JP4036356B2 - クローン豚の作出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳類の体細胞からのクローン動物の作出は困難と考えられていたが、１９９６年にCampbellらのグループは羊の胚由来の培養細胞（継代６〜１３代）を血清飢餓状態にして細胞周期をＧ0期とし、この細胞の核を移植することにより産仔の獲得に成功し、ほぼ無限に増やせる培養細胞でもクローン個体を作出することができることを示した(Nature,380,64-66,1996) 。１９９７年、Wilmutらは同様な手法を用いて、培養した乳腺細胞及び線維芽細胞を血清飢餓状態にし、一例ではあるがクローン羊ドーリーの作出を報告した(Nature,385,810-813,1997) 。クローン羊ドーリーの作出法は、除核した羊の卵母細胞と雌羊由来の細胞を電気的に融合することにより核移植するものであるが、かかる細胞融合による核移植では、ドナー細胞の核だけでなく、その細胞質までも卵子に導入されることが避けられないといわれている。その他、細胞融合による核移植に関しては、乳より分離した乳腺由来の細胞をＧ0期に同調した後、電気的融合効率を高めるため３０〜１２０分間トリプシン処理を行い、かかる細胞を用いて核移植するクローン牛の作出方法が知られている（特開平１１−３４１９３５号公報）。
【０００３】
他方、体細胞核を除核卵母細胞に直接注入するクローン動物の作出については、若山らがクローンマウスの作出方法について報告している(Nature,394,369-374,1998)。このクローンマウスの作出方法は、未受精卵の透明体に穴を開けてピペットを差し込み、分裂中期の染色体を除去した除核卵母細胞に、過排卵を誘発したマウスから採取した卵丘細胞、セルトリ細胞、神経細胞由来の核を細胞膜を破って直接注入（インジェクション）し、ストロンチウムで活性化処理した後、サイトカラシンＢで極体の放出を抑制しながら偽前核を形成させ、この胚を培養した後、偽妊娠雌マウスの子宮に移植する方法である。
【０００４】
ところで、豚の心臓や膵臓等の臓器はその大きさからしてヒトの臓器と交換可能性がきわめて高く、クローン豚の作出は異種移植の問題を解決する手段として、また、良質な食肉生産点からも期待されていたが、少なくとも４匹の受精卵が子宮に存しないと妊娠に失敗することから、活力ある数個の胚を用いる必要があること、豚胚は極めて脆く核移植など取扱中に壊れやすいことなど、クローン豚作出上の特有の問題があり、多くの研究者がチャレンジしたがうまくいかなかった。しかし、スコットランドのPPL Therapeutics社のAlan Colmanらは２０００年３月にクローン豚を作出したことを記者発表しているが、その詳細についての学術論文は未だ刊行されていない（Science,288,1724-1725,2000）。
【０００５】
その他、アルギン酸等による胚の包埋技術としては以下のものが知られている。ＣＢ６Ｆ１マウス及びゴールデンシリアンハムスターを用いて、インビトロにおける胚卵割率、着床率、生児出生率に関し、齧歯目胚のアルギン酸ナトリウムカプセル化の影響及びインビボにおけるカプセルの分解速度を調べ、３．０％アルギン酸ナトリウムによる齧歯目動物胚のカプセル化は、胚の発達、着床率、又は生存率に対して悪影響を与えないことや、挿入後４８時間以内に分解するので、インビトロにおけるヒトの受精及び胚着床に有用であることが報告されている（FERTILITY AND STERILITY,59,652-656,1993）。ヤギ幼胚の二分割胚の凍結保存における寒天の影響を調べ、二分割胚を寒天で固定したもの又は固定しないものの両方を凍結保存し、解凍後、損傷のないもの及び一部損傷のあるものをレシピエントの子宮に移植したところ、前者では解凍後も損傷を受けていないものが５０％の割合で得られたが、後者では解凍後も損傷を受けていないものが５％であったことが報告されている（THERIOGENOLOGY,28,317-322）。ホルスタイン雌牛の二分割胚の凍結解凍時におけるポリリジン／アルギン酸膜の包埋効果について調べ、二分割胚をポリリジン／アルギン酸膜で包埋すると、対照に比べて高い形態学上のスコアを示すことが報告されている（THERIOGENOLOGY,29,262,1988）。ウサギ胚の凍結解凍におけるアルギン酸カルシウムゲル封入効果について調べ、アルギン酸カルシウムゲル封入胚は対照に比べて、胚の非細胞性成分（透明帯及びムチン被膜）の損傷の発生が減少し、また解凍後の生存率が向上することが報告されている（THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL ZOOLOGY,254,186-191,1990）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、クローン豚の作出は異種移植の問題を解決する手段として、また、良質な食肉生産点からも重要である。すなわち、クローン豚作出技術と遺伝子組換え技術とを組み合わせることにより、ヒトへの異種移植のためのドナーの供給が可能となり、選択された表現型をもつ豚をクローン技術により増産することは、食肉生産が可能となる。本発明の課題は、効率のよいクローン豚の作出方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、分化した細胞から豚のクローンを作出するための方法について種々調査・検討し、除核した卵子に豚の胎児線維芽細胞核を顕微注入し、電気活性化処理により発生を誘発し、かかる活性化処理クローン胚を雌豚の卵管に移植したところ、外見的に正常な雌の仔豚が得られ、毛色による判定とＤＮＡマイクロサテライト分析によって前記仔豚がクローン豚であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、サイトカラシンＢ処理を施した豚の卵子からピエゾマイクロマニピュレーターに取り付けた除核用ピペットを用いて除核し、該除核された卵子に豚の体細胞核を、ピエゾマイクロマニピュレーターに取り付けた体細胞注入用ピペットを用いて注入し、該体細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚をアルギン酸で包埋し、妊娠豚の流産処理後の雌豚の卵管又は子宮に移植することを特徴とする体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項１）や、豚の卵子が豚の体内成熟卵子であることを特徴とする請求項１記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項２）や、体細胞核が胎児線維芽細胞核であることを特徴とする請求項１又は２記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項３）や、体細胞核が細胞周期Ｇ0期に同調させた体細胞から得られる核であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項４）や、活性化処理が電気パルス活性化処理であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項５）や、活性化処理後の核移植胚をアルギン酸で包埋することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項６）に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明における体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法としては、採取した豚の卵子から除核し、該除核された卵子に豚の体細胞核を注入し、該体細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する方法であれば特に制限されるものではなく、ここで、体細胞核直接注入法とは、体細胞の核を除核細胞に直接注入（インジェクション）する方法をいい、かかる体細胞核直接注入法には、例えば、プライムテック株式会社製のＰＭＭ三次元マイクロマニピュレーションシステム「ＥＭＭ−７１５ＯＵＤ」を用いることができる。
【００１０】
上記豚の卵子としては、豚の成熟卵子であれば特に制限されるものではなく、プロスタグランジンＦ２α、クロプロステノール、絨毛ゴナドトロピン等のホルモン投与による過排卵処理により得られる体内成熟卵子の他、屠場由来の卵巣から採取した卵子を体外成熟させたものも使用できるが、着床率の点からして体内成熟卵子、特に性成熟（６ヶ月齢以上）した雌豚から採取した体内成熟卵子が好ましい。かかる体内成熟卵子は、過排卵処理により得られる雌豚の子宮及び卵巣をＰＢＳ溶液等を用いて卵管灌流を行うことにより採取することができるが、卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好ましい。
【００１１】
上記豚のレシピエント卵子から除核は、細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンＢ処理を施した豚の卵子から除核することが好ましく、より具体的にはサイトカラシンＢを含有するＮＣＳＵ２３等の培地で体外成熟卵子等のレシピエント卵子を処理した後、除核操作用シャーレのサイトカラシン入りドロップに移してホールディングピペットで保定し、透明帯を迅速・的確にに貫通することができる除核用ピペット（外径２５〜３０μｍ）を用いて、Ｍ（metaphase）II期の染色体を含む第一極体の付近を極体ごと吸引することにより行われる。なお、吸引した極体を調べることにより除核できていることを確認することが好ましく、また除核卵子からはサイトカラシンＢを除去することが好ましい。
【００１２】
上記体細胞核としては、豚体細胞に由来する核であれば特に制限されるものではないが、例えば胎児線維芽細胞核を好適に例示することができる。特にレシピエントや仮親と毛色の異なる品種の豚をドナーとすることが、毛色からクローン豚であるかどうかを簡便に判定する上で好ましい。また、核移植に用いるドナー細胞の細胞周期は特に制限されるものではないが、細胞周期Ｇ0期に同調させた体細胞が好ましい。細胞周期Ｇ0期に同調させた体細胞は、例えばコンフルエントな状態で培養液の交換なしに、体細胞を１６日間前後培養し続けることによって得ることができる。線維芽細胞を用いる場合、トリプシン処理で細胞を分散させたものが好ましく、また、培養細胞が線維芽細胞であることを、サイトケラチンとＳＳＥＡ−１との陰性反応、ビメンチンでの陽性反応、線維芽細胞の特異的プライマーによるＰＣＲ分析等により確認することが好ましい。
【００１３】
上記体細胞核の除核されたレシピエント卵母細胞への直接注入は、体細胞の細胞膜を崩壊させて実質的に体細胞核からなる画分を注入することがドナー細胞質の影響を排除して核移植胚の発生を良好にする点で好ましい。これに対して融合法による核の注入は細胞質を伴って注入することになるので、細胞質による汚染に対して敏感である豚のクローン作出においては好ましくない。また、体細胞核のインジェクションピペットとしては、透明帯の貫通が迅速・精確かつ簡単にでき、細胞質膜へのダメージを最小にすることができるものが好ましく、かかるインジェクションピペットとしてはピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた体細胞注入用ピペット（外径７〜１０μｍ）を具体的に例示することができる。
【００１４】
上記活性化処理としては、従来公知の核移植胚の活性化処理方法であれば特に制限されるものではないが、クローン豚の作出においては電気パルス活性化処理を好適に例示することができる。電気パルス活性化処理としては、電荷の大きい１回の電気パルス、例えば１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回を印可する方がそれより小さい電荷の電気パルスを２回印可するよりも胚活性の点で好ましく、また、電気パルス活性化処理における培地としてはＮＣＳＵ２３（J.Reprod.Fertil.Suppl.,48,61,1993）を用いることが高い胚盤胞形成率の点で好ましい。また、電気パルスによる活性化処理の場合、体内成熟卵子の方が体外成熟卵子に比べて胚盤胞の発生能の点で好ましい。さらに、レシピエント細胞として体内成熟卵子を用いる場合には、過排卵処理のために使用した最初のｈＣＧ投与後、５０〜６０時間後、好ましくは５４〜５５時間後に活性化処理をすることが望ましい。
【００１５】
電気パルス活性化処理後のクローン胚を卵管及び子宮に移植する際に、卵管及び子宮の膜運動による損耗を防ぐと同時に、白血球の攻撃からの防御するために、活性化処理後の核移植胚をアルギン酸、寒天等で包埋することが好ましい。かかるアルギン酸等による包埋は、複数被膜、好ましくは３重被膜とし、外層膜ほど高濃度のアルギン酸や寒天とすることが特に好ましく、かかる３重包埋胚を用いると、高い胚盤胞の発生が見られる。アルギン酸被膜で包埋する方法としては所定濃度（例えば０．５％、１．５％、２．０％）のアルギン酸ナトリウム液に核移植胚を馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させる操作を繰り返すことにより行う方法を挙げることができる。
【００１６】
活性化処理後の核移植胚を卵管又は子宮に移植する雌豚としては特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊娠２１〜４０日目にプロスタグランジンＦ２α等を用いて人工流産させ、同期化を行った雌豚を用いることが好ましい。また、核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植するに際し、複数個の受精卵を核移植胚に混合して雌豚の卵管又は子宮に移植する追い移植法を用いることが好ましい。
【００１７】
また産仔した豚ドナー体細胞核由来のクローンであることの確認は、産仔の毛色の他、クローン豚、クローン豚の仮親の耳から採取したＤＮＡ並びにクローン豚を作出するために用いた線維芽細胞等の体細胞のＤＮＡを採取し、豚のための特異的なマーカーでマイクロサテライト分析を行い、クローン豚が体細胞と同一の遺伝子をもち、仮親と異なる遺伝子をもつことを確認することにより同定することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例等により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例等によって限定されるものではない。
実施例１（クローン豚の作出）
実施例１−１［体内成熟卵子の採取］
卵子はランドレース（白色）の雌、又はランドレース×大ヨークシャー×デュロックの三元交雑腫（黒斑を有する白色）の雌から採取した。成熟卵子は性成熟（６ヶ月齢以上）又は未成熟の雌豚から採取した。性成熟豚の排卵処理は以下のようにして行った。人工授精から２１〜４０日後の性成熟豚に、まずプロスタグランジンＦ２αのアナログである(+)-クロプロステノール（住友化学社製「Planate」）０．２ｍｇを筋肉内に注射して流産させた。筋肉内注射の２４時間後に、クロプロステノール０．２ｍｇとウマ絨毛ゴナドトロピン（ｅＣＧ）１５００単位を共に筋肉内に注射した。ｅＣＧを注射してから７２時間後にヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）５００単位を筋肉内に注射することにより過排卵処理を行った。一方、未性成熟雌豚の排卵処理は以下のようにして行った。１５００単位のｅＣＧのみを筋肉内に注射し、その７２時間後に５００単位のｈＣＧを筋肉内に注射することにより過排卵処理を行った。これら過排卵処理を行った雌豚は、ｈＣＧを投与してから４５時間後に屠殺し、子宮及び卵巣を採取した。０．１％ＢＳＡを加えたカルシウム、マグネシウムを含まないダルベッコのＰＢＳ溶液を用いて卵管灌流を行って体内成熟卵子を採取した。卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去した。採取した体内成熟卵子は培養液（ＮＣＳＵ２３）で３８．５℃、５％ＣＯ2インキュベーターで核移植操作まで培養した。
【００１９】
実施例１−２［除核操作］
上記実施例１−１で得られたレシピエント卵子（体外成熟卵子）を、５μｇサイトカラシンＢ／１ｍｌ培養液（ＮＣＳＵ２３）に入れて１５分以上処理した後、核移植（除核操作）用シャーレのサイトカラシン入りドロップに卵子を移し、第一極体の位置が１２時、３時、６時のいずれかにくるようにホールディングピペットで保定し、ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた除核用ピペット（外径２５〜３０μｍ）を用いて透明帯を迅速に貫通することにより、Ｍ（metaphase）II期の染色体を含む第一極体の付近を極体ごと細胞質の１／４〜１／３程吸引した。除核処理は、室温下でサイトカラシンＢが５μｇ／ｍｌ入りＮＣＳＵ２３培養液中で１０〜１５個ずつの卵子を処理した。吸引した極体と細胞質を別の５μｇヘキスト３３３４２／１ｍｌ培養液（ＮＣＳＵ２３）のドロップに移し、１５分後にＵＶによる蛍光顕微鏡観察を行い、除核できていることを確認した。除核ができた卵子は、直ちにサイトカラシンＢの含まれていない培養液ＮＣＳＵ２３で丁寧に洗浄し、サイトカラシンを除核卵子から除去し、３８．５℃、ＣＯ2インキュベーターに戻して培養した。
【００２０】
実施例１−３［胎児線維芽細胞の分離］
梅山豚雌の発情周期を把握した上で人工授精し、妊娠２４日目の梅山豚×梅山豚（黒色）を屠殺して子宮より一匹の胎児を採取し、頭部と内臓を除去した後、細切し、トリプシン処理で細胞を分散させた後、３時間４℃下で０．２５％トリプシンと１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液で培養した後、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで洗浄して初代培養細胞を得た。細胞培養は１０％ＦＣＳ入りのＤＭＥＭで行い、細胞が飽和状態になる度に２〜６回の植え継ぎを行い、高密度に細胞をまくことにより安定をはかった（参考写真１参照）。核移植に用いたドナー細胞としては、飽和状態で培養液の交換なしに１６日間培養し続けることによってＧ0期になったものを用いた。培養細胞は、３日後ではＰＣＮＡで陽性反応を示すが、１０日後には免疫反応がなくなるので１６日目にはＧ0期になったことが証明された。かかる培養細胞が線維芽細胞であることは、培養細胞がサイトケラチンとＳＳＥＡ−１で陰性反応を示し、ビメンチンで強い陽性反応を示すことにより確認し、胎児の雌雄判別は線維芽細胞の特異的ＺＦＹ／ＳＲＹプライマーによるＰＣＲ分析によって行った。また、それぞれの培養細胞の核型が正常であることはＧ染色で確認した。
【００２１】
実施例１−４［胎児線維芽細胞の準備］
核移植予定日（１６日前）に合わせて、新しい培養液（１０％ＦＣＳ入りＤＭＥＭ）に植え継ぎ、３７℃、５％ＣＯ2で培養し、放置した。核移植直前に、ドナー体細胞である休止状態の胎児線維芽細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで０．２５％トリプシンを用いて細胞を浮遊させた（参考写真２参照）後、トリプシンを１０％ＦＣＳ入りＤＭＥＭで不活化し、遠心後（１０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）、上清を除き核移植に用いる培養液（ＮＣＳＵ２３）に再浮遊させ、核移植（体細胞核注入）用シャーレのドロップに適量体細胞を浮遊させておいた。
【００２２】
実施例１−５［体細胞核の注入］
実施例１−２の除核処理を行った卵子を、胎児線維芽細胞が浮遊したシャーレの１つのドロップに１０〜１５個ずつ入れて体細胞核注入操作を行った。ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた体細胞注入用ピペット（外径７〜１０μｍ）により、浮遊している体細胞を丁寧に数回ピペッティングすることにより細胞膜を崩壊させて実質的に体細胞核からなる画分を、除核操作による卵子の透明帯の穴に注意しながらホールディングピペットにより保定された除核卵子の細胞質内に注入した。ピエゾマイクロマニピュレーターは、透明帯の貫通が簡単にでき、細胞質膜へのダメージを最小にすることができた。また、マニピュレーションの間、インジェクションピペットは、１５％ＰＶＰを含むＮＣＳＵ２３培養液のドロップでまめに洗浄した。注入後、予め準備しておいた培養用ドロップ（ＮＣＳＵ２３）に移し、次の活性化処理までの３〜４時間、インキュベーター（３８．５℃、５％ＣＯ2）で培養しておいた。
【００２３】
実施例１−６［電気パルス活性化処理］
上記体細胞核が注入された卵子をＮＣＳＵ２３で培養し、ｈＣＧ投与５４〜５５時間後に電気パルス活性化処理をＳＳＨ−２融合装置（shimadzu社製）を用いて行った。まず、室温放置した電解質溶液（０．０１％のＢＳＡ、０．０５ｍＭのＣａＣｌ2、０．１ｍＭのＭｇＳＯ4添加０．２８Ｍマンニトール溶液）の入ったシャーレを２枚と２ｍｍ幅ステンレスワイヤー電極のチャンバーを用意し、１枚目のシャーレの電解質溶液に卵子を浸して馴染ませ、さらに２枚目の電解質溶液入りのシャーレに移して馴染ませた。卵子が電解質溶液に馴染んだ後、２ｍｍ幅ステンレスワイヤー電極のチャンバーに卵子を並べ、電気パルスによる活性化処理を表１記載の条件で実施した。電気パルスによる活性化処理後、極体の放出防止のため活性化した胚を細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンＢに浸した。すなわち、５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを含むＮＣＳＵ２３で２時間培養を行い、第二極体放出の抑制処理を行った。次に、サイトカラシンＢを含まないＮＣＳＵ２３で丁寧に洗浄し、発生培養用ドロップ（ＮＣＳＵ２３）で活性後４０時間培養した。電気パルスによる活性化処理後、ＮＣＳＵ２３培地に代えて、ＢＥＣＭ３培地（Biol.Reprod.,55,1069,1996）及びｍＷＭ培地（J.Anim.Sci.,71,1561,1993）を用いてそれぞれ同様に活性化した胚を培養した。電気パルス活性化処理後の卵母細胞の生存率の結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
表１からわかるように、電荷の大きい１回の電気パルスを印可した場合、それより小さい電荷の電気パルスを２回印可した場合よりも良好な胚活性を示し、さらに、培養液の違いによる発生の影響では、ＮＣＳＵ２３を用いた場合に最も高い胚盤胞形成率が得られた。これらの結果から、クローン作出には、１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回の電気パルスを活性化条件とし、ＮＣＳＵ２３で培養することにした。またこれと同条件で、体内成熟卵子と体外成熟卵子の発生能を比較した。１６７個の体外成熟卵子を活性化した結果、４８時間までに１１６個が分割したが、胚盤胞にまで至ったのはわずかに４個（２．４％）だけであった。この値２．４％は、表１に示される対応する体内成熟卵子の値（３１．２％）より有意に低かった。以上の実験結果から、体内成熟卵子をクローン作出に用いることとした。
【００２６】
実施例１−７［仮親への胚移植］
豚胚はたとえ体外培養で胚盤胞まで発生しても仮親の子宮角に移植した後の発生能は乏しい（Biol.Reprod.,59,451,1998）。さらに豚の着床には４個以上の胚が必要であると言われ、通常の受精卵の存在がクローン胚の発生を助けると考えられたので、子宮内でのクローン胚の発生を助ける受精卵の能力を調べるために２つの試験区を組んだ。クローン胚を仮親に移植する前の体外培養を２０時間（試験区Ａ、１−細胞期胚）又は４０時間（試験区Ｂ、２−４細胞期胚）行い（参考写真３参照）、その後仮親に移植した。仮親は以下のように予め調整した。ランドレース×大ヨークシャー×デュロックの三元交雑腫の雌豚６頭に、ランドレース精液で人工授精し、その妊娠２１〜４０日目に０．２ｍｇのクロプロステノールを注射することにより流産させ、その注射の２４時間後に０．２ｍｇのクロプロステノールと１０００単位のｅＣＧを筋肉内に注射した。ｅＣＧ注射後７２時間後にｈＣＧ５００単位を注射した。ｈＣＧ投与後２４時間でランドレース精液による人工授精を行い、クローン胚を卵管移植する際に、片方の卵管を洗い流した。クローン胚のインビトロにおける発生及びその後の仮親での結果を表２に示す。表２からもわかるように、９６個のクローン胚と仮親３頭を用いた試験区Ａからの産仔９頭、及び６３個のクローン胚と仮親３頭を用いた試験区Ｂからの産仔２４頭は、いずれも毛色は白色で、クローン豚ではなかった。
【００２７】
【表２】
【００２８】
そこで、試験区Ｃとして、２〜６回植え継いだ線維芽細胞から得た１１０個の２−８細胞期クローン胚を４頭の仮親に、通常の受精卵を存在させずに移植した。すなわち、ランドレース×大ヨークシャー×デュロックの三元交雑腫の雌豚６頭に、ランドレース精液で人工授精し、その妊娠２１〜４０日目に０．２ｍｇのクロプロステノールを注射することにより流産させ、その注射の２４時間後に０．２ｍｇのクロプロステノールと１０００単位のｅＣＧを筋肉内に注射した。ｅＣＧ注射後７２時間後にｈＣＧ５００単位を注射した。ｈＣＧを投与してから、４８又は６８時間後に卵管移植を行った。４頭の仮親のうち３頭は、移植後２７，３５，６１日目に発情が帰って来た。遅くなった発情回帰は、豚の発情サイクルが２１日周期であることから、それぞれの仮親が妊娠していたことを示している。胚の子宮着床は豚のＥ１３−１４で起こり、妊娠していたはずの２頭は胎盤形成後に発生が終わっていた。妊娠を維持していた試験区Ｃでの４番目の仮親の卵管移植したクローン胚は植え継ぎ２回目の線維芽細胞から得られたものであり、これらの胚の１つから黒色の毛色をもつ子豚が自然分娩で産まれた。生誕時の子豚の体重は１．２ｋｇ、胎盤重量は０．３ｋｇであり、両値とも通常の子豚の正常な値の範囲内であった。また、いくつかのクローン牛の例では胎盤異常が現れ、顕微注入法によるクローンマウスでは通常マウスより胎盤が大きくなるという報告があったが、この子豚に付いていた胎盤は、外見上ばかりでなく解剖学的にも正常であった。このクローン豚をＸｅｎａと名付けた（参考写真４参照）。
【００２９】
Ｘｅｎａは梅山豚×梅山豚の核遺伝子由来のクローンであると予測できる黒色の毛色をもつ健康な雌の子豚であり、この由来を確認するため、Ｘｅｎａ及びＸｅｎａの仮親であるランドレースの耳から採取したＤＮＡ並びにＸｅｎａを作出するために用いた線維芽細胞のＤＮＡを採取し、豚のための特異的な２３のマーカーでマイクロサテライト分析を行った。サンプルは、Geno Typer Softwareによる３７３Ａ オートシークエンサーで調べた。マーカーは ＳＷ２８６、ＳＷ８４０、ＳＷ９５７、ＳＷ１３３、ＳＷ２７４、ＳＷ３７３、ＳＷ４９１、ＳＷ７４１、ＳＷ８３９、ＳＷ７４２、ＳＷ１３２７、ＳＷ１３１１、ＳＷ１２２、ＳＷ４３５、ＳＷ５４０、ＳＷ９４２、ＳＷＲ１０２１、ＳＷ１３９９、ＳＷ２４９、ＳＷＲ４２６、ＳＷＲ５２４、ＳＷＲ４１４、ＳＷ７１７を用いた。３つのマーカーのセットＳＷ１３３、ＳＷ２７４、ＳＷＲ１０２１からのデータは判定できなかったが、結果が判定できたマーカーの全てで、クローン子豚Ｘｅｎａと線維芽細胞が同一の遺伝子を持ち、ランドレースである仮親と異なる遺伝子をもつと同定することができた。
【００３０】
実施例２（クローン豚の作出）
実施例２−１［アルギン酸３重包埋法］
上記実施例１−６で得られた電気パルス活性化処理後のクローン胚を卵管及び子宮に移植する際に、卵管及び子宮の膜運動による損耗を防ぐと同時に、白血球の攻撃からの防御を目的として、以下のようにアルギン酸３重包埋法をクローン胚に適用した。まず、アルギン酸ナトリウムを所定濃度（０．５％、１．５％、２．０％）となるようにリンゲル液に溶かしてオートクレーブ滅菌し、包埋液を調製した。電気パルス活性化処理後４０時間の核移植胚をリンゲル液（３７℃）に移し、ピペッティング等を行いよく馴染ませた後、０．５％アルギン酸ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの１１０ｍＭ塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し、固まった胚入りのアルギン酸ナトリウムを吸引し、次に１．５％アルギン酸ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの１１０ｍＭ塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し、固まった胚入りのアルギン酸ナトリウムを吸引し、続いて２．０％アルギン酸ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの１１０ｍＭ塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し固化させた。
【００３１】
上記包埋処理は３７℃の温度条件下で行われ、アルギン酸で３重包埋された核移植胚は移植まで培養液に移しておいた。活性化処理２日後の卵管移植の際、子宮卵管接合部を皮膚縫合用ナイロン糸で結びアルギン酸包埋胚が子宮に落ちないようにし、３日後にアルギン酸包埋胚を回収し、その発生状況を確認し、発生が良好なものを子宮角上端に最終移植した。その結果、包埋なしで子宮から回収した胚は、明らかに白血球に攻撃されており、また、卵管、子宮内の膜の運動により胚に負担がかかり胚の細胞質が飛び出て、透明帯だけ回収というものも多数見られた。一方、３重包埋した胚は、回収率も１００％に近い値を示し、また発生率（Blast,Morula）も良好な値（約２０％）を示した。
【００３２】
実施例２−２［仮親への胚移植］
実施例２−１で得られたアルギン酸３重包埋胚を仮親への胚移植に用いた。外科的胚移植７日前に妊娠豚２頭に対して、クロプロステノール２ｍｌを臀部に注射して流産させた。外科的胚移植６日前に妊娠雌豚に対して、クロプロステノール２ｍｌとＰＭＳＧ１５００ＩＵを臀部に注射し、注射の７２時間後、ｈＣＧ５００ＩＵを臀部に注射した。２頭のうち１頭はｈＣＧ投与してから２４時間後に人工授精し、外科的胚移植を行う前に受精卵を回収し、この回収した受精卵４〜５個をアルギン酸３重包埋核移植胚に混合して、２頭のうちの他の雌豚の卵管に移植した。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によると、異種移植の問題を解決する手段として、また、良質な食肉生産点からも重要であるクローン豚を作出することができる。そして、本発明のクローン豚の作出技術と遺伝子組換え技術とを組み合わせることにより、ヒトへの異種移植のためのドナーの供給が可能となり、また、選択された表現型をもつ豚をクローン技術により増産することにより食肉生産が可能となる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳類の体細胞からのクローン動物の作出は困難と考えられていたが、１９９６年にCampbellらのグループは羊の胚由来の培養細胞（継代６〜１３代）を血清飢餓状態にして細胞周期をＧ0期とし、この細胞の核を移植することにより産仔の獲得に成功し、ほぼ無限に増やせる培養細胞でもクローン個体を作出することができることを示した(Nature,380,64-66,1996) 。１９９７年、Wilmutらは同様な手法を用いて、培養した乳腺細胞及び線維芽細胞を血清飢餓状態にし、一例ではあるがクローン羊ドーリーの作出を報告した(Nature,385,810-813,1997) 。クローン羊ドーリーの作出法は、除核した羊の卵母細胞と雌羊由来の細胞を電気的に融合することにより核移植するものであるが、かかる細胞融合による核移植では、ドナー細胞の核だけでなく、その細胞質までも卵子に導入されることが避けられないといわれている。その他、細胞融合による核移植に関しては、乳より分離した乳腺由来の細胞をＧ0期に同調した後、電気的融合効率を高めるため３０〜１２０分間トリプシン処理を行い、かかる細胞を用いて核移植するクローン牛の作出方法が知られている（特開平１１−３４１９３５号公報）。
【０００３】
他方、体細胞核を除核卵母細胞に直接注入するクローン動物の作出については、若山らがクローンマウスの作出方法について報告している(Nature,394,369-374,1998)。このクローンマウスの作出方法は、未受精卵の透明体に穴を開けてピペットを差し込み、分裂中期の染色体を除去した除核卵母細胞に、過排卵を誘発したマウスから採取した卵丘細胞、セルトリ細胞、神経細胞由来の核を細胞膜を破って直接注入（インジェクション）し、ストロンチウムで活性化処理した後、サイトカラシンＢで極体の放出を抑制しながら偽前核を形成させ、この胚を培養した後、偽妊娠雌マウスの子宮に移植する方法である。
【０００４】
ところで、豚の心臓や膵臓等の臓器はその大きさからしてヒトの臓器と交換可能性がきわめて高く、クローン豚の作出は異種移植の問題を解決する手段として、また、良質な食肉生産点からも期待されていたが、少なくとも４匹の受精卵が子宮に存しないと妊娠に失敗することから、活力ある数個の胚を用いる必要があること、豚胚は極めて脆く核移植など取扱中に壊れやすいことなど、クローン豚作出上の特有の問題があり、多くの研究者がチャレンジしたがうまくいかなかった。しかし、スコットランドのPPL Therapeutics社のAlan Colmanらは２０００年３月にクローン豚を作出したことを記者発表しているが、その詳細についての学術論文は未だ刊行されていない（Science,288,1724-1725,2000）。
【０００５】
その他、アルギン酸等による胚の包埋技術としては以下のものが知られている。ＣＢ６Ｆ１マウス及びゴールデンシリアンハムスターを用いて、インビトロにおける胚卵割率、着床率、生児出生率に関し、齧歯目胚のアルギン酸ナトリウムカプセル化の影響及びインビボにおけるカプセルの分解速度を調べ、３．０％アルギン酸ナトリウムによる齧歯目動物胚のカプセル化は、胚の発達、着床率、又は生存率に対して悪影響を与えないことや、挿入後４８時間以内に分解するので、インビトロにおけるヒトの受精及び胚着床に有用であることが報告されている（FERTILITY AND STERILITY,59,652-656,1993）。ヤギ幼胚の二分割胚の凍結保存における寒天の影響を調べ、二分割胚を寒天で固定したもの又は固定しないものの両方を凍結保存し、解凍後、損傷のないもの及び一部損傷のあるものをレシピエントの子宮に移植したところ、前者では解凍後も損傷を受けていないものが５０％の割合で得られたが、後者では解凍後も損傷を受けていないものが５％であったことが報告されている（THERIOGENOLOGY,28,317-322）。ホルスタイン雌牛の二分割胚の凍結解凍時におけるポリリジン／アルギン酸膜の包埋効果について調べ、二分割胚をポリリジン／アルギン酸膜で包埋すると、対照に比べて高い形態学上のスコアを示すことが報告されている（THERIOGENOLOGY,29,262,1988）。ウサギ胚の凍結解凍におけるアルギン酸カルシウムゲル封入効果について調べ、アルギン酸カルシウムゲル封入胚は対照に比べて、胚の非細胞性成分（透明帯及びムチン被膜）の損傷の発生が減少し、また解凍後の生存率が向上することが報告されている（THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL ZOOLOGY,254,186-191,1990）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、クローン豚の作出は異種移植の問題を解決する手段として、また、良質な食肉生産点からも重要である。すなわち、クローン豚作出技術と遺伝子組換え技術とを組み合わせることにより、ヒトへの異種移植のためのドナーの供給が可能となり、選択された表現型をもつ豚をクローン技術により増産することは、食肉生産が可能となる。本発明の課題は、効率のよいクローン豚の作出方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、分化した細胞から豚のクローンを作出するための方法について種々調査・検討し、除核した卵子に豚の胎児線維芽細胞核を顕微注入し、電気活性化処理により発生を誘発し、かかる活性化処理クローン胚を雌豚の卵管に移植したところ、外見的に正常な雌の仔豚が得られ、毛色による判定とＤＮＡマイクロサテライト分析によって前記仔豚がクローン豚であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、サイトカラシンＢ処理を施した豚の卵子からピエゾマイクロマニピュレーターに取り付けた除核用ピペットを用いて除核し、該除核された卵子に豚の体細胞核を、ピエゾマイクロマニピュレーターに取り付けた体細胞注入用ピペットを用いて注入し、該体細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚をアルギン酸で包埋し、妊娠豚の流産処理後の雌豚の卵管又は子宮に移植することを特徴とする体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項１）や、豚の卵子が豚の体内成熟卵子であることを特徴とする請求項１記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項２）や、体細胞核が胎児線維芽細胞核であることを特徴とする請求項１又は２記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項３）や、体細胞核が細胞周期Ｇ0期に同調させた体細胞から得られる核であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項４）や、活性化処理が電気パルス活性化処理であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項５）や、活性化処理後の核移植胚をアルギン酸で包埋することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法（請求項６）に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明における体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法としては、採取した豚の卵子から除核し、該除核された卵子に豚の体細胞核を注入し、該体細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する方法であれば特に制限されるものではなく、ここで、体細胞核直接注入法とは、体細胞の核を除核細胞に直接注入（インジェクション）する方法をいい、かかる体細胞核直接注入法には、例えば、プライムテック株式会社製のＰＭＭ三次元マイクロマニピュレーションシステム「ＥＭＭ−７１５ＯＵＤ」を用いることができる。
【００１０】
上記豚の卵子としては、豚の成熟卵子であれば特に制限されるものではなく、プロスタグランジンＦ２α、クロプロステノール、絨毛ゴナドトロピン等のホルモン投与による過排卵処理により得られる体内成熟卵子の他、屠場由来の卵巣から採取した卵子を体外成熟させたものも使用できるが、着床率の点からして体内成熟卵子、特に性成熟（６ヶ月齢以上）した雌豚から採取した体内成熟卵子が好ましい。かかる体内成熟卵子は、過排卵処理により得られる雌豚の子宮及び卵巣をＰＢＳ溶液等を用いて卵管灌流を行うことにより採取することができるが、卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好ましい。
【００１１】
上記豚のレシピエント卵子から除核は、細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンＢ処理を施した豚の卵子から除核することが好ましく、より具体的にはサイトカラシンＢを含有するＮＣＳＵ２３等の培地で体外成熟卵子等のレシピエント卵子を処理した後、除核操作用シャーレのサイトカラシン入りドロップに移してホールディングピペットで保定し、透明帯を迅速・的確にに貫通することができる除核用ピペット（外径２５〜３０μｍ）を用いて、Ｍ（metaphase）II期の染色体を含む第一極体の付近を極体ごと吸引することにより行われる。なお、吸引した極体を調べることにより除核できていることを確認することが好ましく、また除核卵子からはサイトカラシンＢを除去することが好ましい。
【００１２】
上記体細胞核としては、豚体細胞に由来する核であれば特に制限されるものではないが、例えば胎児線維芽細胞核を好適に例示することができる。特にレシピエントや仮親と毛色の異なる品種の豚をドナーとすることが、毛色からクローン豚であるかどうかを簡便に判定する上で好ましい。また、核移植に用いるドナー細胞の細胞周期は特に制限されるものではないが、細胞周期Ｇ0期に同調させた体細胞が好ましい。細胞周期Ｇ0期に同調させた体細胞は、例えばコンフルエントな状態で培養液の交換なしに、体細胞を１６日間前後培養し続けることによって得ることができる。線維芽細胞を用いる場合、トリプシン処理で細胞を分散させたものが好ましく、また、培養細胞が線維芽細胞であることを、サイトケラチンとＳＳＥＡ−１との陰性反応、ビメンチンでの陽性反応、線維芽細胞の特異的プライマーによるＰＣＲ分析等により確認することが好ましい。
【００１３】
上記体細胞核の除核されたレシピエント卵母細胞への直接注入は、体細胞の細胞膜を崩壊させて実質的に体細胞核からなる画分を注入することがドナー細胞質の影響を排除して核移植胚の発生を良好にする点で好ましい。これに対して融合法による核の注入は細胞質を伴って注入することになるので、細胞質による汚染に対して敏感である豚のクローン作出においては好ましくない。また、体細胞核のインジェクションピペットとしては、透明帯の貫通が迅速・精確かつ簡単にでき、細胞質膜へのダメージを最小にすることができるものが好ましく、かかるインジェクションピペットとしてはピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた体細胞注入用ピペット（外径７〜１０μｍ）を具体的に例示することができる。
【００１４】
上記活性化処理としては、従来公知の核移植胚の活性化処理方法であれば特に制限されるものではないが、クローン豚の作出においては電気パルス活性化処理を好適に例示することができる。電気パルス活性化処理としては、電荷の大きい１回の電気パルス、例えば１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回を印可する方がそれより小さい電荷の電気パルスを２回印可するよりも胚活性の点で好ましく、また、電気パルス活性化処理における培地としてはＮＣＳＵ２３（J.Reprod.Fertil.Suppl.,48,61,1993）を用いることが高い胚盤胞形成率の点で好ましい。また、電気パルスによる活性化処理の場合、体内成熟卵子の方が体外成熟卵子に比べて胚盤胞の発生能の点で好ましい。さらに、レシピエント細胞として体内成熟卵子を用いる場合には、過排卵処理のために使用した最初のｈＣＧ投与後、５０〜６０時間後、好ましくは５４〜５５時間後に活性化処理をすることが望ましい。
【００１５】
電気パルス活性化処理後のクローン胚を卵管及び子宮に移植する際に、卵管及び子宮の膜運動による損耗を防ぐと同時に、白血球の攻撃からの防御するために、活性化処理後の核移植胚をアルギン酸、寒天等で包埋することが好ましい。かかるアルギン酸等による包埋は、複数被膜、好ましくは３重被膜とし、外層膜ほど高濃度のアルギン酸や寒天とすることが特に好ましく、かかる３重包埋胚を用いると、高い胚盤胞の発生が見られる。アルギン酸被膜で包埋する方法としては所定濃度（例えば０．５％、１．５％、２．０％）のアルギン酸ナトリウム液に核移植胚を馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させる操作を繰り返すことにより行う方法を挙げることができる。
【００１６】
活性化処理後の核移植胚を卵管又は子宮に移植する雌豚としては特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊娠２１〜４０日目にプロスタグランジンＦ２α等を用いて人工流産させ、同期化を行った雌豚を用いることが好ましい。また、核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植するに際し、複数個の受精卵を核移植胚に混合して雌豚の卵管又は子宮に移植する追い移植法を用いることが好ましい。
【００１７】
また産仔した豚ドナー体細胞核由来のクローンであることの確認は、産仔の毛色の他、クローン豚、クローン豚の仮親の耳から採取したＤＮＡ並びにクローン豚を作出するために用いた線維芽細胞等の体細胞のＤＮＡを採取し、豚のための特異的なマーカーでマイクロサテライト分析を行い、クローン豚が体細胞と同一の遺伝子をもち、仮親と異なる遺伝子をもつことを確認することにより同定することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例等により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例等によって限定されるものではない。
実施例１（クローン豚の作出）
実施例１−１［体内成熟卵子の採取］
卵子はランドレース（白色）の雌、又はランドレース×大ヨークシャー×デュロックの三元交雑腫（黒斑を有する白色）の雌から採取した。成熟卵子は性成熟（６ヶ月齢以上）又は未成熟の雌豚から採取した。性成熟豚の排卵処理は以下のようにして行った。人工授精から２１〜４０日後の性成熟豚に、まずプロスタグランジンＦ２αのアナログである(+)-クロプロステノール（住友化学社製「Planate」）０．２ｍｇを筋肉内に注射して流産させた。筋肉内注射の２４時間後に、クロプロステノール０．２ｍｇとウマ絨毛ゴナドトロピン（ｅＣＧ）１５００単位を共に筋肉内に注射した。ｅＣＧを注射してから７２時間後にヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）５００単位を筋肉内に注射することにより過排卵処理を行った。一方、未性成熟雌豚の排卵処理は以下のようにして行った。１５００単位のｅＣＧのみを筋肉内に注射し、その７２時間後に５００単位のｈＣＧを筋肉内に注射することにより過排卵処理を行った。これら過排卵処理を行った雌豚は、ｈＣＧを投与してから４５時間後に屠殺し、子宮及び卵巣を採取した。０．１％ＢＳＡを加えたカルシウム、マグネシウムを含まないダルベッコのＰＢＳ溶液を用いて卵管灌流を行って体内成熟卵子を採取した。卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去した。採取した体内成熟卵子は培養液（ＮＣＳＵ２３）で３８．５℃、５％ＣＯ2インキュベーターで核移植操作まで培養した。
【００１９】
実施例１−２［除核操作］
上記実施例１−１で得られたレシピエント卵子（体外成熟卵子）を、５μｇサイトカラシンＢ／１ｍｌ培養液（ＮＣＳＵ２３）に入れて１５分以上処理した後、核移植（除核操作）用シャーレのサイトカラシン入りドロップに卵子を移し、第一極体の位置が１２時、３時、６時のいずれかにくるようにホールディングピペットで保定し、ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた除核用ピペット（外径２５〜３０μｍ）を用いて透明帯を迅速に貫通することにより、Ｍ（metaphase）II期の染色体を含む第一極体の付近を極体ごと細胞質の１／４〜１／３程吸引した。除核処理は、室温下でサイトカラシンＢが５μｇ／ｍｌ入りＮＣＳＵ２３培養液中で１０〜１５個ずつの卵子を処理した。吸引した極体と細胞質を別の５μｇヘキスト３３３４２／１ｍｌ培養液（ＮＣＳＵ２３）のドロップに移し、１５分後にＵＶによる蛍光顕微鏡観察を行い、除核できていることを確認した。除核ができた卵子は、直ちにサイトカラシンＢの含まれていない培養液ＮＣＳＵ２３で丁寧に洗浄し、サイトカラシンを除核卵子から除去し、３８．５℃、ＣＯ2インキュベーターに戻して培養した。
【００２０】
実施例１−３［胎児線維芽細胞の分離］
梅山豚雌の発情周期を把握した上で人工授精し、妊娠２４日目の梅山豚×梅山豚（黒色）を屠殺して子宮より一匹の胎児を採取し、頭部と内臓を除去した後、細切し、トリプシン処理で細胞を分散させた後、３時間４℃下で０．２５％トリプシンと１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液で培養した後、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで洗浄して初代培養細胞を得た。細胞培養は１０％ＦＣＳ入りのＤＭＥＭで行い、細胞が飽和状態になる度に２〜６回の植え継ぎを行い、高密度に細胞をまくことにより安定をはかった（参考写真１参照）。核移植に用いたドナー細胞としては、飽和状態で培養液の交換なしに１６日間培養し続けることによってＧ0期になったものを用いた。培養細胞は、３日後ではＰＣＮＡで陽性反応を示すが、１０日後には免疫反応がなくなるので１６日目にはＧ0期になったことが証明された。かかる培養細胞が線維芽細胞であることは、培養細胞がサイトケラチンとＳＳＥＡ−１で陰性反応を示し、ビメンチンで強い陽性反応を示すことにより確認し、胎児の雌雄判別は線維芽細胞の特異的ＺＦＹ／ＳＲＹプライマーによるＰＣＲ分析によって行った。また、それぞれの培養細胞の核型が正常であることはＧ染色で確認した。
【００２１】
実施例１−４［胎児線維芽細胞の準備］
核移植予定日（１６日前）に合わせて、新しい培養液（１０％ＦＣＳ入りＤＭＥＭ）に植え継ぎ、３７℃、５％ＣＯ2で培養し、放置した。核移植直前に、ドナー体細胞である休止状態の胎児線維芽細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで０．２５％トリプシンを用いて細胞を浮遊させた（参考写真２参照）後、トリプシンを１０％ＦＣＳ入りＤＭＥＭで不活化し、遠心後（１０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）、上清を除き核移植に用いる培養液（ＮＣＳＵ２３）に再浮遊させ、核移植（体細胞核注入）用シャーレのドロップに適量体細胞を浮遊させておいた。
【００２２】
実施例１−５［体細胞核の注入］
実施例１−２の除核処理を行った卵子を、胎児線維芽細胞が浮遊したシャーレの１つのドロップに１０〜１５個ずつ入れて体細胞核注入操作を行った。ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた体細胞注入用ピペット（外径７〜１０μｍ）により、浮遊している体細胞を丁寧に数回ピペッティングすることにより細胞膜を崩壊させて実質的に体細胞核からなる画分を、除核操作による卵子の透明帯の穴に注意しながらホールディングピペットにより保定された除核卵子の細胞質内に注入した。ピエゾマイクロマニピュレーターは、透明帯の貫通が簡単にでき、細胞質膜へのダメージを最小にすることができた。また、マニピュレーションの間、インジェクションピペットは、１５％ＰＶＰを含むＮＣＳＵ２３培養液のドロップでまめに洗浄した。注入後、予め準備しておいた培養用ドロップ（ＮＣＳＵ２３）に移し、次の活性化処理までの３〜４時間、インキュベーター（３８．５℃、５％ＣＯ2）で培養しておいた。
【００２３】
実施例１−６［電気パルス活性化処理］
上記体細胞核が注入された卵子をＮＣＳＵ２３で培養し、ｈＣＧ投与５４〜５５時間後に電気パルス活性化処理をＳＳＨ−２融合装置（shimadzu社製）を用いて行った。まず、室温放置した電解質溶液（０．０１％のＢＳＡ、０．０５ｍＭのＣａＣｌ2、０．１ｍＭのＭｇＳＯ4添加０．２８Ｍマンニトール溶液）の入ったシャーレを２枚と２ｍｍ幅ステンレスワイヤー電極のチャンバーを用意し、１枚目のシャーレの電解質溶液に卵子を浸して馴染ませ、さらに２枚目の電解質溶液入りのシャーレに移して馴染ませた。卵子が電解質溶液に馴染んだ後、２ｍｍ幅ステンレスワイヤー電極のチャンバーに卵子を並べ、電気パルスによる活性化処理を表１記載の条件で実施した。電気パルスによる活性化処理後、極体の放出防止のため活性化した胚を細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンＢに浸した。すなわち、５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを含むＮＣＳＵ２３で２時間培養を行い、第二極体放出の抑制処理を行った。次に、サイトカラシンＢを含まないＮＣＳＵ２３で丁寧に洗浄し、発生培養用ドロップ（ＮＣＳＵ２３）で活性後４０時間培養した。電気パルスによる活性化処理後、ＮＣＳＵ２３培地に代えて、ＢＥＣＭ３培地（Biol.Reprod.,55,1069,1996）及びｍＷＭ培地（J.Anim.Sci.,71,1561,1993）を用いてそれぞれ同様に活性化した胚を培養した。電気パルス活性化処理後の卵母細胞の生存率の結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
表１からわかるように、電荷の大きい１回の電気パルスを印可した場合、それより小さい電荷の電気パルスを２回印可した場合よりも良好な胚活性を示し、さらに、培養液の違いによる発生の影響では、ＮＣＳＵ２３を用いた場合に最も高い胚盤胞形成率が得られた。これらの結果から、クローン作出には、１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回の電気パルスを活性化条件とし、ＮＣＳＵ２３で培養することにした。またこれと同条件で、体内成熟卵子と体外成熟卵子の発生能を比較した。１６７個の体外成熟卵子を活性化した結果、４８時間までに１１６個が分割したが、胚盤胞にまで至ったのはわずかに４個（２．４％）だけであった。この値２．４％は、表１に示される対応する体内成熟卵子の値（３１．２％）より有意に低かった。以上の実験結果から、体内成熟卵子をクローン作出に用いることとした。
【００２６】
実施例１−７［仮親への胚移植］
豚胚はたとえ体外培養で胚盤胞まで発生しても仮親の子宮角に移植した後の発生能は乏しい（Biol.Reprod.,59,451,1998）。さらに豚の着床には４個以上の胚が必要であると言われ、通常の受精卵の存在がクローン胚の発生を助けると考えられたので、子宮内でのクローン胚の発生を助ける受精卵の能力を調べるために２つの試験区を組んだ。クローン胚を仮親に移植する前の体外培養を２０時間（試験区Ａ、１−細胞期胚）又は４０時間（試験区Ｂ、２−４細胞期胚）行い（参考写真３参照）、その後仮親に移植した。仮親は以下のように予め調整した。ランドレース×大ヨークシャー×デュロックの三元交雑腫の雌豚６頭に、ランドレース精液で人工授精し、その妊娠２１〜４０日目に０．２ｍｇのクロプロステノールを注射することにより流産させ、その注射の２４時間後に０．２ｍｇのクロプロステノールと１０００単位のｅＣＧを筋肉内に注射した。ｅＣＧ注射後７２時間後にｈＣＧ５００単位を注射した。ｈＣＧ投与後２４時間でランドレース精液による人工授精を行い、クローン胚を卵管移植する際に、片方の卵管を洗い流した。クローン胚のインビトロにおける発生及びその後の仮親での結果を表２に示す。表２からもわかるように、９６個のクローン胚と仮親３頭を用いた試験区Ａからの産仔９頭、及び６３個のクローン胚と仮親３頭を用いた試験区Ｂからの産仔２４頭は、いずれも毛色は白色で、クローン豚ではなかった。
【００２７】
【表２】
そこで、試験区Ｃとして、２〜６回植え継いだ線維芽細胞から得た１１０個の２−８細胞期クローン胚を４頭の仮親に、通常の受精卵を存在させずに移植した。すなわち、ランドレース×大ヨークシャー×デュロックの三元交雑腫の雌豚６頭に、ランドレース精液で人工授精し、その妊娠２１〜４０日目に０．２ｍｇのクロプロステノールを注射することにより流産させ、その注射の２４時間後に０．２ｍｇのクロプロステノールと１０００単位のｅＣＧを筋肉内に注射した。ｅＣＧ注射後７２時間後にｈＣＧ５００単位を注射した。ｈＣＧを投与してから、４８又は６８時間後に卵管移植を行った。４頭の仮親のうち３頭は、移植後２７，３５，６１日目に発情が帰って来た。遅くなった発情回帰は、豚の発情サイクルが２１日周期であることから、それぞれの仮親が妊娠していたことを示している。胚の子宮着床は豚のＥ１３−１４で起こり、妊娠していたはずの２頭は胎盤形成後に発生が終わっていた。妊娠を維持していた試験区Ｃでの４番目の仮親の卵管移植したクローン胚は植え継ぎ２回目の線維芽細胞から得られたものであり、これらの胚の１つから黒色の毛色をもつ子豚が自然分娩で産まれた。生誕時の子豚の体重は１．２ｋｇ、胎盤重量は０．３ｋｇであり、両値とも通常の子豚の正常な値の範囲内であった。また、いくつかのクローン牛の例では胎盤異常が現れ、顕微注入法によるクローンマウスでは通常マウスより胎盤が大きくなるという報告があったが、この子豚に付いていた胎盤は、外見上ばかりでなく解剖学的にも正常であった。このクローン豚をＸｅｎａと名付けた（参考写真４参照）。
【００２９】
Ｘｅｎａは梅山豚×梅山豚の核遺伝子由来のクローンであると予測できる黒色の毛色をもつ健康な雌の子豚であり、この由来を確認するため、Ｘｅｎａ及びＸｅｎａの仮親であるランドレースの耳から採取したＤＮＡ並びにＸｅｎａを作出するために用いた線維芽細胞のＤＮＡを採取し、豚のための特異的な２３のマーカーでマイクロサテライト分析を行った。サンプルは、Geno Typer Softwareによる３７３Ａ オートシークエンサーで調べた。マーカーは ＳＷ２８６、ＳＷ８４０、ＳＷ９５７、ＳＷ１３３、ＳＷ２７４、ＳＷ３７３、ＳＷ４９１、ＳＷ７４１、ＳＷ８３９、ＳＷ７４２、ＳＷ１３２７、ＳＷ１３１１、ＳＷ１２２、ＳＷ４３５、ＳＷ５４０、ＳＷ９４２、ＳＷＲ１０２１、ＳＷ１３９９、ＳＷ２４９、ＳＷＲ４２６、ＳＷＲ５２４、ＳＷＲ４１４、ＳＷ７１７を用いた。３つのマーカーのセットＳＷ１３３、ＳＷ２７４、ＳＷＲ１０２１からのデータは判定できなかったが、結果が判定できたマーカーの全てで、クローン子豚Ｘｅｎａと線維芽細胞が同一の遺伝子を持ち、ランドレースである仮親と異なる遺伝子をもつと同定することができた。
【００３０】
実施例２（クローン豚の作出）
実施例２−１［アルギン酸３重包埋法］
上記実施例１−６で得られた電気パルス活性化処理後のクローン胚を卵管及び子宮に移植する際に、卵管及び子宮の膜運動による損耗を防ぐと同時に、白血球の攻撃からの防御を目的として、以下のようにアルギン酸３重包埋法をクローン胚に適用した。まず、アルギン酸ナトリウムを所定濃度（０．５％、１．５％、２．０％）となるようにリンゲル液に溶かしてオートクレーブ滅菌し、包埋液を調製した。電気パルス活性化処理後４０時間の核移植胚をリンゲル液（３７℃）に移し、ピペッティング等を行いよく馴染ませた後、０．５％アルギン酸ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの１１０ｍＭ塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し、固まった胚入りのアルギン酸ナトリウムを吸引し、次に１．５％アルギン酸ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの１１０ｍＭ塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し、固まった胚入りのアルギン酸ナトリウムを吸引し、続いて２．０％アルギン酸ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの１１０ｍＭ塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し固化させた。
【００３１】
上記包埋処理は３７℃の温度条件下で行われ、アルギン酸で３重包埋された核移植胚は移植まで培養液に移しておいた。活性化処理２日後の卵管移植の際、子宮卵管接合部を皮膚縫合用ナイロン糸で結びアルギン酸包埋胚が子宮に落ちないようにし、３日後にアルギン酸包埋胚を回収し、その発生状況を確認し、発生が良好なものを子宮角上端に最終移植した。その結果、包埋なしで子宮から回収した胚は、明らかに白血球に攻撃されており、また、卵管、子宮内の膜の運動により胚に負担がかかり胚の細胞質が飛び出て、透明帯だけ回収というものも多数見られた。一方、３重包埋した胚は、回収率も１００％に近い値を示し、また発生率（Blast,Morula）も良好な値（約２０％）を示した。
【００３２】
実施例２−２［仮親への胚移植］
実施例２−１で得られたアルギン酸３重包埋胚を仮親への胚移植に用いた。外科的胚移植７日前に妊娠豚２頭に対して、クロプロステノール２ｍｌを臀部に注射して流産させた。外科的胚移植６日前に妊娠雌豚に対して、クロプロステノール２ｍｌとＰＭＳＧ１５００ＩＵを臀部に注射し、注射の７２時間後、ｈＣＧ５００ＩＵを臀部に注射した。２頭のうち１頭はｈＣＧ投与してから２４時間後に人工授精し、外科的胚移植を行う前に受精卵を回収し、この回収した受精卵４〜５個をアルギン酸３重包埋核移植胚に混合して、２頭のうちの他の雌豚の卵管に移植した。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によると、異種移植の問題を解決する手段として、また、良質な食肉生産点からも重要であるクローン豚を作出することができる。そして、本発明のクローン豚の作出技術と遺伝子組換え技術とを組み合わせることにより、ヒトへの異種移植のためのドナーの供給が可能となり、また、選択された表現型をもつ豚をクローン技術により増産することにより食肉生産が可能となる。
Claims (6)
- サイトカラシンＢ処理を施した豚の卵子からピエゾマイクロマニピュレーターに取り付けた除核用ピペットを用いて除核し、該除核された卵子に豚の体細胞核を、ピエゾマイクロマニピュレーターに取り付けた体細胞注入用ピペットを用いて注入し、該体細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚をアルギン酸で包埋し、妊娠豚の流産処理後の雌豚の卵管又は子宮に移植することを特徴とする体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法。
- 豚の卵子が豚の体内成熟卵子であることを特徴とする請求項１記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法。
- 体細胞核が胎児線維芽細胞核であることを特徴とする請求項１又は２記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法。
- 体細胞核が細胞周期Ｇ0期に同調させた体細胞から得られる核であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法。
- 活性化処理が電気パルス活性化処理であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法。
- 活性化処理後の核移植胚をアルギン酸で包埋することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法。
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