RU2352637C1

RU2352637C1 - Способ получения гибридной стволовой клетки человека

Info

Publication number: RU2352637C1
Application number: RU2007123281/13A
Authority: RU
Inventors: Александр Сергеевич Тепляшин (RU); Александр Сергеевич Тепляшин; Галина Николаевна Сингина (RU); Галина Николаевна Сингина; Наталия Игоревна Чупикова (RU); Наталия Игоревна Чупикова; Светлана Загировна Шарифуллина (RU); Светлана Загировна Шарифуллина
Original assignee: Александр Сергеевич Тепляшин
Priority date: 2007-06-21
Filing date: 2007-06-21
Publication date: 2009-04-20
Also published as: RU2007123281A; WO2009002223A1

Abstract

Изобретение относится к области клеточной инженерии. Получают донорскую соматическую клетку человека, представляющую собой мезенхимную стволовую клетку. Получают и культивируют ооцит свиньи. Затем из ооцита удаляют ядро и переносят в него ядро донорской соматической клетки. Также предложена гибридная стволовая клетка человека, полученная описанным способом. Изобретение позволяет получать гибридные стволовые клетки человека, генетический набор которых идентичен таковому пациента, при использовании которых в восстановительной терапии исключается вероятность возникновения иммунной несовместимости. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 табл.

Description

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к клеточной инженерии, в частности к способу получения гибридной стволовой клетки человека путем межвидовой трансплантации ядер соматических клеток человека, а именно ядер мезенхимных стволовых клеток человека в зрелые ооциты свиней.

Уровень техники.

Развитие биотехнологической науки и практики, в частности ее составляющей - клеточной инженерии, направлено на создание биологических объектов, обладающих полезными для человека свойствами. Реконструированные объекты развиваются по отличному от исходного материала генетическому пути. Работы ведутся в нескольких направлениях, среди которых большие надежды связывают с технологией пересадки ядер соматических клеток. В основе данного метода лежит способность взрослой соматической клетки перепрограммироваться после переноса ядра в энуклеированную неоплодотворенную яйцеклетку [Wilmut I, et.al. 2002 Somatic cell nuclear transfer. Nature. 419 583-58]. Под влиянием неизвестных факторов в ядре соматической клетки происходит активация генов раннего эмбриогенеза, и образуется совершенно новый реконструированный объект, способный к полноценному постнатальному развитию. У человека способность к репрограмированию ядер соматических клеток показана, например, в работах Stojkovic.M. c соавторами [Stojkovic. M., et.al. Derivation of a human blastocyst after heterologous nuclear transfer to donated oocytes Reprod. BioMedicine Online, 2005, 11(2), 226-23] и Hwang WS. с соавторами [Hwang WS et al Evidence of a Pluripotent Human Embryonic Stem Cell Line Derived from a Cloned Blastocyst. Science. 2004. V.303 (5664) 1669-1674].

У человека применение пересадки ядер соматических клеток связывают с получением реконструированных клеточных объектов и выделением из них пациентспецифичных стволовых клеток. Для этого донорские соматические клетки, полученные от человека, пересаживают в энуклеированные ооциты, затем цитопласт и пересаженную клетку сливают с образованием реконструированного ооцита, активируют и культивируют до стадии бластоцисты. В последующем из данных бластоцист можно получать стволовые клетки. Так как генетический набор данных клеток идентичен таковому пациента (пациентспецифичные клетки), то при их использовании в восстановительной терапии исключается вероятность возникновения иммунной несовместимости.

Известен способ пересадки ядер соматических клеток человека в женские донорские ооциты [Stojkovic M., et.al. Derivation of a human blastocyst after heterologous nuclear transfer to donated oocytes Reprod. BioMedicine Online, 2005, 11(2), 226-231]. Недостатком данного способа является то, что ооциты и донорские клетки получают от разных пациентов. Использование выделенных из таких гибридов стволовых клеток в восстановительной терапии требует длительного употребления иммунодепрессантов, так как может возникнуть реакция отторжения. Использование эмбриональных стволовых клеток как источника ядра также является неудобным. Не каждый пациент имеет возможность иметь собственные эмбриональные стволовые клетки и технология их получения довольно трудоемка. Более того, недостатком такого метода является ограниченное количество донорских ооцитов.

Проблема обеспеченности ооцитами решается путем использования межвидовой трансплантации ядер соматических клеток человека в ооциты животных. Известен способ пересадки эмбриональных стволовых клеток человека в энуклеированный ооцит кролика [Chen Y., et.at. Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes. Cell Research 2003; 13(4):251-264} и способ пересадки ядер фибробластов пуповины человека в ооциты коров, полученных после созревания in vitro, взятый в качестве прототипа [Chang KH., et al Blastocyst formation, karyotype, and mitochondrial DNA of interspecies embryos derived from nuclear transfer of human cord fibroblasts into enucleated bovine oocytes. Fertil. Steril. 2003. 80. 138-1387]. Однако данный способ имеет серьезный недостаток, так как используемая в данном случае ткань плаценты не является универсальным источником клеток.

Таким образом, несмотря на то что показана возможность к репрограмированию соматических клеток человека после пересадки их в энуклеированный ксеногенный ооцит, эффективность метода остается крайне низкой. Также нет убедительных данных о возможности получения биологических объектов, обладающих пациентспецифичными характеристиками, путем межвидовой трансплантации ядер соматических клеток.

В связи с этим существуют убедительные причины для разработки способа получения реконструированных ооцитов с пациентспецифичными характеристиками путем пересадки ядер соматических клеток человека и их последующего культивирования.

Раскрытие изобретения.

Согласно данному изобретению было обнаружено, что межвидовые биологические объекты, в частности, гибридные клетки можно получать путем межвидовой трансплантации ядер соматических клеток, осуществляя слияние мультипотентных мезенхимных стволовых клеток человека с энуклеированными ооцитами свиньи с последующим культивированием образованных гибридных стволовых клеток с получением эмбрионов человека.

Следовательно, целью данного изобретения является разработка способа получения гибридной стволовой клетки человека, включающий стадии получения донорской соматической клетки человека; получения и культивирование ооцита; удаления ядра ооцита с получением энуклеированного ооцита; переноса ядра донорской соматической клетки в энуклеированный ооцит; и слияния и активацию ядра соматической клетки и энуклеированного ооцита с получением активированной стволовой клетки человека, отличающийся тем, что в качестве донорской соматической клетки человека используют мезенхимную стволовую клетку, а в качестве ооцита используют ооцит свиньи.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию постактивации и культивирование полученной стволовой клетки с образованием эмбриона человека. Такое культивирование может быть осуществлено до стадии морулы или бластоцисты.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения в качестве мезенхимной стволовой клетки человека используют клетку, полученную из жировой ткани. Мезенхимная стволовая клетка может быть из монослойной культуры после ее культивирования в бессывороточной среде.

В дополнительном варианте осуществления изобретения культивирование ооцита осуществляют in vitro, а также осуществляют удаление клеток кумулюса.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения удаление ядра ооцита осуществляют путем удаления первого направительного тельца вместе с прилегающим участком цитоплазмы, содержащим метафазные хромосомы.

В дополнительном варианте осуществления изобретения перенос ядра донорской соматической клетки осуществляют путем переноса указанных клеток в перевителлиновое пространство энуклеированных ооцитов.

В еще одном варианте осуществления изобретения слияние и активацию ядра соматической клетки и энуклеированного ооцита проводят методом электрослияния.

В изобретении также заявлена гибридная стволовая клетка человека, полученная путем переноса ядра мезенхимальной стволовой клетки человека в энуклеированный ооцит свиньи.

Предложенная гибридная стволовая клетка может быть получена с использованием раскрытого выше способа.

Предложенный способ получения гибридной стволовой клетка человека путем межвидовой трансплантации ядер далее описывается более подробно.

Стадия 1. Получение донорских клеток.

Каких-либо ограничений по использованию соматических клеток в качестве источника ядер соматических клеток нет. Однако эффективность способа значительно возрастает при использовании ядра стволовой или прогениторной клетки. Более того, ткань, из которой выделяются клетки, должна быть доступной и универсальной. Наиболее доступной и универсальной является жировая ткань. В связи с этим наиболее предпочтительными являются мезенхимные стволовые клетки, выделенные из жировой ткани (ММСК). Данные клетки имеют в культуре уникальные характеристики: способность пролиферировать в течение длительного времени и при индукции к дифференцировке формировать клетки тканей, имеющих мезенхимное происхождение, их можно довольно легко получить от каждого человека, в том числе и от больного. При пересадке таких клеток в энуклеированный донорский ооцит получают клеточные объекты, генетически идентичные пациенту, т.е. обладающие пациентспецифичными характеристиками. Указанные клетки получают ранее описанным способом с некоторыми модификациями [Zuk P.A. et.al Human adipose tissue is source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 2002. 13: 4279-429].

Например, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки получают из жировой ткани человека. Ткань промывают, механически измельчают и подвергают ферментативной обработке коллагеназой с последующим культивированием в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, дополненной эмбриональной сывороткой теленка, однократным раствором заменимых аминокислот и антибиотиками при 37°С и 5% СО₂ в воздухе. По достижении монослоя культуру субкультивируют до 2-3 пассажа, анализируют на наличие маркеров, характерных для ММСК, замораживают и хранят до использования. После размораживания клетки отмывают от криопротектора и культивируют в вышеуказанных условиях до 70% монослоя.

Для синхронизации клеточных циклов ооцитов и донорских ядер соматические клетки культивируют в среде с низким содержанием сыворотки или в бессывороточной среде [Boquest AC. et.al. Flow cytometric cell cycle analysis of cultured porcine fetal fibroblast cells used for nuclear transfer. Biol. Reprod. 1990.60. 1013-1019]. Субкультивирование и подготовку клеток к трансплантации проводят путем смены сред, после трипсинизации.

Стадия 2. Получение и культивирование реципиентных ооцитов.

Донорами цитопласта являются созревшие in vitro ооциты свиней, использование которых позволяет решить проблему недостатка в ооцитах человека. Ооциты свиней можно получать в неограниченном количестве после выделения из яичников животных после убоя [L.R.Abeydeera. In vitro production of embryos in swine. Theriogenology. 2002: 57. 257-273]. Ооциты получают из яичников половозрелых свинок и свиноматок методом аспирации или рассечения фолликулов. Выделенные ооциты тщательно отмывают в среде ТСМ 199, содержащей 25 мМ HEPES или в среде Talp-HEPES (промывочные среды). Затем отбирают те, которые имеют гомогенную ооплазму и окружены 2-3 слоями кумулюсных клеток. Отобранные ооциты культивируют в среде ТСМ 199, содержащей BSA или сыворотку, а также 0,57 мМ цистеина, фолликулостимулирующий и лютеонизирующий гормоны, фолликулярную жидкость и 50 мкг/мл гентамицин сульфата, а также эпидермальный фактор роста в концентрации 10 нг/мл при 38.5°С и 5% CO₂ в воздухе. Ооциты свиней культивируют в соответствующих культуральных условиях в течение 42-46 часов, что позволяет увеличить количество яйцеклеток, достигших метафазы II, и одновременно количество яйцеклеток, имеющих четкое направительное тельце. При этом первые 20-22 часа используют среду, содержащую гормоны, затем частично созревшие ооциты переносят в свежую среду, из которой гормоны исключаются.

Стадия 3 и 4. Удаление ядра реципиентных ооцитов и пересадка ядер соматических клеток.

Удаление ядра ооцитов свиней проводят после предварительного удаления клеток кумулюса. Получают энуклеированные ооциты путем прямого прокола зоны пеллюцида микроманипуляционной иглой с последующим удалением первого направительного тельца вместе с прилегающим к нему участком цитоплазмы, содержащего метафазные хромосомы. В перевителлиновое пространство полученных реципиентных энуклеированных ооцитов переносят донорские клетки. Для этого сначала ооциты из среды созревания переносят в среду ТСМ 199, содержащую 0,1% гиалуронидазы, и инкубируют при 37°С в течение 1 минуты. Кумулюс удаляют осторожным пипетированием в промывающей среде и переносят в раствор цитохалазина В. Раствор цитохалазина В готовят добавлением стокового раствора на основе DMSO к среде ТСМ 199, дополненной 4% BSA и антибиотиками в конечной концентрации 5-7,5 мкг/мл. Для энуклеации ооцитов используют микроинъекционые иглы диаметром 20-25 мкм. Ооцит фиксируют удерживающей пипеткой, после чего его зону пеллюцида пронизывают микроинъекционной иглой в направлении 6 или 12 часов и в нее засасывают направительное тельце с небольшим количеством прилегающей к нему цитоплазмы. Затем, продолжая удерживать ооцит, в его перевителлиновое пространство пипеткой пересаживают целую клетку. Использование этого способа позволяет снизить время на проведение процедуры и уменьшить травматизм ооцитов и, как следствие, повысить их жизнеспособность на фоне улучшения общей эффективности способа межвидовой пересадки ядер.

Для контроля качества удаления ядерного материала в реципиентных ооцитах их окрашивают Hoechst 33342. Стоковый раствор данного красителя добавляют к среде ТСМ 199, дополненной 4% BSA и антибиотиками в конечной концентрации 5 мкг/мл. Ооциты после энуклеации и пересадки соматической клетки переносят в данный раствор на 5 минут. После этого на эпифлюорисцентном микроскопе исследуют наличие ДНК в цитоплазме реципиентного ооцита.

Стадия 5: Слияние и активация ядра донорской соматической клетки с энуклеированным ооцитом с получением гибридной стволовой клетки.

Для создания гибридной клетки, способной к развитию, цитоплазму перенесенной соматической клетки следует объединить с цитоплазмой энуклеированного ооцита с последующей активацией полученных гибридных клеток. Для этого обычно используют электрослияние.

Электрослияние проводят с использованием Мультипоратора, прибора способного воздействовать импульсами заданного напряжения. Во время воздействия импульса вследствие образования пор в цитоплазматических мембранах объединяемых клеток их цитоплазмы объединяются. Реконструированные ооциты помещают в камеру для электрослияния, которую предварительно заполняют слабым гипотоническим буфером (200-240 мОсмоль/кг), содержащим сорбитол. Слияние проводят после предварительного элигмента в 0,3 кВ/см продолжительностью 10 секунд посредством двух последовательных пульсов продолжительностью 30 секунд напряжением 1-1,4 кВ/см. После этого ооциты тщательно отмывают от буфера в промывочной среде и переносят в постактивирующий раствор. Использование слабого гипотонического буфера в сочетании с низким напряжением с одной стороны позволяет повысить процент слияния мезенхимной стволовой клетки человека и ооцита свиньи, а с другой стороны обеспечить наилучшую выживаемость полученных реконструированных клеток. Активацию проводят одновременно с электрослиянием. Процедуру слияния и активации проводят при температуре от 25-28°С. Соблюдение данного температурного режима обеспечивает оптимальные условия для воздействия буфера и, как следствие, увеличивает проницаемость цитоплазматических мембран, обеспечивая лучшее воздействие создаваемого напряжения без вреда для жизнеспособности ооцитов и клеток.

Стадия 6. Постактивация и культивирование гибридных стволовых клеток.

Для предотвращения процессов метилирования полученные гибридные клетки постактивируют и только затем культивируют до нужной стадии. Активированные клетки культивируют сначала в течение 30 минут в растворе цитохалазина В вышеуказанного состава, а затем в среде для культивирования содержащей DMAP (среду получают добавлением 100 × стокового раствора DMAP на основе DMSO в конечной концентрации в среде 2 мМ). Через 2-4 часа постактивации реконструированные ооциты анализируют и отбирают те, у которых произошло объединение донорских цитопластов и кариопластов, после чего реконструированные ооциты, в которых визуализировано слияние, переносят в среду подходящего состава для дальнейшего культивирования. В качестве сред культивирования используют среды G1.2/G2.2 и NCSU-23, содержащие соли натрия, калия, магния и кальция, а также энергетические субстраты в виде пирувата, натрия лактата и глутамина и источник белка в виде BSA (Таблица 5). Постактивацию и культивирование проводят в средах, не содержащих феноловый красный. Данное вещество добавляют в качестве индикатора уровня рН, но оно обладает токсическими свойствами, что снижает жизнеспособность клеток.

Данное изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничение объема данного изобретения.

Пример 1. Получение мультипотентных мезенхимных стволовых клеток.

ММСК получали из жировой ткани человека. Для этого жировую ткань тщательно промывали в ФСБ, измельчали маленькими острыми ножницами и подвергали ферментативной обработке 0,075%-ным раствором коллагеназы типа I на среде ДМЕМ при 37°С в течение 30 минут. Коллагеназу отмывали эквивалентным объемом питательной среды (ДМЕМ, дополненная 10% эмбриональной сывороткой теленка) и центрифугировали при 1000 g в течение 5 минут. Полученный осадок ресуспендировали и пропускали через фильтры с диаметром пор 100 мкм для удаления клеточных остатков. Концентрация клеток для посева составляла 5×10⁶ клеток на культуральный флакон 75 см^3.. Культивировали мезенхимные стволовые клетки в среде ДМЕМ (фирмы Gibco) с низким содержанием глюкозы, дополненной эмбриональной сывороткой теленка, однократным раствором заменимых аминокислот и антибиотиками при 37°С и 5% СО₂ в воздухе. Через двое суток культивирования были замечены колонии прикрепившихся клеток. Среду меняли каждые 4 суток и по достижению 90%-ой прочности монослоя их субкультивировали и замораживали. В нужное время алликвоту замороженных клеток размораживали и отмывали от криопротектора двукратным центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 минут в питательной среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональную сыворотку теленка. После этого клетки высевали в культуральные чашки Петри и культивировали в условиях, используемых перед замораживанием, до получения плотного монослоя. Последние двое суток клетки культивировали в бессывороточной среде. Непосредственно перед процедурой пересадки ядер клетки снимали с субстрата раствором трипсин-ЭДТА, отмывали и разводили в небольшом количестве манипуляционной среды ТСМ 199 (см. таблицу 1) с получением суспензии клеток.

Пример 2. Получение и культивирование реципиентных ооцитов свиньи

Яичники от половозрелых свинок и свиноматок доставляли в лабораторию в физиологическом растворе с антибиотиками. В лаборатории их тщательно отмывали в указанном транспортном растворе и переносили в 10 см чашки Петри, содержащие примерно 10 мл промывочной среды (см. таблицу 2). Режущим инструментом проводили рассечение видимых фолликулов, после чего яичники тщательно отполаскивали. Под стереомикроскопом из промывочной среды отбирали ооциты с 2-3 слоями кумулюсных клеток, после чего их отмывали и переносили в среду созревания (см. таблицу 3) и культивировали при 38,5°С и 5% CO₂ в воздухе в течение 38-50 часов. При этом первая половина периода культивирования проходила в присутствии гормонов, а вторая без гормонов. В таблице 4 показано влияние времени созревания ооцитов на эффективность образования гибридных клеток после пересадки ядер и их последующее развитие. Из таблицы видно, что оптимальным временем созревания ооцитов свиней является период с 42-46 часов. При более длительном культивировании или наоборот, меньшей продолжительности созревания, резко снижается потенция к развитию клеточных гибридов как до 8 клеточной стадии, так и до стадии бластоцисты.

Пример 3. Энуклеация ооцитов и пересадка донорских клеток.

Реципиентные ооциты, полученные в примере 2, освобождали от окружающих их клеток кумулюса. Для этого ооциты обрабатывали 0,1% раствором гиалуронидазы (фирмы Sigma приготовленного добавлением 90 мкл 10 × стокового раствора к промывочной среде ТСМ 199) в течение 1 минуты. Прилегающие кумулюсные клетки удаляли осторожным пипетированием с использованием стеклянной пипетки диаметром 160 мкм. После удаления клеток кумулюса в растворе гиалуронидазы ооциты переносили в промывочную среду ТСМ 199. Многократно отмывали в данной среде и переносили в свежую промывочную среду, содержащую цитохалазин В. Раствор готовили добавлением 100 × стокового (конечная концентрация 5-7,5 мкг/мл) раствора цитохалазина В. В данной среде ооциты культивировали в условиях инкубатора при 38,5°С и 5% СО₂ в течение 30 минут. Прокультивированные в растворе цитохалазина В ооциты переносили в каплю промывочной среды, в которой и проводили процедуру энуклеации. Суспензию соматических донорских клеток, полученную в примере 1, добавляли в соседнюю каплю. Чашку Петри с каплями помещали на нагретый до 37°С столик микроскопа "Nicon". В центр капли с ооцитами слева в направлении 9 часов вводили удерживающую пипетку и справа две микроинъекционных иглы диаметром 20-25 мкм. Между каплей с ооцитами и каплей с соматическими клетками делали соединительную дорожку из среды с использованием удерживающей пипетки. Ооцит фиксировали на удерживающей пипетке так, чтобы направительное тельце выставлялось на 6 или 12 часов. Микроинъекционную иглу с заостренным и сточенным под углом 45° кончиком вводили в перевителлиновое пространство удерживаемого ооцита в месте, где находилось направительное тельце. Создавая в пипетке гидравлическое давление, отсасывали первое направительное тельце вместе с прилегающим к нему небольшим участком цитоплазмы, содержащим метафазные хромосомы. В пипетку того же диаметра, но с тупым концом, в соседней капле засасывали донорскую соматическую клетку. По дорожке пипетку возвращали в каплю с ооцитом, фиксированным на удерживающей пипетке. Пипетку с донорской клеткой вводили в перевителлиновое пространство ооцита через отверстие, образовавшееся в процессе энуклеации, и, создавая положительное давление, из пипетки выпускали соматическую клетку. После этого ооциты окрашивали Hoechst 33342 (5 кг/мл). После этого ооциты тщательно отмывали в манипуляционной среде и переносили в каплю свежей среды под слоем минерального масла. На микроскопе Olympus в ультрафиолетовом свете проводили оценку качества удаления ДНК. Для слияния использовали только не содержащие собственной ДНК ооциты.

Пример 4. Электрослияние и активация полученных гибридных клеток.

Цитопласт (реципиентный энуклеированный ооцит) и кариопласт (донорскую соматическую клетку) объединяли методом электрослияния в микрокамере с использованием Мультипоратора фирмы Eppendorf. Реконструированные ооциты переносили в камеру для электрослияния, заполняли 50 мкл раствора сорбитола (200-240 мОсмоль/кг), после чего в нее вводили реконструированные ооциты. Слияние и активацию проводили после предварительного элигмента в 0,3 кВ/см в течение 10 минут посредством двух последовательных импульсов в 1-1,4 кВ/см продолжительностью 30 секунд. Температура раствора сорбитола при этом составляла 25-28°С. После воздействия импульсов ооциты тщательно отмывали от раствора сорбитола в среде для манипуляций.

Пример 5. Культивирование полученных гибридных клеток.

Подвергшиеся процедуре электрослияния реконструированные ооциты сначала культивировали в среде NCSU-23, содержащей 5 мкг/мл цитохалазина В в течение 30 минут, а затем 3 часа в среде NCSU-23, к которой добавлен DMAP (стоковый раствор DMAP, разведенный в DMSO, добавляли к среде в конечной концентрации 2 мМ). По истечению данного периода отбирали гибриды, в которых произошло полное объединение цитопласта реципиентного ооцита и содержимого соматической клетки. Отобранные клеточные комплексы культивировали в течение 5-6 дней в условиях инкубатора при 38,5°С, 5% CO₂ в воздухе и максимальной влажности. В процессе культивирования проводили оценку степени развития полученных клеточных объектов. В Таблице 5 показано, что вследствие оптимизации приемов энуклеации и пересадки донорских клеток успешно реконструируются 8 из 10 яйцеклеток. Режимы электрослияния и составы буферных растворов обеспечивают слияние цитоплазматических мембран ооцитов и пересаженных ММСК в 70% случаев. Активированные клеточные комплексы обладают способностью к полноценному развитию. 30,5% из них достигает стадии 4-8 клеток и 9,55% стадий морул и бластоцист.

Результаты культивирования гибридных стволовых клеток, полученных в результате пересадки ММСК, выделенной из жировой ткани человека, в энуклеированный ооцит свиней.

Использовано ооцитов, n	Кол-во гибридных клеток, n	Норма слияния,% (n)	Норма развития 4-8 гибридных клеток, % (n)	Норма развития морул/бластоцист, % (n)
484	387	70,0 (271)	30,5 (48)	9,55(15)

Таблица 1
Состав манипуляционной среды
Наименование ингредиента	мМ/на 100 мл среды
TCM199(Gibco)	950 мг
Бикарбонат натрия	220 мг
Глутамин	0,1
HEPES	2,5
Гентамицин	50 мкг/мл
FCS	10%
Вода ионизированная	До 100 мл

Таблица 2
Состав среды для выделения ооцитов
Наименование ингредиента	мМ/на 100 мл среды
ТСМ 199 (Gibco)	950 мг
Бикарбонат натрия	220 мг
Глутамин	0,1
HEPES	2,5
Гентамицин	50 мкг/мл
BSA	0,4%
Вода ионизированная	До 100 мл

Таблица 3
Состав среды для созревания ооцитов
Наименование ингредиента	мМ/на 100 мл среды
ТСМ 199 (Gibco)	950 мг
Бикарбонат натрия	220 мг
Глутамин	0,1
Глюкоза	0,3
Цистеин	0,1
Na-пируват	0,091
HEPES	2,5
Гентамицин	50 мкг/мл
BSA	0,4%
FCH	0,5 мкг/мл
LH	0,5 мкг/мл
17β - эстрадиол	1 мкг/мл
EGF	10 мкг/мл
Вода ионизированная	До 100 мл

Таблица 4
Результаты образования гибридных клеток, их дробления и развития до стадии бластоцисты в зависимости от продолжительности созревания реципиентных ооцитов
Время созревания ооцитов, ч	Кол-во ооцитов, n	Норма слияния, (%) n	Норма дробления, % (n)	Норма развития до 8 клеток, % (n)	Норма развития стадии бластоцисты, % (n)
38	106	77,35 (82)	21,9 (18)	-
40	94	79,8 (75)	32,00 (24)	6,6 (5)	-
42	130	76,9 (100)	46,0 (46)	26,0 (26)	5,0 (5)
44	131	80,1 (105)	53,3 (56)	35,2 (37)	7,6 (8)
46	112	76,7 (86)	51,2 (44)	32,55 (28)	8,13 (7)
48	121	54,5 (66)	43,9 (29)	28,78 (19)	-
50	126	39,7 (50)	30,0 (15)	-	-

Таблица 5
Состав сред для культивирования эмбрионов
Наименование ингредиента	G1	G2	NSCU-23
NaCl	85,16	85,16	108,73
KCl	5,8	5,5	4,78
CaCl₂	-	-	1,7
CaCl₂×2H₂O	1,8	1,8	-
KH₂PO₄	-	-	1,19
MgSO₄×7H₂O	1,0	1,0	1,19
NaH₂PO₄×2H₂O	0,5	0,5	-
NaHCO₃	25,0	25,0	25,07
Глюкоза	0,5	3,15	5,55
Глутамин	1,0	1,0	1,0
Таурин	0,1	-	7,0
Гипотаурин	-	-	5,0
Na-пируват	0,32	0,10	-
Na-лактат	10,5	5,87	-
ЭДТА	0,01	-	-
Заменимые аминокислоты	1.0%	1.0%	-
Незаменимые аминокислоты	-	1.0%	-
BSA [мг/мл]	-	-	4,0
HAS [мг/мл]	2,0	2,0	-
Пенициллин [МЕ/мл]	100	100	100
Стрептомицин[МЕ/мл]	50	50	50

Claims

1. Способ получения гибридной стволовой клетки человека, включающий следующие стадии:
получение донорской соматической клетки человека;
получение и культивирование ооцита;
удаление ядра ооцита с получением энуклеированного ооцита;
перенос ядра донорской соматической клетки в энуклеированный ооцит и
слияние и активация ядра донорской соматической клетки и
энуклеированного ооцита с получением гибридной стволовой клетки
человека,
отличающийся тем, что в качестве донорской соматической клетки
человека используют мезенхимную стволовую клетку, а в качестве ооцита
используют ооцит свиньи.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий постактивацию и культивирование полученной активированной стволовой клетки.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивирование осуществляют до стадии морулы.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивирование осуществляют до стадии бластоцисты.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что мезенхимную стволовую клетку человека получают из жировой ткани.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что мезенхимную стволовую клетку получают из монослойной культуры после ее культивирования в бессывороточной среде.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование ооцита осуществляют in vitro.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что осуществляют удаление клеток кумулюса.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что удаление ядра ооцита осуществляют путем удаления первого направительного тельца вместе с прилегающим участком цитоплазмы, содержащим метафазные хромосомы.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что перенос ядра донорской соматической клетки осуществляют путем переноса указанных клеток в перевителлиновое пространство энуклеированных ооцитов.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что слияние и активацию ядра соматической клетки и энуклеированного ооцита проводят методом электрослияния.

12. Гибридная стволовая клетка человека, полученная путем переноса ядра мезенхимальной стволовой клетки человека в энуклеированный ооцит свиньи.

13. Гибридная стволовая клетка человека, полученная способом по любому из пп.1-11.