JP4036608B2 - クローン非ヒト動物の作出方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法、詳しくは、除核された非ヒト動物の卵子に当該非ヒト動物の体細胞核を注入する体細胞核直接注入法により、クローン豚をはじめとするクローン非ヒト動物を効率よく作出する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
哺乳類の体細胞からのクローン動物の作出は困難と考えられていたが、1996年にCampbellらのグループは羊の胚由来の培養細胞(継代6〜13代)を血清飢餓状態にして細胞周期をG0期とし、この細胞の核を移植することにより産仔の獲得に成功し、ほぼ無限に増やせる培養細胞でもクローン個体を作出することができることを示した(Nature,380,64-66,1996) 。1997年、Wilmutらは同様な手法を用いて、培養した乳腺細胞及び線維芽細胞を血清飢餓状態にし、一例ではあるがクローン羊ドーリーの作出を報告した(Nature,385,810-813,1997) 。クローン羊ドーリーの作出法は、除核した羊の卵母細胞と雌羊由来の細胞を電気的に融合することにより核移植するものであるが、かかる細胞融合による核移植では、ドナー細胞の核だけでなく、その細胞質までも卵子に導入されることが避けられないといわれている。その他、細胞融合による核移植に関しては、乳より分離した乳腺由来の細胞をG0期に同調した後、電気的融合効率を高めるため30〜120分間トリプシン処理を行い、かかる細胞を用いて核移植するクローン牛の作出方法が知られている(特開平11−341935号公報)。
【0003】
また、体細胞核を除核卵母細胞に直接注入するクローン動物の作出については、若山らがクローンマウスの作出方法について報告している(Nature,394,369-374,1998)。このクローンマウスの作出方法は、未受精卵の透明帯に穴を開けてピペットを差し込み、分裂中期の染色体を除去した除核卵母細胞に、過排卵を誘発したマウスから採取した卵丘細胞、セルトリ細胞、神経細胞由来の核を細胞膜を破って直接注入(インジェクション)し、ストロンチウムで活性化処理した後、サイトカラシンBで極体の放出を抑制しながら偽前核を形成させ、この胚を培養した後、偽妊娠雌マウスの子宮に移植する方法である。
【0004】
豚の心臓や膵臓等の臓器はその大きさからしてヒトの臓器と交換可能性がきわめて高く、クローン豚の作出は異種移植の問題を解決する手段として、また、良質な食肉生産点からも期待されていたが、少なくとも4匹の受精卵が子宮に存しないと妊娠に失敗することから、活力ある数個の胚を用いる必要があること、豚胚は極めて脆く核移植など取扱中に壊れやすいことなど、クローン豚作出上の特有の問題があり、多くの研究者がチャレンジしたがうまくいかなかった。しかし最近、スコットランドのPPL Therapeutics社のAlan Colmanらは成体細胞からの細胞融合による核移植でクローン豚を作出していたことを報告(Nature,407,505-509,2000)し、また本発明者らによっても体細胞核直接導入法によるクローン豚の作出についての報告(Science,289,1118-1119,2000)がなされている。
【0005】
ところで、動物の卵子が受精して受精卵が生じ、この受精卵が分裂して発生していく段階の個体は胚(embryyo)と呼ばれているが、かかる胚のアルギン酸や寒天等による包埋技術についても知られている。例えば、CB6F1マウス及びゴールデンシリアンハムスターを用いて、インビトロにおける胚卵割率、着床率、生児出生率に関し、齧歯目胚のアルギン酸ナトリウムカプセル化の影響及びインビボにおけるカプセルの分解速度を調べ、3.0%アルギン酸ナトリウムによる齧歯目動物胚のカプセル化は、胚の発達、着床率、又は生存率に対して悪影響を与えないことや、挿入後48時間以内に分解するので、インビトロにおけるヒトの受精及び胚着床に有用であることが報告されている(FERTILITY AND STERILITY,59,652-656,1993)。
【0006】
ヤギ幼胚の二分割胚の凍結保存における寒天の影響を調べ、二分割胚を寒天で固定したもの又は固定しないものの両方を凍結保存し、解凍後、損傷のないもの及び一部損傷のあるものをレシピエントの子宮に移植したところ、前者では解凍後も損傷を受けていないものが50%の割合で得られたが、後者では解凍後も損傷を受けていないものが5%であったことが報告されている(THERIOGENOLOGY,28,317-322)。ホルスタイン雌牛の二分割胚の凍結解凍時におけるポリリジン/アルギン酸膜の包埋効果について調べ、二分割胚をポリリジン/アルギン酸膜で包埋すると、対照に比べて高い形態学上のスコアを示すことが報告されている(THERIOGENOLOGY,29,262,1988)。
【0007】
ウサギ胚の凍結を成功させるためには、凍結融解に際しての透明帯の割断損傷を回避することが不可欠であるとし、凍結融解によって生じる非細胞性成分(透明帯及びムチン被膜)の損傷及びインビボとインビトロにおける融解後の胚の生存性に関し、アルギン酸カルシウムゲル封入の保護効果について調べ、2%アルギン酸ナトリウムを含むリンガー液に浸したウサギ桑実胚を110mMの塩化カルシウム溶液の中に投入することにより得られたアルギン酸カルシウムゲル封入胚は対照に比べて、胚の非細胞性成分(透明帯及びムチン被膜)の損傷の発生が減少し、またアルギン酸カルシウムゲルから解放された凍結融解胚の生存率が向上し、凍結前にウサギ胚をアルギン酸ゲルに封入することにより融解後の移植できる胚の比率が改善されることが報告されている(THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL ZOOLOGY,254,186-191,1990)。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
クローン非ヒト動物、特にクローン豚の作出は異種移植の問題を解決する手段として、また、良質な食肉生産点からも重要である。すなわち、クローン豚作出技術と遺伝子組換え技術とを組み合わせることにより、ヒトへの異種移植のためのドナーの供給が可能となり、選択された表現型をもつ豚をクローン技術により増産することは、食肉生産が可能となる。しかし、前記のように、豚胚は極めて脆く核移植など取扱中に壊れやすいことなど、クローン豚作出上の特有の問題があり、効率よくクローン豚を作出する技術は未だ確立されていない現状にある。
【0009】
また、アルギン酸ゲルや寒天を用いた胚の包埋技術は知られているが、これら公知の包埋技術は凍結融解時等の胚の損傷からの保護を目的として行われているものである。これに対して、体細胞核直接注入法は、卵細胞からの除核時及び該除核細胞への体細胞核の直接注入時の2回にわたって、ある意味で胚を積極的に損傷させることから、かかる体細胞核直接注入法における核移植胚の包埋技術については、当然のことながら、現在に至るまで報告されていない。本発明の課題は、除核された非ヒト動物の卵子に当該非ヒト動物の体細胞核を注入する体細胞核直接注入法により、クローン豚をはじめとするクローン非ヒト動物を効率よく作出する方法を提供することにある。
【0010】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、分化した細胞から豚のクローンを作出するための方法について種々調査・検討し、除核した卵子に豚の胎児線維芽細胞核を顕微注入し、電気活性化処理により発生を誘発し、かかる電気パルス活性化処理後のクローン胚を卵管及び子宮に移植する際に、順次濃度を高めたアルギン酸ゲルで3重に包埋し、その後雌豚の卵管に移植したところ、桑実胚、初期胚盤胞、胚盤胞に健全に生育することを見い出し、この健全に生育したアルギン酸3重包埋胚を仮親に移植したところクローン豚が得られることを確認し、本発明を完成するに至った。
【0011】
すなわち本発明は、採取した非ヒト動物の卵子から除核し、該除核された卵子に非ヒト動物の体細胞核を注入し、該体細胞核が注入された核移植胚にアルギン酸を用いて、アルギン酸の濃度を順次高めていく3重包埋処理を施し、該包埋処理が施された核移植胚を雌非ヒト動物の卵管又は子宮に移植することを特徴とする体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法(請求項1)や、体細胞核が注入された卵子に活性化処理を施した核移植胚に3重包埋処理を施すことを特徴とする請求項1記載の体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法(請求項2)や、3重包埋処理が、1重目がアルギン酸濃度0.5%、2重目がアルギン酸濃度1.5%、3重目がアルギン酸濃度2.0%でのアルギン酸の濃度を順次高めていく3重包埋処理であることを特徴とする請求項1又は2記載の体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法(請求項3)や、非ヒト動物が豚であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法(請求項4)に関する。
【0012】
【発明の実施の形態】
本発明の体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法としては、採取した非ヒト動物の卵子から除核し、該除核された卵子に非ヒト動物の体細胞核を注入し、該体細胞核が注入された核移植胚に包埋剤を用いて包埋処理を施し、該包埋処理が施された核移植胚を雌非ヒト動物の卵管又は子宮に移植する方法であれば特に制限されるものではなく、ここで、体細胞核直接注入法とは、体細胞の核を除核細胞に直接注入(インジェクション)する方法をいい、かかる体細胞核直接注入法には、例えば、プライムテック株式会社製のPMM三次元マイクロマニピュレーションシステム「EMM−715OUD」を用いることができる。
【0013】
本発明における非ヒト動物としては、豚、山羊、羊、ウサギ、ウシ、ウマ、ラット、マウス、ニワトリ等を具体的に例示することができるが、前記のように、豚の胚は極めて脆く、核移植など取扱中に壊れる可能性が大きいことから、本発明の体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法は、特にクローン豚の作出に好適である。以下、非ヒト動物が豚の場合を例にとって、本発明の体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法について説明するが、本発明のクローン非ヒト動物の作出方法はクローン豚の作出方法に限定されるものではない。
【0014】
レシピエント卵子としては、豚の成熟卵子であれば特に制限されるものではなく、プロスタグランジンF2α、クロプロステノール、絨毛ゴナドトロピン等のホルモン投与による過排卵処理により得られる体内成熟卵子の他、屠場由来の卵巣から採取した卵子を体外成熟させたものも使用できるが、着床率の点からして体内成熟卵子、特に性成熟(6ヶ月齢以上)した雌豚から採取した体内成熟卵子が好ましい。かかる体内成熟卵子は、過排卵処理により得られる雌豚の子宮及び卵巣をPBS溶液等を用いて卵管灌流を行うことにより採取することができるが、卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好ましい。
【0015】
上記豚のレシピエント卵子からの除核は、細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンB処理を施した豚の卵子から除核することが好ましく、より具体的にはサイトカラシンBを含有するNCSU23等の培地で体外成熟卵子等のレシピエント卵子を処理した後、除核操作用シャーレのサイトカラシン入りドロップに移してホールディングピペットで保定し、透明帯を迅速・的確に貫通することができる除核用ピペット(外径25〜30μm)を用いて、M(metaphase)II期の染色体を含む第一極体の付近を極体ごと吸引することにより行われる。なお、吸引した極体を調べることにより除核できていることを確認することが好ましく、また除核卵子からはサイトカラシンBを除去することが好ましい。
【0016】
体細胞核としては、豚体細胞に由来する核であれば特に制限されるものではないが、例えば胎児線維芽細胞核を好適に例示することができる。特にレシピエントや仮親と毛色の異なる品種の豚をドナーとすることが、毛色からクローン豚であるかどうかを簡便に判定する上で好ましい。また、核移植に用いるドナー細胞の細胞周期は特に制限されるものではないが、細胞周期G0/G01期に同調させた体細胞が好ましい。細胞周期G0/G01期に同調させた体細胞は、例えばコンフルエントな状態で培養液の交換なしに、体細胞を16日間前後培養し続けることによって得ることができる。線維芽細胞を用いる場合、トリプシン処理で細胞を分散させたものが好ましく、また、培養細胞が線維芽細胞であることを、サイトケラチンとSSEA−1との陰性反応、ビメンチンでの陽性反応、線維芽細胞の特異的プライマーによるPCR分析等により確認することが好ましい。
【0017】
上記体細胞核の除核されたレシピエント卵母細胞への直接注入は、体細胞の細胞膜を崩壊させて実質的に体細胞核からなる画分を注入することがドナー細胞質の影響を排除して核移植胚の発生を良好にする点で好ましい。これに対して融合法による核の注入は細胞質を伴って注入することになるので、細胞質による汚染に対して敏感である豚のクローン作出においては好ましくない。また、体細胞核のインジェクションピペットとしては、透明帯の貫通が迅速・精確かつ簡単にでき、細胞質膜へのダメージを最小にすることができるものが好ましく、かかるインジェクションピペットとしてはピエゾマイクロマニピュレーター(プライムテック株式会社製)に取り付けた体細胞注入用ピペット(外径7〜12μm)を具体的に例示することができる。
【0018】
上記のようにして得られた体細胞核が注入された卵子には、包埋処理に先立って、活性化処理を施すことが好ましい。かかる活性化処理としては、従来公知の核移植胚の活性化処理方法であれば特に制限されるものではないが、クローン豚の作出においては電気パルス活性化処理を好適に例示することができる。電気パルス活性化処理としては、電荷の大きい1回の電気パルス、例えば1.5kV/cm、100μsec、1回を印可する方がそれより小さい電荷の電気パルスを2回印可するよりも胚活性の点で好ましく、また、電気パルス活性化処理における培地としてはNCSU23(J.Reprod.Fertil.Suppl.,48,61,1993)を用いることが高い胚盤胞形成率の点で好ましい。また、電気パルスによる活性化処理の場合、体内成熟卵子の方が体外成熟卵子に比べて胚盤胞の発生能の点で好ましい。さらに、レシピエント細胞として体内成熟卵子を用いる場合には、過排卵処理のために使用した最初のhCG投与後、50〜60時間後、好ましくは54〜55時間後に活性化処理をすることが望ましい。
【0019】
卵細胞からの除核時及び該除核細胞への体細胞核の直接注入時の2回にわたって損傷を受けた核移植胚の胚盤胞への発生率を高め、クローン豚を効率よく作出するために、活性化処理後の核移植胚は、卵管又は子宮への移植前に、包埋剤により包埋処理が施される。かかる包埋剤による包埋処理は、複数回の包埋処理を行い、複数被膜で包埋した核移植胚とすることが好ましく、特に3重包埋処理を行い、3重被膜核移植胚とすることが好ましい。また、かかる複数回の包埋処理を行うに際しては、包埋剤の濃度を順次高めていく包埋処理、すなわち外層膜ほど高濃度の包埋剤を用いて包埋し、その物理的強度を内層から外層へと順次高めていくことが好ましい。
【0020】
包埋処理に用いられる包埋剤としては、核移植胚を包埋することにより、2回にわたって損傷を受けた核移植胚の桑実胚や胚盤胞への発生率を高め、クローン豚を効率よく作出することができるものであれば特に制限されるものではないが、損傷を受けた透明帯の修復・保護機能を有するものや、包埋処理後の核移植胚を卵管及び子宮に移植した後、生体内での分解機能を有するものや、卵管及び子宮の膜運動による損耗からの保護機能を有するものや、白血球の攻撃からの防御機能を有するものや、包埋皮膜を通しての栄養分の透過・排泄物の排出機能を有するものの他、包埋処理時に核移植胚に影響を与えることなく包埋処理することができるものや、顕微鏡下で包埋皮膜が確認しやすいものや、顕微鏡下で包埋胚の操作がし易くなるものなどが好ましい。かかる包埋剤としては、アルギン酸、寒天等の天然多糖類の他、ムコタンパク質、ポリアミノ酸などの蛋白質、生分解性有機高分子等を例示することができるが、上記包埋剤としての好ましい機能を備えたアルギン酸が特に好ましい。その他、包埋剤の使用濃度についても特に制限されるものではないが、上記包埋剤としての好ましい機能を十分発揮しうる濃度が好ましい。なお、複数回の包埋処理を行う場合、例えばアルギン酸と寒天等、包埋剤の種類を変えて包埋処理をすることもできる。
【0021】
例えば、アルギン酸を包埋剤として3重包埋処理する方法としては、アルギン酸ナトリウムを所定濃度(例えば0.5%、1.5%、2.0%)となるようにリンゲル液等に溶解し、あらかじめ滅菌しておき、この滅菌済みのアルギン酸ナトリウム溶液(例えば0.5%)に核移植胚を浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル包埋胚とした後、この包埋胚を前記アルギン酸ナトリウム溶液よりも高濃度のアルギン酸ナトリウム溶液(例えば1.5%)に浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル2重包埋胚とし、次いでこの2重包埋胚を上記アルギン酸ナトリウム溶液よりも高濃度のアルギン酸ナトリウム溶液(例えば2.0%)に浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル3重包埋核移植胚とする方法を具体的に示すことができる。
【0022】
活性化処理後に包埋剤による包埋処理をした核移植胚を卵管又は子宮に移植する雌豚としては特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊娠21〜40日目にプロスタグランジンF2α等を用いて人工流産させ、同期化を行った雌豚を用いることが好ましい。また、核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植するに際し、複数個の受精卵を核移植胚に混合して雌豚の卵管又は子宮に移植する追い移植法を用いることが好ましい。
【0023】
また産仔した豚ドナー体細胞核由来のクローンであることの確認は、産仔の毛色の他、クローン豚、クローン豚の仮親の耳から採取したDNA並びにクローン豚を作出するために用いた線維芽細胞等の体細胞のDNAを採取し、豚のための特異的なマーカーでマイクロサテライト分析を行い、クローン豚が体細胞と同一の遺伝子をもち、仮親と異なる遺伝子をもつことを確認することにより同定することができる。
【0024】
【実施例】
以下、本発明を実施例等により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例等によって限定されるものではない。
実施例1(クローン豚の作出)
実施例1−1[体内成熟卵子の採取]
卵子はランドレース(白色)の雌、又はランドレース×大ヨークシャー×デュロックの三元交雑腫(黒斑を有する白色)の雌から採取した。成熟卵子は性成熟(6ヶ月齢以上)又は未成熟の雌豚から採取した。性成熟豚の排卵処理は以下のようにして行った。人工授精から21〜40日後の性成熟豚に、まずプロスタグランジンF2αのアナログである(+)-クロプロステノール(住友化学社製「Planate」)0.2mgを筋肉内に注射して流産させた。筋肉内注射の24時間後に、クロプロステノール0.2mgとウマ絨毛ゴナドトロピン(eCG)1500単位を共に筋肉内に注射した。eCGを注射してから72時間後にヒト絨毛ゴナドトロピン(hCG)500単位を筋肉内に注射することにより過排卵処理を行った。一方、未性成熟雌豚の排卵処理は以下のようにして行った。1500単位のeCGのみを筋肉内に注射し、その72時間後に500単位のhCGを筋肉内に注射することにより過排卵処理を行った。これら過排卵処理を行った雌豚は、hCGを投与してから45時間後に屠殺し、子宮及び卵巣を採取した。0.1%BSAを加えたカルシウム、マグネシウムを含まないダルベッコのPBS溶液を用いて卵管灌流を行って体内成熟卵子を採取した。卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去した。採取した体内成熟卵子は培養液(NCSU23)で38.5℃、5%CO2インキュベーターで核移植操作まで培養した。
【0025】
実施例1−2[除核操作]
上記実施例1−1で得られたレシピエント卵子(体外成熟卵子)を、5μgサイトカラシンB/1ml培養液(NCSU23)に入れて15分以上処理した後、核移植(除核操作)用シャーレのサイトカラシン入りドロップに卵子を移し、第一極体の位置が12時、3時、6時のいずれかにくるようにホールディングピペットで保定し、ピエゾマイクロマニピュレーター(プライムテック株式会社製)に取り付けた除核用ピペット(外径25〜30μm)を用いて透明帯を迅速に貫通することにより、M(metaphase)II期の染色体を含む第一極体の付近を極体ごと細胞質の1/4〜1/3程吸引した。除核処理は、室温下でサイトカラシンBが5μg/ml入りNCSU23培養液中で10〜15個ずつの卵子を処理した。吸引した極体と細胞質を別の5μgヘキスト33342/1ml培養液(NCSU23)のドロップに移し、15分後にUVによる蛍光顕微鏡観察を行い、除核できていることを確認した。除核ができた卵子は、直ちにサイトカラシンBの含まれていない培養液NCSU23で丁寧に洗浄し、サイトカラシンを除核卵子から除去し、38.5℃、CO2インキュベーターに戻して培養した。
【0026】
実施例1−3[胎児線維芽細胞の分離]
梅山豚雌の発情周期を把握した上で人工授精し、妊娠24日目の梅山豚×梅山豚(黒色)を屠殺して子宮より一匹の胎児を採取し、頭部と内臓を除去した後、細切し、トリプシン処理で細胞を分散させた後、3時間4℃下で0.25%トリプシンと1mMのEDTAを含むPBS溶液で培養した後、10%FCSを含むDMEMで洗浄して初代培養細胞を得た。細胞培養は10%FCS入りのDMEMで行い、細胞が飽和状態になる度に2〜6回の植え継ぎを行い、高密度に細胞をまくことにより安定をはかった(参考写真1参照)。核移植に用いたドナー細胞としては、飽和状態で培養液の交換なしに16日間培養し続けることによってG0期になったものを用いた。培養細胞は、3日後ではPCNAで陽性反応を示すが、10日後には免疫反応がなくなるので16日目にはG0期になったことが証明された。かかる培養細胞が線維芽細胞であることは、培養細胞がサイトケラチンとSSEA−1で陰性反応を示し、ビメンチンで強い陽性反応を示すことにより確認し、胎児の雌雄判別は線維芽細胞の特異的ZFY/SRYプライマーによるPCR分析によって行った。また、それぞれの培養細胞の核型が正常であることはG染色で確認した。
【0027】
実施例1−4[胎児線維芽細胞の準備]
核移植予定日(16日前)に合わせて、新しい培養液(10%FCS入りDMEM)に植え継ぎ、37℃、5%CO2で培養し、放置した。核移植直前に、ドナー体細胞である休止状態の胎児線維芽細胞をPBSで洗浄し、次いで0.25%トリプシンを用いて細胞を浮遊させた(参考写真2参照)後、トリプシンを10%FCS入りDMEMで不活化し、遠心後(1000rpm,5min)、上清を除き核移植に用いる培養液(NCSU23)に再浮遊させ、核移植(体細胞核注入)用シャーレのドロップに適量体細胞を浮遊させておいた。
【0028】
実施例1−5[体細胞核の注入]
実施例1−2の除核処理を行った卵子を、胎児線維芽細胞が浮遊したシャーレの1つのドロップに10〜15個ずつ入れて体細胞核注入操作を行った。ピエゾマイクロマニピュレーター(プライムテック株式会社製)に取り付けた体細胞注入用ピペット(外径7〜12μm)により、浮遊している体細胞を丁寧に数回ピペッティングすることにより細胞膜を崩壊させて実質的に体細胞核からなる画分を、除核操作による卵子の透明帯の穴に注意しながらホールディングピペットにより保定された除核卵子の細胞質内に注入した。ピエゾマイクロマニピュレーターは、透明帯の貫通が簡単にでき、細胞質膜へのダメージを最小にすることができた。また、マニピュレーションの間、インジェクションピペットは、15%PVPを含むNCSU23培養液のドロップでまめに洗浄した。注入後、予め準備しておいた培養用ドロップ(NCSU23)に移し、次の活性化処理までの3〜4時間、インキュベーター(38.5℃、5%CO2)で培養しておいた。
【0029】
実施例1−6[電気パルス活性化処理]
上記体細胞核が注入された卵子をNCSU23で培養し、hCG投与54〜55時間後に電気パルス活性化処理をSSH−2融合装置(shimadzu社製)を用いて行った。まず、室温放置した電解質溶液(0.01%のBSA、0.05mMのCaCl2、0.1mMのMgSO4添加0.28Mマンニトール溶液)の入ったシャーレを2枚と2mm幅ステンレスワイヤー電極のチャンバーを用意し、1枚目のシャーレの電解質溶液に卵子を浸して馴染ませ、さらに2枚目の電解質溶液入りのシャーレに移して馴染ませた。卵子が電解質溶液に馴染んだ後、2mm幅ステンレスワイヤー電極のチャンバーに卵子を並べ、電気パルスによる活性化処理を表1記載の条件で実施した。電気パルスによる活性化処理後、極体の放出防止のため活性化した胚を細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンBに浸した。すなわち、5μg/mlサイトカラシンBを含むNCSU23で2時間培養を行い、第二極体放出の抑制処理を行った。次に、サイトカラシンBを含まないNCSU23で丁寧に洗浄し、発生培養用ドロップ(NCSU23)で活性後40時間培養した。電気パルスによる活性化処理後、NCSU23培地に代えて、BECM3培地(Biol.Reprod.,55,1069,1996)及びmWM培地(J.Anim.Sci.,71,1561,1993)を用いてそれぞれ同様に活性化した胚を培養した。電気パルス活性化処理後の卵母細胞の生存率の結果を表1に示す。
【0030】
【表1】
【0031】
表1からわかるように、電荷の大きい1回の電気パルスを印可した場合、それより小さい電荷の電気パルスを2回印可した場合よりも良好な胚活性を示し、さらに、培養液の違いによる発生の影響では、NCSU23を用いた場合に最も高い胚盤胞形成率が得られた。これらの結果から、クローン作出には、1.5kV/cm、100μsec、1回の電気パルスを活性化条件とし、NCSU23で培養することにした。またこれと同条件で、体内成熟卵子と体外成熟卵子の発生能を比較した。167個の体外成熟卵子を活性化した結果、48時間までに116個が分割したが、胚盤胞にまで至ったのはわずかに4個(2.4%)だけであった。この値2.4%は、表1に示される対応する体内成熟卵子の値(31.2%)より有意に低かった。以上の実験結果から、体内成熟卵子をクローン作出に用いることとした。
【0032】
実施例1−7[アルギン酸3重包埋法]
上記実施例1−6で得られた電気パルス活性化処理後のクローン胚に、以下のようにアルギン酸3重包埋法を適用した。まず、アルギン酸ナトリウムを所定濃度(0.5%、1.5%、2.0%)となるようにリンゲル液に溶かしてオートクレーブ滅菌し、包埋液を調製した。電気パルス活性化処理後40時間の核移植胚を滅菌済みリンゲル液(37℃)に移し、ピペッティング等を行いよく馴染ませた後、0.5%アルギン酸ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの110mM塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し、固まった胚入りのアルギン酸ナトリウムを吸引し、次に1.5%アルギン酸ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの110mM塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し、固まった胚入りのアルギン酸ナトリウムを吸引し、続いて2.0%アルギン酸ナトリウムを含む包埋液に移し、よく馴染ませてからなるべく胚を密集させた状態で吸引し、滅菌済みの110mM塩化カルシウム液にゆっくりと吐出し固化させた。
【0033】
上記包埋処理は37℃の温度条件下で行われ、アルギン酸で3重包埋された核移植胚は移植まで培養液に移しておいた。活性化処理2日後のアルギン酸包埋胚又は対照としての未包埋胚をそれぞれ卵管に移植した。その際、子宮卵管接合部を皮膚縫合用ナイロン糸で結びアルギン酸包埋胚が子宮に落ちないようにし、移植3日後にアルギン酸包埋胚を回収し、その発生状況を観察した。その結果、包埋なしで子宮から回収した対照区の胚は、細胞質が黒色に変色したものや、白血球等に攻撃されて崩壊したものや、また、卵管、子宮内の膜の運動により胚に負担がかかり胚の細胞質が飛び出て、透明帯だけ回収というものが多数見られた(図1;参考写真3参照)。一方、3重包埋した胚は、健全に生育した胚盤胞や桑実胚が数多く見受けられ(図2;参考写真4参照)、回収率も87%と高い値を示し、また発生率(Blast,Morula)も良好な値(約23%)を示した。なお、これら包埋後の回収実験は、0.5%のアルギン酸ナトリウムを用いた1重包埋胚についても、0.5%と2.0%のアルギン酸ナトリウムを用いた2重包埋胚についても、上記3重包埋胚と同様に行った。これらの結果を表2に示す。表2中、M(morula)は桑実胚を、E−B(early blastocyst)は初期胚盤胞を、B(blastocyst)は胚盤胞を、H−B(hatching blastocyst)は孵化胚盤胞をそれぞれ示す。
【0034】
【表2】
【0035】
実施例1−8[仮親への胚移植]
実施例1−7で得られたアルギン酸3重包埋胚のうち、発生が良好なものを仮親の子宮角上端に最終移植した。外科的胚最終移植10日前に妊娠豚2頭に対して、クロプロステノール2mlを臀部に注射して流産させた。外科的胚移植6日前に妊娠雌豚に対して、クロプロステノール2mlとPMSG1500IUを臀部に注射し、注射の72時間後、hCG500IUを臀部に注射した。2頭のうち1頭はhCG投与してから24時間後に人工授精し、外科的胚移植を行う前に受精卵を回収し、この回収した受精卵4〜5個をアルギン酸3重包埋核移植胚に混合して、2頭のうちの他の雌豚の子宮角上端に移植した。これらアルギン酸3重包埋核移植胚の1つから黒色の毛色をもつ子豚が自然分娩で産まれた。生誕時の子豚の体重は1.2kg、胎盤重量は0.3kgであり、両値とも通常の子豚の正常な値の範囲内であった。また、いくつかのクローン牛の例では胎盤異常が現れ、顕微注入法によるクローンマウスでは通常マウスより胎盤が大きくなるという報告があったが、この子豚に付いていた胎盤は、外見上ばかりでなく解剖学的にも正常であった。
【0036】
【発明の効果】
本発明によると、異種移植の問題を解決する手段として、また、良質な食肉生産性の点からも重要であるクローン非ヒト動物、特にクローン豚を効率よく作出することが可能となる。そして、本発明の非ヒト動物の作出技術と遺伝子組換え技術とを組み合わせることにより、ヒトへの異種移植のためのドナーの供給が可能となり、また、選択された表現型をもつ豚等の非ヒト動物をクローン技術により増産することにより食肉生産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】子宮から回収した比較例のアルギン酸未包埋胚の顕微鏡写真を示す図である。
【図2】子宮から回収した本発明のアルギン酸3重包埋胚の顕微鏡写真を示す図である。
Claims (4)
- 採取した非ヒト動物の卵子から除核し、該除核された卵子に非ヒト動物の体細胞核を注入し、該体細胞核が注入された核移植胚にアルギン酸を用いて、アルギン酸の濃度を順次高めていく3重包埋処理を施し、該包埋処理が施された核移植胚を雌非ヒト動物の卵管又は子宮に移植することを特徴とする体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法。
- 体細胞核が注入された卵子に活性化処理を施した核移植胚に3重包埋処理を施すことを特徴とする請求項1記載の体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法。
- 3重包埋処理が、1重目がアルギン酸濃度0.5%、2重目がアルギン酸濃度1.5%、3重目がアルギン酸濃度2.0%でのアルギン酸の濃度を順次高めていく3重包埋処理であることを特徴とする請求項1又は2記載の体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法。
- 非ヒト動物が豚であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の体細胞核直接注入法によるクローン非ヒト動物の作出方法。
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