JP5439677B2 - 透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製するための方法及び培地、該方法により調製された哺乳動物卵を用いた受精方法 - Google Patents
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Description
本発明は、体外受精や遺伝子改変動物の作製に用いることができる技術に関する。特には、本発明は、哺乳動物の未受精卵、受精卵、又は発生初期胚を処置する方法、及びそのために用いることができる培地に関する。
受精に際しては、卵子の近傍に到来した精子は、卵透明帯に接触すると先体反応が生じ、頭部の先端にある先体が変化してヒアルロニダーゼ、アクロシン等の溶解酵素が放出され、これらの働きにより精子は透明帯を通過し、内部に存在する卵細胞に到達し、受精に到る。しかし、形成異常を起こした精子や凍結保存した精子では、受精能が低下しており、卵子と精子を混ぜ合わせるだけの通常の体外受精では受精卵の作製が困難である。そのため、哺乳動物の体外受精においては、受精率を高めるための様々な工夫が成されている。
現在，遺伝子の機能解析及びそれに関連した研究開発が、国家プロジェクトとして世界中で盛んに行われつつあるが、その中で重要な役割を果たしているのが遺伝子改変（Ｔｇ（Transgenic）及びＫＯ（Knock Out））マウスである。ＫＯマウスが次々と作られることから、今後、その数は、１００万種を超えるものと考えられており、その系統維持には天文学的な数のマウスを飼育しなければならならず、これらマウスの維持管理が，世界中の実験動物施設においてきわめて深刻な問題になっている。そこで注目を集めているのが凍結精子によるこれらマウスの保存であるが、特に、実験動物として汎用されているＣ５７ＢＬ／６系統マウスの精子は、凍結処理及び融解処理により損傷をうけ活力を低下し、透明帯を通過する力を欠いているものが多く、受精率が低い。
近年、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス精子の改善された凍結法が報告されているが（非特許文献１）、操作が煩雑であることから、安定した高い受精率を得ることは難しく、一般には、せいぜい１０〜２０％の受精率しか得られないのが現状である。
さらに、体外受精において、新鮮な卵子の使用が困難な場合には、凍結保存された卵子を用いることが行われているが、凍結融解により、透明帯が固くなり、凍結融解卵子を用いた場合には、新鮮な精子であっても、受精率が低下するという問題がある。
かかる状況下において、現在、受精能が低下した精子を用いた体外受精、或いは凍結保存した卵子を用いた体外受精において、効率的に受精卵を作製するために、以下のような生殖補助技術が利用されている。
さらに、体外受精において、新鮮な卵子の使用が困難な場合には、凍結保存された卵子を用いることが行われているが、凍結融解により、透明帯が固くなり、凍結融解卵子を用いた場合には、新鮮な精子であっても、受精率が低下するという問題がある。
かかる状況下において、現在、受精能が低下した精子を用いた体外受精、或いは凍結保存した卵子を用いた体外受精において、効率的に受精卵を作製するために、以下のような生殖補助技術が利用されている。
比較的運動能が維持されている精子に対しては、透明帯部分切開法（ＰＺＤ：Partial Zona-Pellucida Dissection（非特許文献２）；ＺＩＰ：Partial Zona-Pellucida Incision by Piezo-micromanipulator（非特許文献３））やレーザー透明帯穿孔法（特許文献１）が利用されている。透明帯部分切開法は、注射針の先端（ＰＺＤ）やピエゾマイクロマニュピレーターに接続したガラス毛細管の先端（ＺＩＰ）を用いて、卵子の透明帯をカットする方法であり、レーザー透明帯穿孔法は、レーザーにより卵子の透明帯に穴を空ける方法である。これらの方法により透明帯に作製されたスリットや穴から、精子が卵子内に侵入可能となり、受精率が向上する。
一方、凍結融解後、全く運動性が認められない精子に対しては、一個の精子を卵細胞質に機械的に直接注入する卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ：Intra Cytoplasmic Sperm Injection）（非特許文献４）が一般に用いられている。
しかしながら、これらの方法は、特別な技術や装置が必要となり、汎用性が低いという問題がある。
一方、凍結融解後、全く運動性が認められない精子に対しては、一個の精子を卵細胞質に機械的に直接注入する卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ：Intra Cytoplasmic Sperm Injection）（非特許文献４）が一般に用いられている。
しかしながら、これらの方法は、特別な技術や装置が必要となり、汎用性が低いという問題がある。
透明帯はまた、受精卵（受精胚）を保護する機能も有する。透明帯は、卵子の周囲に存在する膜であり、受精卵は所定の時期までその透明帯で包囲・保護されて発達し、次に透明帯から脱出して着床する。
しかしながら、発生段階において、発生初期胚（胚盤胞期胚）が透明帯を孵化できないために、子宮への着床が障害される場合がある。かかる障害は、排卵誘発剤を用い卵胞を成熟させた時に得られた卵子の透明帯が固くなったり又は厚くなったりする場合の他、透明帯形成異常を有する卵子を用いた場合、凍結保存した卵子を用いて体外受精した場合、或いは受精卵（胚）を凍結保存したのち融解し子宮へ移植した場合に起こりやすい。
しかしながら、発生段階において、発生初期胚（胚盤胞期胚）が透明帯を孵化できないために、子宮への着床が障害される場合がある。かかる障害は、排卵誘発剤を用い卵胞を成熟させた時に得られた卵子の透明帯が固くなったり又は厚くなったりする場合の他、透明帯形成異常を有する卵子を用いた場合、凍結保存した卵子を用いて体外受精した場合、或いは受精卵（胚）を凍結保存したのち融解し子宮へ移植した場合に起こりやすい。
体外受精により得られた受精卵が着床しやすいように、子宮へ移植する前に、アシストハッチング法（透明帯開孔法）が利用されている。アシストハッチング法は、注射針やガラス毛細管の先端を利用して機械的に透明帯を切断する透明帯部分切開法（非特許文献２及び３）、レーザーにより透明帯に穴を空ける方法（特許文献１）、酵素により透明帯を溶解させる方法（非特許文献５）がある。
しかしながら、注射針やガラス毛細管の先端を利用する方法やレーザーにより透明帯に穴を空ける方法は、特別な装置と技術が必要となり、汎用性が低いという問題がある。酵素による方法は、胚へのダメージにより発生能が低下するという問題がある。
しかしながら、注射針やガラス毛細管の先端を利用する方法やレーザーにより透明帯に穴を空ける方法は、特別な装置と技術が必要となり、汎用性が低いという問題がある。酵素による方法は、胚へのダメージにより発生能が低下するという問題がある。
遺伝子改変動物、例えば遺伝子改変マウス（ノックアウトマウス）は、概ね、以下の手順で作製される。まず、ターゲッティングベクター（組換えＤＮＡ）を調製した後、エレクトロポレーション法などにより、そのターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入する。そして、相同的遺伝子組換えの起こったＥＳ細胞株を選別する。次に、胚盤胞期の受精卵にできる腔にマイクロマニュピレーターを用いてＥＳ細胞を注入し、キメラ胚を作製し、そのキメラ胚を偽妊娠マウスの子宮に移植する方法（インジェクションキメラ作製法）や、透明帯を除去した発生初期胚（例えば、８細胞期胚）を作製し、それにＥＳ細胞を加えて集合塊を作り、胚盤胞期まで培養して偽妊娠マウスの子宮に移植する方法（集合キメラ法）によりキメラを作製する。そして産仔（キメラマウス）を得る。次に、作製したキメラマウスと野生型マウスを交配し、生殖細胞が組換えＥＳ細胞由来の細胞により形成されているかどうかを確認する。そして、生殖細胞が組換えＥＳ細胞由来の細胞により形成されていることが確認されたマウス同士を交配し、得られた産仔の中からノックアウトマウスを選別する。
上記方法で用いられるマイクロマニュピレーター法は、特殊な装置と技術が必要となる。一方、集合キメラ法においては、発生初期胚の透明帯の除去が必要であるが、透明帯の除去には、酸性タイロード液（ｐＨ２）が利用されている（特許文献２）。酸性タイロード液を用いた場合は、酸性タイロード液自身が、細胞毒性が高いこと、そして、操作中にタンパク質フリーの条件で使用する必要があり、ディッシュ或いはガラスキャピラリーに発生初期胚が接着することにより、操作性が極めて低いという問題がある。
上記生殖補助技術の他にも、受精率を上げるために精子をシクロデキストリン誘導体並びにアミノ酸及び／又は解糖系中間体物質を含有する培地で精子を前培養する方法（特許文献３）、凍結融解精子を用いた場合に発生する過酸化水素による受精率の低下を防ぐために、還元型グルタチオン含有培地で前培養した精子に未受精卵を添加し、そして還元型グルタチオン存在下で受精する方法（非特許文献６）、ヒトの体外受精において妊娠効率を上げるための連続的培養系及びプロセス（特許文献４）など、培地や培養方法に関するものが提案されている。
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Bath, M.L. (2010) Inhibition of In Vitro Fertilizing Capacity of Cryopreserved Mouse Sperm by Factors Released by Damaged Sperm, and Stimulation by Gultathione., PLOS ONE, Vol. 5, Issue 2, e9387.
体外受精においては、形成異常を有する精子或いは凍結保存した精子のような、低受精能を示す精子では、卵子の透明帯を通過することができず、通常の体外受精では効率的に受精卵を作製することが困難であるため、受精に際し、卵透明帯の菲薄化又は除去が必要となる。また、凍結した卵子を用いた場合にも、透明帯が固くなり、通常の体外受精では効率的に受精卵を作製することが困難であるため、受精に際し、同様な処置が必要となる。
体外受精において、受精卵の作製後は、発生初期胚（胚盤胞胚）が透明帯を孵化できないため、子宮への着床が障害される場合があり、かかる場合は、着床の障害となる透明帯の菲薄化又は除去が必要となる。
さらには、遺伝子改変動物の作製工程においては、透明帯を除去した発生初期胚（例えば、２〜８細胞期胚）を作製する必要がある。
さらには、遺伝子改変動物の作製工程においては、透明帯を除去した発生初期胚（例えば、２〜８細胞期胚）を作製する必要がある。
本発明の目的は、哺乳動物卵又は胚において、受精率や発生率の向上が期待できる方法を提供することである。
また本発明の目的は、哺乳動物卵又は胚（例えば、未受精卵、受精卵又は発生初期胚）の透明帯を菲薄化又は除去する方法、透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵及び／又は胚（例えば、未受精卵、受精卵又は発生初期胚）を調製する方法、及び該方法により調製された透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を提供することである。
本発明の他の目的は、体外受精、受精卵の移植、遺伝子改変動物の作製において利用される発生初期胚の調製、において用いることができる、透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物胚を調製する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、上記調製方法であって、少なくとも特別な技術や装置を要求することがない方法を提供することであり、好ましくは、細胞毒性がなく又は実験操作性を損なうことがない、汎用性がある方法を提供することである。
また本発明の目的は、哺乳動物卵又は胚（例えば、未受精卵、受精卵又は発生初期胚）の透明帯を菲薄化又は除去する方法、透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵及び／又は胚（例えば、未受精卵、受精卵又は発生初期胚）を調製する方法、及び該方法により調製された透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を提供することである。
本発明の他の目的は、体外受精、受精卵の移植、遺伝子改変動物の作製において利用される発生初期胚の調製、において用いることができる、透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物胚を調製する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、上記調製方法であって、少なくとも特別な技術や装置を要求することがない方法を提供することであり、好ましくは、細胞毒性がなく又は実験操作性を損なうことがない、汎用性がある方法を提供することである。
また本発明の別の目的は、体外受精、移植前の受精卵の前処理、又は遺伝子改変動物の作製において利用される発生初期胚の調製、において用いることができる、哺乳動物胚の透明帯を菲薄化又は除去できる哺乳動物胚用の培地を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、哺乳動物卵又は胚（未受精卵、受精卵又は発生初期胚）を、ＳＨ基を有する還元剤（例えば、還元型グルタチオンやＤＴＴ）で処理することにより、哺乳動物卵又は胚の透明帯を菲薄化又は除去できること、並びにそれらの透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を用いることにより受精率や発生率を向上できることを見いだし、本発明を完成した。
本発明は、哺乳動物（ヒト及び非ヒト哺乳動物）卵又は胚を、有効量のＳＨ基を有する還元剤（還元型グルタチオン、ＤＴＴ、又はジスルフィド還元酵素）を含有する培地で処理することにより、卵又は胚の透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製する方法である。
本発明はまた、ＳＨ基を有する還元剤を処理することにより透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵と、好ましくはシクロデキスチトリンで前培養された精子を受精する方法である。
本発明の別の態様は、遺伝子改変マウスの作製に用いることができる透明帯が菲薄化又は除去されたマウス発生初期胚を調製する方法である。
本発明の他の態様は、着床率を向上できる透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物受精卵又は胚を調製する方法である。
本発明はより具体的には、以下の通りである。
本発明は、哺乳動物（ヒト及び非ヒト哺乳動物）卵又は胚を、有効量のＳＨ基を有する還元剤（還元型グルタチオン、ＤＴＴ、又はジスルフィド還元酵素）を含有する培地で処理することにより、卵又は胚の透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製する方法である。
本発明はまた、ＳＨ基を有する還元剤を処理することにより透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵と、好ましくはシクロデキスチトリンで前培養された精子を受精する方法である。
本発明の別の態様は、遺伝子改変マウスの作製に用いることができる透明帯が菲薄化又は除去されたマウス発生初期胚を調製する方法である。
本発明の他の態様は、着床率を向上できる透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物受精卵又は胚を調製する方法である。
本発明はより具体的には、以下の通りである。
（１）以下の工程：
ａ．哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の精子を、０．１ｍＭ以上２０ｍＭ以下のシクロデキストリン及び０．１ｍＭ以上１０ｍM以下のカルシウムを含有する培地で前培養する工程、
ｂ．哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の未受精卵の透明帯の菲薄化又は除去のために、該未受精卵を、ＳＨ基を有する還元剤をＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上５００ｍＭ以下の濃度で含有する培地に加え、該還元剤により処理された未受精卵を調製する工程、及び
ｃ．工程ａで前培養した該精子と、工程２でＳＨ基を有する還元剤で処理した該未受精卵を共培養して受精を行う工程、
を含む受精方法。
（２）前記未受精卵がマウス未受精卵である前記（１）に記載の受精方法。
（３）前記シクロデキストリンがメチル−β―シクロデキストリンである前記（１）又は（２）に記載の受精方法。
ａ．哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の精子を、０．１ｍＭ以上２０ｍＭ以下のシクロデキストリン及び０．１ｍＭ以上１０ｍM以下のカルシウムを含有する培地で前培養する工程、
ｂ．哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の未受精卵の透明帯の菲薄化又は除去のために、該未受精卵を、ＳＨ基を有する還元剤をＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上５００ｍＭ以下の濃度で含有する培地に加え、該還元剤により処理された未受精卵を調製する工程、及び
ｃ．工程ａで前培養した該精子と、工程２でＳＨ基を有する還元剤で処理した該未受精卵を共培養して受精を行う工程、
を含む受精方法。
（２）前記未受精卵がマウス未受精卵である前記（１）に記載の受精方法。
（３）前記シクロデキストリンがメチル−β―シクロデキストリンである前記（１）又は（２）に記載の受精方法。
（４）工程ｃが、工程ａで前培養した該精子を、工程ｂでＳＨ基を有する還元剤で処理した該未受精卵の存在する培地中に添加し媒精を行う工程である、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の受精方法。
（５）前記ＳＨ基を有する還元剤が還元型グルタチオンであり、かつ培地中の該還元型グルタチオン濃度が、１５ｍｇ／ｍｌ以上９０ｍｇ／ｍｌ以下である、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の受精方法。
（６）前記ＳＨ基を有する還元剤が還元型グルタチオンであり、かつ培地中の該還元型グルタチオン濃度が、０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下である、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の受精方法。
（７）培地中の前記還元型グルタチオン濃度が、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ以下である、前記（６）に記載の受精方法。
（８）前記工程ｃの媒精を、前記工程ｂと同じ培地中で前記未受精卵と前記精子を数時間共培養することにより行う、前記（６）又は（７）に記載の受精方法。
（９）前記工程ｃの媒精を、還元型グルタチオンを実質的に含有しない培地で行う、前記（５）に記載の受精方法。
（１０）受精に用いる精子が、還元型グルタチオンを含まない培地で前培養されている新鮮精子、凍結精子、冷蔵精子又はそれらの組み合わせである、前記（１）に記載の受精方法。
（１１）受精に用いる精子がマウス凍結精子であり、工程ａの精子の前培養を少なくとも３０分間行う、前記（１）に記載の受精方法。
（５）前記ＳＨ基を有する還元剤が還元型グルタチオンであり、かつ培地中の該還元型グルタチオン濃度が、１５ｍｇ／ｍｌ以上９０ｍｇ／ｍｌ以下である、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の受精方法。
（６）前記ＳＨ基を有する還元剤が還元型グルタチオンであり、かつ培地中の該還元型グルタチオン濃度が、０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下である、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の受精方法。
（７）培地中の前記還元型グルタチオン濃度が、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ以下である、前記（６）に記載の受精方法。
（８）前記工程ｃの媒精を、前記工程ｂと同じ培地中で前記未受精卵と前記精子を数時間共培養することにより行う、前記（６）又は（７）に記載の受精方法。
（９）前記工程ｃの媒精を、還元型グルタチオンを実質的に含有しない培地で行う、前記（５）に記載の受精方法。
（１０）受精に用いる精子が、還元型グルタチオンを含まない培地で前培養されている新鮮精子、凍結精子、冷蔵精子又はそれらの組み合わせである、前記（１）に記載の受精方法。
（１１）受精に用いる精子がマウス凍結精子であり、工程ａの精子の前培養を少なくとも３０分間行う、前記（１）に記載の受精方法。
（１２）哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）卵又は胚を、ＳＨ基を有する還元剤（好ましくは、ＤＴＴ又は還元型グルタチオン）をＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上５００ｍＭ以下の濃度（還元型グルタチオンの場合は、０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上１５０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）、好ましくは、ＳＨ当量で０．５ｍＭ以上５００ｍＭ以下の濃度（還元型グルタチオンの場合は、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上１５０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）で含有する培地で処理することにより透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製する方法。
（１３）前記哺乳動物卵又は胚が、マウス未受精卵又はマウス胚である前記（１２）に記載の透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製する方法。
（１４）前記哺乳動物卵が未受精卵であり、かつ、培地中の前記ＳＨ基を有する還元剤（好ましくは、ＤＴＴ又は還元型グルタチオン）の濃度が、ＳＨ当量で０．５ｍＭ以上１０ｍＭ以下（還元型グルタチオンの場合は、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）、好ましくは、ＳＨ当量で０．５ｍＭ以上１．５ｍＭ以下（還元型グルタチオンの場合は、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）である、前記（１２）に記載の透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵を調製する方法。
（１５）培地中の前記ＳＨ基を有する還元剤（好ましくは、ＤＴＴ又は還元型グルタチオン）の濃度が、ＳＨ当量で５０ｍＭ以上５００ｍＭ以下（還元型グルタチオンの場合は、１５ｍｇ／ｍｌ以上１５０ｍｇ／ｍｌ以下）、好ましくは、ＳＨ当量で１００ｍＭ以上３００ｍＭ以下（還元型グルタチオンの場合は、３０ｍｇ／ｍｌ以上９０ｍｇ／ｍｌ以下）である、前記（１２）に記載の透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製する方法。
（１６）前記（１２）〜（１５）のいずれか一つに記載の方法により調製された透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚。
（１３）前記哺乳動物卵又は胚が、マウス未受精卵又はマウス胚である前記（１２）に記載の透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製する方法。
（１４）前記哺乳動物卵が未受精卵であり、かつ、培地中の前記ＳＨ基を有する還元剤（好ましくは、ＤＴＴ又は還元型グルタチオン）の濃度が、ＳＨ当量で０．５ｍＭ以上１０ｍＭ以下（還元型グルタチオンの場合は、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）、好ましくは、ＳＨ当量で０．５ｍＭ以上１．５ｍＭ以下（還元型グルタチオンの場合は、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）である、前記（１２）に記載の透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵を調製する方法。
（１５）培地中の前記ＳＨ基を有する還元剤（好ましくは、ＤＴＴ又は還元型グルタチオン）の濃度が、ＳＨ当量で５０ｍＭ以上５００ｍＭ以下（還元型グルタチオンの場合は、１５ｍｇ／ｍｌ以上１５０ｍｇ／ｍｌ以下）、好ましくは、ＳＨ当量で１００ｍＭ以上３００ｍＭ以下（還元型グルタチオンの場合は、３０ｍｇ／ｍｌ以上９０ｍｇ／ｍｌ以下）である、前記（１２）に記載の透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製する方法。
（１６）前記（１２）〜（１５）のいずれか一つに記載の方法により調製された透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚。
（１７）哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）卵又は胚を、ＤＴＴ又は還元型グルタチオンをＳＨ当量で５０ｍＭ以上３００ｍＭ以下の濃度で含有する培地で処理することにより透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製する方法。
（１８）前記哺乳動物卵又は胚が、マウス未受精卵又はマウス発生初期胚（２細胞期胚〜１６細胞期胚）である前記（１７）に記載の透明帯が菲薄化又は除去されたマウス未受精卵及び／又はマウス発生初期胚を調製する方法。
（１９）前記（１８）の方法により調製されたマウス発生初期胚をＥＳ細胞株と凝集させる手順を少なくとも含む、キメラ非ヒト哺乳動物の作製方法。
（２０）前記（１７）に記載の方法により調製された哺乳動物胚を用いることを含む、哺乳動物胚の着床率を高める方法。
（２１）前記（１７）又は（１８）により調製された哺乳動物卵又は胚。
（１８）前記哺乳動物卵又は胚が、マウス未受精卵又はマウス発生初期胚（２細胞期胚〜１６細胞期胚）である前記（１７）に記載の透明帯が菲薄化又は除去されたマウス未受精卵及び／又はマウス発生初期胚を調製する方法。
（１９）前記（１８）の方法により調製されたマウス発生初期胚をＥＳ細胞株と凝集させる手順を少なくとも含む、キメラ非ヒト哺乳動物の作製方法。
（２０）前記（１７）に記載の方法により調製された哺乳動物胚を用いることを含む、哺乳動物胚の着床率を高める方法。
（２１）前記（１７）又は（１８）により調製された哺乳動物卵又は胚。
（２２）哺乳類動物（ヒト及び非ヒト哺乳動物）卵又は胚の透明帯を菲薄化又除去するための、ＳＨ基を有する還元剤（好ましくは、ＤＴＴ又は還元型グルタチオン）をＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上５００ｍＭ以下の濃度（還元型グルタチオンの場合は、０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上１５０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）、好ましくは、ＳＨ当量で０．５ｍＭ以上５００ｍＭ以下の濃度（還元型グルタチオンの場合は、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上１５０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）で含有する、哺乳動物卵又は胚用培地。
（２３）体外受精用の未受精卵を培養するための培地又は受精用培地であり、ＳＨ基を有する還元剤（好ましくは、ＤＴＴ又は還元型グルタチオン）をＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上１０ｍＭ以下の濃度（還元型グルタチオンの場合は、０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）、好ましくは、ＳＨ当量で０．５ｍＭ以上１．５ｍＭ以下の濃度（還元型グルタチオンの場合は、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）で含有する培地。
（２３）体外受精用の未受精卵を培養するための培地又は受精用培地であり、ＳＨ基を有する還元剤（好ましくは、ＤＴＴ又は還元型グルタチオン）をＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上１０ｍＭ以下の濃度（還元型グルタチオンの場合は、０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）、好ましくは、ＳＨ当量で０．５ｍＭ以上１．５ｍＭ以下の濃度（還元型グルタチオンの場合は、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）で含有する培地。
（２４）ＳＨ基を有する還元剤（好ましくは、ＤＴＴ又は還元型グルタチオン）をＳＨ当量で５０ｍＭ以上３００ｍＭ以下の濃度（還元型グルタチオンの場合は、１５ｍｇ／ｍｌ以上９０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度）で含有する、哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）卵又は胚の透明帯を菲薄化又は除去するための培地、
（２５）前記非ヒト哺乳動物胚が遺伝子改変動物作製用の受容胚又は発生初期胚である前記（２４）に記載の培地。
（２６）前記遺伝子改変動物が遺伝子改変マウスである前記（２５）に記載の培地。
（２５）前記非ヒト哺乳動物胚が遺伝子改変動物作製用の受容胚又は発生初期胚である前記（２４）に記載の培地。
（２６）前記遺伝子改変動物が遺伝子改変マウスである前記（２５）に記載の培地。
（２７）以下の培地（ｉ）及び（ｉｉ）からなる受精用培地キット：
（ｉ）哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の精子を前培養するための、０．１ｍＭ以上２０ｍＭ以下のシクロデキストリン及び０．１ｍＭ以上１０ｍＭ以下のカルシウムを含有する精子前培養用培地、及び
（ｉｉ））哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の卵と精子の受精を行うための、ＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上１０ｍＭ以下のＳＨ基を有する還元剤を含有する受精用培地。
（２８）前記受精用培地が、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度の還元型グルタチオンを含有する、前記（２７）に記載の受精用培地キット。
（２９）前記精子前培養用培地が、還元型グルタチオンを実質的に含有しない前記（１９）又は（２０）に記載の受精用培地キット。
（３０）前記精子前培養用培地が、ＴＹＨ培地、ＨＴＦ培地、ＫＳＯＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ’ｓ ＰＢＳ培地、Ｍ２培地、ＰＢ１培地、Ｈａｎｋｓ培地、Ｈeｐeｓ-ＴＡＬＰ培地、Ｈoｐｐe＆Ｐｉｔｔｓ培地、ｍ−ＫＲＢ培地、ＨＩＳ培地、ＢＯ培地、ｍＴＡＬＰ培地、ｍＴ培地、ＭＣＭ培地、ＣＣＭ培地、Ｋ−ＭＣＭ培地、ＢＷＷ培地、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、ＢＭＯＣ培地、Ｔ６培地、ＨＴ６培地、Ｂａｖｉｓｔｅｒ−ＴＡＬＰ培地、ＳＯＦ培地、Ｍｅｎｅｚｏ−Ｂ２培地、Ｈａｍ’ｓ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＭＥＭ培地、ｍＷＭ培地からなる群より選ばれる培地であり、かつ、前記受精用培地が、ＨＴＦ培地、ＴＹＨ培地、ｍＲ１ＥＣＭ培地、ＢＯ培地、ＫＳＯＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ’ｓ ＰＢＳ培地、Ｍ２培地、ＰＢ１培地、Ｈａｎｋｓ培地、Ｈeｐeｓ-TALP培地、Ｈoｐｐe＆Ｐｉｔｔｓ培地、ｍ−ＫＲＢ培地、ＨＩＳ培地、ｍＴＡＬＰ培地、ｍＴ培地、ＭＣＭ培地、ＣＣＭ培地、Ｋ−ＭＣＭ培地、ＢＷＷ培地、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、ＢＭＯＣ培地、Ｔ６培地、ＨＴ６培地、Ｂａｖｉｓｔｅｒ−ＴＡＬＰ培地、ＳＯＦ培地、Ｍｅｎｅｚｏ−Ｂ２培地、Ｈａｍ’ｓ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＭＥＭ培地、ｍＷＭ培地からなる群より選ばれる培地である、前記（２７）〜（２９）のいずれか一つに記載の受精用培地キット。
（３１）前記非ヒト哺乳動物がマウスである、前記（２７）〜（３０）のいずれかに記載の受精用培地キット。
（ｉ）哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の精子を前培養するための、０．１ｍＭ以上２０ｍＭ以下のシクロデキストリン及び０．１ｍＭ以上１０ｍＭ以下のカルシウムを含有する精子前培養用培地、及び
（ｉｉ））哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の卵と精子の受精を行うための、ＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上１０ｍＭ以下のＳＨ基を有する還元剤を含有する受精用培地。
（２８）前記受精用培地が、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度の還元型グルタチオンを含有する、前記（２７）に記載の受精用培地キット。
（２９）前記精子前培養用培地が、還元型グルタチオンを実質的に含有しない前記（１９）又は（２０）に記載の受精用培地キット。
（３０）前記精子前培養用培地が、ＴＹＨ培地、ＨＴＦ培地、ＫＳＯＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ’ｓ ＰＢＳ培地、Ｍ２培地、ＰＢ１培地、Ｈａｎｋｓ培地、Ｈeｐeｓ-ＴＡＬＰ培地、Ｈoｐｐe＆Ｐｉｔｔｓ培地、ｍ−ＫＲＢ培地、ＨＩＳ培地、ＢＯ培地、ｍＴＡＬＰ培地、ｍＴ培地、ＭＣＭ培地、ＣＣＭ培地、Ｋ−ＭＣＭ培地、ＢＷＷ培地、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、ＢＭＯＣ培地、Ｔ６培地、ＨＴ６培地、Ｂａｖｉｓｔｅｒ−ＴＡＬＰ培地、ＳＯＦ培地、Ｍｅｎｅｚｏ−Ｂ２培地、Ｈａｍ’ｓ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＭＥＭ培地、ｍＷＭ培地からなる群より選ばれる培地であり、かつ、前記受精用培地が、ＨＴＦ培地、ＴＹＨ培地、ｍＲ１ＥＣＭ培地、ＢＯ培地、ＫＳＯＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ’ｓ ＰＢＳ培地、Ｍ２培地、ＰＢ１培地、Ｈａｎｋｓ培地、Ｈeｐeｓ-TALP培地、Ｈoｐｐe＆Ｐｉｔｔｓ培地、ｍ−ＫＲＢ培地、ＨＩＳ培地、ｍＴＡＬＰ培地、ｍＴ培地、ＭＣＭ培地、ＣＣＭ培地、Ｋ−ＭＣＭ培地、ＢＷＷ培地、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、ＢＭＯＣ培地、Ｔ６培地、ＨＴ６培地、Ｂａｖｉｓｔｅｒ−ＴＡＬＰ培地、ＳＯＦ培地、Ｍｅｎｅｚｏ−Ｂ２培地、Ｈａｍ’ｓ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＭＥＭ培地、ｍＷＭ培地からなる群より選ばれる培地である、前記（２７）〜（２９）のいずれか一つに記載の受精用培地キット。
（３１）前記非ヒト哺乳動物がマウスである、前記（２７）〜（３０）のいずれかに記載の受精用培地キット。
（３２）哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）卵又は胚の透明帯を菲薄化又は除去するための、ＳＨ基を有する還元剤（還元型ジスルフィド又はＤＴＴ）の使用。
（３３）哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の未受精卵と精子、好ましくはマウス未受精卵とシクロデキストリン含有培地で前培養したマウス精子（新鮮精子、冷蔵精子、又は凍結精子）との受精において、該未受精卵の透明帯を菲薄化又は除去することにより受精率を増加させるためのＳＨ基を有する還元剤（還元型ジスルフィド又はＤＴＴ）の使用。
（３３）哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の未受精卵と精子、好ましくはマウス未受精卵とシクロデキストリン含有培地で前培養したマウス精子（新鮮精子、冷蔵精子、又は凍結精子）との受精において、該未受精卵の透明帯を菲薄化又は除去することにより受精率を増加させるためのＳＨ基を有する還元剤（還元型ジスルフィド又はＤＴＴ）の使用。
本発明によれば、哺乳類動物、特にはマウスの体外受精において、特別な装置を必要とせず、飛躍的な操作の簡便化や大幅な作業の効率化を実現できる。さらには、本発明は、着床を容易にする技術として、或いは、遺伝子改変動物、特に遺伝子改変マウスの作製において有用な技術として利用できる。また、グルタチオン自身が防御因子として存在する生体由来成分であることから、卵子及び胚に対する毒性が極めて低く、安全に使用できる。
本明細書中で、「Ｘ〜Ｙ」という表現を用いた場合は、下限としてＸを、上限としてＹを含む意味で用いる。
本明細書中では、特に断りがない限りは、「グルタチオン」及び「還元型グルタチオン」は、交換可能な用語として用いる。
本明細書中では、特に断りがない限りは、「グルタチオン」及び「還元型グルタチオン」は、交換可能な用語として用いる。
本発明に用いられる、「透明帯が菲薄化する」とは、卵の透明帯の構造がＳＨ基を有する還元剤（例えば、還元型グルタチオンやＤＴＴ）の作用を受けることにより、透明帯中のジスルフィド結合が切断されて透明帯が変化又は脆弱化し（見かけ上の変化を伴わない場合も含む）、場合によっては、膨化その他の見かけ上の変化を伴い、精子が、グルタチオンの作用を受ける前の透明帯に比べて、容易に通過できる状態になることを意味する。
本発明に用いられる、「有効量のＳＨ基を有する還元剤を含有する」とは、卵の透明帯を菲薄化又は除去できる量又は濃度のＳＨ基を有する還元剤（例えば、還元型グルタチオンやＤＴＴ）を含んでいることを意味する。
本発明に用いられる、「有効量のＳＨ基を有する還元剤を含有する」とは、卵の透明帯を菲薄化又は除去できる量又は濃度のＳＨ基を有する還元剤（例えば、還元型グルタチオンやＤＴＴ）を含んでいることを意味する。
本発明に用いられる哺乳動物及び／又は胚（未受精卵、受精卵及び／又は発生初期胚）を提供する哺乳動物は、特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ等の家畜類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル等の実験動物類、ネコやイヌ等のペット類、野生動物等、全ての動物種を含むが、マウス、ラット、ハムスター等の実験動物が好ましく、マウスが特に好ましい。またマウスは、自然発生マウス、遺伝子改変マウスのいずれを用いることもでき、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ、ＣＨ３／Ｈｅ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７Ｂ／６Ｎ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＩＣＲ、ＢＤＦ１、Ｂ６Ｃ３Ｆ１、１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪ等の系統をあげることができる。これらの内、本発明の対象としては、ＢＡＬＢ／ｃ及び１２９系統が好ましい。
本発明において用いられる「哺乳動物胚」なる語は、哺乳動物由来の、未受精卵、受精卵及び発生初期胚（２細胞期胚から胚盤胞期）を含む意味であり、特に断りのない限り、それらの全てを含む意味で用いられる。 本発明において用いられる「哺乳動物卵」は、哺乳動物由来の未受精卵及び受精卵を含み意味であり、特に断りのない限り両者を含む意味である。本発明において用いられる「哺乳動物胚」は、発生初期胚、例えば、２細胞期胚から胚盤胞期胚を意味する。
本発明に用いられる哺乳動物胚及び／又は（未受精卵、受精卵及び／又は発生初期胚）は、哺乳動物より採取したものを直接使用しても、或いはそれを冷蔵保存して又は凍結保存した後融解して使用しても良い。冷蔵保存、又は凍結保存及び融解は、体外受精の技術分野における定法に従って行なうことができる。
本発明に用いられる哺乳動物胚及び／又は（未受精卵、受精卵及び／又は発生初期胚）は、哺乳動物より採取したものを直接使用しても、或いはそれを冷蔵保存して又は凍結保存した後融解して使用しても良い。冷蔵保存、又は凍結保存及び融解は、体外受精の技術分野における定法に従って行なうことができる。
本発明において用いられる「未受精卵」なる語は、個体から採取後新鮮な状態にある卵（胚）、採取後使用までの間冷蔵保存された卵子、及び凍結保存した後融解して使用される卵子を含む意味であり、特に断りのない限り、それらの全てを含む意味で用いられる。
本発明において用いられる「受精卵」なる語は、受精後の卵（胚）及びそれを凍結後融解した卵（胚）のいずれも含む意味であり、特に断りのない限り、両者を含む意味で用いられる。
本発明において用いられる「発生初期胚」なる語は、２細胞期から胚盤胞期までの胚を含む意味である。また、「発生初期胚」なる語は、発生開始初期の胚及びそれを凍結後融解した胚のいずれも含む意味であり、特に断りのない限り、両者を含む意味で用いられる。
本発明において用いられる「受精卵」なる語は、受精後の卵（胚）及びそれを凍結後融解した卵（胚）のいずれも含む意味であり、特に断りのない限り、両者を含む意味で用いられる。
本発明において用いられる「発生初期胚」なる語は、２細胞期から胚盤胞期までの胚を含む意味である。また、「発生初期胚」なる語は、発生開始初期の胚及びそれを凍結後融解した胚のいずれも含む意味であり、特に断りのない限り、両者を含む意味で用いられる。
本発明で用いられるＳＨ基を有する還元剤として、還元型グルタチオン、ＤＴＴ、ジスルフィド還元酵素（例えば、グルタチオンレダクターゼやチオレドキシン）をあげることができるが、還元型グルタチオン又はＤＴＴか好ましく、還元型グルタチオンが特に好ましい。
本発明で用いられる還元型グルタチオンは、市販の還元型グルタチオンをそのまま用いることができるが、市販の酸化型グルタチオンを還元した後用いても良い。
本発明で用いられる還元型グルタチオンは、市販の還元型グルタチオンをそのまま用いることができるが、市販の酸化型グルタチオンを還元した後用いても良い。
本発明で用いるＳＨ基を有する還元剤の濃度は、還元型グルタチオン又はＤＴＴの場合は、培地中、ＳＨ当量で、０．２５ｍＭ以上５００ｍＭ以下、より好ましくは、０．５ｍＭ以上３００ｍＭ以下、特に好ましくは、１．０ｍＭ以上２００ｍＭ以下であるが、その目的に応じて適宜選択でき、目的に応じた好ましい濃度が存在する。
本発明のＳＨ基を有する還元剤として還元型グルタチオンを用いる場合は、還元型グルタチオンの濃度は、培地中、好ましくは０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上１５０ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上９０ｍｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは、０．３０ｍｇ／ｍｌ以上６０ｍｇ／ｍｌ以下であるが、その目的に応じて、濃度は適宜選択でき、目的に応じた好ましい濃度が存在する。
本発明のＳＨ基を有する還元剤としてＤＴＴを用いる場合は、ＤＴＴの濃度は、培地中、好ましくは０．１２５ｍＭ以上２５０ｍＭ以下、より好ましくは、０．２５ｍＭ以上１５０ｍＭ以下、特に好ましくは、０．５ｍＭ以上１００ｍＭであるが、その目的に応じて、濃度は適宜選択でき、目的に応じた好ましい濃度が存在する。
本発明のＳＨ基を有する還元剤として還元型グルタチオンを用いる場合は、還元型グルタチオンの濃度は、培地中、好ましくは０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上１５０ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上９０ｍｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは、０．３０ｍｇ／ｍｌ以上６０ｍｇ／ｍｌ以下であるが、その目的に応じて、濃度は適宜選択でき、目的に応じた好ましい濃度が存在する。
本発明のＳＨ基を有する還元剤としてＤＴＴを用いる場合は、ＤＴＴの濃度は、培地中、好ましくは０．１２５ｍＭ以上２５０ｍＭ以下、より好ましくは、０．２５ｍＭ以上１５０ｍＭ以下、特に好ましくは、０．５ｍＭ以上１００ｍＭであるが、その目的に応じて、濃度は適宜選択でき、目的に応じた好ましい濃度が存在する。
本発明のＳＨ基を有する還元剤としてジスルフィド還元酵素を用いる場合は、培地中に酵素を、０．０１ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下の濃度、好ましくは、０．１ｍｇ／ｍｌ以上１０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で添加し、２０〜３７℃で、０．５〜２４時間、好ましくは１〜８時間反応を行うが、その目的に応じて、濃度や反応時間は適宜選択でき、目的に応じた好ましい条件が存在する。
本発明のＳＨ基を有する還元剤グルタチオンの培地中の濃度は、哺乳動物卵又は胚の透明体を菲薄化する目的の場合及び透明体を除去する目的の場合において、異なった濃度で用いることができる。例えば、ＳＨ基を有する還元剤として、還元型グルタチオンを用いた場合は、それぞれ、以下に記すような濃度で用いることができる。
本発明で用いるグルタチオン濃度は、哺乳動物卵又は胚の透明帯を菲薄化する目的においては、培地中、好ましくは０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上１５ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは０．１５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ未満、特に好ましくは０．３０ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ未満である。培地中のグルタチオン濃度は、上記範囲中の低濃度、例えば、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ未満の範囲の濃度であっても、透明帯の菲薄化の目的のために十分な効果を発揮できる。
本発明で用いるグルタチオン濃度は、透明帯を菲薄化する目的において、比較的長い時間、例えば数十分〜数時間、哺乳動物卵又は胚を処理又は培養する場合は、低濃度で十分な効果が発揮できる。その際のグルタチオン濃度は、好ましくは０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上６．０ｍｇ／ｍｌ以下であり、より好ましくは、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ未満、特に好ましくは、０．３０ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ未満である。これらの濃度で未受精卵を処理又は培養することにより、受精率が２０％〜６０％向上し、凍結精子、冷蔵精子、新鮮精子のいずれを用いた場合でも、その受精率は大幅に上昇する。
本発明で用いるグルタチオン濃度は、透明帯を菲薄化する目的において、比較的短い時間、例えば数十秒〜数分間、哺乳動物卵又は胚を処理又は培養する場合は、中程度の濃度で十分な効果が発揮できる。その際のグルタチオン濃度は、好ましくは６．０ｍｇ／ｍｌ以上１５ｍｇ／ｍｌ未満、より好ましくは、６．０ｍｇ／ｍｌ以上１２ｍｇ／ｍｌ以下である。これらの濃度で未受精卵を比較的短い時間培養したのち、グルタチオンを培地から除去し、精子と受精させることにより、受精率が向上する。中程度の濃度での処理は、低濃度での処理で効果が十分に得られない未受精卵（例えば、凍結融解卵子）や種（例えば、家畜等の大型の動物）が存在した場合に、特に有効である。
本発明で用いるグルタチオン濃度は、培地中、哺乳動物卵又は胚の透明帯を除去する目的においては、培地中、好ましくは１５ｍｇ／ｍｌ以上１５０ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは、１５ｍｇ／ｍｌ以上９０ｍｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは、３０ｍｇ／ｍｌ以上９０ｍｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは、３０ｍｇ／ｍｌ以上６０ｍｇ／ｍｌ以下である。これらの濃度で未受精卵、受精卵や発生初期胚（例えば、８細胞期胚）を短時間（例えば、１０秒〜数分間、好ましくは３０秒〜１２０秒間）処理すると、簡単に透明帯を除去することができる。
上記グルタチオン濃度範囲は、マウスの未受精卵、受精卵又は発生初期胚において特に好ましい範囲であるが、グルタチオンの濃度は、上記範囲内において、対象とする未受精卵、受精卵、発生初期胚の状態（新鮮胚、冷蔵保存胚、又は凍結融解胚）やその種類に応じて適宜選択可能である。
また、哺乳類動物種の違いによる、未受精卵、受精卵、又は発生初期胚の大きさに応じて、グルタチオン濃度の好ましい範囲は、適宜選択可能であり、マウスの胚に比べて大きな胚（例えば、牛胚）を用いた場合は、マウス胚に比べてより高濃度のグルタチオンを用いることが適当である。また、処理時間を、適宜選択し、より短く又はより長くすることも可能である。
また、哺乳類動物種の違いによる、未受精卵、受精卵、又は発生初期胚の大きさに応じて、グルタチオン濃度の好ましい範囲は、適宜選択可能であり、マウスの胚に比べて大きな胚（例えば、牛胚）を用いた場合は、マウス胚に比べてより高濃度のグルタチオンを用いることが適当である。また、処理時間を、適宜選択し、より短く又はより長くすることも可能である。
本発明のＳＨ基を有する還元剤として還元型グルタチオンを用いた例を上記に記載したが、ＤＴＴを用いる場合は、ＳＨ当量で換算して同等の濃度のＤＴＴを用いることにより、哺乳動物卵又は胚の透明体を菲薄化又は除去ができる。
以下、還元型グルタチオンの例を中心に本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものでない。
以下、還元型グルタチオンの例を中心に本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものでない。
このようにして透明帯が菲薄化又は除去された未受精卵は、きわめて運動性の低い精子とも体外受精できるので有用である。また、凍結融解卵子を用いた体外受精においては、凍結融解により卵子の透明帯が硬化し、精子が通過しにくくなるので、本発明を用いて、透明帯を菲薄化又は除去することが有効である。さらには、遺伝子改変動物の作製においては、本発明を用いて、発生初期胚（例えば、２細胞期〜８細胞期胚）の透明帯を除去し、ＥＳ細胞との融合に用いることができる。
上記した哺乳動物卵又は胚の透明帯の菲薄化又は除去のための濃度は、透明帯の菲薄化又は透明帯の除去の目的においてあくまで目安であって、上記した透明帯の菲薄化のための濃度の範囲内において、透明帯が除去される場合を排除するものではなく、また上記した透明帯を除去するための濃度の範囲内において、透明帯が菲薄化される場合を排除するものではない。
本発明において、本発明の方法を体外受精に用いる場合は、未受精卵は、受精の前にグルタチオン又はＤＴＴ含有培地で処理されても良く、また、受精と同時にグルタチオン又はＤＴＴ含有培地で処理されても良い。受精の前にグルタチオン含有培地で処理される場合は、未受精卵を、グルタチオン含有培地、例えば、グルタチオン含有ＨＴＦ培地で、例えば、数十秒〜数分間、或いは数十分間処置した後、必要に応じてグルタチオンを培地から除去し、受精に用いる。好ましくは、グルタチオン含有培地で未受精卵を調製し、グルタチオン処理をし、必要に応じてグルタチオンを含有しない培地に交換した後、そこに調製した精子を添加し、受精を行う。一方、未受精卵を受精と同時にグルタチオン含有培地で処理する場合は、未受精卵を、グルタチオン含有培地で調製し、そこに別途調製した精子を添加（媒清）し、受精を行う。このように、例えばグルタチオン含有培地で未受精卵の処理を行った後または処理を開始した後、そこに精子を添加することが好ましい。これにより、多くの未受精卵を簡便な方法により同時に受精できる。
透明帯を除去するために、高濃度のグルタチオン、例えば、１５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のグルタチオン含有培地で未受精卵を処理した場合は、受精の前にグルタチオンを除いておくことが必要である。
透明帯を除去するために、高濃度のグルタチオン、例えば、１５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のグルタチオン含有培地で未受精卵を処理した場合は、受精の前にグルタチオンを除いておくことが必要である。
本発明の方法においては、本発明の方法により透明帯が菲薄化又は除去された未受精卵との受精に用いる精子は、前培養してから用いることが好ましい。。かかる場合は、精子を、天然体又は合成体のα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン或いはそれらの誘導体のいずれか、或いはそれらの任意の２つ以上の組み合わせを含む培地で前培養することにより、受精率の向上が期待できる。特に、受精能の低下した凍結精子を用いた場合は、受精率の大きな向上が期待できる。
シクロデキストリンは、合成体、天然体、或いはそれらの誘導体のいずれを用いても良く、シクロデキストリン誘導体は、例えば、６個のグルコースがα−1,4結合で環状に結合したα−シクロデキストリン骨格、７個のグルコースがα−1,4結合で環状に結合したβ−シクロデキストリン骨格、または８個のグルコースがα−1,4結合で環状に結合したγ−シクロデキストリン骨格を有するものをあげることができる。このようなシクロデキストリン誘導体としては、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、グルコシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、スルフォブチル−β−シクロデキストリン、ならびにこれらのα体およびg体を挙げることができるが、好ましくは、メチル−β−シクロデキストリンである。前培養におけるシクロデキストリン又はその誘導体の濃度は、用いられるシクロデキストリンの種類に応じて適宜選択され、例えば、好ましくは０．１ｍＭ以上２０ｍＭ以下、より好ましくは０．２ｍＭ以上１０ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．５ｍＭ以上５ｍＭ以下であるが、メチル−β−シクロデキストリンの場合は、例えば０．５ｍＭ以上５ｍＭ以下が好ましく、０．５ｍＭ以上３．０ｍＭ以下がさらに好ましい。
精子の前培養においては、受精能を活性化するために培地にはカルシウムを添加するのが好ましい。培地中のカルシウム濃度は、例えば、０．１ｍＭ以上１０ｍＭ以下であり、好ましくは０．５ｍＭ以上５．０ｍＭ以下、更に好ましくは１．０ｍＭ以上２．０ｍＭ以下であるが、本発明における至適濃度は約１．７ｍＭである。
精子の前培養は、上記デキストリン及びカルシウムを含む培地で、約３７℃で、１０分〜数時間、好ましくは３０分〜１時間行う。前培養の時間は、精子の種類や状態（新鮮精子、冷蔵精子又は凍結精子）に応じて、適宜選択可能である。
本発明の哺乳動物（ヒト及び非ヒト哺乳動物）卵の受精方法は、以下の工程を含むａ．哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の精子を、０．１ｍＭ以上２０ｍＭ以下のシクロデキストリン及び０．１ｍＭ以上１０ｍM以下のカルシウムを含有する培地で前培養する工程、
ｂ．哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の未受精卵の透明帯の菲薄化又は除去のために、該未受精卵を、ＳＨ基を有する還元剤をＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上５００ｍＭ以下の濃度で含有する培地に添加し、該還元剤により処理された未受精卵を調製する工程、及び
ｃ．工程ａで前培養した該精子と、工程２でＳＨ基を有する還元剤で処理した該未受精卵を共培養しての受精を行う工程。
ここで、未受精卵は、特に限定されないが、好ましくはマウス未受精卵である。
ここで、ＳＨ基を有する還元剤は、還元型グルタチオン又はＤＴＴであり、還元型グルタチオンが好ましい。また培地中の還元剤の濃度は、ＳＨ当量で、０．２５ｍＭ以上１０ｍＭ以下、好ましくは０．５ｍＭ以上１０ｍＭ以下であり、還元型グルタチオンの場合は、０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ以下である。特に、新鮮精子を用いる場合は、０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上の還元型グルタチオンで顕著な受精率の向上が達成される。
ｂ．哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の未受精卵の透明帯の菲薄化又は除去のために、該未受精卵を、ＳＨ基を有する還元剤をＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上５００ｍＭ以下の濃度で含有する培地に添加し、該還元剤により処理された未受精卵を調製する工程、及び
ｃ．工程ａで前培養した該精子と、工程２でＳＨ基を有する還元剤で処理した該未受精卵を共培養しての受精を行う工程。
ここで、未受精卵は、特に限定されないが、好ましくはマウス未受精卵である。
ここで、ＳＨ基を有する還元剤は、還元型グルタチオン又はＤＴＴであり、還元型グルタチオンが好ましい。また培地中の還元剤の濃度は、ＳＨ当量で、０．２５ｍＭ以上１０ｍＭ以下、好ましくは０．５ｍＭ以上１０ｍＭ以下であり、還元型グルタチオンの場合は、０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ以下である。特に、新鮮精子を用いる場合は、０．０７５ｍｇ／ｍｌ以上の還元型グルタチオンで顕著な受精率の向上が達成される。
本発明の哺乳動物（ヒト及び非ヒト哺乳動物）の未受精卵の受精方法においては、上記の様に、精子をシクロデキストリン及びカルシウムを含有する培地で前培養する。培地に添加するシクロデキストリン及びカルシウムの濃度は上記した通りである。シクロデキストリンの添加により受精率の向上が得られる。凍結精子を用いる場合は、シクロデキストリンで前培養することが特に好ましく、特にマウス凍結精子を用いた場合は、受精率の著しい改善が得られる。また、カルシウムの含有により、受精能の活性化が期待できる。
本発明の哺乳動物（ヒト及び非ヒト哺乳動物）の未受精卵の受精方法はさらに、
工程ｃが、工程ａにおいてシクロデキストリン存在下で前培養した該精子を、工程２においてＳＨ基を有する還元剤で処理した該未受精卵の存在する培地中に添加し媒精を行うである工程である態様を含む。
グルタチオンで未受精卵の処理を行った後または処理を開始した後、そこに精子を添加する方法により、多くの未受精卵を簡便な方法により同時に受精できる
工程ｃが、工程ａにおいてシクロデキストリン存在下で前培養した該精子を、工程２においてＳＨ基を有する還元剤で処理した該未受精卵の存在する培地中に添加し媒精を行うである工程である態様を含む。
グルタチオンで未受精卵の処理を行った後または処理を開始した後、そこに精子を添加する方法により、多くの未受精卵を簡便な方法により同時に受精できる
本発明の哺乳動物（ヒト及び非ヒト哺乳動物）の未受精卵の受精方法はさらに、
前記精子を前記未受精卵の存在する培地中に添加した後、数十分〜数時間それらを共培養し、透明帯の菲薄化又は除去を行いながら受精を行うこともできる。共培養の時間は、用いる精子及び卵子の種類や状態、培養条件等に応じて適宜選択出来るが、数十分の共培養でも十分な受精が期待でき、数時間の共培養で受精が完了する。マウスの場合は、数十分の受精で十分な受精が達成でき、３時間程度で受精が完了する。これにより、透明帯の菲薄化の進行と受精を同時に行うことができ、操作が効率よく行える。
前記精子を前記未受精卵の存在する培地中に添加した後、数十分〜数時間それらを共培養し、透明帯の菲薄化又は除去を行いながら受精を行うこともできる。共培養の時間は、用いる精子及び卵子の種類や状態、培養条件等に応じて適宜選択出来るが、数十分の共培養でも十分な受精が期待でき、数時間の共培養で受精が完了する。マウスの場合は、数十分の受精で十分な受精が達成でき、３時間程度で受精が完了する。これにより、透明帯の菲薄化の進行と受精を同時に行うことができ、操作が効率よく行える。
他の観点において、本発明の哺乳動物（ヒト及び非ヒト哺乳動物）の未受精卵の受精方法は、上記工程において、未受精卵を、ＳＨ基を有する還元剤をＳＨ当量で５０ｍＭ以上３００ｍＭ以下の濃度で含有する培地で処理することにより胚の透明帯中を除去する工程、培地からＳＨ基を有する還元剤を除く工程、及び該未受精卵が存在する培地中に、精子を添加する媒精を行う工程、を含む。を含む。
ここで、ＳＨ基を有する還元剤が還元型グルタチオンである場合は、培地中の該還元型グルタチオン濃度が１５ｍｇ／ｍｌ以上９０ｍｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。
ここで、ＳＨ基を有する還元剤が還元型グルタチオンである場合は、培地中の該還元型グルタチオン濃度が１５ｍｇ／ｍｌ以上９０ｍｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。
上記のそれぞれの受精方法で用いる精子は、新鮮精子、凍結精子、冷蔵精子又はそれらの組み合わせであることもできるが、凍結精子を用いることが簡便である。また、還元型グルタチオンで処理されていない精子を用いることができる。
本発明の培地は、哺乳類動物（ヒト及び非ヒト哺乳動物）卵又は胚の透明帯を菲薄化又除去するための、ＳＨ基を有する還元剤として還元型グルタチオン又はＤＴＴをＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上３００ｍＭ以下の濃度で含有する、哺乳動物胚用培地である。
本発明の透明帯を菲薄化するための培地は、ＳＨ基を有する還元剤として還元型グルタチオン又はＤＴＴをＳＨ当量で０．５ｍＭ以上１０ｍＭ以下の濃度で含有する培地である。
本発明の透明帯を除去するための培地は、ＳＨ基を有する還元剤として還元型グルタチオン又はＤＴＴをＳＨ当量で５０ｍＭ以上３００ｍＭ以下の濃度で含有する培地である。
本発明の透明帯を菲薄化するための培地は、ＳＨ基を有する還元剤として還元型グルタチオン又はＤＴＴをＳＨ当量で０．５ｍＭ以上１０ｍＭ以下の濃度で含有する培地である。
本発明の透明帯を除去するための培地は、ＳＨ基を有する還元剤として還元型グルタチオン又はＤＴＴをＳＨ当量で５０ｍＭ以上３００ｍＭ以下の濃度で含有する培地である。
本発明の培地は、遺伝子改変動物作製用の受容胚又は発生初期胚を処理又は培養する場合は、ＳＨ基を有する還元剤として還元型グルタチオン又はＤＴＴをＳＨ当量で５０ｍＭ以上３００ｍＭ以下、好ましくは１００ｍＭ以上３００ｍＭ以下の濃度で含有する。
本発明で用いる培地は、未受精卵の調製又は受精のために用いられる培地に、ＳＨ基を有する還元剤（例えば、還元型グルタチオン又はＤＴＴ）を所定の濃度含有した受精用培地であれば、培地の種類は特に制限無く用いられる。具体的には、例えば、ＨＴＦ培地、ＴＹＨ培地、ｍＲ１ＥＣＭ培地、ＢＯ培地、ＫＳＯＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ’ｓ ＰＢＳ培地、Ｍ２培地、ＰＢ１培地、Ｈａｎｋｓ培地、Ｈeｐeｓ-TALP培地、Ｈoｐｐe＆Ｐｉｔｔｓ培地、ｍ−ＫＲＢ培地、ＨＩＳ培地、ｍＴＡＬＰ培地、ｍＴ培地、ＭＣＭ培地、ＣＣＭ培地、Ｋ−ＭＣＭ培地、ＢＷＷ培地、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、ＢＭＯＣ培地、Ｔ６培地、ＨＴ６培地、Ｂａｖｉｓｔｅｒ−ＴＡＬＰ培地、ＳＯＦ培地、Ｍｅｎｅｚｏ−Ｂ２培地、Ｈａｍ’ｓ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＭＥＭ培地及び、ｍＷＭ培地培地を用いることができ、例えば、ＨＴＦ培地、ＴＹＨ培地、ｍＲ１ＥＣＭ培地、ＢＯ培地にグルタチオンを所定の濃度含有させた培地が好ましく用いられ、ＨＴＦ培地にＳＨ基を有する還元剤（例えば、還元型グルタチオン又はＤＴＴ）を含有した培地が特に好ましく用いられる。ここで、ＴＹＨ培地は、マウスの受精卵に対して好ましく用いられ、ｍＲ１ＥＣＭ培地は、ラットの受精卵に対して好ましく用いられ、ＢＯ培地は、家畜の受精卵に対して好ましく用いられる。
本発明において精子の前培養に用いる培地は、シクロデキストリンを所定の濃度含有した培地であれば、培地の種類は特に制限なく用いられる。例えば、ＴＹＨ又はＨＴＦに、シクロデキストリン（好ましくは、メチル-β−シクロデキストリン）を所定の濃度含有させた培地が好ましく用いられる。具体的には、例えば、ＨＴＦ培地、ＴＹＨ培地、ｍＲ１ＥＣＭ培地、ＢＯ培地、ＫＳＯＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ’ｓ ＰＢＳ培地、Ｍ２培地、ＰＢ１培地、Ｈａｎｋｓ培地、Ｈeｐeｓ-TALP培地、Ｈoｐｐe＆Ｐｉｔｔｓ培地、ｍ−ＫＲＢ培地、ＨＩＳ培地、ｍＴＡＬＰ培地、ｍＴ培地、ＭＣＭ培地、ＣＣＭ培地、Ｋ−ＭＣＭ培地、ＢＷＷ培地、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、ＢＭＯＣ培地、Ｔ６培地、ＨＴ６培地、Ｂａｖｉｓｔｅｒ−ＴＡＬＰ培地、ＳＯＦ培地、Ｍｅｎｅｚｏ−Ｂ２培地、Ｈａｍ’ｓ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＭＥＭ培地、及びｍＷＭ培地をあげることができるが、ＴＹＨ培地が特に好ましく用いられる。
本発明においては、上記の精子前培養用培地と上記の受精用培地をキットとすることもできる。即ち、本発明の別の一つの態様においては、本発明はまた、以下の精子前培養用培地及び受精用培地を含む受精用培地キットである：
（ｉ）哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の精子を前培養するための、１．０ｍＭ以上１０ｍＭ以下のカルシウム及び０．１ｍＭ以上２０ｍＭ以下のシクロデキストリンを含有する精子前培養用培地、及び
（ｉｉ））哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の卵と精子の受精を行うための、ＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上１０ｍＭ以下のＳＨ基を有する還元剤を含有する受精用培地。
（ｉ）哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の精子を前培養するための、１．０ｍＭ以上１０ｍＭ以下のカルシウム及び０．１ｍＭ以上２０ｍＭ以下のシクロデキストリンを含有する精子前培養用培地、及び
（ｉｉ））哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）の卵と精子の受精を行うための、ＳＨ当量で０．２５ｍＭ以上１０ｍＭ以下のＳＨ基を有する還元剤を含有する受精用培地。
培地の例として、ＨＴＦ培地、ＴＹＨ培地、ｍＲＩＣＥ培地及びBO培地の組成を以下に示す。
以下、本発明の方法を適用する未受精卵を調製する方法を、マウスを例に説明する。しかしながら、本発明の方法の適用はマウスに限定されるものではない。
１．卵子の調製
１−１）新鮮未受精卵の採取
本発明に係る透明帯が菲薄化又除去された未受精卵の調製方法において、哺乳動物、特にマウスからの新鮮未受精卵の採取に際しては、当該技術分野で実施されている前処理を採用することができる。すなわち、排卵誘発剤の投与により過排卵処理を行なった雌マウスを安楽死させ腹部を切開する。子宮、卵管、卵巣を体外に取り出した後、卵管のみを採取し、卵管膨大部より卵丘細胞に包まれた新鮮未受精卵を取り出す。具体的には、過排卵処理は、排卵誘発剤、例えば、卵胞刺激ホルモン性の性腺刺激ホルモンの卵胞成熟効果と、黄体形成ホルモン性の性腺刺激ホルモンの排卵効果とを組合せたものであり、より具体的には、成熟雌マウス（８〜１２週齢）に所定濃度の血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）と胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を、例えば４８時間間隔で腹腔内に投与（７．５単位／匹）することにより過排卵処理を施すことができる。過排卵処理を施した雌マウスの卵管膨大部より未受精卵塊（卵丘・卵子複合体：ＣＯＣ）を採取する。
１−１）新鮮未受精卵の採取
本発明に係る透明帯が菲薄化又除去された未受精卵の調製方法において、哺乳動物、特にマウスからの新鮮未受精卵の採取に際しては、当該技術分野で実施されている前処理を採用することができる。すなわち、排卵誘発剤の投与により過排卵処理を行なった雌マウスを安楽死させ腹部を切開する。子宮、卵管、卵巣を体外に取り出した後、卵管のみを採取し、卵管膨大部より卵丘細胞に包まれた新鮮未受精卵を取り出す。具体的には、過排卵処理は、排卵誘発剤、例えば、卵胞刺激ホルモン性の性腺刺激ホルモンの卵胞成熟効果と、黄体形成ホルモン性の性腺刺激ホルモンの排卵効果とを組合せたものであり、より具体的には、成熟雌マウス（８〜１２週齢）に所定濃度の血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）と胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を、例えば４８時間間隔で腹腔内に投与（７．５単位／匹）することにより過排卵処理を施すことができる。過排卵処理を施した雌マウスの卵管膨大部より未受精卵塊（卵丘・卵子複合体：ＣＯＣ）を採取する。
１−２）卵丘細胞の除去
前記工程にて得られた新鮮未受精卵塊をヒアルロニダーゼ処理に供し、卵丘細胞を除去する。具体的には、新鮮未受精卵塊を、ヒアルロニダーゼ（０．１％）を添加した体外受精用培地（ＨＴＦ培地）に導入し、ヒアルロニダーゼで処理し、洗浄後、卵丘細胞が除去された卵子を得る。
前記工程にて得られた新鮮未受精卵塊をヒアルロニダーゼ処理に供し、卵丘細胞を除去する。具体的には、新鮮未受精卵塊を、ヒアルロニダーゼ（０．１％）を添加した体外受精用培地（ＨＴＦ培地）に導入し、ヒアルロニダーゼで処理し、洗浄後、卵丘細胞が除去された卵子を得る。
１−３）未受精卵の冷蔵保存
未受精卵を冷蔵保存して使用する場合は、上記１）のようにして得た卵丘細胞付着卵子、或いはさらに２）の操作を加えて卵丘細胞を除去した卵子を、Ｍ２培地中に移動し、冷蔵保存（１〜１５℃）して使用する。冷蔵保存は、４８時間可能である。
未受精卵を冷蔵保存して使用する場合は、上記１）のようにして得た卵丘細胞付着卵子、或いはさらに２）の操作を加えて卵丘細胞を除去した卵子を、Ｍ２培地中に移動し、冷蔵保存（１〜１５℃）して使用する。冷蔵保存は、４８時間可能である。
１−４）未受精卵の凍結保存
新鮮未受精卵は、凍結保存した後使用することもできる。未受精卵の凍結保存は、卵丘細胞を除去した卵子を、２０％牛胎仔血清を含むＨＴＦ培地で１０分間培養した後、凍結することにより行う。
新鮮未受精卵は、凍結保存した後使用することもできる。未受精卵の凍結保存は、卵丘細胞を除去した卵子を、２０％牛胎仔血清を含むＨＴＦ培地で１０分間培養した後、凍結することにより行う。
室温にて、ディッシュに１Ｍ ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）のドロップ（１００μｌ）を作製する。１Ｍ ＤＭＳＯは、ディスポーザブル・フィルターユニット（ポアサイズ：０．２２μｍ）を用いて使用直前に濾過する。凍結する胚を１つの１Ｍ ＤＭＳＯのドロップに静かに移す。胚がディッシュの底に沈んだら、残りの１Ｍ ＤＭＳＯのドロップに胚を均等に分けて移す。２０μｌ用のオートピペッターを用いて、５μlの１Ｍ ＤＭＳＯ溶液とともに胚をクライオチューブ内に入れ、０℃の冷却装置に移す。５分後、あらかじめ０℃に冷却しておいた保存液（ＤＡＰ２１３）４５μｌをチューブ内の管壁を伝わらせて静かに添加する。さらに５分後、液体窒素内で冷却しておいたケーンにチューブを装着し、直ちに液体窒素中に浸漬し、凍結する。
２．精子の調製
２−１）新鮮精子の調製
マウス成熟雄（８週齢以上）より採取した精巣上体尾部から精子塊を採取し、ディッシュ内の精子培養液（ＴＹＨ培地）（２００μｌ／２精巣上体尾部）に移し、インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ2）で６０分間前培養し、新鮮精子として受精に用いる。
２−１）新鮮精子の調製
マウス成熟雄（８週齢以上）より採取した精巣上体尾部から精子塊を採取し、ディッシュ内の精子培養液（ＴＹＨ培地）（２００μｌ／２精巣上体尾部）に移し、インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ2）で６０分間前培養し、新鮮精子として受精に用いる。
２−２）冷蔵精子の調製
マウス成熟雄（８週齢以上）より採取した精巣上体尾部を採取し、チューブ内のLifor培地（Lifor（登録商標） ACF Perfusion Media）に移し、冷蔵保存（１〜１５℃）し、冷蔵精子として受精に用いる。
マウス成熟雄（８週齢以上）より採取した精巣上体尾部を採取し、チューブ内のLifor培地（Lifor（登録商標） ACF Perfusion Media）に移し、冷蔵保存（１〜１５℃）し、冷蔵精子として受精に用いる。
２−３）凍結精子の調製
マウス成熟雄（１２週齢以上）より採取した精巣上体尾部を、ディッシュ内の精子凍結保存液（例えば、ＦＥＲＴＩＵＰ（登録商標）、九動株式会社）（１２０μｌ／２精巣上体尾部）に移し、精巣の５〜６箇所に切れ込みを入れる。ディッシュを約３分間静置し、精子を保存液中に懸濁した後、精巣上体尾部をディッシュから取り出す。残った精子懸濁液を以下のようにして凍結する。
マウス成熟雄（１２週齢以上）より採取した精巣上体尾部を、ディッシュ内の精子凍結保存液（例えば、ＦＥＲＴＩＵＰ（登録商標）、九動株式会社）（１２０μｌ／２精巣上体尾部）に移し、精巣の５〜６箇所に切れ込みを入れる。ディッシュを約３分間静置し、精子を保存液中に懸濁した後、精巣上体尾部をディッシュから取り出す。残った精子懸濁液を以下のようにして凍結する。
ストローにＨＴＦ培地を１００μｌ吸引する。ついで、約１０μｌの空気相を作製し、最後に、上記採取した精子懸濁液を、１０μｌずつストローに充填し、液体窒素中に浸漬し、凍結保存し、凍結精子として用いる。
凍結保存しておいた精子を液体窒素中から取り出し、３７℃の温水中に浸漬し、１０分間加温した後、融解した精子懸濁液を９０μｌのＴＹＨ培地のドロップに移す。
凍結保存しておいた精子を液体窒素中から取り出し、３７℃の温水中に浸漬し、１０分間加温した後、融解した精子懸濁液を９０μｌのＴＹＨ培地のドロップに移す。
３．体外受精
精子懸濁液を、９０μｌのＴＹＨ培地中で、３７℃で３０分間、前培養し、実体顕微鏡下で非運動性の精子を避けて運動性を示す精子を回収し、受精に用いる。前培養した精子懸濁液１０μｌを、予め卵丘・卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）を導入しておいた９０μｌのＨＴＦ培地（±グルタチオン）に加え（媒精）、５〜６時間インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ2）で共培養し、受精を行う。その後、新しいＨＴＦのドロップで卵子を洗浄し、卵子の観察を行う。単為発生卵子と判定されたもの（卵細胞質内に１つの前核のみが認められるもの）を、取り除き、翌日（媒精２４時間後）、２細胞期胚のみを選別し、受精率を以下の式により求める。
体外受精率（％）＝（２細胞期胚の数）／（２細胞期胚の数＋未受精卵の数）×１００
精子懸濁液を、９０μｌのＴＹＨ培地中で、３７℃で３０分間、前培養し、実体顕微鏡下で非運動性の精子を避けて運動性を示す精子を回収し、受精に用いる。前培養した精子懸濁液１０μｌを、予め卵丘・卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）を導入しておいた９０μｌのＨＴＦ培地（±グルタチオン）に加え（媒精）、５〜６時間インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ2）で共培養し、受精を行う。その後、新しいＨＴＦのドロップで卵子を洗浄し、卵子の観察を行う。単為発生卵子と判定されたもの（卵細胞質内に１つの前核のみが認められるもの）を、取り除き、翌日（媒精２４時間後）、２細胞期胚のみを選別し、受精率を以下の式により求める。
体外受精率（％）＝（２細胞期胚の数）／（２細胞期胚の数＋未受精卵の数）×１００
４．受精卵の卵管への移植
通常、卵管へは、前核期受精卵及び２細胞期胚を移植する。但し、それ以外の発生段階にある胚の移植も可能である。
受容雌には、ＩＣＲ系マウスを用い、移植前日に外陰部を観察して発情前期にあるものを選び、精管結紮雄と同居させる。翌日、膣栓を確認したものを受容雌として用いる（偽妊娠第１日目）。麻酔した受容雌の皮膚及び腹壁を切開し、切開部より、卵巣、卵管及び子宮の一部を体外に露出させ、卵巣に付着した脂肪をクレンメで固定する。２００μｌの移植用ドロップをディッシュの中央に作製し、移植する胚（２０個／匹）を移植用ドロップに移す。次いで、移植用キャピラリーに、少量の培養液とともに１０個の胚を吸引する。卵管を、その円周の約１／２〜２／３程度切開し、その切開部から卵管膨大部に向かって胚を含むキャピラリーを挿入し、胚を移植する。反対側の卵管へも、同様の操作手順で胚を移植する。
胚移植後の産子率（着床率）は以下の式により求める。
産子の発生率（％）＝（産子数）／（移植胚数）×１００
通常、卵管へは、前核期受精卵及び２細胞期胚を移植する。但し、それ以外の発生段階にある胚の移植も可能である。
受容雌には、ＩＣＲ系マウスを用い、移植前日に外陰部を観察して発情前期にあるものを選び、精管結紮雄と同居させる。翌日、膣栓を確認したものを受容雌として用いる（偽妊娠第１日目）。麻酔した受容雌の皮膚及び腹壁を切開し、切開部より、卵巣、卵管及び子宮の一部を体外に露出させ、卵巣に付着した脂肪をクレンメで固定する。２００μｌの移植用ドロップをディッシュの中央に作製し、移植する胚（２０個／匹）を移植用ドロップに移す。次いで、移植用キャピラリーに、少量の培養液とともに１０個の胚を吸引する。卵管を、その円周の約１／２〜２／３程度切開し、その切開部から卵管膨大部に向かって胚を含むキャピラリーを挿入し、胚を移植する。反対側の卵管へも、同様の操作手順で胚を移植する。
胚移植後の産子率（着床率）は以下の式により求める。
産子の発生率（％）＝（産子数）／（移植胚数）×１００
５．キメラ動物の作製
以下に、本発明の方法を適用する、共培養法によるキメラ動物作製の方法を、マウスを例に説明する。特には、本発明の方法は、受容胚の調製のために用いることができる。しかしながら、本発明の方法の適用はマウスに限定されるものではない。
以下に、本発明の方法を適用する、共培養法によるキメラ動物作製の方法を、マウスを例に説明する。特には、本発明の方法は、受容胚の調製のために用いることができる。しかしながら、本発明の方法の適用はマウスに限定されるものではない。
（Ａ）ＥＳ細胞の調製
液体窒素タンクから、ＥＳ細胞の入ったチューブを取り出し、３７℃のウォーターバスで融解する。融解したＥＳ細胞を、約５ｍｌのＥＳＭ（ＤＭＳＯ ４５０ｍｌ、血清 １００ｍｌ、非必須アミノ酸溶液 ５ｍｌ、β−メルカプトエタノール ５ｍｌ、及びＥＳＧＲＯ（４５０，０００ｕｎｉｔｓ、ＣＨＥＭＩＣＯＮ）に懸濁し、ゼラチンコートしたディッシュに移して、１０分間培養する。続いて、ＥＳ細胞が浮遊している上清を遠沈管に入れ、共培養に用いるまで、氷上で保存する。
液体窒素タンクから、ＥＳ細胞の入ったチューブを取り出し、３７℃のウォーターバスで融解する。融解したＥＳ細胞を、約５ｍｌのＥＳＭ（ＤＭＳＯ ４５０ｍｌ、血清 １００ｍｌ、非必須アミノ酸溶液 ５ｍｌ、β−メルカプトエタノール ５ｍｌ、及びＥＳＧＲＯ（４５０，０００ｕｎｉｔｓ、ＣＨＥＭＩＣＯＮ）に懸濁し、ゼラチンコートしたディッシュに移して、１０分間培養する。続いて、ＥＳ細胞が浮遊している上清を遠沈管に入れ、共培養に用いるまで、氷上で保存する。
（Ｂ）受容胚の調製
ＰＭＳＧとｈＣＧによって過排卵処理した雌マウスを、ｈＣＧ投与後、直ちに成熟雄と交配する。翌日、膣栓の有無を確認する。ｈＣＧ投与約４０〜４６時間後に、膣栓を確認したマウスから卵管を採取・灌流することにより、２細胞期胚を採取する。採取した２細胞期胚を、ＫＳＯＭ培地のドロップ中で培養し、８細胞期へ発生したものを受容胚として用いる。
ＰＭＳＧとｈＣＧによって過排卵処理した雌マウスを、ｈＣＧ投与後、直ちに成熟雄と交配する。翌日、膣栓の有無を確認する。ｈＣＧ投与約４０〜４６時間後に、膣栓を確認したマウスから卵管を採取・灌流することにより、２細胞期胚を採取する。採取した２細胞期胚を、ＫＳＯＭ培地のドロップ中で培養し、８細胞期へ発生したものを受容胚として用いる。
（Ｃ）マウス胚の作製
ディッシュ上に作製した１０μｌの１００ｍＭのグルタチオンを含有したＨＴＦ培地のドロップに、受容胚を導入し、透明帯を溶解する。透明帯の消失が確認されたら、直ちに１０００μｌのＨＴＦ培地を加えて希釈する。透明帯を除去した受容胚は、３個作製した１００μｌのＫＳＯＭ培地中を移動させながら、グルタチオンを完全に取り除く。
（Ｄ）キメラ胚の作製
ディッシュ上に、ＫＳＯＭ培地のドロップ（15μｌ）を作製し、ディッシュの底面にアグリゲーションニードルで窪みを作製した後に、流動パラフィンで被覆する。透明帯を除去した受容胚を１つの窪みに１個ずつ導入し、その上からＥＳ細胞をふりかける。翌日まで、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター内で培養し、胚盤胞期胚まで発生したキメラ胚を得る。
（Ｅ）子宮内胚移植
受容雌には、ＩＣＲ系マウスを用い、移植前日に外陰部を観察して発情前期にあるものを選び、精管結紮雄と同居させる。翌日、膣栓を確認し、偽妊娠第３日目になった段階で受容雌として用いる。麻酔した受容雌の皮膚及び腹壁を切開し、切開部より、卵巣、卵管及び子宮の一部を体外に露出させ、卵巣に付着した脂肪をクレンメで固定する。１００μｌの移植用ドロップをディッシュの中央に作製し、移植する胚（２０個／匹）を移植用ドロップに移す。次いで、移植用キャピラリーに、少量の培養液とともに１０個の胚を吸引する。注射針を用いて子宮の卵管接合部に近い部位を切開し、卵巣側から子宮膣部側に向かって胚を含むキャピラリーを挿入し、胚を移植する。反対側の子宮へも、同様の操作手順で胚を移植する。
ディッシュ上に作製した１０μｌの１００ｍＭのグルタチオンを含有したＨＴＦ培地のドロップに、受容胚を導入し、透明帯を溶解する。透明帯の消失が確認されたら、直ちに１０００μｌのＨＴＦ培地を加えて希釈する。透明帯を除去した受容胚は、３個作製した１００μｌのＫＳＯＭ培地中を移動させながら、グルタチオンを完全に取り除く。
（Ｄ）キメラ胚の作製
ディッシュ上に、ＫＳＯＭ培地のドロップ（15μｌ）を作製し、ディッシュの底面にアグリゲーションニードルで窪みを作製した後に、流動パラフィンで被覆する。透明帯を除去した受容胚を１つの窪みに１個ずつ導入し、その上からＥＳ細胞をふりかける。翌日まで、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター内で培養し、胚盤胞期胚まで発生したキメラ胚を得る。
（Ｅ）子宮内胚移植
受容雌には、ＩＣＲ系マウスを用い、移植前日に外陰部を観察して発情前期にあるものを選び、精管結紮雄と同居させる。翌日、膣栓を確認し、偽妊娠第３日目になった段階で受容雌として用いる。麻酔した受容雌の皮膚及び腹壁を切開し、切開部より、卵巣、卵管及び子宮の一部を体外に露出させ、卵巣に付着した脂肪をクレンメで固定する。１００μｌの移植用ドロップをディッシュの中央に作製し、移植する胚（２０個／匹）を移植用ドロップに移す。次いで、移植用キャピラリーに、少量の培養液とともに１０個の胚を吸引する。注射針を用いて子宮の卵管接合部に近い部位を切開し、卵巣側から子宮膣部側に向かって胚を含むキャピラリーを挿入し、胚を移植する。反対側の子宮へも、同様の操作手順で胚を移植する。
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
精子凍結保存液（ＣＰＡ液）の調製
精子凍結保存液として、ＴＹＨ培地ではなくＣＰＡ培地を用いた。ＣＰＡ培地は以下のようにして調製した。
１，８００ｍｇのラフィノース５水和物、３００ｍｇのスキムミルク（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）及び１４６ｍｇのＬ−グルタミンを１０ｍｌ蒸留水に６０℃にて溶解し、さらに、温浴中にて９０分間６０℃にて加温した。１．０ｍｌずつマイクロ遠心管に移し、１０，０００×ｇで６０分間遠心処理した。上清０．７ｍｌを採取し、０．２２ｍｍの孔サイズの使い捨てフィルターで濾過し、ＣＰＡ培地とし、室温で保存し、実験に用いた。
精子凍結保存液として、ＴＹＨ培地ではなくＣＰＡ培地を用いた。ＣＰＡ培地は以下のようにして調製した。
１，８００ｍｇのラフィノース５水和物、３００ｍｇのスキムミルク（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）及び１４６ｍｇのＬ−グルタミンを１０ｍｌ蒸留水に６０℃にて溶解し、さらに、温浴中にて９０分間６０℃にて加温した。１．０ｍｌずつマイクロ遠心管に移し、１０，０００×ｇで６０分間遠心処理した。上清０．７ｍｌを採取し、０．２２ｍｍの孔サイズの使い捨てフィルターで濾過し、ＣＰＡ培地とし、室温で保存し、実験に用いた。
実施例１：グルタチオンによる受精率増加作用
上記記載の定法に従って、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの新鮮精子、凍結精子及びＩＣＲマウスの冷蔵精子（２日間冷蔵）を調製した精子懸濁液を用いて体外受精を行なった。また、上記記載の定法に従って、マウスの新鮮未受精卵を調製し、卵丘・卵母複合体を得た。
上記記載の定法に従って、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの新鮮精子、凍結精子及びＩＣＲマウスの冷蔵精子（２日間冷蔵）を調製した精子懸濁液を用いて体外受精を行なった。また、上記記載の定法に従って、マウスの新鮮未受精卵を調製し、卵丘・卵母複合体を得た。
ＨＴＦ培地は上記した組成表に従い調製した。調製したＨＴＦ培地に、還元型グルタチオンを１ｍＭ（０．３０７ｍｇ／ｍｌ）になるように加え、グルタチオン含有培地を調製した。具体的には、組成表に従いＨＴＦ培地を調製し、５ｍｌずつアンプルに封入した（成分Ａ）。また、還元型グルタチオン（ＳＩＧＭＡ社より入手）３０．７ｍｇをＮａＣｌ ５９３．８ｍｇと混合した後、１回使用量（グルタチオン１．５３５ｍｇ／混合物３１．２２５ｍｇ）に分注した（成分Ｂ）。使用前まで、これらの試薬を冷蔵保存し、使用直前に、成分Ａと成分Ｂを混合し、受精に用いた。コントロールは、成分Ａ（グルタチオンを添加していないＴＨＦ培地）のみを用いた。
本発明で用いた凍結保存精子を用いた体外受精の方法を、図１に示す。
具体的には、ディッシュ内の、卵丘・卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）を含む９０μｌのＨＴＦ培地（グルタチオン濃度 １ｍＭ）中に、新鮮精子、冷凍精子及び冷蔵精子のそれぞれの精子懸濁液（運動性がある精子を回収したもの）を１０μｌ加え、受精を行い、受精率を上記に従い求めた。グルタチオンを含有しないＨＴＦ培地を用い、コントロールとした。結果を表５示す。
未受精卵をグルタチオンで処理することにより、すべての精子において、受精率の大きな向上が見られた。特に、冷蔵精子を用いた体外受精においては、その向上が著しかった。
実施例２：グルタチオン濃度による影響
実施例１と同様にして、種々の還元型グルタチオン濃度を用いて受精率を検討した。精子は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの凍結精子を用い、図１に従って行った。結果を以下の表６に示す。
実施例１と同様にして、種々の還元型グルタチオン濃度を用いて受精率を検討した。精子は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの凍結精子を用い、図１に従って行った。結果を以下の表６に示す。
これにより、０．５ｍＭ（０．１５ｍｇ／ｍｌ）以上のグルタチオン濃度において、受精率の向上が確認された。特に、１．０ｍＭ以上２．０ｍＭ以下（０．３０ｍｇ／ｍｌ以上０．６０ｍｇ／ｍｌ）の濃度において顕著な受精率の向上が確認された。
また、グルタチオンが透明帯の膨化に及ぼす影響を確認した。上記「１．卵子の調整」に従って準備した卵丘細胞が除去された新鮮未受精卵を、それぞれの濃度のグルタチオンを含有するＨＴＦ培地で、３７℃で、6時間処理した後、透明帯内の面積を顕微鏡下で撮影し画像解析ソフトにより測定した。結果を、図２に示す。また、グルタチオン濃度、０ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ及び１０ｍＭのそれぞれにおける透明帯の様子を、倒立顕微鏡観察した。結果を、図３に示す。
これらの結果より、グルタチオン濃度依存的に、透明帯の膨化が認められ、特に、２ｍＭ以上の濃度においては、透明帯の膨化が顕著に認められた。
これらの結果より、グルタチオン濃度依存的に、透明帯の膨化が認められ、特に、２ｍＭ以上の濃度においては、透明帯の膨化が顕著に認められた。
上記受精率の向上の結果と透明帯の膨化の結果より、１．０ｍＭ以上１．５０ｍＭ未満（０．３０ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ未満）のグルタチオン濃度においては、透明帯の膨化が顕著に現れないにもかかわらず、受精率の顕著な向上が確認された。
実施例３：メチル−β−シクロデキストリンとグルタチオンの併用作用
精子の前培養における、グルタチオン及びメチル−β−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）の影響を、実施例１と同様にして確認した。精子の前培養に用いたＴＹＨ培地は、ウシ血清アルブミンの代わりにポリビニルアルコール（１．０ｍｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ社より入手）用い、メチル−β−シクロデキストリン（０．７５ｍＭ、ＳＩＧＭＡ社より入手）を加えた以外は、上記の組成に従って調製した。また、ＴＹＨ培地中のグルタチオン濃度は１ｍＭとし、実施例１と同様にして調製し、使用直前にＴＹＨ培地に添加した。メチル−β−シクロデキストリンを含有するもの、グルタチオンを含有するもの、両者を含有するもの、のそれぞれについて受精率に対する影響を比較した。
精子の前培養における、グルタチオン及びメチル−β−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）の影響を、実施例１と同様にして確認した。精子の前培養に用いたＴＹＨ培地は、ウシ血清アルブミンの代わりにポリビニルアルコール（１．０ｍｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ社より入手）用い、メチル−β−シクロデキストリン（０．７５ｍＭ、ＳＩＧＭＡ社より入手）を加えた以外は、上記の組成に従って調製した。また、ＴＹＨ培地中のグルタチオン濃度は１ｍＭとし、実施例１と同様にして調製し、使用直前にＴＹＨ培地に添加した。メチル−β−シクロデキストリンを含有するもの、グルタチオンを含有するもの、両者を含有するもの、のそれぞれについて受精率に対する影響を比較した。
実施例１と同様にして、卵丘・卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）を含む９０μｌのＨＴＦ培地（グルタチオン添加の場合は、濃度を１ｍＭとした）にて、受精を行った（表中のＩＶＦ／グルタチオン）。精子はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの凍結精子を用い、図１に示す工程に従って行った。融解精子は、ＴＹＨ培地（±グルタチオン、±メチル−β−シクロデキストリン）中、３７℃で、３０分間、前培養し、運動性を示す精子を回収して、受精に用いた。実験は５回行った。結果を、以下の表７に示す。
上記結果も、未受精卵をグルタチオンで処理することにより、受精率の顕著な向上を示している。
一方、精子のプレインキュベーションに関しては、精子を１ｍＭのグルタチオンで前処理しても、受精率の改善は見られないことが示された。しかし、精子をメチル−β−シクロデキストリンで処理したものは受精率が向上し、さらに未受精卵をグルタチオンで処理することと組み合わせた場合は、受精率が大きく向上していることが示された。
一方、精子のプレインキュベーションに関しては、精子を１ｍＭのグルタチオンで前処理しても、受精率の改善は見られないことが示された。しかし、精子をメチル−β−シクロデキストリンで処理したものは受精率が向上し、さらに未受精卵をグルタチオンで処理することと組み合わせた場合は、受精率が大きく向上していることが示された。
実施例４：未受精卵の透明帯の除去（１）
上記「１．卵子の調整」に従って準備した卵丘細胞が除去されたマウス新鮮未受精卵子を調製した。グルタチオンを１００ｍＭ（３０．７ｍｇ／ｍｌ）含有するＨＴＦ培地で、９０秒間、２０℃で処理した。行った操作を、図７を参照して説明する。シャーレの底に１０μｌのグルタチオン含有ＨＴＦ培地を滴下し、その中に１０個の胚を挿入した。３０秒後には、透明帯の薄くなり始め（膨化し）、９０秒後には、完全に透明帯が消失した。透明帯の消失を確認後、胚へダメージを避けるために、直ちに、１０００μｌのグルタチオンを含有しないＨＴＦ培地で希釈した。その後、透明帯除去胚を１００μｌのＨＴＦのドロップ中へ移動し、さらに２回１００μｌのＨＴＦのドロップ中へ胚を移動し、培養を続けた。
上記「１．卵子の調整」に従って準備した卵丘細胞が除去されたマウス新鮮未受精卵子を調製した。グルタチオンを１００ｍＭ（３０．７ｍｇ／ｍｌ）含有するＨＴＦ培地で、９０秒間、２０℃で処理した。行った操作を、図７を参照して説明する。シャーレの底に１０μｌのグルタチオン含有ＨＴＦ培地を滴下し、その中に１０個の胚を挿入した。３０秒後には、透明帯の薄くなり始め（膨化し）、９０秒後には、完全に透明帯が消失した。透明帯の消失を確認後、胚へダメージを避けるために、直ちに、１０００μｌのグルタチオンを含有しないＨＴＦ培地で希釈した。その後、透明帯除去胚を１００μｌのＨＴＦのドロップ中へ移動し、さらに２回１００μｌのＨＴＦのドロップ中へ胚を移動し、培養を続けた。
透明帯除去の状態を倒立顕微鏡により確認した。図４ａは、グルタチオン処理前の未受精卵である。図４ｂは、グルタチオン処理後の未受精卵である。図に示されるように、グルタチオン処理の結果、未受精卵の透明帯が除去された。
次いで、一般的に受精能の低いＣ５７ＢＬ／６マウスの凍結精子を使用し、上記のようにして調整した透明帯除去卵子を用いた以外は実施例１と同様にして、受精を行った。受精能の低い精子を用いても受精が起こり、卵の発生（卵の分割）が確認された。結果を、図４ｃに示す。
上記の実験を１０回繰り返した。結果は、７０個の胚を用いて、７０個の透明帯除去胚を作製でき、６６個の胚が胚盤胞期まで発生したことを確認した。この結果、胚の透明帯除去をすることにより、受精能が低い精子を用いた場合でも、非常に高い頻度で受精が行われ、発生が起こることが確認された。
上記の実験を１０回繰り返した。結果は、７０個の胚を用いて、７０個の透明帯除去胚を作製でき、６６個の胚が胚盤胞期まで発生したことを確認した。この結果、胚の透明帯除去をすることにより、受精能が低い精子を用いた場合でも、非常に高い頻度で受精が行われ、発生が起こることが確認された。
実施例５：未受精卵の透明帯の除去（２）
グルタチオン濃度を５０ｍＭ（１５．４ｍｇ／ｍｌ）としたＨＴＦ培地を用いた以外は、実施例４と同様にして、未受精卵の透明帯の除去を行った。５０ｍＭの濃度のグルタチオンを用いた場合にも、透明帯は完全に除去されたが、透明帯が消失するまでに７〜８分かかった。実験を２回繰り返したが、結果は、２０個の胚を用いて、２０個の透明帯除去胚を作成できた。
グルタチオン濃度を５０ｍＭ（１５．４ｍｇ／ｍｌ）としたＨＴＦ培地を用いた以外は、実施例４と同様にして、未受精卵の透明帯の除去を行った。５０ｍＭの濃度のグルタチオンを用いた場合にも、透明帯は完全に除去されたが、透明帯が消失するまでに７〜８分かかった。実験を２回繰り返したが、結果は、２０個の胚を用いて、２０個の透明帯除去胚を作成できた。
実施例６：凍結未受精卵の透明帯の除去
定法に従って、８週齢の雌マウスを用いて、マウスの凍結未受精卵を調製した。凍結未受精卵を融解後、実施例４と同様にして、グルタチオンを１００ｍＭ含有するＨＴＦ培地で、９０秒間、２０℃で処理し、その状態を顕微鏡により確認した。図５ａは、グルタチオン処理前の未受精卵である。図５ｂは、グルタチオン処理後の未受精卵である。図に示されるように、グルタチオン処理の結果、凍結融解未受精卵の透明帯が除去された。
実施例１と同様にして、透明帯を除去した未受精卵を用いて受精を行ったところ、受精率は２５％（１２５／４９２）であった。また、顕微鏡による観察により、精子の進入が容易になったことが示された（図５ｃ）。本発明の方法が、凍結受精卵にも有効であることが確認された。
定法に従って、８週齢の雌マウスを用いて、マウスの凍結未受精卵を調製した。凍結未受精卵を融解後、実施例４と同様にして、グルタチオンを１００ｍＭ含有するＨＴＦ培地で、９０秒間、２０℃で処理し、その状態を顕微鏡により確認した。図５ａは、グルタチオン処理前の未受精卵である。図５ｂは、グルタチオン処理後の未受精卵である。図に示されるように、グルタチオン処理の結果、凍結融解未受精卵の透明帯が除去された。
実施例１と同様にして、透明帯を除去した未受精卵を用いて受精を行ったところ、受精率は２５％（１２５／４９２）であった。また、顕微鏡による観察により、精子の進入が容易になったことが示された（図５ｃ）。本発明の方法が、凍結受精卵にも有効であることが確認された。
実施例７：透明帯の菲薄化及び除去とグルタチオン濃度
グルタチオン濃度及び処理時間が、透明帯の菲薄化及び除去に及ぼす影響を確認した。上記「１．卵母細胞の調整」に従って準備した卵丘細胞が除去されたマウス新鮮未受精卵子を調製した後、シャーレの底に１０μｌの種々の濃度（５，１０，２５，５０，１００，２００，及び３００ｍＭ）のグルタチオンを含有するＨＴＦ培地を滴下し、その中に２０個の卵子を挿入し、透明帯が除去されるまでの時間を測定した。結果を表８に示す。
グルタチオン濃度及び処理時間が、透明帯の菲薄化及び除去に及ぼす影響を確認した。上記「１．卵母細胞の調整」に従って準備した卵丘細胞が除去されたマウス新鮮未受精卵子を調製した後、シャーレの底に１０μｌの種々の濃度（５，１０，２５，５０，１００，２００，及び３００ｍＭ）のグルタチオンを含有するＨＴＦ培地を滴下し、その中に２０個の卵子を挿入し、透明帯が除去されるまでの時間を測定した。結果を表８に示す。
上記結果より、５０ｍＭ以上のグルタチオン濃度で透明帯が除去され、除去に必要な時間は、濃度依存的に減少した。なお、グルタチオン濃度の増加に伴い、処理培地のｐＨも下がる。
実施例９：グルタチオン処理による着床率（産子発生率）の上昇
実施例１と同様にして、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのマウス凍結精子を用いて、受精を行なった。次いで、グルタチオンを１ｍＭ含有するＨＴＦ培地で、受精卵を洗浄し、さらに培養（発生）行った。翌日、受精が確認された胚（２細胞期胚）を回収し、上記の定法に従い、雌マウスに移植し、産子数を確認した。ＨＴＦ培地中のグルタチオン濃度は１ｍＭとし、グルタチオンを含有しないＨＴＦ培地を用いて受精及び培養を行なったものをコントロールとした。
その結果、ＨＴＦ培地のみで、受精及び培養を行なった場合は、産子発生率は、３１／８０（３８．８％）であるのに対し、グルタチオン含有ＨＴＦ培地で受精及び培養を行なった場合は、４３／８０（５３．８％）であった。グルタチオンによる透明帯の菲薄化により、産子発生率（着床率）が上昇し、効果的に産子を作製できることが示された。
実施例１と同様にして、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのマウス凍結精子を用いて、受精を行なった。次いで、グルタチオンを１ｍＭ含有するＨＴＦ培地で、受精卵を洗浄し、さらに培養（発生）行った。翌日、受精が確認された胚（２細胞期胚）を回収し、上記の定法に従い、雌マウスに移植し、産子数を確認した。ＨＴＦ培地中のグルタチオン濃度は１ｍＭとし、グルタチオンを含有しないＨＴＦ培地を用いて受精及び培養を行なったものをコントロールとした。
その結果、ＨＴＦ培地のみで、受精及び培養を行なった場合は、産子発生率は、３１／８０（３８．８％）であるのに対し、グルタチオン含有ＨＴＦ培地で受精及び培養を行なった場合は、４３／８０（５３．８％）であった。グルタチオンによる透明帯の菲薄化により、産子発生率（着床率）が上昇し、効果的に産子を作製できることが示された。
実施例１０：マウス発生初期胚の透明帯の除去
遺伝子改変マウスの作製に用いるマウス発生初期胚（８細胞期胚）の透明帯の除去を行った。具体的には、調製したマウス発生初期胚（８細胞期胚）を、グルタチオンを１００ｍＭ含有するＨＴＦ培地で、９０秒間、２０℃で処理し、その状態を顕微鏡により確認した。図６ａは、グルタチオン処理前のマウス胚である。図６ｂは、グルタチオン処理後のマウス胚である。図に示されるように、グルタチオン処理の結果、遺伝子改変マウスの作製に用いる８細胞期胚からの透明帯の除去が容易に行え、ＥＳ細胞との共培養に適したマウス胚が調製された。
遺伝子改変マウスの作製に用いるマウス発生初期胚（８細胞期胚）の透明帯の除去を行った。具体的には、調製したマウス発生初期胚（８細胞期胚）を、グルタチオンを１００ｍＭ含有するＨＴＦ培地で、９０秒間、２０℃で処理し、その状態を顕微鏡により確認した。図６ａは、グルタチオン処理前のマウス胚である。図６ｂは、グルタチオン処理後のマウス胚である。図に示されるように、グルタチオン処理の結果、遺伝子改変マウスの作製に用いる８細胞期胚からの透明帯の除去が容易に行え、ＥＳ細胞との共培養に適したマウス胚が調製された。
実施例１１：グルタチオン処理卵子透明帯中のチオールの確認
上記「１．卵母細胞の調整」に従って準備した卵丘細胞が除去されたマウス新鮮未受精卵子を調製した後、シャーレの底に１００μｌの種々の濃度（０，０．２５，０．５，０．７５，１．０，１．２５，１．５及び２．０ｍＭ）のグルタチオンを含有するＨＴＦ培地を滴下し、その中に５０個の卵子を挿入し、３７℃で１時間処理した。その後、チオール反応性蛍光色素（Alexa Fluor 488 C5-maleimide）を用いて、透明帯中のタンパクチオールを検出した。蛍光標識の結果を図８に示す。また、各濃度のグルタチオンで処理した卵子の蛍光強度を図９に示す（コントロールを１００％とした）。
上記「１．卵母細胞の調整」に従って準備した卵丘細胞が除去されたマウス新鮮未受精卵子を調製した後、シャーレの底に１００μｌの種々の濃度（０，０．２５，０．５，０．７５，１．０，１．２５，１．５及び２．０ｍＭ）のグルタチオンを含有するＨＴＦ培地を滴下し、その中に５０個の卵子を挿入し、３７℃で１時間処理した。その後、チオール反応性蛍光色素（Alexa Fluor 488 C5-maleimide）を用いて、透明帯中のタンパクチオールを検出した。蛍光標識の結果を図８に示す。また、各濃度のグルタチオンで処理した卵子の蛍光強度を図９に示す（コントロールを１００％とした）。
この結果より、処理したグルタチオン濃度に応じて、透明帯中の蛍光強度が増加していること、即ち透明帯中のフリーのチオール基が増加していることが確認された。これは、グルタチオンが透明帯中のジスルフィド結合に作用して、少なくともその結合の一部を切断していることを示している。更には、結合の切断が増加するに伴い透明帯の膨化が進むことが示されている。
実施例１２：グルタチオン以外の還元剤による透明帯の菲薄化
実施例２と同様にして、他の還元剤（ＤＴＴ、アスコルビン酸（ＶＣ）、及びエピカテキン（ＥＣ））による透明帯の菲薄化及び膨化に及ぼす影響を確認した。それぞれの還元剤の濃度による未受精卵の透明帯の膨化の程度は、顕微鏡下で撮影し、以下の式により求めた。
％Relative area in ZP＝（各実験区の透明帯面積／０ｍＭの透明体面積）Ｘ１００
結果を図１０に示す。
実施例２と同様にして、他の還元剤（ＤＴＴ、アスコルビン酸（ＶＣ）、及びエピカテキン（ＥＣ））による透明帯の菲薄化及び膨化に及ぼす影響を確認した。それぞれの還元剤の濃度による未受精卵の透明帯の膨化の程度は、顕微鏡下で撮影し、以下の式により求めた。
％Relative area in ZP＝（各実験区の透明帯面積／０ｍＭの透明体面積）Ｘ１００
結果を図１０に示す。
ＤＴＴ、アスコルビン酸及びエピカテキンをそれぞれ０．５、５、１ｍＭ添加した培地で処理した未受精卵の透明帯の様子を図１１に示す。
図１０及び図１１の結果より、ＤＴＴ処理による透明体の菲薄化及び膨化が確認された。しかし一方、ＳＨ基を有しない還元剤である、アスコルビン酸又はエピカテキンでは、透明体の菲薄化又は膨化は起こらなかった。
図１０及び図１１の結果より、ＤＴＴ処理による透明体の菲薄化及び膨化が確認された。しかし一方、ＳＨ基を有しない還元剤である、アスコルビン酸又はエピカテキンでは、透明体の菲薄化又は膨化は起こらなかった。
実施例１３：グルタチオンによる各種系統のマウスにおける受精率の向上
実施例１と同様にして、種々の系統のマウスを用いて、グルタチオンによる受精率の向上を検討した。精子は、ＭＢＣＤで前培養した新鮮精子及び凍結精子を用いて受精を行った。ＨＴＦ培地中のグルタチオン濃度は、新鮮精子の場合は０．２５ｍＭとし、凍結精子の場合は１ｍＭとした。また、精子は受精前に、実施例３と同様にして、ＭＢＣＤ含有ＴＹＨ培地（グルタチオンなし）で前培養を行った。前培養時間は、新鮮精子と冷蔵精子の場合は１時間、凍結精子の場合は３０分とした。新鮮精子の結果を表９に、凍結精子の結果を表１０に示す。
実施例１と同様にして、種々の系統のマウスを用いて、グルタチオンによる受精率の向上を検討した。精子は、ＭＢＣＤで前培養した新鮮精子及び凍結精子を用いて受精を行った。ＨＴＦ培地中のグルタチオン濃度は、新鮮精子の場合は０．２５ｍＭとし、凍結精子の場合は１ｍＭとした。また、精子は受精前に、実施例３と同様にして、ＭＢＣＤ含有ＴＹＨ培地（グルタチオンなし）で前培養を行った。前培養時間は、新鮮精子と冷蔵精子の場合は１時間、凍結精子の場合は３０分とした。新鮮精子の結果を表９に、凍結精子の結果を表１０に示す。
新鮮精子の場合は、０．２５ｍＭのグルタチオン濃度で受精率の十分な改善がみられた。また、全てのマウスの系統において、グルタチオン添加により凍結精子による受精率の著しい向上が確認された。
実施例１４：ＭＢＣＤ及びグルタチオンによる冷蔵精子の受精率の向上
実施例１と同様にして、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの冷蔵精子を用いて、ＭＢＣＤ及びグルタチオンによる受精率の向上を検討した。精子は、受精前に、実施例３と同様にしてＭＢＣＤ含有ＴＹＨ培地（グルタチオンなし）で前培養を行った。前培養時間は１時間とした。結果は、グルタチオンを添加しない場合の受精率が５２．４％であるのに対し、グルタチオンを０．５ｍＭ添加した場合には、受精率は８５．４％に上昇した。
実施例１と同様にして、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの冷蔵精子を用いて、ＭＢＣＤ及びグルタチオンによる受精率の向上を検討した。精子は、受精前に、実施例３と同様にしてＭＢＣＤ含有ＴＹＨ培地（グルタチオンなし）で前培養を行った。前培養時間は１時間とした。結果は、グルタチオンを添加しない場合の受精率が５２．４％であるのに対し、グルタチオンを０．５ｍＭ添加した場合には、受精率は８５．４％に上昇した。
上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
本発明は、哺乳動物の体外受精、受精卵の子宮移植（着床）において有用である。本発明はさらに、遺伝子改変動物の作製工程において用いることができる有用な技術である。
Claims (14)
- 以下の工程：
ａ．非ヒト哺乳動物の精子を、０．１ｍＭ以上２０ｍＭ以下のシクロデキストリン及び０．１ｍＭ以上１０ｍM以下のカルシウムを含有する培地で前培養する工程、
ｂ．非ヒト哺乳動物の未受精卵の透明帯の菲薄化のために、該未受精卵を、還元型グルタチオンを０．２５ｍＭ以上１０ｍＭ以下の濃度で含有する培地に添加し、該還元型グルタチオンにより処理された未受精卵を調製する工程、及び
ｃ．工程ａで前培養した該精子を、工程ｂで還元型グルタチオンで処理した該未受精卵の存在する培地中に添加し媒精を行う工程、
を含む受精方法。 - 前記未受精卵がマウス未受精卵である請求項１に記載の受精方法。
- 前記シクロデキストリンがメチル−β―シクロデキストリンである請求項１又は２に記載の受精方法。
- 受精に用いる精子がマウス凍結精子であり、工程ａの精子の前培養を少なくとも１０分間行う、請求項１〜３のいずれか一つに記載の受精方法。
- 前記還元型グルタチオン濃度が、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下である、請求項１〜４のいずれか一つに記載の受精方法。
- 培地中の前記還元型グルタチオン濃度が、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ以下である、請求項５に記載の受精方法。
- 前記工程ｃの媒精を、前記工程ｂと同じ培地中で前記未受精卵と前記精子を数時間共培養することにより行う、請求項５又は６に記載の受精方法。
- 受精に用いる精子が、還元型グルタチオンを含まない培地で前培養されている新鮮精子、凍結精子、冷蔵精子又はそれらの組み合わせである、請求項１〜７のいずれか一つに記載の受精方法。
- 以下の培地（ｉ）及び（ｉｉ）からなる受精用培地キット：
（ｉ）非ヒト哺乳動物の精子を前培養するための、０．１ｍＭ以上２０ｍＭ以下のシクロデキストリン及び０．１ｍＭ以上１０ｍＭ以下のカルシウムを含有する精子前培養用培地、及び
（ｉｉ）非ヒト哺乳動物の卵と精子の受精を行うための、０．２５ｍＭ以上１０ｍＭ以下の濃度の還元型グルタチオンを含有する受精用培地。 - 前記還元型グルタチオン濃度が、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上３．０ｍｇ／ｍｌ以下である、請求項９に記載の受精用培地キット。
- 前記還元型グルタチオン濃度が、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上０．４６ｍｇ／ｍｌ以下である、請求項１０に記載の受精用培地キット。
- 前記精子前培養用培地が、還元型グルタチオンを実質的に含有しない請求項９〜１１のいずれかひとつに記載の受精用培地キット。
- 前記精子前培養用培地が、ＴＹＨ培地、ＨＴＦ培地、ｍＲ１ＥＣＭ培地、ＢＯ培地、ＫＳＯＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ’ｓ ＰＢＳ培地、Ｍ２培地、ＰＢ１培地、Ｈａｎｋｓ培地、Ｈeｐeｓ-ＴＡＬＰ培地、Ｈoｐｐe＆Ｐｉｔｔｓ培地、ｍ−ＫＲＢ培地、ＨＩＳ培地、ｍＴＡＬＰ培地、ｍＴ培地、ＭＣＭ培地、ＣＣＭ培地、Ｋ−ＭＣＭ培地、ＢＷＷ培地、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、ＢＭＯＣ培地、Ｔ６培地、ＨＴ６培地、Ｂａｖｉｓｔｅｒ−ＴＡＬＰ培地、ＳＯＦ培地、Ｍｅｎｅｚｏ−Ｂ２培地、Ｈａｍ’ｓ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＭＥＭ培地、ｍＷＭ培地からなる群より選ばれる培地であり、かつ、前記受精用培地が、ＨＴＦ培地、ＴＹＨ培地、ｍＲ１ＥＣＭ培地、ＢＯ培地、ＫＳＯＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ’ｓ ＰＢＳ培地、Ｍ２培地、ＰＢ１培地、Ｈａｎｋｓ培地、Ｈeｐeｓ-TALP培地、Ｈoｐｐe＆Ｐｉｔｔｓ培地、ｍ−ＫＲＢ培地、ＨＩＳ培地、ｍＴＡＬＰ培地、ｍＴ培地、ＭＣＭ培地、ＣＣＭ培地、Ｋ−ＭＣＭ培地、ＢＷＷ培地、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、ＢＭＯＣ培地、Ｔ６培地、ＨＴ６培地、Ｂａｖｉｓｔｅｒ−ＴＡＬＰ培地、ＳＯＦ培地、Ｍｅｎｅｚｏ−Ｂ２培地、Ｈａｍ’ｓ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＭＥＭ培地、ｍＷＭ培地からなる群より選ばれる培地である、請求項９〜１２のいずれか一つに記載の受精用培地キット。
- 前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項９〜１３のいずれか一つに記載の受精用培地キット。
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