％ＣＯ₂）で培養しておい
た。

【００２９】参考例６［電気パルス活性化処理］上記体細胞核が注入された卵子をＮＣＳＵ２３で培養
し、ｈＣＧ投与５４〜５５時間後に電気パルス活性化処
理をＳＳＨ−２融合装置（shimadzu社製）を用いて行っ
た。まず、室温放置した電解質溶液（０．０１％のＢＳ
Ａ、０．０５ｍＭのＣａＣｌ₂、０．１ｍＭのＭｇＳＯ₄
添加０．２８Ｍマンニトール溶液）の入ったシャーレを
２枚と２ｍｍ幅ステンレスワイヤー電極のチャンバーを
用意し、１枚目のシャーレの電解質溶液に卵子を浸して
馴染ませ、さらに２枚目の電解質溶液入りのシャーレに
移して馴染ませた。卵子が電解質溶液に馴染んだ後、２
ｍｍ幅ステンレスワイヤー電極のチャンバーに卵子を並
べ、電気パルスによる活性化処理を表１記載の条件で実
施した。電気パルスによる活性化処理後、極体の放出防
止のため活性化した胚を細胞骨格形成阻害剤であるサイ
トカラシンＢに浸した。すなわち、５μｇ／ｍｌサイト
カラシンＢを含むＮＣＳＵ２３で２時間培養を行い、第
二極体放出の抑制処理を行った。次に、サイトカラシン
Ｂを含まないＮＣＳＵ２３で丁寧に洗浄し、発生培養用
ドロップ（ＮＣＳＵ２３）で活性後４０時間培養した。
電気パルスによる活性化処理後、ＮＣＳＵ２３培地に代
えて、ＢＥＣＭ３培地（Biol.Reprod.,55,1069,1996）
及びｍＷＭ培地（J.Anim.Sci.,71,1561,1993）を用いて
それぞれ同様に活性化した胚を培養した。電気パルス活
性化処理後の卵母細胞の生存率の結果を表１に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】表１からわかるように、電荷の大きい１回
の電気パルスを印可した場合、それより小さい電荷の電
気パルスを２回印可した場合よりも良好な胚活性を示
し、さらに、培養液の違いによる発生の影響では、ＮＣ
ＳＵ２３を用いた場合に最も高い胚盤胞形成率が得られ
た。これらの結果から、クローン作出には、１．５ｋＶ
／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回の電気パルスを活性化条
件とし、ＮＣＳＵ２３で培養することにした。またこれ
と同条件で、体内成熟卵子と体外成熟卵子の発生能を比
較した。１６７個の体外成熟卵子を活性化した結果、４
８時間までに１１６個が分割したが、胚盤胞にまで至っ
たのはわずかに４個（２．４％）だけであった。この値
２．４％は、表１に示される対応する体内成熟卵子の値
（３１．２％）より有意に低かった。以上の実験結果か
ら、体内成熟卵子をクローン作出に用いることとした。

【００３２】実施例１［アルギン酸２重包埋核移植胚］上記参考例６で得られた電気パルス活性化処理後のクロ
ーン胚に、以下のようにアルギン酸２重包埋法を適用し
た。まず、アルギン酸ナトリウムを所定濃度（０．５
％、２．０％）となるようにリンゲル液に溶かしてオー
トクレーブ滅菌し、包埋液を調製した。電気パルス活性
化処理後４０時間の核移植胚を滅菌済みリンゲル液（３
７℃）に移し、ピペッティング等を行いよく馴染ませた
後、０．５％アルギン酸ナトリウムを含む包埋液に移
し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させた状態で
吸引し、滅菌済みの１１０ｍＭ塩化カルシウム液にゆっ
くりと吐出し、固まった胚入りのアルギン酸ナトリウム
を吸引し、次に２．０％アルギン酸ナトリウムを含む包
埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させ
た状態で吸引し、滅菌済みの１１０ｍＭ塩化カルシウム
液にゆっくりと吐出し固化させ、アルギン酸３重包埋核
移植胚を得た。

【００３３】実施例２［アルギン酸３重包埋核移植胚］上記参考例６で得られた電気パルス活性化処理後のクロ
ーン胚に、以下のようにアルギン酸３重包埋法を適用し
た。まず、アルギン酸ナトリウムを所定濃度（０．５
％、１．５％、２．０％）となるようにリンゲル液に溶
かしてオートクレーブ滅菌し、包埋液を調製した。電気
パルス活性化処理後４０時間の核移植胚を滅菌済みリン
ゲル液（３７℃）に移し、ピペッティング等を行いよく
馴染ませた後、０．５％アルギン酸ナトリウムを含む包
埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させ
た状態で吸引し、滅菌済みの１１０ｍＭ塩化カルシウム
液にゆっくりと吐出し、固まった胚入りのアルギン酸ナ
トリウムを吸引し、次に１．５％アルギン酸ナトリウム
を含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を
密集させた状態で吸引し、滅菌済みの１１０ｍＭ塩化カ
ルシウム液にゆっくりと吐出し、固まった胚入りのアル
ギン酸ナトリウムを吸引し、続いて２．０％アルギン酸
ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからな
るべく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの１１０
ｍＭ塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し固化させ、ア
ルギン酸３重包埋核移植胚を得た。

【００３４】比較例［アルギン酸単層包埋核移植胚］上記参考例６で得られた電気パルス活性化処理後のクロ
ーン胚に、以下のようにアルギン酸単層包埋処理を行っ
た。まず、アルギン酸ナトリウムを０．５％となるよう
にリンゲル液に溶かしてオートクレーブ滅菌し、包埋液
を調製した。電気パルス活性化処理後４０時間の核移植
胚を滅菌済みリンゲル液（３７℃）に移し、ピペッティ
ング等を行いよく馴染ませた後、０．５％アルギン酸ナ
トリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなる
べく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの１１０ｍ
Ｍ塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し固化させ、アル
ギン酸単層包埋核移植胚を得た。

【００３５】［実験結果］上記包埋処理はすべて３７℃
の温度条件下で行われ、アルギン酸で包埋された核移植
胚は移植まで培養液に移しておき、以下の包埋回収実験
に供した。なお、かかる包埋回収実験において未包埋処
理の核移植胚を対照として用いた。包埋回収実験は、活
性化処理２日後のアルギン酸包埋処理又は未包埋処理の
各核移植胚をそれぞれ卵管に移植した。その際、子宮卵
管接合部を皮膚縫合用ナイロン糸で結び、アルギン酸包
埋胚や未包埋胚が子宮に落ちないようにした。移植３日
後にアルギン酸包埋胚や未包埋胚を回収し、その発生状
況を観察した。結果を表２並びに図１及び図２に示す。
なお、表２中、Ｍ（morula）は桑実胚を、Ｅ−Ｂ（earl
y blastocyst）は初期胚盤胞を、Ｂ（blastocyst）は胚
盤胞を、Ｈ−Ｂ（hatching blastocyst）は孵化胚盤胞
をそれぞれ示す。

【００３６】

【表２】

【００３７】図１に示されるように、包埋なしで子宮か
ら回収された対照区の胚は、細胞質が黒色に変色したも
のや、白血球等に攻撃されて崩壊したものや、また、卵
管、子宮内の膜の運動により胚に負担がかかり胚の細胞
質が飛び出て、透明帯だけ回収というものが多数見られ
た（参考写真３参照）。一方、図２に示されるように、
子宮から回収された３重包埋胚は、健全に生育した胚盤
胞や桑実胚が数多く見受けられた（参考写真４参照）。
また、表２からもわかるように、回収率は、３重包埋胚
８７％、２重包埋胚７８％、１重包埋胚４５％、未包埋
胚７７％であり、桑実胚や胚盤胞の発生率は、３重包埋
胚２３％、２重包埋胚４２％、１重包埋胚１０％、未包
埋胚１４％であった。表２の結果から、多重包埋処理を
施した核移植胚が、１重包埋胚や未包埋胚に比べて、回
収率及び発生率の点でも優れていることがわかる。

【００３８】参考例７［仮親への胚移植］実施例２で得られたアルギン酸３重包埋胚のうち、発生
が良好なものを仮親の子宮角上端に最終移植した。外科
的胚最終移植１０日前に妊娠豚２頭に対して、クロプロ
ステノール２ｍｌを臀部に注射して流産させた。外科的
胚移植６日前に妊娠雌豚に対して、クロプロステノール
２ｍｌとＰＭＳＧ１５００ＩＵを臀部に注射し、注射の
７２時間後、ｈＣＧ５００ＩＵを臀部に注射した。２頭
のうち１頭はｈＣＧ投与してから２４時間後に人工授精
し、外科的胚移植を行う前に受精卵を回収し、この回収
した受精卵４〜５個をアルギン酸３重包埋核移植胚に混
合して、２頭のうちの他の雌豚の子宮角上端に移植し
た。これらの胚の１つから黒色の毛色をもつ子豚が自然
分娩で産まれた。生誕時の子豚の体重は１．２ｋｇ、胎
盤重量は０．３ｋｇであり、両値とも通常の子豚の正常
な値の範囲内であった。また、いくつかのクローン牛の
例では胎盤異常が現れ、顕微注入法によるクローンマウ
スでは通常マウスより胎盤が大きくなるという報告があ
ったが、この子豚に付いていた胎盤は、外見上ばかりで
なく解剖学的にも正常であった。

【００３９】

【発明の効果】本発明によると、核移植胚を用いた体細
胞核直接注入法によるクローン豚をはじめとするクロー
ン非ヒト動物の作出方法等に特に有利に用いることがで
きる、クローン胚を効率よく桑実胚や胚盤胞まで生育さ
せることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】子宮から回収した比較例のアルギン酸未包埋胚
の顕微鏡写真を示す図である。

【図２】子宮から回収した本発明のアルギン酸３重包埋
胚の顕微鏡写真を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者岩元正樹茨城県土浦市荒川沖235−１エクセル武井203 (72)発明者三松淳茨城県土浦市霞ヶ岡10−30 Ｆターム(参考） 4B024 AA10 AA20 GA11 GA18 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA04 BC46 BC47 CA47 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】包埋剤を用いて、胚に２回以上の包埋処
理を施すことにより得られる多重包埋処理胚。
【請求項２】２回以上の包埋処理が３回の包埋処理で
あることを特徴とする請求項１記載の多重包埋処理胚。
【請求項３】２回以上の包埋処理が、包埋剤の濃度を
順次高めていく包埋処理であることを特徴とする請求項
１又は２記載の多重包埋処理胚。
【請求項４】包埋剤がアルギン酸又は寒天であること
を特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の多重包埋処
理胚。
【請求項５】包埋処理が施される胚が、採取した非ヒ
ト動物の卵子から除核し、該除核された卵子に非ヒト動
物の体細胞核を注入した核移植胚であることを特徴とす
る請求項１〜４のいずれか記載の多重包埋処理胚。
【請求項６】核移植胚が、体細胞核が注入された卵子
に活性化処理を施した核移植胚であることを特徴とする
請求項５記載の多重包埋処理胚。
【請求項７】包埋処理が施される胚が、豚由来の胚で
あることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の多
重包埋処理胚。