CN107034174B - 一种新型小鼠胚胎透明带去除试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种新型小鼠胚胎透明带去除试剂及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107034174B
CN107034174B CN201710463160.3A CN201710463160A CN107034174B CN 107034174 B CN107034174 B CN 107034174B CN 201710463160 A CN201710463160 A CN 201710463160A CN 107034174 B CN107034174 B CN 107034174B
Authority
CN
China
Prior art keywords
zona pellucida
baclofen
reagent
mouse
embryo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710463160.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107034174A (zh
Inventor
梁浩
葛良鹏
孙静
吴梦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Academy of Animal Sciences
Original Assignee
Chongqing Academy of Animal Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Academy of Animal Sciences filed Critical Chongqing Academy of Animal Sciences
Priority to CN201710463160.3A priority Critical patent/CN107034174B/zh
Publication of CN107034174A publication Critical patent/CN107034174A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107034174B publication Critical patent/CN107034174B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C12N2500/33—Amino acids other than alpha-amino carboxylic acids, e.g. beta-amino acids, taurine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种新型的溶解小鼠透明带的试剂，包括巴氯芬，所述巴氯芬的浓度为300μM‑10mM，所述试剂pH为5‑6。本发明处理小鼠透明带溶解快速，PH值高，对胚胎的伤害较小，可应用于体外受精、体外人工核移植等实验技术中。

Description

一种新型小鼠胚胎透明带去除试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于胚胎发育领域，涉及一种小鼠胚胎透明带去除试剂及其制备方法和应用。
背景技术
透明带(zona pelluccida，ZP)是一层包绕在所有哺乳动物卵母细胞外围的非细胞的糖蛋白结构，对卵子的发育、受精以及着床前胚胎发育起着关键性作用。小鼠的透明带由ZP1、ZP2、ZP3构成，与猪和人等其他哺乳动物不尽相同，ZP1、ZP2和ZP3在ZP中并非呈杂乱混融状，而是有其特定构型的。通过电镜分析知，ZP3呈重复的网格状纤维结构，通过二硫桥的方式将多个ZP2·ZP3异质二聚体连成一串珠状长链；ZP1通过形成二聚体连接ZP1和ZP2，三者相结合构成具有三维构型的网格蛋白。IVF(in vitro fertilization，体外受精)、体外人工核移植以及其他需要对早期胚胎显微操作的研究都需要在着床前胚胎即透明带尚未消失前进行，所以透明带的存在成为上述研究的一种障碍，因此确定一种简单易行、快速去除透明带且对胚胎损伤最小的方法可以为上述研究打下良好的基础。
巴氯芬(Baclofen)分子结构为
Figure BDA0001322316620000011
其为γ-氨基丁酸的衍生物，是首个应用于临床的选择性GABA B受体激动剂，分子量为213.5，为白色粉末，熔点约为200℃，熔融时同时分解，溶于热水，微溶于乙醇、乙醚。对于baclofen的研究，大多数集中于临床方面的应用，主要是baclofen对神经系统和运动系统的镇痛、解痉作用，有少数几个报道则是研究baclofen在胃食管反流病中的治疗效果，在其他方面的研究则鲜有报道。
现有比较成熟去除透明带的方法主要为：酸性台式液去透明带法、0.5％链酶蛋白酶去透明带法。但是这些方法普遍存在对胚胎的安全性低，处理速度慢等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新型的溶解小鼠透明带的试剂和方法，其溶解快速，对胚胎的伤害较小，可直接应用于体外受精、体外人工核移植等实验技术中。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
巴氯芬(baclofen)在溶解小鼠透明带中的应用。
一种去除小鼠透明带试剂，包括巴氯芬，所述巴氯芬的浓度为300μM-10mM，所述试剂pH为5-6。为了进一步减小对胚胎的伤害，并提高溶解速率，所述巴氯芬的浓度为500μM，pH为5.5。
上述去除小鼠透明带试剂，其制备方法为将巴氯芬溶于PBS溶液中，pH调整为5.0-6.0，巴氯芬浓度为300μM-10mM。
本发明的另一目的在于提供利用上述试剂去除小鼠透明带的方法，包括以下步骤：
(1)获得小鼠任意时期胚胎并培养；
(2)将上述试剂用微旋移液器或其他微量注射器注向小鼠胚胎透明带，透明带立即
(1-2s)溶解；
(3)更换胚胎培养液更换，接续培养或做其他实验用。
有益效果
1.本发明能有效的去除小鼠透明带，速度快，1-2s内即刻可去除透明带，且透明带去除后胚胎活力不受影响，可以顺利进行多胚胎融合，形成超大囊胚。
2.本发明处理量大，仅需少量试剂就可处理大批对象，溶解20个胚胎只需要500μM的巴氯芬5μl以内，成本低，适合于工业化生产。
3.PH5-6即可快速溶解透明带，比传统的透明带去除所需PH值更中性，酸性条件要求低。
4.本发明处理胚胎后直接更换培养液即可得到实验用胚胎，操作简单。
附图说明
图1采用本发明去除透明带试剂有效溶解小鼠透明带的实物图1；
图2采用本发明去除透明带试剂有效溶解小鼠透明带的实物图2；
图3采用本发明去除透明带试剂溶解透明带后胚胎发育活力实验。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
一种去除小鼠透明带试剂，pH为5.5，试剂中包含浓度为500μM巴氯芬。该试剂的配制是将巴氯芬溶于PBS溶液中，将pH调整为5.5，巴氯芬浓度为500μM。
采用所得的去除小鼠透明带试剂处理小鼠胚胎，包括以下步骤：
1、超排小鼠：下午13时对小鼠超数排卵：经腹腔注射PMSG 10IU/只，48h后，经腹腔注射hCG 10IU/只。注射hCG后，按雌雄鼠2∶1合笼，次日上午8时检查雌鼠，通过检查是否有阴道栓以确定受精母鼠。
2、获取胚胎：确定受精母鼠的当天上午，将受精母鼠快速并人道的利用颈椎脱臼法处死，在无菌条件下，打开小鼠腹腔，用小剪刀取出输卵管以及部分靠近输卵管的子宫，置于M2培养液中。解剖显微镜下观察，找到膨大的输卵管壶腹部，用针头撕破壶腹部，即有被卵丘细胞包围的合子团流出。将合子移至透明质酸酶溶液(用M2稀释到0.3mg/mL)中，在解剖镜下观察，见卵丘细胞脱掉立即将受精卵转移到含新鲜FHM操作液中，洗3-5次，以去除残留的透明质酸酶、卵丘细胞以及杂质。
3、胚胎培养：在50mm小皿中制作6-9个KMSO培养液滴，每个液滴约含有30ul培养液，随后盖上液体石蜡，将上一步获取的胚胎转移至培养液滴中，每个液滴约含20个胚胎。
4、去除透明带：用微旋移液器或口吸管将胚胎溶解液注入培养液滴中(浓度为500μM，注射量为2μl。
实验结果：
1.胚胎透明带去除情况如图1和图2所示。图1中(A)为带有透明带的小鼠胚胎(8细胞期)，(B)为用巴氯芬液去除小鼠透明带的小鼠胚胎(8细胞期)。图2(A-F)为间隔1s连续拍照，可见胚胎透明带迅速溶解(1-2s)。
2.溶解透明带后胚胎活力实验
溶解透明带后继续培养，实现了多胚胎融合如图3所示，处理组透明带溶解之后半小时后再换新鲜培养液继续培养，于24h形成多胚胎融合，48h形成超大囊胚，证明其活力良好。(A)处理组用透明带溶解液处理后的胚胎，透明带已经去除；(B)处理组24h之后可见胚胎聚团正在融合；(C)48h后发育为一个特大囊胚；(D)对照组：上为正在脱带的正常囊胚，下为还未脱带的正常囊胚。
处理组为实验组，注入本发明去除小鼠透明带试剂。对照组所加试剂为PBS，其余培养条件均与实验组相同。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.巴氯芬(baclofen)在溶解小鼠透明带中的应用。
2.使用巴氯芬试剂去除小鼠透明带的方法，包括以下步骤：(1)获得小鼠任意时期胚胎并培养；(2)将所述试剂用微旋移液器或其他微量注射器注向小鼠胚胎透明带，透明带立即溶解；(3)更换胚胎培养液，继续培养或做其他实验用；其中所述巴氯芬试剂为巴氯芬的PBS溶液，巴氯芬浓度为300μM-10mM，pH为5.0-6.0。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述巴氯芬浓度为500μM，pH为5.5。
CN201710463160.3A 2017-06-15 2017-06-15 一种新型小鼠胚胎透明带去除试剂及其制备方法和应用 Active CN107034174B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710463160.3A CN107034174B (zh) 2017-06-15 2017-06-15 一种新型小鼠胚胎透明带去除试剂及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710463160.3A CN107034174B (zh) 2017-06-15 2017-06-15 一种新型小鼠胚胎透明带去除试剂及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107034174A CN107034174A (zh) 2017-08-11
CN107034174B true CN107034174B (zh) 2020-07-28

Family

ID=59542275

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710463160.3A Active CN107034174B (zh) 2017-06-15 2017-06-15 一种新型小鼠胚胎透明带去除试剂及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107034174B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1447854A (zh) * 2000-06-15 2003-10-08 田边制药株式会社 来自猿猴的胚胎干细胞
WO2012036107A1 (ja) * 2010-09-13 2012-03-22 国立大学法人熊本大学 透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製するための方法及び培地、該方法により調製された哺乳動物卵を用いた受精方法
CN106389313A (zh) * 2016-10-08 2017-02-15 安徽省逸欣铭医药科技有限公司 一种巴氯芬口服液组合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1447854A (zh) * 2000-06-15 2003-10-08 田边制药株式会社 来自猿猴的胚胎干细胞
WO2012036107A1 (ja) * 2010-09-13 2012-03-22 国立大学法人熊本大学 透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製するための方法及び培地、該方法により調製された哺乳動物卵を用いた受精方法
CN106389313A (zh) * 2016-10-08 2017-02-15 安徽省逸欣铭医药科技有限公司 一种巴氯芬口服液组合物

Also Published As

Publication number Publication date
CN107034174A (zh) 2017-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Neri et al. Understanding fertilization through intracytoplasmic sperm injection (ICSI)
Tesarik et al. Fertilizable oocytes reconstructed from patient's somatic cell nuclei and donor ooplasts
Nabavi et al. Effect of caffeine on motility and vitality of sperm and in vitro fertilization of outbreed mouse in T6 and M16 media
CA2856860C (en) Method of in vitro fertilization with delay of embryo transfer and use of peripheral blood mononuclear cells
KR100666595B1 (ko) 사람 난자의 체외성숙 및 체외수정을 위한연속합성배양액의 조성물 및 이를 이용한 배양방법
CN103271778B (zh) 利用卵细胞胞浆注射精子方法的小鼠微生物净化方法
CN111269877B (zh) 一种着床前无透明带胚胎聚合及体外培养的方法
CN107034174B (zh) 一种新型小鼠胚胎透明带去除试剂及其制备方法和应用
EP1293561B1 (en) Monkey-origin embryonic stem cells
Landim-Alvarenga et al. New assisted reproductive technologies applied to the horse industry: successes and limitations
CN107043743B (zh) 犬卵母细胞的体外成熟方法
Mitalipov et al. Nuclear transfer in nonhuman primates
Parmar et al. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and its applications in veterinary sciences: An overview
Granot et al. Preparation and evaluation of oocytes for ICSI
Ranganath et al. A study to find optimal intra-cytoplasmic sperm injection timing of oocytes matured from germinal vesicle in in vitro maturation cycles using a time lapse system
Meng et al. Role of germinal vesicle on protein synthesis in rat oocyte during in vitro maturation
Abu Elmagd et al. A Modified ICSI Technique: Using Zona Pellucida as A Natural Bait
CN100457902C (zh) 一种制备单个卵裂球染色体的方法
CN108344868B (zh) 人组蛋白H3 Ser10和Ser28在鉴定人早期胚胎的发育分期中的应用
Chang et al. Assisted reproductive technology in nonhuman primates
CN108344867B (zh) 人组蛋白H3 Ser10和Ser28在鉴定人卵母细胞成熟分期中的应用
CN113801840A (zh) 一种提高小鼠体外受精效率的操作液及其使用方法
El-Gezeiry et al. Effect Of Chemical Activation On Oocytes And The Optimum Time On Icsi Outcome
Cummins et al. Ultrastructural observations on gamete interactions using micromanipulated mouse oocytes
Karja Nuclear maturation of porcine oocytes in vitro: effect of the cumulus-oocyte complexes quality

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant