JP2002045085A

JP2002045085A - クローン豚の作出方法

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Publication number: JP2002045085A
Application number: JP2000236147A
Authority: JP
Inventors: Akira Onishi; 彰大西; Hirobumi Hanada; 博文花田; Masaki Iwamoto; 正樹岩元; Atsushi Mimatsu; 淳三松
Original assignee: NATL INST OF ANIMAL INDUSTRY; PRIMETECH KK
Current assignee: NATL INST OF ANIMAL INDUSTRY; PRIMETECH KK
Priority date: 2000-08-03
Filing date: 2000-08-03
Publication date: 2002-02-12
Anticipated expiration: 2020-08-03
Also published as: JP4036356B2

Abstract

(57)【要約】【課題】異種移植の問題を解決する手段として、ま
た、良質な食肉生産点からも重要であるクローン豚を体
細胞核直接注入法により効率よく作出する方法を提供す
ること。【解決手段】採取した豚の体内成熟卵子から除核し、
該除核されたレシピエント卵子に豚の胎児繊維芽細胞核
を直接注入し、該胎児繊維芽細胞核が注入された卵子に
電気パルス活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚
を流産処理後の雌豚の卵管又は子宮に移植してクローン
豚を作出する。活性化処理後の核移植胚をアルギン酸で
多重に包埋することや、核移植胚を雌豚の卵管又は子宮
に移植するに際し、複数個の受精卵を前記核移植胚に混
合して雌豚の卵管又は子宮に移植することもできる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、体細胞核直接注入
法によるクローン豚の作出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳類の体細胞からのクローン動物の作
出は困難と考えられていたが、１９９６年にCampbellら
のグループは羊の胚由来の培養細胞（継代６〜１３代）
を血清飢餓状態にして細胞周期をＧ₀期とし、この細胞
の核を移植することにより産仔の獲得に成功し、ほぼ無
限に増やせる培養細胞でもクローン個体を作出すること
ができることを示した(Nature,380,64-66,1996) 。１９
９７年、Wilmutらは同様な手法を用いて、培養した乳腺
細胞及び線維芽細胞を血清飢餓状態にし、一例ではある
がクローン羊ドーリーの作出を報告した(Nature,385,81
0-813,1997) 。クローン羊ドーリーの作出法は、除核し
た羊の卵母細胞と雌羊由来の細胞を電気的に融合するこ
とにより核移植するものであるが、かかる細胞融合によ
る核移植では、ドナー細胞の核だけでなく、その細胞質
までも卵子に導入されることが避けられないといわれて
いる。その他、細胞融合による核移植に関しては、乳よ
り分離した乳腺由来の細胞をＧ₀期に同調した後、電気
的融合効率を高めるため３０〜１２０分間トリプシン処
理を行い、かかる細胞を用いて核移植するクローン牛の
作出方法が知られている（特開平１１−３４１９３５号
公報）。

【０００３】他方、体細胞核を除核卵母細胞に直接注入
するクローン動物の作出については、若山らがクローン
マウスの作出方法について報告している(Nature,394,36
9-374,1998)。このクローンマウスの作出方法は、未受
精卵の透明体に穴を開けてピペットを差し込み、分裂中
期の染色体を除去した除核卵母細胞に、過排卵を誘発し
たマウスから採取した卵丘細胞、セルトリ細胞、神経細
胞由来の核を細胞膜を破って直接注入（インジェクショ
ン）し、ストロンチウムで活性化処理した後、サイトカ
ラシンＢで極体の放出を抑制しながら偽前核を形成さ
せ、この胚を培養した後、偽妊娠雌マウスの子宮に移植
する方法である。

【０００４】ところで、豚の心臓や膵臓等の臓器はその
大きさからしてヒトの臓器と交換可能性がきわめて高
く、クローン豚の作出は異種移植の問題を解決する手段
として、また、良質な食肉生産点からも期待されていた
が、少なくとも４匹の受精卵が子宮に存しないと妊娠に
失敗することから、活力ある数個の胚を用いる必要があ
ること、豚胚は極めて脆く核移植など取扱中に壊れやす
いことなど、クローン豚作出上の特有の問題があり、多
くの研究者がチャレンジしたがうまくいかなかった。し
かし、スコットランドのPPL Therapeutics社のAlan Col
manらは２０００年３月にクローン豚を作出したことを
記者発表しているが、その詳細についての学術論文は未
だ刊行されていない（Science,288,1724-1725,2000）。

【０００５】その他、アルギン酸等による胚の包埋技術
としては以下のものが知られている。ＣＢ６Ｆ１マウス
及びゴールデンシリアンハムスターを用いて、インビト
ロにおける胚卵割率、着床率、生児出生率に関し、齧歯
目胚のアルギン酸ナトリウムカプセル化の影響及びイン
ビボにおけるカプセルの分解速度を調べ、３．０％アル
ギン酸ナトリウムによる齧歯目動物胚のカプセル化は、
胚の発達、着床率、又は生存率に対して悪影響を与えな
いことや、挿入後４８時間以内に分解するので、インビ
トロにおけるヒトの受精及び胚着床に有用であることが
報告されている（FERTILITY AND STERILITY,59,652-65
6,1993）。ヤギ幼胚の二分割胚の凍結保存における寒天
の影響を調べ、二分割胚を寒天で固定したもの又は固定
しないものの両方を凍結保存し、解凍後、損傷のないも
の及び一部損傷のあるものをレシピエントの子宮に移植
したところ、前者では解凍後も損傷を受けていないもの
が５０％の割合で得られたが、後者では解凍後も損傷を
受けていないものが５％であったことが報告されている
（THERIOGENOLOGY,28,317-322）。ホルスタイン雌牛の
二分割胚の凍結解凍時におけるポリリジン／アルギン酸
膜の包埋効果について調べ、二分割胚をポリリジン／ア
ルギン酸膜で包埋すると、対照に比べて高い形態学上の
スコアを示すことが報告されている（THERIOGENOLOGY,2
9,262,1988）。ウサギ胚の凍結解凍におけるアルギン酸
カルシウムゲル封入効果について調べ、アルギン酸カル
シウムゲル封入胚は対照に比べて、胚の非細胞性成分
（透明帯及びムチン被膜）の損傷の発生が減少し、また
解凍後の生存率が向上することが報告されている（THE
JOURNAL OF EXPERIMENTAL ZOOLOGY,254,186-191,199
0）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前記のように、クロー
ン豚の作出は異種移植の問題を解決する手段として、ま
た、良質な食肉生産点からも重要である。すなわち、ク
ローン豚作出技術と遺伝子組換え技術とを組み合わせる
ことにより、ヒトへの異種移植のためのドナーの供給が
可能となり、選択された表現型をもつ豚をクローン技術
により増産することは、食肉生産が可能となる。本発明
の課題は、効率のよいクローン豚の作出方法を提供する
ことにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、分化した
細胞から豚のクローンを作出するための方法について種
々調査・検討し、除核した卵子に豚の胎児線維芽細胞核
を顕微注入し、電気活性化処理により発生を誘発し、か
かる活性化処理クローン胚を雌豚の卵管に移植したとこ
ろ、外見的に正常な雌の仔豚が得られ、毛色による判定
とＤＮＡマイクロサテライト分析によって前記仔豚がク
ローン豚であることを確認し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００８】すなわち、本発明は、採取した豚の卵子か
ら除核し、該除核された卵子に豚の体細胞核を注入し、
該体細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性
化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植するこ
とを特徴とする体細胞核直接注入法によるクローン豚の
作出方法（請求項１）や、豚の卵子が豚の体内成熟卵子
であることを特徴とする請求項１記載の体細胞核直接注
入法によるクローン豚の作出方法（請求項２）や、サイ
トカラシンＢ処理を施した豚の卵子から除核することを
特徴とする請求項１又は２記載の体細胞核直接注入法に
よるクローン豚の作出方法（請求項３）や、体細胞核が
胎児線維芽細胞核であることを特徴とする請求項１〜３
のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン豚
の作出方法（請求項４）や、体細胞核が細胞周期Ｇ₀期
に同調させた体細胞から得られる核であることを特徴と
する請求項１〜４のいずれか記載の体細胞核直接注入法
によるクローン豚の作出方法（請求項５）や、活性化処
理が電気パルス活性化処理であることを特徴とする請求
項１〜５のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるク
ローン豚の作出方法（請求項６）や、活性化処理後の核
移植胚を包埋材で包埋することを特徴とする請求項１〜
６のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン
豚の作出方法（請求項７）や、包埋材がアルギン酸であ
ることを特徴とする請求項７記載の体細胞核直接注入法
によるクローン豚の作出方法（請求項８）や、雌豚が妊
娠豚の流産処理後の雌豚であることを特徴とする請求項
１〜８のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクロ
ーン豚の作出方法（請求項９）や、核移植胚を雌豚の卵
管又は子宮に移植するに際し、複数個の受精卵を前記核
移植胚に混合して雌豚の卵管又は子宮に移植することを
特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の体細胞核直接
注入法によるクローン豚の作出方法（請求項１０）に関
する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明における体細胞核直接注入
法によるクローン豚の作出方法としては、採取した豚の
卵子から除核し、該除核された卵子に豚の体細胞核を注
入し、該体細胞核が注入された卵子に活性化処理を施
し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移
植する方法であれば特に制限されるものではなく、ここ
で、体細胞核直接注入法とは、体細胞の核を除核細胞に
直接注入（インジェクション）する方法をいい、かかる
体細胞核直接注入法には、例えば、プライムテック株式
会社製のＰＭＭ三次元マイクロマニピュレーションシス
テム「ＥＭＭ−７１５ＯＵＤ」を用いることができる。

【００１０】上記豚の卵子としては、豚の成熟卵子であ
れば特に制限されるものではなく、プロスタグランジン
Ｆ２α、クロプロステノール、絨毛ゴナドトロピン等の
ホルモン投与による過排卵処理により得られる体内成熟
卵子の他、屠場由来の卵巣から採取した卵子を体外成熟
させたものも使用できるが、着床率の点からして体内成
熟卵子、特に性成熟（６ヶ月齢以上）した雌豚から採取
した体内成熟卵子が好ましい。かかる体内成熟卵子は、
過排卵処理により得られる雌豚の子宮及び卵巣をＰＢＳ
溶液等を用いて卵管灌流を行うことにより採取すること
ができるが、卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニ
ダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好まし
い。

【００１１】上記豚のレシピエント卵子から除核は、細
胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンＢ処理を施した
豚の卵子から除核することが好ましく、より具体的には
サイトカラシンＢを含有するＮＣＳＵ２３等の培地で体
外成熟卵子等のレシピエント卵子を処理した後、除核操
作用シャーレのサイトカラシン入りドロップに移してホ
ールディングピペットで保定し、透明帯を迅速・的確に
に貫通することができる除核用ピペット（外径２５〜３
０μｍ）を用いて、Ｍ（metaphase）II期の染色体を含
む第一極体の付近を極体ごと吸引することにより行われ
る。なお、吸引した極体を調べることにより除核できて
いることを確認することが好ましく、また除核卵子から
はサイトカラシンＢを除去することが好ましい。

【００１２】上記体細胞核としては、豚体細胞に由来す
る核であれば特に制限されるものではないが、例えば胎
児線維芽細胞核を好適に例示することができる。特にレ
シピエントや仮親と毛色の異なる品種の豚をドナーとす
ることが、毛色からクローン豚であるかどうかを簡便に
判定する上で好ましい。また、核移植に用いるドナー細
胞の細胞周期は特に制限されるものではないが、細胞周
期Ｇ₀期に同調させた体細胞が好ましい。細胞周期Ｇ₀期
に同調させた体細胞は、例えばコンフルエントな状態で
培養液の交換なしに、体細胞を１６日間前後培養し続け
ることによって得ることができる。線維芽細胞を用いる
場合、トリプシン処理で細胞を分散させたものが好まし
く、また、培養細胞が線維芽細胞であることを、サイト
ケラチンとＳＳＥＡ−１との陰性反応、ビメンチンでの
陽性反応、線維芽細胞の特異的プライマーによるＰＣＲ
分析等により確認することが好ましい。

【００１３】上記体細胞核の除核されたレシピエント卵
母細胞への直接注入は、体細胞の細胞膜を崩壊させて実
質的に体細胞核からなる画分を注入することがドナー細
胞質の影響を排除して核移植胚の発生を良好にする点で
好ましい。これに対して融合法による核の注入は細胞質
を伴って注入することになるので、細胞質による汚染に
対して敏感である豚のクローン作出においては好ましく
ない。また、体細胞核のインジェクションピペットとし
ては、透明帯の貫通が迅速・精確かつ簡単にでき、細胞
質膜へのダメージを最小にすることができるものが好ま
しく、かかるインジェクションピペットとしてはピエゾ
マイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社
製）に取り付けた体細胞注入用ピペット（外径７〜１０
μｍ）を具体的に例示することができる。

【００１４】上記活性化処理としては、従来公知の核移
植胚の活性化処理方法であれば特に制限されるものでは
ないが、クローン豚の作出においては電気パルス活性化
処理を好適に例示することができる。電気パルス活性化
処理としては、電荷の大きい１回の電気パルス、例えば
１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回を印可する方
がそれより小さい電荷の電気パルスを２回印可するより
も胚活性の点で好ましく、また、電気パルス活性化処理
における培地としてはＮＣＳＵ２３（J.Reprod.Fertil.
Suppl.,48,61,1993）を用いることが高い胚盤胞形成率
の点で好ましい。また、電気パルスによる活性化処理の
場合、体内成熟卵子の方が体外成熟卵子に比べて胚盤胞
の発生能の点で好ましい。さらに、レシピエント細胞と
して体内成熟卵子を用いる場合には、過排卵処理のため
に使用した最初のｈＣＧ投与後、５０〜６０時間後、好
ましくは５４〜５５時間後に活性化処理をすることが望
ましい。

【００１５】電気パルス活性化処理後のクローン胚を卵
管及び子宮に移植する際に、卵管及び子宮の膜運動によ
る損耗を防ぐと同時に、白血球の攻撃からの防御するた
めに、活性化処理後の核移植胚をアルギン酸、寒天等で
包埋することが好ましい。かかるアルギン酸等による包
埋は、複数被膜、好ましくは３重被膜とし、外層膜ほど
高濃度のアルギン酸や寒天とすることが特に好ましく、
かかる３重包埋胚を用いると、高い胚盤胞の発生が見ら
れる。アルギン酸被膜で包埋する方法としては所定濃度
（例えば０．５％、１．５％、２．０％）のアルギン酸
ナトリウム液に核移植胚を馴染ませた後、塩化カルシウ
ム液等のカルシウムイオン含有液と接触させる操作を繰
り返すことにより行う方法を挙げることができる。

【００１６】活性化処理後の核移植胚を卵管又は子宮に
移植する雌豚としては特に制限されるものではないが、
人工授精させた後の妊娠２１〜４０日目にプロスタグラ
ンジンＦ２α等を用いて人工流産させ、同期化を行った
雌豚を用いることが好ましい。また、核移植胚を雌豚の
卵管又は子宮に移植するに際し、複数個の受精卵を核移
植胚に混合して雌豚の卵管又は子宮に移植する追い移植
法を用いることが好ましい。

【００１７】また産仔した豚ドナー体細胞核由来のクロ
ーンであることの確認は、産仔の毛色の他、クローン
豚、クローン豚の仮親の耳から採取したＤＮＡ並びにク
ローン豚を作出するために用いた線維芽細胞等の体細胞
のＤＮＡを採取し、豚のための特異的なマーカーでマイ
クロサテライト分析を行い、クローン豚が体細胞と同一
の遺伝子をもち、仮親と異なる遺伝子をもつことを確認
することにより同定することができる。

【００１８】

【実施例】以下、本発明を実施例等により詳細に説明す
るが、本発明の技術的範囲は以下の実施例等によって限
定されるものではない。実施例１（クローン豚の作出）実施例１−１［体内成熟卵子の採取］卵子はランドレース（白色）の雌、又はランドレース×
大ヨークシャー×デュロックの三元交雑腫（黒斑を有す
る白色）の雌から採取した。成熟卵子は性成熟（６ヶ月
齢以上）又は未成熟の雌豚から採取した。性成熟豚の排
卵処理は以下のようにして行った。人工授精から２１〜
４０日後の性成熟豚に、まずプロスタグランジンＦ２α
のアナログである(+)-クロプロステノール（住友化学社
製「Planate」）０．２ｍｇを筋肉内に注射して流産さ
せた。筋肉内注射の２４時間後に、クロプロステノール
０．２ｍｇとウマ絨毛ゴナドトロピン（ｅＣＧ）１５０
０単位を共に筋肉内に注射した。ｅＣＧを注射してから
７２時間後にヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）５００
単位を筋肉内に注射することにより過排卵処理を行っ
た。一方、未性成熟雌豚の排卵処理は以下のようにして
行った。１５００単位のｅＣＧのみを筋肉内に注射し、
その７２時間後に５００単位のｈＣＧを筋肉内に注射す
ることにより過排卵処理を行った。これら過排卵処理を
行った雌豚は、ｈＣＧを投与してから４５時間後に屠殺
し、子宮及び卵巣を採取した。０．１％ＢＳＡを加えた
カルシウム、マグネシウムを含まないダルベッコのＰＢ
Ｓ溶液を用いて卵管灌流を行って体内成熟卵子を採取し
た。卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処
理を行って、卵丘細胞を除去した。採取した体内成熟卵
子は培養液（ＮＣＳＵ２３）で３８．５℃、５％ＣＯ₂
インキュベーターで核移植操作まで培養した。

【００１９】実施例１−２［除核操作］上記実施例１−１で得られたレシピエント卵子（体外成
熟卵子）を、５μｇサイトカラシンＢ／１ｍｌ培養液
（ＮＣＳＵ２３）に入れて１５分以上処理した後、核移
植（除核操作）用シャーレのサイトカラシン入りドロッ
プに卵子を移し、第一極体の位置が１２時、３時、６時
のいずれかにくるようにホールディングピペットで保定
し、ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック
株式会社製）に取り付けた除核用ピペット（外径２５〜
３０μｍ）を用いて透明帯を迅速に貫通することによ
り、Ｍ（metaphase）II期の染色体を含む第一極体の付
近を極体ごと細胞質の１／４〜１／３程吸引した。除核
処理は、室温下でサイトカラシンＢが５μｇ／ｍｌ入り
ＮＣＳＵ２３培養液中で１０〜１５個ずつの卵子を処理
した。吸引した極体と細胞質を別の５μｇヘキスト３３
３４２／１ｍｌ培養液（ＮＣＳＵ２３）のドロップに移
し、１５分後にＵＶによる蛍光顕微鏡観察を行い、除核
できていることを確認した。除核ができた卵子は、直ち
にサイトカラシンＢの含まれていない培養液ＮＣＳＵ２
３で丁寧に洗浄し、サイトカラシンを除核卵子から除去
し、３８．５℃、ＣＯ₂インキュベーターに戻して培養
した。

【００２０】実施例１−３［胎児線維芽細胞の分離］梅山豚雌の発情周期を把握した上で人工授精し、妊娠２
４日目の梅山豚×梅山豚（黒色）を屠殺して子宮より一
匹の胎児を採取し、頭部と内臓を除去した後、細切し、
トリプシン処理で細胞を分散させた後、３時間４℃下で
０．２５％トリプシンと１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ
溶液で培養した後、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで洗浄
して初代培養細胞を得た。細胞培養は１０％ＦＣＳ入り
のＤＭＥＭで行い、細胞が飽和状態になる度に２〜６回
の植え継ぎを行い、高密度に細胞をまくことにより安定
をはかった（参考写真１参照）。核移植に用いたドナー
細胞としては、飽和状態で培養液の交換なしに１６日間
培養し続けることによってＧ₀期になったものを用い
た。培養細胞は、３日後ではＰＣＮＡで陽性反応を示す
が、１０日後には免疫反応がなくなるので１６日目には
Ｇ₀期になったことが証明された。かかる培養細胞が線
維芽細胞であることは、培養細胞がサイトケラチンとＳ
ＳＥＡ−１で陰性反応を示し、ビメンチンで強い陽性反
応を示すことにより確認し、胎児の雌雄判別は線維芽細
胞の特異的ＺＦＹ／ＳＲＹプライマーによるＰＣＲ分析
によって行った。また、それぞれの培養細胞の核型が正
常であることはＧ染色で確認した。

【００２１】実施例１−４［胎児線維芽細胞の準備］核移植予定日（１６日前）に合わせて、新しい培養液
（１０％ＦＣＳ入りＤＭＥＭ）に植え継ぎ、３７℃、５
％ＣＯ₂で培養し、放置した。核移植直前に、ドナー体
細胞である休止状態の胎児線維芽細胞をＰＢＳで洗浄
し、次いで０．２５％トリプシンを用いて細胞を浮遊さ
せた（参考写真２参照）後、トリプシンを１０％ＦＣＳ
入りＤＭＥＭで不活化し、遠心後（１０００ｒｐｍ，５
ｍｉｎ）、上清を除き核移植に用いる培養液（ＮＣＳＵ
２３）に再浮遊させ、核移植（体細胞核注入）用シャー
レのドロップに適量体細胞を浮遊させておいた。

【００２２】実施例１−５［体細胞核の注入］実施例１−２の除核処理を行った卵子を、胎児線維芽細
胞が浮遊したシャーレの１つのドロップに１０〜１５個
ずつ入れて体細胞核注入操作を行った。ピエゾマイクロ
マニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り
付けた体細胞注入用ピペット（外径７〜１０μｍ）によ
り、浮遊している体細胞を丁寧に数回ピペッティングす
ることにより細胞膜を崩壊させて実質的に体細胞核から
なる画分を、除核操作による卵子の透明帯の穴に注意し
ながらホールディングピペットにより保定された除核卵
子の細胞質内に注入した。ピエゾマイクロマニピュレー
ターは、透明帯の貫通が簡単にでき、細胞質膜へのダメ
ージを最小にすることができた。また、マニピュレーシ
ョンの間、インジェクションピペットは、１５％ＰＶＰ
を含むＮＣＳＵ２３培養液のドロップでまめに洗浄し
た。注入後、予め準備しておいた培養用ドロップ（ＮＣ
ＳＵ２３）に移し、次の活性化処理までの３〜４時間、
インキュベーター（３８．５℃、５％ＣＯ₂）で培養し
ておいた。

【００２３】実施例１−６［電気パルス活性化処理］上記体細胞核が注入された卵子をＮＣＳＵ２３で培養
し、ｈＣＧ投与５４〜５５時間後に電気パルス活性化処
理をＳＳＨ−２融合装置（shimadzu社製）を用いて行っ
た。まず、室温放置した電解質溶液（０．０１％のＢＳ
Ａ、０．０５ｍＭのＣａＣｌ₂、０．１ｍＭのＭｇＳＯ₄
添加０．２８Ｍマンニトール溶液）の入ったシャーレを
２枚と２ｍｍ幅ステンレスワイヤー電極のチャンバーを
用意し、１枚目のシャーレの電解質溶液に卵子を浸して
馴染ませ、さらに２枚目の電解質溶液入りのシャーレに
移して馴染ませた。卵子が電解質溶液に馴染んだ後、２
ｍｍ幅ステンレスワイヤー電極のチャンバーに卵子を並
べ、電気パルスによる活性化処理を表１記載の条件で実
施した。電気パルスによる活性化処理後、極体の放出防
止のため活性化した胚を細胞骨格形成阻害剤であるサイ
トカラシンＢに浸した。すなわち、５μｇ／ｍｌサイト
カラシンＢを含むＮＣＳＵ２３で２時間培養を行い、第
二極体放出の抑制処理を行った。次に、サイトカラシン
Ｂを含まないＮＣＳＵ２３で丁寧に洗浄し、発生培養用
ドロップ（ＮＣＳＵ２３）で活性後４０時間培養した。
電気パルスによる活性化処理後、ＮＣＳＵ２３培地に代
えて、ＢＥＣＭ３培地（Biol.Reprod.,55,1069,1996）
及びｍＷＭ培地（J.Anim.Sci.,71,1561,1993）を用いて
それぞれ同様に活性化した胚を培養した。電気パルス活
性化処理後の卵母細胞の生存率の結果を表１に示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】表１からわかるように、電荷の大きい１回
の電気パルスを印可した場合、それより小さい電荷の電
気パルスを２回印可した場合よりも良好な胚活性を示
し、さらに、培養液の違いによる発生の影響では、ＮＣ
ＳＵ２３を用いた場合に最も高い胚盤胞形成率が得られ
た。これらの結果から、クローン作出には、１．５ｋＶ
／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回の電気パルスを活性化条
件とし、ＮＣＳＵ２３で培養することにした。またこれ
と同条件で、体内成熟卵子と体外成熟卵子の発生能を比
較した。１６７個の体外成熟卵子を活性化した結果、４
８時間までに１１６個が分割したが、胚盤胞にまで至っ
たのはわずかに４個（２．４％）だけであった。この値
２．４％は、表１に示される対応する体内成熟卵子の値
（３１．２％）より有意に低かった。以上の実験結果か
ら、体内成熟卵子をクローン作出に用いることとした。

【００２６】実施例１−７［仮親への胚移植］豚胚はたとえ体外培養で胚盤胞まで発生しても仮親の子
宮角に移植した後の発生能は乏しい（Biol.Reprod.,59,
451,1998）。さらに豚の着床には４個以上の胚が必要で
あると言われ、通常の受精卵の存在がクローン胚の発生
を助けると考えられたので、子宮内でのクローン胚の発
生を助ける受精卵の能力を調べるために２つの試験区を
組んだ。クローン胚を仮親に移植する前の体外培養を２
０時間（試験区Ａ、１−細胞期胚）又は４０時間（試験
区Ｂ、２−４細胞期胚）行い（参考写真３参照）、その
後仮親に移植した。仮親は以下のように予め調整した。
ランドレース×大ヨークシャー×デュロックの三元交雑
腫の雌豚６頭に、ランドレース精液で人工授精し、その
妊娠２１〜４０日目に０．２ｍｇのクロプロステノール
を注射することにより流産させ、その注射の２４時間後
に０．２ｍｇのクロプロステノールと１０００単位のｅ
ＣＧを筋肉内に注射した。ｅＣＧ注射後７２時間後にｈ
ＣＧ５００単位を注射した。ｈＣＧ投与後２４時間でラ
ンドレース精液による人工授精を行い、クローン胚を卵
管移植する際に、片方の卵管を洗い流した。クローン胚
のインビトロにおける発生及びその後の仮親での結果を
表２に示す。表２からもわかるように、９６個のクロー
ン胚と仮親３頭を用いた試験区Ａからの産仔９頭、及び
６３個のクローン胚と仮親３頭を用いた試験区Ｂからの
産仔２４頭は、いずれも毛色は白色で、クローン豚では
なかった。

【００２７】

【表２】

【００２８】そこで、試験区Ｃとして、２〜６回植え継
いだ線維芽細胞から得た１１０個の２−８細胞期クロー
ン胚を４頭の仮親に、通常の受精卵を存在させずに移植
した。すなわち、ランドレース×大ヨークシャー×デュ
ロックの三元交雑腫の雌豚６頭に、ランドレース精液で
人工授精し、その妊娠２１〜４０日目に０．２ｍｇのク
ロプロステノールを注射することにより流産させ、その
注射の２４時間後に０．２ｍｇのクロプロステノールと
１０００単位のｅＣＧを筋肉内に注射した。ｅＣＧ注射
後７２時間後にｈＣＧ５００単位を注射した。ｈＣＧを
投与してから、４８又は６８時間後に卵管移植を行っ
た。４頭の仮親のうち３頭は、移植後２７，３５，６１
日目に発情が帰って来た。遅くなった発情回帰は、豚の
発情サイクルが２１日周期であることから、それぞれの
仮親が妊娠していたことを示している。胚の子宮着床は
豚のＥ１３−１４で起こり、妊娠していたはずの２頭は
胎盤形成後に発生が終わっていた。妊娠を維持していた
試験区Ｃでの４番目の仮親の卵管移植したクローン胚は
植え継ぎ２回目の線維芽細胞から得られたものであり、
これらの胚の１つから黒色の毛色をもつ子豚が自然分娩
で産まれた。生誕時の子豚の体重は１．２ｋｇ、胎盤重
量は０．３ｋｇであり、両値とも通常の子豚の正常な値
の範囲内であった。また、いくつかのクローン牛の例で
は胎盤異常が現れ、顕微注入法によるクローンマウスで
は通常マウスより胎盤が大きくなるという報告があった
が、この子豚に付いていた胎盤は、外見上ばかりでなく
解剖学的にも正常であった。このクローン豚をＸｅｎａ
と名付けた（参考写真４参照）。

【００２９】Ｘｅｎａは梅山豚×梅山豚の核遺伝子由来
のクローンであると予測できる黒色の毛色をもつ健康な
雌の子豚であり、この由来を確認するため、Ｘｅｎａ及
びＸｅｎａの仮親であるランドレースの耳から採取した
ＤＮＡ並びにＸｅｎａを作出するために用いた線維芽細
胞のＤＮＡを採取し、豚のための特異的な２３のマーカ
ーでマイクロサテライト分析を行った。サンプルは、Ge
no Typer Softwareによる３７３Ａオートシークエン
サーで調べた。マーカーはＳＷ２８６、ＳＷ８４０、
ＳＷ９５７、ＳＷ１３３、ＳＷ２７４、ＳＷ３７３、Ｓ
Ｗ４９１、ＳＷ７４１、ＳＷ８３９、ＳＷ７４２、ＳＷ
１３２７、ＳＷ１３１１、ＳＷ１２２、ＳＷ４３５、Ｓ
Ｗ５４０、ＳＷ９４２、ＳＷＲ１０２１、ＳＷ１３９
９、ＳＷ２４９、ＳＷＲ４２６、ＳＷＲ５２４、ＳＷＲ
４１４、ＳＷ７１７を用いた。３つのマーカーのセット
ＳＷ１３３、ＳＷ２７４、ＳＷＲ１０２１からのデータ
は判定できなかったが、結果が判定できたマーカーの全
てで、クローン子豚Ｘｅｎａと線維芽細胞が同一の遺伝
子を持ち、ランドレースである仮親と異なる遺伝子をも
つと同定することができた。

【００３０】実施例２（クローン豚の作出）実施例２−１［アルギン酸３重包埋法］上記実施例１−６で得られた電気パルス活性化処理後の
クローン胚を卵管及び子宮に移植する際に、卵管及び子
宮の膜運動による損耗を防ぐと同時に、白血球の攻撃か
らの防御を目的として、以下のようにアルギン酸３重包
埋法をクローン胚に適用した。まず、アルギン酸ナトリ
ウムを所定濃度（０．５％、１．５％、２．０％）とな
るようにリンゲル液に溶かしてオートクレーブ滅菌し、
包埋液を調製した。電気パルス活性化処理後４０時間の
核移植胚をリンゲル液（３７℃）に移し、ピペッティン
グ等を行いよく馴染ませた後、０．５％アルギン酸ナト
リウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなるべ
く胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの１１０ｍＭ
塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し、固まった胚入り
のアルギン酸ナトリウムを吸引し、次に１．５％アルギ
ン酸ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてか
らなるべく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの１
１０ｍＭ塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し、固まっ
た胚入りのアルギン酸ナトリウムを吸引し、続いて２．
０％アルギン酸ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴
染ませてからなるべく胚を密集させた状態で吸引し、滅
菌済みの１１０ｍＭ塩化カルシウム液にゆっくりと吐出
し固化させた。

【００３１】上記包埋処理は３７℃の温度条件下で行わ
れ、アルギン酸で３重包埋された核移植胚は移植まで培
養液に移しておいた。活性化処理２日後の卵管移植の
際、子宮卵管接合部を皮膚縫合用ナイロン糸で結びアル
ギン酸包埋胚が子宮に落ちないようにし、３日後にアル
ギン酸包埋胚を回収し、その発生状況を確認し、発生が
良好なものを子宮角上端に最終移植した。その結果、包
埋なしで子宮から回収した胚は、明らかに白血球に攻撃
されており、また、卵管、子宮内の膜の運動により胚に
負担がかかり胚の細胞質が飛び出て、透明帯だけ回収と
いうものも多数見られた。一方、３重包埋した胚は、回
収率も１００％に近い値を示し、また発生率（Blast,Mo
rula）も良好な値（約２０％）を示した。

【００３２】実施例２−２［仮親への胚移植］実施例２−１で得られたアルギン酸３重包埋胚を仮親へ
の胚移植に用いた。外科的胚移植７日前に妊娠豚２頭に
対して、クロプロステノール２ｍｌを臀部に注射して流
産させた。外科的胚移植６日前に妊娠雌豚に対して、ク
ロプロステノール２ｍｌとＰＭＳＧ１５００ＩＵを臀部
に注射し、注射の７２時間後、ｈＣＧ５００ＩＵを臀部
に注射した。２頭のうち１頭はｈＣＧ投与してから２４
時間後に人工授精し、外科的胚移植を行う前に受精卵を
回収し、この回収した受精卵４〜５個をアルギン酸３重
包埋核移植胚に混合して、２頭のうちの他の雌豚の卵管
に移植した。

【００３３】

【発明の効果】本発明によると、異種移植の問題を解決
する手段として、また、良質な食肉生産点からも重要で
あるクローン豚を作出することができる。そして、本発
明のクローン豚の作出技術と遺伝子組換え技術とを組み
合わせることにより、ヒトへの異種移植のためのドナー
の供給が可能となり、また、選択された表現型をもつ豚
をクローン技術により増産することにより食肉生産が可
能となる。

フロントページの続き (72)発明者岩元正樹茨城県土浦市荒川沖235−１エクセル武井203 (72)発明者三松淳茨城県土浦市霞ヶ丘10−30 Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA80 CA01 DA02 GA11 HA01 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA01 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】採取した豚の卵子から除核し、該除核さ
れた卵子に豚の体細胞核を注入し、該体細胞核が注入さ
れた卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚
を雌豚の卵管又は子宮に移植することを特徴とする体細
胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法。
【請求項２】豚の卵子が豚の体内成熟卵子であること
を特徴とする請求項１記載の体細胞核直接注入法による
クローン豚の作出方法。
【請求項３】サイトカラシンＢ処理を施した豚の卵子
から除核することを特徴とする請求項１又は２記載の体
細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法。
【請求項４】体細胞核が胎児線維芽細胞核であること
を特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の体細胞核直
接注入法によるクローン豚の作出方法。
【請求項５】体細胞核が細胞周期Ｇ₀期に同調させた
体細胞から得られる核であることを特徴とする請求項１
〜４のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクロー
ン豚の作出方法。
【請求項６】活性化処理が電気パルス活性化処理であ
ることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の体細
胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法。
【請求項７】活性化処理後の核移植胚を包埋材で包埋
することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の体
細胞核直接注入法によるクローン豚の作出方法。
【請求項８】包埋材がアルギン酸であることを特徴と
する請求項７記載の体細胞核直接注入法によるクローン
豚の作出方法。
【請求項９】雌豚が妊娠豚の流産処理後の雌豚である
ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の体細胞
核直接注入法によるクローン豚の作出方法。
【請求項１０】核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植
するに際し、複数個の受精卵を前記核移植胚に混合して
雌豚の卵管又は子宮に移植することを特徴とする請求項
１〜９のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクロ
ーン豚の作出方法。