CN111269877B - 一种着床前无透明带胚胎聚合及体外培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种着床前无透明带动物胚胎聚合及体外培养的方法，属于胚胎工程、发育生物学技术领域。本发明将处于2—8细胞期的动物胚胎去除透明带后，置于覆盖有胚胎级矿物油及G1或M16培养液的低溶点琼脂糖微滴孔中聚合，在37°C，6％CO2，5％O2，89％N2的三气培养箱中进行体外培养，发育到囊胚。本发明中分别对小鼠着床前无透明带受精胚和孤雌胚进行了聚合及体外培养，发现采用本发明的凝胶微滴孔法，囊胚发育率分别达到89.47％、82.14％，显著高于现有技术。该方法适用于动物的着床前无透明带胚胎的聚合胚的及其体外培养。

Description

一种着床前无透明带胚胎聚合及体外培养的方法
技术领域
本发明涉及一种着床前无透明带胚胎聚合及体外培养的方法，属于胚胎工程、发育生物学技术领域。
背景技术
嵌合体是由两个或两个以上具有不同遗传性状的胚胎或细胞结合在一起发育而成的胚胎。嵌合体的制作方法主要有囊胚注射和聚合法两种。聚合法操作简单，不需要特殊的仪器设备，但其成功率却低于囊胚注射法。其原因可能是聚合法主要依赖于手工操作，各个环节的技术性和操作性都很强，例如透明带去除、胚胎聚合条件、聚合胚的培养液和无透明带胚胎培养条件等，影响因素较多。
透明带在受精卵进行卵裂的过程中，可以阻止卵裂球分散、提高卵裂球之间的连接，保护受精卵内环境的稳定，对受精卵起着重要的保护作用。因此如何保证无透明带胚胎的正常发育是胚胎聚合及手工克隆胚胎领域急需解决的问题之一。
无透明带胚胎培养方法主要有微滴单卵培养法、WOW培养法（参考文献：Vajta G,Peura TT, Holm P, et al. New method for culture of zona-included or zona-freeembryos: the Well of the Well (WOW) system. Mol Reprod Dev. 2000; 55(3):256-64.）、改进的WOW法（即下文的凝胶孔培养法，参考文献：Peura TT, Vajta G. Acomparison of established and new approaches in ovine and bovine nucleartransfer. Cloning Stem Cells. 2003; 5(4):257-77.）、GO培养法（参考文献：ThouasGA, Jones GM, Trounson AO. The 'GO' system--a novel method of microculturefor in vitro development of mouse zygotes to the blastocyst stage.Reproduction. 2003; 126(2):161-9.）、微滴单卵培养法、琼脂柱包埋培养法及海藻酸钙凝胶包埋培养法（参考文献：Liu HCC, Trias ZYHG, Rosenwaks Z. Rescue of zona-freeembryos by partial encapsulation with collagen followed by coculture withendometrial cells. Fertility & Sterility. 2004; 82(3):S89-S90.）等。研究表明，WOW法优于微滴单卵培养法与凝胶包埋培养法（参考文献：小鼠无透明带胚胎培养方法的优化. 农业生物技术学报. 2008; 16(2):270-5.），与WOW法相比，微滴单卵培养法没有群卵培养的优势，而凝胶包埋培养法则不利于营养物质的供给与有毒代谢物的扩散。
近年来，WOW法被广泛应用于无透明带克隆胚胎的培养（参考文献：Peura TT.Improved in vitro development rates of sheep somatic nuclear transfer embryosby using a reverse-order zona-free cloning method. Cloning Stem Cells. 2003;5(1):13-24.；Jena MK, Malakar D, De AK, et al. Handmade cloned andparthenogenetic goat embryos – A comparison of different culture media anddonor cells. Small Ruminant Research. 2012; 105(1-3):255-62.；Alexopoulos NI,French AJ. The prevalence of embryonic remnants following the recovery ofpost-hatching bovine embryos produced in vitro or by somatic cell nucleartransfer. Anim Reprod Sci. 2009; 114(1-3):43-53.），同时也应用于胚胎聚合制备嵌合体或提高克隆成功率（参考文献：Simmet K, Reichenbach M, Reichenbach HD, et al.Phytohemagglutinin facilitates the aggregation of blastomere pairs from Day 5donor embryos with Day 4 host embryos for chimeric bovine embryomultiplication. Theriogenology. 2015; 84(9):1603-10.；Hiriart MI, Bevacqua RJ,Canel NG, et al. Production of chimeric embryos by aggregation of bovine egfpeight-cell stage blastomeres with two-cell fused and asynchronic embryos.Theriogenology. 2013; 80(4):357-64.；Gambini A, De Stefano A, Bevacqua RJ, etal. The aggregation of four reconstructed zygotes is the limit to improve thedevelopmental competence of cloned equine embryos. PLoS One. 2014; 9(11):e110998.），可以提高无透明带胚胎的发育率。WOW法的U型或V型小凹可以代替透明带的束缚作用，避免无透明带培养胚胎中的卵裂球松散开来，这一点尤其有利于嵌合体制备过程中胚胎的聚合。甚至有研究表明，应用WOW培养无透明带胚胎得到的囊胚比有透明带囊胚中的细胞数更多（参考文献：Li J, Vjata G, Callesen H. 151 COMPARISON OF CELLNUMBERS OF ZONA-INTACT AND ZONA-FREE PARTHENOGENETICALLY ACTIVATED PORCINEEMBRYOS CULTURED IN VITRO. Reproduction Fertility & Development. 2009; 22(1):234-.）。其原因可能是由于胚胎与培养基在无透明带的条件下接触更充分，有毒代谢产物也更容易扩散，因此更有利于胚胎的发育。
目前制作小凹的方法主要有：1、使用尖锐器械（例如金属针、胚胎聚集针等）在培养皿底部压制小凹（以下简称压凹法，参考文献：Vajta G, Korosi T, Du Y, et al. TheWell-of-the-Well system: an efficient approach to improve embryo development.Reprod Biomed Online. 2008; 17(1):73-81.）；2、或者使用加热的器械（例如金属针、玻璃针等）在培养皿底部烫制小凹（以下简称烫凹法）；3、在培养皿底部铺一层凝胶，在凝胶上制作小凹（以下简称凝胶孔法）。其中使用烫凹法制作小凹时，需在每隔小凹制作之前先用酒精火焰将针烧热，耗时较长，覆盖培养液后容易出现气泡，不容易清除，且塑料烫制后可能会产生一些毒性物质。而使用压凹法制作小凹对操作技术要求较高，且可能出现塑料碎屑，影响胚胎发育。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种无透明带的2-8细胞期胚胎间的聚合或者2-8细胞胚胎与胚胎干细胞间的聚合及其体外培养发育到囊胚的方法；建立的着床前无透明带聚合胚的体外培养方法，适用于小鼠着床前无透明带聚合胚的体外培养。本发明的目的在于提供一种着床前无透明带胚胎聚合及体外培养的方法，是将处于2-8细胞期的胚胎去除透明带后，置于覆盖有胚胎级矿物油及G1或M16培养液的低溶点琼脂糖微滴孔中聚合，进行体外培养，发育到囊胚；所述低溶点琼脂糖微滴孔是利用低溶点的琼脂糖制成微滴并在其表层打微孔，以用于两个及两个以上无透明带胚胎的聚合及体外发育培养。
在本发明的一种实施方式中，所述体外培养的条件是在35-39℃，4-8% CO2，3-7%O2，85-93% N2的三气培养箱中培养。
在本发明的一种实施方式中，用于无透明带胚胎的聚合及着床前体外培养的物种为鼠。
在本发明的一种实施方式中，低溶点琼脂糖的溶点是39℃，使用时溶解于无菌的PBS（磷酸盐缓冲液）中，使用的浓度范围为0.5-1.0%。
在本发明的一种实施方式中，0.5-1.0%低溶点琼脂糖制成的微滴直径在1-2.5 mm（体积约在1-3 μL）；在琼脂糖微滴凝固块表面打孔的直径在200-800 μm（根据不同种的胚胎直径确定），孔的深度在300-800 μm（约3-5枚胚胎直径）。
在本发明的一种实施方式中，所述琼脂糖微滴孔的制备方法是将低溶点琼脂糖应用PBS缓冲液配制成的终浓度为0.5-1.0%；使用前，将1%琼脂糖应用微波炉加热使之溶解后，置于40-50℃的水浴中平衡1-1.5 h，然后吸入琼脂糖，制成直径大约在1-2 mm的微球块（约1-3 μL），待其凝固后，用直径300-800 μm吸卵管打孔。
在本发明的一种实施方式中，无透明带胚胎的聚合及体外培养的方法，其应用包括但不限于:（1）受精卵来源的两个2-8细胞期胚胎的聚合（2N-2N）与体外培养；（2）孤雌激活来源的两个2-8细胞期胚胎的聚合（2N-2N）与体外培养；（3）受精卵来源的2-8细胞期胚胎与2-细胞融合后发育至2-8细胞期胚胎的聚合（2N-4N）与体外培养；（4）受精卵来源的2-8细胞期胚胎与若干个胚胎干细胞或组织干细胞的聚合（2N-2N）与体外培养；（5）2-细胞融合后发育至2-8细胞期胚胎与若干个胚胎干细胞或组织干细胞的聚合（4N-2N）与体外培养；（6）2-细胞融合后发育至2-8细胞期胚胎与或发育至2-8细胞期核移胚胎的聚合（4N-4N）与体外培养等等。
本发明的有益效果：
本发明采用低熔点琼脂糖凝胶作为制作小孔的材料，加热熔化后，制成琼脂糖微液滴，在其凝固后的微半球上制作小孔，再用培养基覆盖琼脂糖微半球（以下简称凝胶微滴孔法）。本发明与现有的凝胶孔法相比，使用的琼脂糖和培养基大大减少，并能实现胚胎的微滴培养，增加了无透明带聚合胚的囊胚发育效率。而与压凹法或烫凹法相比，本发明克服了这两种方法在移动培养皿时胚胎容易从小凹内溢出的问题，增加了聚合的效率；同时减少了制凹过程中产生对胚胎发育不利的副作用，提高两个胚胎的聚合率及囊胚发育率，如本发明中分别对小鼠着床前无透明带受精胚和孤雌胚进行了聚合及体外培养，发现采用本发明的凝胶微滴孔法，囊胚发育率分别达到89.47%、82.14%，显著高于现有技术。此外，本发明中一个琼脂糖微块内根据实验需要可制备1-4个小孔，构成一个独立的培养微环境，而现有报道中的凝胶孔法中有数十个小凹通过培养基相连，彼此之间不构成一个独立的微环境。
附图说明
图1：着床前无透明带聚合胚的体外培养方法技术路线。
图2：用于胚胎聚合培养的四种微孔，其中，a：凝胶微滴孔（即本发明的方法）；b：压凹；c：烫凹；d：凝胶块孔。
图3：具有双原核的卵母细胞，其中，a：来自受精的卵母细胞，具有大小不等的雌雄原核；b：来自孤雌激活的卵母细胞，具有大小相等的双原核。
图4：透明带去除前后的4细胞期胚胎，其中，a：来自自然受精的4-细胞胚；a’：图a中去除透明带的4-细胞胚；b：来自孤雌激活的4-细胞胚；b’：图b中去除透明带的4-细胞胚。
图5：四种微孔中的4-细胞期胚胎聚合，其中，a：在凝胶微滴孔（本发明）中的两枚4-细胞胚；b：在压凹孔（对照组1）中的两枚4-细胞胚；c：在烫凹孔（对照组2）中的两枚4-细胞胚；d：在凝胶板孔（对照组3）中的两枚4-细胞胚。
图6：四种微孔中4-细胞聚合胚的囊胚发育，其中，a：在凝胶微滴孔（本发明）中聚合胚发育的囊胚；b：在压凹孔（对照组1）中聚合胚发育的囊胚；c：在烫凹孔（对照组2）中聚合胚发育的囊胚；d：在凝胶板孔（对照组3）中聚合胚发育的囊胚。
图7：小鼠聚合囊胚的DAPI染色图，其中，a：明视野；a’：对应于图7a的荧光图，标★号为聚合胚发育的囊胚，无透明带；标▲为正常受精卵发育的囊胚，有透明带。
具体实施方式
本发明的着床前无透明胚胎聚合及体外培养技术路线见图1。本发明的主要内容由以下各部分组成，其核心是有利于两个无透明带胚胎聚合的琼脂糖块及微孔的制备，并将带有微孔的琼脂糖置于G1培养液（见以下方法）中，其它部分也是本发明的重要组成部分。
（一）超数排卵
超数排卵是指采用制剂诱导动物一次排出正常排卵数若干倍的方法。通过激素处理，如：孕马血清促性激素（PMSG）、促卵泡激素（FSH）、促卵泡激素释放因子（LRH）、人绒毛膜激素（HCG）等，使母畜呈非季节性排卵，并且在一次排卵中，能排出较多的卵子。
具体方法是：啮齿类动物（如小鼠，大鼠等），注射7.5 IU的PMSG（三生生物），48小时后注射7.5 IU的HCG（三生生物），16小时后以回收卵母细胞，或者注射HCG后立即自然配种，24小时后以回收受精卵。家畜（如牛、羊、兔等）肌注氯前列烯醇（PG，上海计划生育研究所）0.06-0.1mg/次，间隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG 10-14天后开始超排，即首先肌肉注射FSH（宁波激素制品厂），用量按7-12 IU/Kg计（不同种动物用量不尽相同），分6次，2次/日，每次间隔8-12小时。间隔24小时发情时注射LRH（上海东风制药厂），25 μg/次，注射LRH后28-30小时以回收处于MII期的卵母细胞，或者，注射LRH后12小时后自然配种，28-30小时后以回收受精卵。
（二）2倍体（2N）胚胎的制备
1、孤雌激活来源的2N胚胎制备
啮齿类动物卵母细胞的孤雌激活，将回收的处于MII期的卵母细胞，置于激活液中[含有5 µg/mL CB（sigma）、10mM SrCl2（sigma）的无Ca2+、Mg2+的M16（sigma）培养液]，在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中培养6-10 hr；家畜孤雌激活，将回收的处于MII期的卵母细胞，先在含10 μM 离子霉素（sigma）的M16液中处理5分钟，然后在含2μM 6-dimethylaminopurina(6-DMAP,sigma) 、5 μg/mL CB的M16液中，在37℃，6% CO2，5% O2，89%N2的三气培养箱中培养4-6小时；激活后的卵母细胞均可以见到双原核。然后将上述激活后的卵母细胞，置于M16或G1液滴中，在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中培养2-3.5天，获得2N的4-8细胞期的胚胎。
、正常受精来源的2N胚胎制备
经超排的或自然发情后交配的动物，回收其1细胞期受精卵，置于M16或G1（sigma）中，在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中培养2-3.5天，获得2N的4-8细胞期的胚胎。
（三）4倍体(4N)胚胎的制备
将发育至2细胞期的胚胎，在融合液[含0.3mmol/L 甘露醇、0.05mmol/L CaCl2(sigma )、0.1mmol/L MgSO4( sigma )和5% BSA( sigma )的M16液]中进行融合处理。融合条件：牛羊等家畜为1次直流脉冲（DC），电场强度600-610 V/cm，脉冲宽度为80 ms；小鼠等啮齿动物为2次脉冲，电场强度80 V/cm。通过上述处理使2细胞融合成1细胞胚胎，然后继续在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中培养2天，获得4N的4-8细胞期的胚胎。
（四）透明带的去除
将带有透明带的胚胎在含有0.5%链蛋白酶的M2（sigma）中处理5-10分钟，待透明带消失后，立即移置M16或G1中洗涤3次，去除透明带的胚胎置于M16或G1中待用。
（五）琼脂糖微滴与微孔的制备
将低溶点琼脂糖（Sigma），应用PBS配制成的终浓度为1%。使用前，将1%琼脂糖应用微波炉加热使之溶解后，置于45℃的水浴中平衡1小时，然后用移液枪吸入约1-3 μL琼脂糖，在30 mm皿中制成微球块，待其凝固后，用直径约200-600 μm吸卵管打孔（约为该物种卵母细胞直径的2-3倍），详见图2a。
（六）无透明带胚的聚合与体外培养
在制成微孔的琼脂糖微块上滴加15 μL的M16或G1培养液，再覆盖胚胎级矿物油（sigma），在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中平衡过夜。将去除透明带的胚胎成对置于琼脂糖微孔中，在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中培养4-7 d（根据动物种类确定培养时间），观察并统计其聚合与发育至囊胚的情况。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 小鼠着床前无透明带受精胚的聚合及体外培养
1 材料与方法
1.1 试剂：本实验所用试剂均为胚胎级试剂，除另有说明外均为Sigma产品。
1.2 方法
1.2.1 实验分组：
本实验分为实验组与对照组，分别为：
实验组：为凝胶微滴孔法培养，即本发明的方法，采用1%的低熔点琼脂糖凝胶加热熔化后，制成1-3 μL琼脂糖微液滴，在其凝固后的微小块上制作小孔（图2a），详细方法见下文“1.2.4 凝胶微滴孔的制备”。
对照组Ⅰ：为压凹法培养，即使用尖锐器械（眼科镊）在培养皿底部压制小凹（图2b），详细方法见文献Vajta G, Korosi T, Du Y, et al. The Well-of-the-Wellsystem: an efficient approach to improve embryo development. Reprod BiomedOnline. 2008; 17(1):73-81.；
对照组Ⅱ：为烫凹法培养，即用加热的器械（眼科镊）在培养皿底部烫制小凹（图2c），详细方法见文献Vajta G, Peura TT, Holm P, et al. New method for culture ofzona-included or zona-free embryos: the Well of the Well (WOW) system. MolReprod Dev. 2000; 55(3):256-64.；
对照组Ⅲ：为凝胶孔法培养，即在培养皿底部铺一层1%的低融点琼脂糖凝胶，在凝胶上制作小凹（图2d），详细方法见文献Peura TT, Vajta G. A comparison ofestablished and new approaches in ovine and bovine nuclear transfer. CloningStem Cells. 2003; 5(4):257-77.。
1.2.2 小鼠超排与受精卵采集
所用小鼠为ICR母鼠，6-8周龄，购自南京医科大学实验动物中心。用PMSG、HCG按常规进行超数排卵，注射7.5 IU的PMSG后48小时，注射7.5 IU的HCG，与ICR公鼠以1:1的比例合笼。0.5天后查看阴道栓，并在注射HCG后18小时采用脱颈椎的方法处理小鼠。在M2液中，从输卵管壶腹部刺出带有大量颗粒细胞的卵，置于M16液中作短暂的培养，然后用0.1%的透明质酸酶液去除附着的颗粒细胞，收集的卵用M16洗涤三次后，选出有原核的卵（图3a）即受精卵放置于覆盖有矿物油的G1液滴中，在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2三气培养箱中培养40h左右，获得4细胞期的胚胎（图4a）。
1.2.3 4-细胞期胚胎透明带的去除
将带有透明带的4-细胞胚胎转移至15 μL含有0.5%链蛋白酶的M2中，37℃，6%CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中消化5-13 min，待透明带消失后，立即移至G1中洗涤3次。将无透明带的胚胎（图4a）置于G1中待用。
1.2.4 凝胶微滴孔的制备
将低溶点琼脂糖加热溶解在PBS中配制成的终浓度为1%的溶液，趁热分装。使用前，将琼脂糖凝胶在微波炉中加热熔化后，置于45℃的水浴中平衡1小时，然后用移液枪吸入约1-3 μL琼脂糖，在直径35 mm培养皿中制成微球块，待其凝固后，用直径约400 μm吸卵管在其表面中部打孔。
1.2.5 无透明带胚的聚合与体外培养
实验组：即凝胶微滴孔法培养，在30 mm培养皿内制备10-20个凝胶微滴，每个凝胶微滴制成1-4个微孔，然后在每个琼脂糖微滴上覆盖15 μL G1培养液滴，再在整个皿内覆盖矿物油；对照组Ⅰ、对照组Ⅱ：分别在30 mm培养皿内制备10-20个的小凹上，每个小凹上覆盖15 μL G1培养液滴，再在整个30 mm培养皿内覆盖矿物油；对照组Ⅲ：在一四孔板的一个孔内铺上300 μL的1%琼脂后，凝固后制成小凹，加入约400 μL G1培养液，再覆盖500 μL矿物油。上述均同时在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中平衡过夜。将去除透明带的4-细胞期胚胎成对置于四个实验组、对照组中的微孔或小凹中进行聚合（分别见图5），在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中培养48 h，分别观察并统计其聚合与发育至囊胚（分别见图6）的情况。
2. 结果
本实验共进行了三批，实验结果详见表1。
表1 小鼠受精卵与4C期胚胎聚合及其体外发育
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注：1、实验组：凝胶微滴孔法培养；对照组1：压凹法培养；对照组2：烫凹法培养；对照组3：凝胶孔法培养；
2、2C率（%）=2C数/培养卵数×100；4C率（%）=4C数/培养卵数×100；聚合率（%）=聚合数/4C配对数×100；囊胚率（%）=囊胚数/4C配对数×100。
从表1中的结果我们看出，实验共超排获得了10只见栓的ICR母鼠，获得卵180枚，平均每只鼠获卵18枚，见原核卵数166枚，平均受精率92.22%；经体外培养后分别获得2细胞（2C）、4细胞（4C）期胚胎157枚、147枚，2C的发育率为94.58%，4C的发育率88.55%。
发育的4细胞期卵经链蛋白酶消化去除透明带后，进行两两配对，其聚合与囊胚发育结果为，实验组的4C聚合率为100%，与三个对照组无显著性差异，但聚合胚的囊胚发育率，实验组达到89.47%，均显著地高于对照组1（80.00%）、对照组2（64.71%）、对照组3（75.00%），上述结果详见表1。
上述结果表明，我们成功建立了小鼠受精来源的4细胞胚胎无透明带胚胎应用低溶点琼脂糖凝胶微滴孔进行聚合并培养到囊胚的方法，应用该方法获得的聚合胚的体外囊胚效率均显著优于压凹法、烫凹法、凝胶孔法的体外培养方法。
实施例2 小鼠着床前无透明带孤雌胚的聚合及体外培养
1 材料与方法
1.1试剂本实验所用试剂均为胚胎级试剂，除另有说明外均为Sigma产品。
1.2 方法
1.2.1 实验分组，同实施例一。
本实验分为实验组与对照组，分别为：
实验组：为凝胶微滴孔法培养，即本发明的方法，采用1%的低熔点琼脂糖凝胶加热熔化后，制成1-3 μL琼脂糖微液滴，在其凝固后的微小块上制作小孔（图2a），详细方法见下文“1.2.4 凝胶微滴孔的制备”。
对照组Ⅰ：为压凹法培养，即使用尖锐器械（眼科镊）在培养皿底部压制小凹（图2b），详细方法见文献Vajta G, Korosi T, Du Y, et al. The Well-of-the-Wellsystem: an efficient approach to improve embryo development. Reprod BiomedOnline. 2008; 17(1):73-81.；
对照组Ⅱ：为烫凹法培养，即用加热的器械（眼科镊）在培养皿底部烫制小凹（图2c），详细方法见文献Vajta G, Peura TT, Holm P, et al. New method for culture ofzona-included or zona-free embryos: the Well of the Well (WOW) system. MolReprod Dev. 2000; 55(3):256-64.；
对照组Ⅲ：为凝胶孔法培养，即在培养皿底部铺一层1%的低融点琼脂糖凝胶，在凝胶上制作小凹（图2d），详细方法见文献Peura TT, Vajta G. A comparison ofestablished and new approaches in ovine and bovine nuclear transfer. CloningStem Cells. 2003; 5(4):257-77.。
1.2.2 小鼠超排与卵母细胞采集
所用小鼠为ICR母鼠，6-8周龄，购自南京医科大学实验动物中心。用PMSG、HCG按常规进行超数排卵，注射7.5 IU的PMSG后48小时，注射7.5 IU的HCG，注射HCG后16 hr后，采用脱颈椎的方法处理小鼠，在M2液中，从输卵管壶腹部刺出带有大量颗粒细胞的卵母细胞，置于M16液中作短暂的培养，然后用0.1%的透明质酸酶液去除附着的颗粒细胞，收集的卵母细胞置于M16液中，在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中培养30 min，待用。
1.2.3 卵母细胞的孤雌激活与体外培养至4-细胞
将上述回收的MII期的卵母细胞，置于激活液中（含有5 µg/mL CB、10 mM SrCl2的无Ca2+、Mg2+的M16），在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中培养8 hr，用G1洗涤三次后，选出见有双原核的卵（图3b）置于覆盖有矿物油的G1液滴中，在三气培养箱中培养2 d，获得2N的4细胞期的胚胎（图4b）。
1.2.4 4-细胞期胚胎透明带的去除，方法同实施例一
将带有透明带的4-细胞胚胎转移至15 μL含有0.5%链蛋白酶的M2中，37℃，6%CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中消化5-13 min，待透明带消失后，立即移至G1中洗涤3次。去除透明带的胚胎（图4b’）置于G1中待用。
1.2.4 琼脂糖微滴与微孔的制备，方法同实施例一
将低溶点琼脂糖加热溶解在PBS中配制成的终浓度为1%的溶液，趁热分装。使用前，将琼脂糖凝胶在微波炉中加热熔化后，置于45℃的水浴中平衡1小时，然后用移液枪吸入约1-3 μL琼脂糖，在直径35 mm培养皿中制成微球块，待其凝固后，用直径约400 μm吸卵管打孔。
1.2.5 无透明带胚的聚合与体外培养，方法同实施例一
实验组：即凝胶微滴孔法培养，在30 mm培养皿内制备10-20个凝胶微滴，每个凝胶微滴制成1-4个微孔，然后在每个琼脂糖微滴上覆盖15 μL G1培养液滴，再在整个皿内覆盖矿物油；对照组Ⅰ、对照组Ⅱ：分别在30 mm培养皿内制备10-20制成的小凹上，每个小凹上覆盖15 μL G1培养液滴，再在整个30 mm培养皿内覆盖矿物油；对照组Ⅲ：在一四孔板的一个孔内铺上1%琼脂后，制成小凹，加入约400 μL G1培养液，再覆盖矿物油。上述均同时在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中平衡过夜。将去除透明带的4-细胞期胚胎成对置于四个实验组、对照组中的微孔或小凹中进行聚合，在37℃，6% CO2，5% O2，89% N2的三气培养箱中培养48 h，分别观察并统计其聚合与发育至囊胚的情况。
2. 结果
表2 小鼠卵母细胞孤雌激活与4细胞期胚胎聚合及其体外发育（n=3）
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注：1、实验组：凝胶微滴孔法培养；对照组1：压凹法培养；对照组2：烫凹法培养；对照组3：凝胶孔法培养；
2、2C率（%）=2C数/培养卵数×100；4C率（%）=4C数/培养卵数×100；聚合率（%）=聚合数/4C配对数×100；囊胚率（%）=囊胚数/4C配对数×100。
从表2中的结果我们看出，该实验共超排了15只ICR母鼠，获得卵母细胞378枚，平均每只鼠获卵母细胞25枚；见第一极体排出的处于MII期卵母细胞351枚，平均成熟率92.86%。348枚卵应用SrCl2、CB激活处理后，可见双原核的卵有287枚，平均激活率82.47%。体外培养的287枚中，247枚发育到2-细胞，占培养卵数的86.06%，201枚发育至4-细胞，占培养卵数的70.03%。201枚4-细胞全部应用链蛋白酶处理后去除透明带，可用的无透明带4细胞胚胎枚，然后每2枚4C胚组成一对，分别在四组所制备的孔中在体外继续培养，观察各组的4C聚合及聚合胚的囊胚发育情况。结果表明，实验组的4C聚合率达96.55%，与对照组1（91.30%）无差异，但显著高于对照组2（70.59%）、与对照组3（77.78%）；实验组的4C聚合胚的囊胚率达82.14%，均显著高于对照组1（66.67%）、对照组2（58.33%）与对照组3（64.29%）。对部分来自聚合胚的囊胚应用DAPI染色，可见聚合胚囊胚的细胞数（图7a）多于非聚合的正常囊胚的细胞数（图7a’ ）。
上述结果表明，我们建立了小鼠卵母孤雌激活来源的4细胞无透明带胚胎，应用低溶点琼脂糖微块微孔进行聚合并培养到囊胚的方法，应用该方法其聚合效率显著地高于烫凹法与凝胶孔法，且聚合胚的体外囊胚发育效率均优于压凹法、烫凹法、凝胶孔法的体外培养方法。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种着床前无透明带胚胎聚合及体外培养的方法，其特征在于，无透明带胚胎的聚合及着床前体外培养的物种为鼠，是将处于2-8细胞期的胚胎去除透明带后，置于覆盖有胚胎级矿物油及G1或M16培养液的低溶点琼脂糖微滴孔中聚合，进行体外培养，发育到囊胚；所述低溶点琼脂糖微滴孔是利用低溶点的琼脂糖制成微滴并在其表层打微孔，以用于两个及两个以上无透明带胚胎的聚合及体外发育培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体外培养的条件是在35-39℃，4-8%CO2，3-7% O2，85-93% N2的三气培养箱中培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低溶点琼脂糖使用时溶解于PBS中，使用的浓度范围为0.5-1.0％。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，低溶点琼脂糖制成的微滴体积在1.5-3.0μL；在琼脂糖微滴凝固块表面打孔的直径在200-800μm，孔的深度在300-800μm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎聚合包括受精卵来源的两个2-8细胞期胚胎的聚合。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎聚合包括孤雌激活来源的两个2-8细胞期胚胎的聚合。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎聚合包括受精卵来源的2-8细胞期胚胎与2-细胞融合后发育至2-8细胞期胚胎的聚合。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎聚合包括受精卵来源的2-8细胞期胚胎与若干个胚胎干细胞或组织干细胞的聚合。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎聚合包括2-细胞融合后发育至2-8细胞期胚胎与若干个胚胎干细胞或组织干细胞或发育至2-8细胞期核移胚胎的聚合。
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