KR100839172B1 - 이중 피펫, 이를 이용한 수핵난자의 탈핵 및 핵이식 방법및 체세포 복제동물의 생산방법 - Google Patents

이중 피펫, 이를 이용한 수핵난자의 탈핵 및 핵이식 방법및 체세포 복제동물의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 절개용 피펫 및 탈핵·핵이식용 피펫으로 이루어진 체세포 복제 수정란 제조시 사용되는 이중 피펫, 이를 이용한 수핵난자의 탈핵·핵이식방법 및 체세포 복제동물의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이중 피펫은 절개용 피펫 및 탈핵·핵이식용 피펫이 서로 결합된 미세 조작용 피펫으로, 이를 이용하여 체세포 복제 수정란 제조과정 중 수핵난자에서의 탈핵율 및 이후 복제 수정란의 배반포 발달률을 증가시키는 작용효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 이중 피펫 및 이를 이용한 수핵난자의 탈핵 및 핵이식 방법은 체세포 복제동물의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

이중 피펫, 이를 이용한 수핵난자의 탈핵 및 핵이식 방법 및 체세포 복제동물의 생산방법{Dual pipet and method for enucleation, nuclear transplantation and somatic animal clon production by using the same}
도 1은 본 발명의 절개용 피펫(10)의 단면도이다.
도 2는 본 발명의 탈핵·핵이식용 피펫(20)의 단면도이다.
도 3은 본 발명의 이중 피펫(100)의 정면도 및 부분 확대도이다.
도 4는 절개용 피펫(10) 및 탈핵·핵이식용 피펫(20)을 결합, 고정시킨 본 발명의 이중 피펫(100)의 사진이다.
도 5는 하나의 작업 드롭 안에서 본 발명의 이중 피펫(100)의 절개용 피펫(10) 및 탈핵·핵이식용 피펫(20)을 사용하는 경우의 사진이다.
도 6은 본 발명의 이중 피펫의 절개용 피펫으로 절개창을 만든 후 수핵난자에 탈핵·핵이식용 피펫으로 제1극체와 염색체-방추사 복합체를 탈핵하는 모습을 나타낸 도이다.
도 7은 기존의 스퀴징 방식으로 탈핵하는 모습을 나타낸 도이다.
도 8은 기존의 수핵난자 고정용 피펫으로 수핵난자에 음압을 주어 탈핵하는 모습을 나타낸 도이다.
도 9는 탈핵·핵이식용 피펫(20)으로 탈핵한 수핵난자(3)에 체세포 공여 핵(19)을 주입하는 모습을 나타낸 도이다.
도 10은 수핵난자 고정용 피펫(50) 또는 스퀴징 방식으로 탈핵된 수핵난자(3)에 체세포 공여핵(9)을 주입하는 모습을 나타낸 도이다.
도 11은 체세포 공여핵(9)을 주입한 수핵난자(3)를 전기융합하는 모습을 나타낸 도이다.
도 12는 작업단계를 거친 후 분화된 체세포 복제란의 모습을 나타낸 도이다.
도 13은 배반포 단계의 체세포 복제란의 모습을 나타낸 도이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
3: 수핵난자 6: 제1극체
8: 염색체-방추사 복합체 9: 공여핵
10: 절개용 피펫 11: 모세관부
12: 폐쇄형 팁 말단 13: 폐쇄형 팁 형상부
20: 탈핵·핵이식용 피펫 21: 모세관부
22: 개방형 팁 말단 23: 개방형 팁 형상부
50: 고정용 피펫 100: 이중피펫
본 발명은 절개용 피펫 및 탈핵·핵이식용 피펫으로 이루어진 체세포 복제 수정란 제조시 사용되는 이중 피펫, 이를 이용한 수핵난자의 탈핵·핵이식방법 및 체세포 복제동물의 생산 방법에 관한 것이다.
체세포 복제 기술은 우수형질 개체 확보, 고부가가치 생체반응기 동물의 생산, 질환 모델 동물의 생산, 인체 장기 공여 동물의 생산, 멸종 위기 동물의 보존 등 그 응용 분야의 범위가 매우 넓다. 또한 체세포 복제 기술을 적용하면 환자 체세포 유래 배반포에서 배아 줄기 세포주를 수립할 수 있으며, 이렇게 수립된 배아 줄기 세포로부터 치료에 필수적인 세포를 분화시킬 경우, 환자의 면역 거부 반응을 피할 수 있다는 장점이 있기 때문에 임상적 이용성이 높다(Trounson A., Reprod Fertil Dev 10:121-125(1998)).
이러한 체세포 복제 기술의 근간은 이가 염색체를 가진 공여핵 체세포와, 유전 물질을 가진 핵이 제거된 수핵난자의 융합이다. 공여핵이 이식될 수핵난자는 체세포와 융합된 후 발생할 수 있는 능력을 보유하여야 하는데, 이러한 발생능을 가지기 위해서는 제2차 감수분열 중기(난자가 체내에서 자연적으로 배란되는 시기)까지 난자의 발육이 진행된 수핵난자를 사용해야 한다. 이를 위하여 체외에서 인위적으로 난자를 배양하거나, 호르몬 처치를 통하여 체내에서 난자를 발육시켜 사용한다.
회수된 난자는 체세포와 융합시키기 전 탈핵 과정을 거치게 되는데 주로 물리적인 방법을 이용하여 난자의 핵(제2차 감수분열 중기판이 존재하는 부분의 세포질)을 제거한다.
상기 핵이식과 탈핵시 탈핵율은 체세포 복제 기술에 있어서 중요한 변수이며, 특히 그 개체수가 매우 한정된 동물의 경우 또는 난자를 얻기가 어려운 동물일 경우, 난자의 효과적 이용은 개체생산과 직결되는 요소이기 때문에 효과적인 탈핵은 매우 중요하다.
지금까지 알려진 수핵난자의 탈핵 방법은 사이토칼라신 등의 약물로 난자를 처리하여 세포 내에 존재하는 세포골격 손상을 최대한 방지한 상태에서 미세조작기를 이용한 스퀴징(squeezing), 흡입법 (aspiration) 등 특수 조작에 의하여 이루어진다.
그럼에도 불구하고, 상기 탈핵 과정에서는 기계적 조작에 의한 세포질 충격 및 일부 세포소기관 손실, 핵 유전 물질 제거 시 수반되는 세포질 소실, 그리고 투명대, 세포막 및 난자 전체에 분포하는 세포골격 구조에 손상이 가해질 수 있다. 또한 기능적 측면으로는 갑작스러운 핵 제거에 의한 핵-세포질의 신호 전달 체계의 파괴 등을 유발하여 이후 배발달에 치명적인 손상이 가해질 수 있다.
한 보고에 의하면 20시간 동안 체외 성숙시킨 소 난자의 염색체-방추사 복합체는 제1극체와 가까이 있지 않은 경우가 많아 흡입법으로 탈핵하였을 경우 효율이 59% 밖에 되지 않은 것으로 나타났다(Bordignon V., Smith LC., Mol Reprod Dev 49:29-36(1998); Mohamed Nour MS., Takahashi Y., Theriogenology 51:661-666(1999)).
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 다음과 같은 탈핵 방법이 개발되어 사용되고 있다.
첫째로, 활성화를 통한 탈핵 효율의 증가이다. 제1차 감수분열 중기 성숙 난자의 활성화 전후의 탈핵율을 비교한 결과, 활성화 처리를 한 난자의 탈핵율 이 유의적으로 높았다(91.5% vs 59.9%; Mohamed Nour MS., Takahashi Y., Theriogenology 51: 661-666(1999)).
둘째로, 원심분리를 통한 난자 소기관의 중층화를 유도한 다음, 퍼콜 밀도 그래디언트(percoll density gradient)를 처리하여 원심분리를 한 다음 난자의 염색체-방추사 복합체를 난자 세포질과 분리하는 것이다(Tatham BG., Dowsing AT., Trounson AO., Biol Reprod 51:661-66(1995)).
셋째로, 탈핵 이전에 데미콜킨(demicolcine)을 처리하여 유전 물질을 난자 표면으로 유도시킨 뒤 흡입법으로 탈핵하는 것이다(Baguisi A., Biol Reprod 67:442-446(2002)).
넷째로, 고정용 피펫 및 절개 피펫을 이용하여 성숙난자의 고정 및 절개 각도 등을 효율적으로 구성하여 난자에 조그만 구멍을 낸 뒤 핵을 짜내는 스퀴징 (squeezing) 방법 (참조: 대한민국 등록특허 제 342437호) 및 다섯째로, 난자의 염색체-방추사 복합체에 정밀하게 조준된 레이저를 순간 조사하여 제1극체와 함께 소멸시키는 방법이 있다.
그러나, 상기의 방법을 이용하여 기계적 탈핵 기술의 효율성을 증진한 경우에도 다음과 같은 문제점이 발생하며 이러한 문제들에 의하여 근본적인 효율의 향상은 한계에 직면하여 있다.
먼저, 활성화 방법은 수핵난자와 공여핵 세포 간의 세포주기 불일치를 일으켜 융합 후 첫 DNA 복제 후 유사분열 과정에서 염색체 배수 이상을 일으킬 수 있으며, 흡입에 의한 방법은 투명대 절개와 세포질 소실에 기인한 물리적 및 기능적 손 상을 피할 수 없다.
염색체-방추사 복합체가 제1극체에 멀리 떨어진 상태에서 흡입법의 경우 절개창을 만들기 위해 또는 핵을 흡입시 수핵난자의 물리적 형태에 많은 영향을 주며 스퀴징 방식에 경우는 외부로 유출되어지는 세포질의 양을 늘려서 염색체-방추사 복합체를 탈핵해야 하는 문제점이 있다.
이러한 일련의 기술적 진보에도 불구하고, 아직까지 난자의 탈핵 기술의 근본적인 발전은 이루어지지 않고 있으며, 상술한 문제점들을 최소화할 수 있는 탈핵 방법의 개발이 요구되고 있다.
상기와 같이 물리적 또는 화학적인 경우에도 탈핵 후에는 절개창을 통해 핵이식을 하는 것은 동일한 과정이므로, 본 발명은 핵이식에 사용되는 절개용, 핵이식용 피펫을 동시에 이용하여 효과적으로 물리적인 탈핵을 할 수 있는 새로운 응용 탈핵 방법을 제시하고자 한다.
본 발명자들은 체세포 복제수정란의 제조시 상기 문제점들을 극복한 새로운 탈핵 방법을 개발하기 위하여 노력한 결과, 절개용 피펫 및 핵이식용 피펫으로 이루어진 이중 피펫을 개발하였고. 절개용 피펫으로 수핵난자에 절개창을 만들고 이 절개창를 통해 핵이식용 피펫으로 수핵난자의 탈핵과 핵이식을 동시에 하여 탈핵율을 높임으로써 체세포 복제수정란의 제작 효율이 증가함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 체세포 복제 수정란 제조시 사용되는 피펫으로, 절개용 피펫 및 탈핵·핵이식용 피펫으로 이루어진 이중 피펫, 이를 이용한 수핵난자 탈핵·핵 이식 방법 및 체세포 복제동물 생산방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 절개용 피펫(10) 및 탈핵·핵이식용 피펫(20)으로 이루어진 체세포 복제 수정란 제조시 사용되는 이중 피펫(100)을 제공한다.
더욱 상세하게는, 절개용 피펫(10) 및 탈핵·핵이식용 피펫(20)으로 이루어진 체세포 복제 수정란 제조시 사용되는 피펫으로서,
상기 절개용 피펫(10)은 한쪽 말단으로서 내경이 일정하고 외부와 개방된 모세관 형태의 모세관부(11)와, 다른 말단으로서 내경이 상기 모세관부(11)의 내경보다 짧고 말단으로 갈수록 더 짧아지도록 미세하게 뽑아져 있으면서 외부와 단절되어 있는 폐쇄형 팁 말단(12)을 포함하는 폐쇄형 팁 형상부(13)로 이루어지고,
상기 탈핵·핵이식용 피펫(20)은 한쪽 말단으로서 내경이 일정하고 외부와 개방된 모세관 형태의 모세관부(21)와, 다른 말단으로서 내경이 상기 모세관부(21)의 내경보다 짧고 말단으로 갈수록 더 짧아지도록 미세하게 뽑아져 있으면서 외부와 개방된 개방형 팁 말단(22)을 포함하는 개방형 팁 형상부(23)로 이루어지며,
상기 절개용 피펫(10)과 탈핵·핵이식용 피펫(20)은 같은 방향으로 평행하게 위치되었을 때, 절개용 피펫(10)의 모세관부(11)와 탈핵·핵이식용 피펫(20)의 모세관부(21)가 서로 결합되어 있고, 이와 같이 결합되어 있을 때 폐쇄형 팁 말단(12)이 개방형 팁 말단(22)에 비해 길게 돌출되어 있는 것을 특징으로 하는 이중 피펫을 제공한다(도 1 내지 도 3).
이러한 본 발명의 이중 피펫(100)은 체세포 복제 수정란 제조시에 사용될 수 있으며, 특히 수핵란 절개, 탈핵 및 공여핵의 이식용으로 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 이중 피펫(100)을 이루는 절개용 피펫(10) 및 탈핵·핵이식용 피펫(20)은 먼저, 마이크로피펫 풀러(micropipette puller) 등을 이용하여 내경이 일정하고 양단이 개방되어 있는 모세관을 한쪽 말단이 미세하게 뽑아진 형태로 제작가공하여 사용할 수 있고, 이는 당업계에서 마이크로 인젝션을 위해 모세관을 가공하는 통상적인 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 이 때 절개용 피펫(10) 및 탈핵·핵이식용 피펫(20)의 폐쇄형 팁 형상부(13) 및 개방형 팁 형상부(23)는 원하는 정도의 내경이 나올 수 있게 길게 뽑아내어 성형하며 이는 마이크로 풀러에서 온도, 잡아당기는 힘 등의 조건을 조정함으로써 가능하다.
도 1은 수핵난자에서 탈핵 전 절개창을 만드는 절개용 피펫(10)의 단면도이다. 절개용 피펫(10)은 풀러로 제조한 그대로 사용하는데, 한쪽 말단으로서 모세관부(11)는 내경이 일정하고 외부와 개방된 모세관형태이고, 다른 말단으로서 폐쇄형 팁 말단(12)은 내경이 상기 모세관부(11)의 내경보다 짧고 말단으로 갈수록 더 짧아지도록 미세하게 뽑아져 있으면서 외부와 단절되어 있는 형태이다.
또한, 도 2는 수핵난자에서 절개창을 통해 탈핵하고, 공여핵을 이식하는 탈핵·핵이식용 피펫(20)의 단면도이다. 한쪽 말단으로서 모세관부(21)는 내경이 일정하고 외부와 개방된 모세관형태이고, 다른 말단으로서 개방형 팁 말단(22)은 내경이 모세관부(21)의 내경보다 짧고 말단으로 갈수록 더 짧아지도록 미세하게 뽑 아져있으면서 외부와 개방되어 있는 형태이다. 이러한 탈핵·핵이식용 피펫(20)은 상기 절개용 피펫(10)의 폐쇄형 팁 말단(12)을 연마하여 개방형 팁 말단(22)이 개방된 상태로 성형할 수도 있다.
또한, 개방형 팁 말단(22)은 수핵난자에서 탈핵하거나 공여핵 이식할 때 피펫 내에서 핵이 손상되지 않고 움직일 수 있도록 핵보다 좀더 내경이 긴데, 내경은 약 10~30 마이크로미터가 되는 것이 좋고, 특히 약 10~20 마이크로미터인 것이 바람직하다. 내경이 10 마이크로미터 미만인 경우는 핵이 피펫 내에서 움직일 때 피펫 내벽에 의해 손상을 받을 수 있어 최종적인 체세포복제수정란의 배반포로의 발달률을 낮추므로 바람직하지 않다.
이렇게 제조된 절개용 피펫(10) 및 탈핵·핵이식용 피펫(20)은 같은 방향으로 평행하게 위치되어, 절개용 피펫(10)의 모세관부(11)와 탈핵·핵이식용 피펫(20)의 모세관 부(21)가 서로 결합되어 본 발명의 이중 피펫(100)으로 형성되고, 이와 같이 결합되어 있을 때 폐쇄형 팁 말단(12)이 개방형 팁 말단(22)에 비해 길게 돌출되어 있는 것을 특징으로 한다 (도 3).
두 모세관부(11, 21)가 접하는 부분의 전체 또는 일부분에 실리콘, 에폭시 본드 또는 글루건 등의 통상의 접착제를 사용하여 절개용 피펫(10) 및 탈핵·핵이식용 피펫(20)을 접착 고정할 수 있다.
또한, 폐쇄형 팁 말단(12)이 개방형 팁 말단(22)에 비해 돌출되어 나온 형태인 것이 절개 후 탈핵 및 핵이식 단계를 수행하기에 바람직한데, 폐쇄형 팁 말 단(12)이 돌출되어 나오는 정도는 수핵난자의 크기에 따라 조절될 수 있으며, 높은 탈핵율 및 배반포 발달률을 위해서는 약 100~1000㎛ 정도가 바람직하며, 약 400~600㎛ 정도 돌출되어 나온 형태인 것이 본 발명의 이중 피펫(100)으로 가장 바람직하다.
또한, 본 발명의 이중 피펫(100)에서 탈핵·핵이식용 피펫(20)의 경우 추가적으로 탈핵·핵이식용 피펫(20) 내부에 세포가 붙는 것을 방지하기 위해 불화수소(Hydrofluoric acid)로 2~3번 세척한 후 증류수로 세척을 하고 I-Gepal(SIGMA, I-3021, Octylphenyl-polyethylene glycol) 등으로 코팅하는 것이 바람직하다.
또한, 수핵난자 조작시 절개용 피펫(10)이 위쪽 또는 아래쪽에 위치하는 것이 모두 가능하나, 절개용 피펫(10)이 위쪽에 위치하도록 본 발명의 이중 피펫(100)을 제조하는 것이 미세조작하기 용이하며, 탈핵율 및 배반포 발달률을 높이기 위해서 바람직하다.
상기와 같이 제조한 본 발명의 이중 피펫(100)은 수핵난자에서 탈핵하는 과정 및 공여핵 이식시 하나의 작업드롭 안에서 피펫을 교환하지 않고 작업이 가능하게 함으로써 작업시간을 단축시키는 작용효과를 나타낸다.
또한, 난자의 염색체-방추사 복합체(8)와 제1극체(6)가 가까이 있지 않아서 탈핵이 불가능한 수핵난자(3)를 절개창을 통해 난자에 본 발명의 이중 피펫(100)의 탈핵·핵이식용 피펫(20)으로 탈핵과 핵이식을 동시에 하여 제1극체(6)에서 멀리 떨어진 염색체-방추사 복합체(8)를 효과적으로 제거하여 탈핵율을 높이는 작용효과 를 나타낸다.
또한, 본 발명은 체세포 복제 수정란 제조시, 상기 본 발명의 이중 피펫(100)을 이용하여 수핵난자를 탈핵하고 핵이식하는 방법을 제공한다.
본 발명의 수핵난자 탈핵 및 핵이식방법은, 1) 이중 피펫(100)의 절개용 피펫(10)으로 수핵난자(3)에 절개창을 만드는 단계; 2) 상기 절개창을 통해 이중 피펫(100)의 탈핵·핵이식용 피펫(20)으로 탈핵하는 단계; 3) 이중 피펫(100)의 탈핵·핵이식용 피펫(20)으로 공여핵 이식을 동시에 수행하는 단계로 이루어진다.
체세포 복제수정란의 제조시 본 발명의 이중 피펫을 사용하면 탈핵과 동시에 핵이식을 가능하게 하여 작업시간을 줄여주고, 수핵난자의 형태를 최대한 유지한 채 탈핵을 가능케 하며, 수핵난자 제 1극체와 중기판이 가까이 있지 않은 경우에도 효율적인 탈핵 및 핵이식을 가능하게 한다.
또한, 수핵난의 탈핵율을 높여 복제수정란 제조 작업시 제공되는 수핵난의 숫자를 더 확보할 수 있게 하여 탈핵 이후 복제 수정란의 배반포 발달률을 증가시키는 작용효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 이중 피펫 및 이를 이용한 수핵난자의 탈핵방법은 체세포 복제동물의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 이중 피펫(100)을 이용한 수핵난자 탈핵 및 핵이식 방법을 포함한 체세포 복제동물의 생산 방법을 제공한다.
1) 체세포를 배양한 후 단일세포로 분리하여 공여핵 체세포를 준비하는 단계; 2) 수핵난자용으로 채취한 난자를 체외성숙시키는 단계; 3) 체외성숙시킨 난자에서 난구세포를 제거하는 단계; 4) 상기 3)단계의 난자에서 이중 피펫(100)의 절개용 피펫(10)을 이용하여 절개창을 만드는 단계; 5) 상기 난자의 절개창을 통해 이중 피펫(100)의 탈핵·핵이식용 피펫(20)으로 탈핵시켜 수핵난자(3)를 준비하는 단계; 6) 상기 수핵난자(3)에 이중 피펫(100)의 탈핵·핵이식용 피펫(20)으로 공여핵(9)을 이식하여 공여핵 이식란을 제조하는 단계; 7) 공여핵 이식란을 세포융합하여 체세포 복제 수정란을 제조하는 단계; 8) 체세포 복제 수정란을 활성화시키는 단계; 9) 체세포 복제 수정란을 체외배양하는 단계 및 9) 상기 체세포 복제 수정란을 대리모 동물에 이식하여 체세포 복제동물을 생산하는 단계로 이루어진다.
본 발명에서 사용된 '체세포'는 생식세포 이외의 세포를 의미한다.
본 발명의 '공여핵 체세포'는 체세포의 핵 이식시 수핵난자로 핵 내 유전물질을 제공하는 세포를 의미한다.
본 발명의 '수핵난자'는 체세포의 핵 이식시 공여핵 체세포로부터 핵을 이식받는 난자로서, 공여핵 체세포의 핵 이식을 위하여 난자 내 핵이 제거되고 세포질을 제공하는 난자를 의미한다.
본 발명의 '체세포 복제 수정란'은 체세포의 공여핵을 핵이 제거된 수핵난자에 주입한 후, 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 핵과 세포질이 융합된 난자를 의미한다.
본 발명의 '체세포'는 동물세포로, 어류, 양서류, 조류 및 포유동물을 포함 하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 포유동물, 예컨대, 인간을 포함한 영장류, 소, 돼지, 곰, 고양이, 개, 말 및 설치류 등의 체세포이고, 가장 바람직하게는 소 또는 인간의 체세포이다.
본 발명에서 체세포 복제 수정란을 제조하고, 체외배양하여 대리모에게 이식하여 체세포 복제동물을 생산하는 기본적인 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따른다.
또한, 본 발명자는 대한민국 공개특허 제 2002-0080616 호에서 체세포 복제동물 생산방법을 개시한 바 있으며 상기 공개특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어, 본 명세서에 기재되지 않은 본 발명의 특징이 보다 명확하게 설명된다.
이로써 수핵난자의 확보가 어려운 포유류의 경우 본 발명에 의해 수핵난의 탈핵율을 높임으로써 복제수정란 제조 작업시 제공되는 수핵난자 및 배반포로 발달된 체세포 복제수정란의 숫자를 더 확보할 수 있게 하고, 결과적으로 체세포 복제 동물의 생산율도 상승시키는 작용효과를 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예1 ] 본 발명의 이중 피펫 제조
본 발명의 이중 피펫을 제조하기 위해 절개용 및 탈핵·핵이식용 피펫을 각각 제작하였다.
마이크로 피펫은 풀러(Puller; PC-10, Narishigae사, 일본), 마이크로포지(Microforge; MF-9, Narishige사, 일본) 등과 같은 기기들을 사용하여 제작하였다.
먼저, 절개용 피펫(Cutting pipette)은 나리시게 G-1(외경 1.0mm, 내경 0.9mm, Narishige사, 일본)을 사용하여 추(소 1개, 대 1개)를 부착하고, 풀링단계(단계1~단계 2)에 고정한 후, 온도를 80~101.5℃로 조정하여 제조하였다.
탈핵·핵 이식용 피펫(Injection pipette)은 나리시게 G-1을 사용하여 추(소 1개)를 부착하고, 풀링단계(단계 1~단계 2)에 고정한 후, 온도를 80~101.5℃로 조정하여 제조하였다. 탈핵·핵 이식용 피펫은 내부에 세포가 붙는 것을 방지하기 위해 불화수소(Hydrofluoric acid)로 2~3번 세척한 후 증류수로 세척을 하고 I-Gepal(SIGMA, I-3021)로 코팅하였다.
그 다음, 절개용 피펫(10)과 탈핵·핵이식용 피펫(20)을 평행하게 놓고, 절개용 피펫의 폐쇄형 팁 말단(12)이 탈핵·핵이식용 피펫(20)의 개방형 팁 말단(22)에 비해 약 500 ㎛ 돌출되게 위치시켜 절개와 핵 이식시 서로 간섭을 받지 않게 한 다음, 양 피펫의 모세관 부(11, 21)가 접하는 부분에 실리콘을 사용하여 접착시키고 일체로 결합, 고정시킴으로써 본 발명의 이중 피펫을 제조하였다(도 1 내지 도 4 참조).
[ 실시예2 ] 본 발명의 이중 피펫을 이용한 체세포 복제 수정란 및 체세포 복제동물의 생산
1) 난자의 채취 및 배양
도축장에서 채취해 온 소의 난소에서 난포의 직경이 3~5㎜ 크기의 것만 골라 18게이지 주사바늘과 일회용 주사기를 이용하여 난포액과 함께 난자를 뽑은 후 실체현미경 하에서 세포질과 난구세포가 균일한 미성숙 난포란만 선별하였다. 미성숙 난포란을 성숙배양 배지를 사용하여 20~20시간 동안 5% CO2, 95% 습도로 조정된 배양기 내에서 배양하였다. 성숙배양 배지로는 10%의 FBS 및 0.015 IU FSH (Antrin, Denka Pharm., 일본국), 0.015 IU LH (Sigma, 미합중국)가 첨가된 TCM199 (이하, TCM199)을 사용하였다.
2) 체세포 배양
2-1) 공여핵 체세포 분리
40일령 소 태아를 안과용 가위로 잘게 썰어 0.1~0.2㎠ 넓이의 조직으로 절제한 다음, 5㎖ 시험관에 인산염 완충 용액을 준비하여 여기에 절제된 조직을 넣어 4℃로 냉장 보관하였다. 다시 인산염 완충용액으로 세정한 후 0.05% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 배양기 안에서 10-20분간 정치하였다. 1800rpm에서 5분간 원심분리하여 2~3회 세척하였다. 최종 원심세정 후 침전 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM으로 옮겨 37℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양하였다.
2-2) 계대배양
페트리디쉬의 배양액을 버리고 인산염 완충 용액으로 1~2회 세척한 후 0.05% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 배양기 안에서 5분간 정치하였다. 이 세포를 인산염 완충용액으로 세정 후 회수하여 1800rpm에서 5분 정도 원심분리 세척하여 적당량을 새로운 페트리디쉬에 분주하고 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양하였다.
2-3) 혈청기아 배양
10% FBS가 첨가된 DMEM에서 배양하여 증식중인 세포주를 0.5% FBS가 첨가된 배양액으로 교체하고 3~10일간 배양 후 공여핵으로 제공하였다.
3) 물리적 탈핵
3-1) 난구세포의 제거
모든 체외 조작은 Hepes가 25 mM 첨가된 mSOF (이하 Hepes-mSOF)를 사용하였다. 배양 조건은 5% CO2, 5% O2, 고습도 환경이고, 체외 배양액의 조성은 (NaCl (106mM), KCL (7.2mM), NaHCO3 (25mM), KH2PO4 (1.2mM), 소듐락테이트 (6.6mM), CaCl2 (1.7mM), MgCl2 (0.5mM), 소듐피루베이트 (0.3mM), 글루코오스 (1.5mM), BSA (8mg/ml), MEM 필수아미노산 용액(2% v/v), MEM 비필수 아미노산용액(1% v/v), 글루타민 (1mM), ITS 인슐린, 트렌스페린, 셀레늄 혼합물(1%,v/v)을 사용하였다.
상기에서 20시간 동안 성숙시킨 난자를 0.1% 히알루로니다아제 (Sigma, 미합중국)가 첨가된 Hepes-mSOF로 3-4회 세정한 다음, 내경이 170 ㎛인 유리관을 사용하여 부드러운 피페팅(pipetting)으로 남은 난구세포층을 깨끗이 제거하였다. 실험에는 세포질이 균질하고 제1극체가 방출된 성숙 난자만을 선별하여 사용하였다. 이 작업 시간은 10~15분 이내로 하였다.
3-2) 본 발명의 이중 피펫 등 핵이식에 사용할 피펫의 제작
핵이식에 사용할 피펫으로 고정용 피펫, 본 발명의 이중 피펫 및 난자의 세정 및 운반용 피펫을 각각 제작하였다.
피펫은 풀러(Puller; PC-10, Narishigae사, 일본), 마이크로포지(Microforge; MF-9, Narishige사, 일본) 등과 같은 기기들을 사용하여 제작하였다.
고정용 피펫(Holding pipette, 50)은 나리시게 GD-1(Narishige사, 일본)을 사용하여 추를 부착하지 않고, 풀링단계(Pulling step, 단계 1)에 고정한 후, 온도를 80℃로 조정하여 제조하였다.
본 발명의 이중 피펫은 상기 실시예 1과 같이 절개용 피펫과 탈핵·핵이식용 피펫을 제작하여 두 피펫을 일체로 결합함으로써 제조하였다(도 1 내지 도 4).
난자의 세정 및 운반용 피펫은 알코올 램프를 이용하여 내경이 300㎛ 이상이 되도록 하고, 한번 사용한 것은 폐기하였다.
상기 제작한 피펫들은 수정란의 미세조작을 위한 매니퓰레이터(manipulator)의 피펫 고정 장치에 위치시켰다. 매니퓰레이터에 구비된 구동장비를 이용해서 원하는 위치로 본 발명의 이중피펫을 교대로 움직임으로써 하기 작업을 수행하였다.
3-3) 투명대의 절개 및 탈핵
성숙 난자를 본 발명의 이중 피펫을 이용하여 탈핵할 난자 (실험군), 기존의 스퀴징 방법으로 탈핵할 난자 (비교군 1) 및 난자 고정용 피펫으로 탈핵할 난자 (비교군 2)로 분류하여 하기와 같이 투명대 절개 및 탈핵을 실시하였다.
먼저, 수핵난자를 Hoechst 33342 (최종농도 5~10 ㎍/㎖) 및 사이토칼라신 B (cytochalasin B, sigma C-6762, 최종농도 5 ㎍/㎖)의 혼합용액에 10~15분간 정치한 다음, 이를 100 ㎍/㎖ 피토헤마토글루티닌(Phytohematoglutinin, Sigma, 미합중국)이 함유된 4 ㎕의 Hepes-mSOF 미세드롭으로 이동시킨 후에 탈핵을 실시하였다.
실험군의 난자는 고정용 피펫으로 제1극체가 12시 방향으로 가도록 난자를 고정한 다음, 본 발명의 이중 피펫 중 절개용 피펫을 1시 방향으로 하여 폐쇄형 팁 말단으로 투명대를 절개하여 10시 방향으로 통과시켰다. 이후 고정용 피펫을 푼 다음, 상기 고정용 피펫을 절개용 피펫이 통과한 제1극체 상단부의 투명대에 접촉시키고 두 피펫을 마찰을 가해 투명대에 절개창을 만들었다. 그런 다음 실험군의 난자에서는 제1극체와 중기판이 들어있는 세포질의 일부를 본 발명의 이중 피펫 중 핵이식용 피펫을 이용해 음압을 가해 난자로부터 제거시켰다 (도 5 및 도 6).
비교군 1은 스퀴징 방법으로 탈핵을 실시한 군으로, 난자를 고정용 피펫으로 제1극체가 12시 방향으로 가도록 난자를 고정한 다음, 절개용 피펫을 1시 방향으로 하여 투명대를 절개하여 10시 방향으로 통과시켰다. 이후 고정용 피펫을 푼 다음, 상기 고정용 피펫을 절개용 피펫이 통과한 제1극체 상단부의 투명대에 접촉시키고 두 피펫을 마찰을 가해 투명대에 절개창을 만들었다. 그런 다음 비교군 1 의 난자에서는 제1극체와 중기판이 들어있는 세포질의 일부를 압력을 가해 난자로부터 방출시켰다(도 7).
한편, 비교군 2의 난자는 상기 실험군의 난자와 동일한 방법으로 절개창을 만든 후 난자고정용 피펫을 이용하여 절개창을 통해 음압을 주어 난자에서는 제1극체와 중기판이 들어있는 세포질의 일부를 난자로부터 방출시켰다(도 8).
4) 핵이식
상기 탈핵 과정에서와 같이, 핵이식은 100 ㎍/㎖ 피토헤마토글루티닌이 함유된 4 ㎕의 Hepes-mSOF 동일한 작업용 드롭에서 실시하였다.
탈핵이 끝난 상태의 작업용 드롭에 상기 실시예 2-2)에서 준비된 공여핵인 체세포 부유액을 소량 주입한 후, 직경이 20 ㎛인 세포막이 깨끗한 세포를 선별하여 핵이식용 피펫 안으로 흡입하였다. 그 다음, 고정용 피펫으로 탈핵 난자의 절개창이 1시 방향으로 오도록 난자를 고정한 후, 절개창을 통해 주란강 안에 핵이식용 피펫을 옮기고 상기 체세포를 주입하였다.
실험군와 같이 본 발명의 이중 피펫의 핵이식용 피펫을 사용해 탈핵 후 핵이식을 하게 되면 도 9와 같은 모양이 된다.
본 발명의 이중 피펫을 사용하여 탈핵 및 핵이식 과정을 수행시, 탈핵과 동시에 핵이식을 가능하게 하여 작업시간을 줄여주고, 수핵난자의 형태를 최대한 유지한 채 탈핵을 가능케 하며, 수핵난자 제 1극체와 중기판이 가까이 있지 않은 경우에도 효율적인 탈핵 및 핵이식을 가능하였다.
비교군 1, 비교군 2에서 탈핵 후 핵이식을 하게 되면 도 10과 같이 탈핵된 난자 제1극체와 중기판이 절개창 위로 보이며, 핵이식용 피펫으로 핵 이식시 자연스럽게 제1극체와 중기판이 떨어져 나가게 하였다(도 7). 비교군 1, 비교군 2에서 염색체-방추사가 가까이 있지 않은 경우는 외부로 유출되어지는 세포질의 양을 늘려서 염색체-방추사 복합체를 탈핵해야 하는 문제점이 있었다.
5) 전기융합
핵이식이 완료된 후 공여핵(9) 세포와 수핵난자(3)의 세포질의 융합은 Electronic Cell Manipulator RMX2010 (www.Biofusiontech.com, 대한민국)로 실시하였다(도 10). 이때 융합 배지는 0.1 mM MgCl2 및 0.05% BSA가 첨가된 0.27 M 마니톨 (Sigma, 미합중국) 용액을 사용하였고, 여기에 핵이식란을 2-3분 동안 두어 평형화를 실시하였다. 그 다음 핵이식란을 직접 전기융합용 바늘 사이에 두고 공여핵(9) 세포는 (+)극, 난자는 (-)극으로 향하게 하여 직접융합용 바늘을 수핵난자 표면에 약간의 양압을 주면서 직류 전류 20 Volt, 가해지는 시간 10 ㎲, 횟수 1회 자극하여 융합을 유도하였다. 30분 뒤 융합 확인 후 융합이 안된 것은 1회 재융합을 실시하였다.
6) 재프로그래밍 유도
전기 융합이 끝난 복제수정란은 4시간 동안 39 ℃, 5% CO2 배양기 내에서 mSOF로 4시간 동안 배양하여 세포핵의 재프로그래밍을 유도하였다.
7) 화학적 활성화
통전이 끝난 핵 이식란은 배양용 mSOF으로 옮겨 30분간 배양하고 그 후 정상 적인 융합이 일어난 난자만 선별하여 활성화시켰다.
Ca2 +-Ionophore(A23187)가 첨가된 Hepes-mSOF 용액에서 5분간 활성화시킨 난자를 6-DMAP가 첨가된 mSOF 용액에서 4시간 동안 활성화시켰다. 활성화가 끝난 난자를 mSOF 배지에서 2~3회 세척하여 배양을 실시하였다.
8) 복제수정란의 배양
활성화 처리가 완료된 복제수정란을 Hepes-mSOF로 3회 세정한 후 7일간 mSOF에서 39℃, 5% CO2 배양기에서 배양, 분화시켜 배반포로 발달시켰다(도 12, 도 13).
상기 실시예 1) 내지 8)에서 제조된 각각의 복제수정란의 배반포 발달률은 하기 표 1(실시예 3-3의 복제수정란을 대상으로 한 결과) 및 표 2에 나타내었다.
난자의수 발달된 체세포 복제 수정란의 수 (%)
탈핵처리 탈핵전 난자의수 탈핵성공갯수 (A) 주입 융합 (B) 2세포 (C) 4세포 (C) 8세포 (C) 16세포 (C) 상실배 (C) 배반포 (C)
실험군 본 발명 의 이중 피펫 사 용 172 146 (85%) 141 132 (94%) 101 (84%) 95 (72%) 71 (54%) 46 (35%) 40 (30%) 33 (25%)
비교군1 스퀴징 156 109 (70%) 103 98 (95%) 76 (78%) 66 (67%) 56 (57%) 39 (40%) 26 (26%) 20 (20%)
비교군 2 고정용 피펫 동시사용 138 95 (69%) 92 85 (92%) 66 (77%) 55 (65%) 46 (54%) 27 (32%) 24 (28%) 19 (20%)
A 탈핵전 난자 수에 대한 백분율 B 주입된 난자 수에 대한 백분율 C 융합된 난자 수에 대한 백분율
상기 표 1의 결과를 보면, 본 발명의 이중 피펫을 사용하여 탈핵한 실험군에서 탈핵성공율이 85%로 가장 높았고, 이후에 핵이식하여 제조된 복제수정란의 배반포 발달률이 25%로 가장 높음을 알 수 있었다.
고정용 피펫으로 탈핵 후 핵이식한 비교군 2의 복제수정란 배반포 발달률이 20%로 높았고, 스퀴징 방법으로 제조된 비교군 1의 복제수정란 배반포 발달률 20%와 각각의 방법은 유의적인 차이를 보이지 않았다.
또한, 본 발명에서 중요한 점으로 언급하는 전체 공여된 난자의 수에 대한 비율을 살펴 보자면
탈핵처리 탈핵전 난자의 수 탈핵 성공 갯수 배반포
실험군 본 발명의 이중 피펫 사용 172 146 (85%) 33 (19.1%)D
비교군1 스퀴징 156 109 (70%) 20 (12.8%)
비교군2 고정용 피펫 사용 138 95 (69%) 19 (13.7%)
D 탈핵전 난자의 수에 대한 백분율
전체 난자수에 대한 백분율을 보면, 본 발명의 이중 피펫을 사용하여 탈핵, 핵이식하여 제조된 복제수정란(실험군)의 전체 난자수에 대한 배반포 발달률이 19.1%로 가장 높음을 확인할 수 있었다.
반면, 스퀴징 방법으로 제조된 복제수정란(비교군 1)의 배반포 발달률이 12.8 %, 고정용 피펫으로 탈핵 후 핵이식한 복제수정란(비교군 2)의 배반포 발달률이 13.7%으로 각각 나타났다.
즉 스퀴징 방식(비교군 1)과 고정용 피펫을 사용한 탈핵방법(비교군 2)은 전체 탈핵 전 난자수에 대한 배반포 백분율에서 유의적인 차이를 보이지 않았지만, 본 발명의 이중 피펫을 사용하여 탈핵한 방법(실험군)은 탈핵율도 높고, 배반포로의 발달률도 높아 최종 결과에서는 현저한 차이를 보였다.
비교군 1, 비교군 2의 경우는 염색체-방추사가 가까이 있지 않은 경우 외부로 유출되어지는 세포질의 양을 늘려서 염색체-방추사 복합체를 탈핵해야 하는 문제점이 있으며, 비교군 1, 비교군 2는 상대적으로 탈핵 후 세포질 유실이 많아져 공여핵 융합 시에도 공여핵과 세포질 사이에 밀착성이 떨어지고 공간이 많아져 세포 융합률 또한 떨어지고 결국 배반포로의 발달률도 감소하는 단점을 가진다.
따라서, 본 발명의 절개용 피펫 및 핵이식용 피펫으로 이루어진 이중 피펫 및 이를 이용한 수핵난자의 탈핵방법은 수핵난자의 확보가 어려운 포유류의 경우 수핵난의 탈핵율을 높임으로써 복제수정란 제조 작업시 제공되는 수핵란의 숫자를 더 확보할 수 있게 하여 탈핵 이후 복제 수정란의 배반포 발달률을 증가시키는 작용효과를 나타낸다.
9) 체세포 복제수정란의 이식 및 체세포 복제 동물 생산
상기 체외배양된 실험군의 체세포 복제 수정란을 통상의 수정란 이식방법에 따라 대리모동물(홀스타인 젖소)에 이식하여 체세포 복제 동물을 생산한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
배반포 성숙란 이식두수 임신 중 분만산자
30 6 3 1
상기에서 살펴본 바와 같이, 체세포 복제수정란의 제조시 본 발명의 이중 피펫을 사용하면 탈핵과 동시에 핵이식을 가능하게 하여 작업시간을 줄여주고, 수핵난자의 형태를 최대한 유지한 채 탈핵을 가능하게 하며, 수핵난자 제1극체와 중기판이 가까이 있지 않은 경우에도 효율적인 탈핵 및 핵이식을 가능하게 한다.
또한, 수핵난의 탈핵율을 높여 복제수정란 제조시 제공되는 수핵난의 숫자를 더 확보할 수 있게 하여 탈핵 이후 복제 수정란의 배반포 발달률을 증가시키는 작용효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 탈핵 및 핵이식용 이중 피펫 및 이를 이용한 수핵난자의 탈핵 및 핵이식 방법은 체세포 복제동물의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (3)

  1. 절개용 피펫 및 탈핵·핵이식용 피펫으로 이루어진 체세포 복제 수정란 제조시 사용되는 피펫으로서,
    상기 절개용 피펫은 한쪽 말단으로서 내경이 일정하고 외부와 개방된 모세관 형태의 모세관부와, 다른 말단으로서 내경이 상기 모세관부의 내경보다 짧고 말단으로 갈수록 더 짧아지도록 뽑아져 있으면서 외부와 단절되어 있는 폐쇄형 팁 말단을 포함하는 폐쇄형 팁 형상부로 이루어지고,
    상기 탈핵·핵이식용 피펫은 한쪽 말단으로서 내경이 일정하고 외부와 개방된 모세관 형태의 모세관부와, 다른 말단으로서 내경이 상기 모세관부의 내경보다 짧고 말단으로 갈수록 더 짧아지도록 뽑아져 있으면서 외부와 개방된 개방형 팁 말단을 포함하는 개방형 팁 형상부로 이루어지며,
    상기 절개용 피펫과 탈핵·핵이식용 피펫은 같은 방향으로 평행하게 위치되었을 때, 절개용 피펫의 모세관부와 탈핵·핵이식용 피펫의 모세관부가 서로 결합되어 있고, 이와 같이 결합되어 있을 때 폐쇄형 팁 말단이 개방형 팁 말단에 비해 길게 돌출되어 있는 것을 특징으로 하는 이중 피펫.
  2. 제1항에 있어서, 상기 절개용 피펫은 핵이식용 피펫보다 100~1000㎛ 돌출되어 있는 것을 특징으로 하는 이중 피펫.
  3. 제1항에 있어서, 상기 절개용 피펫이 핵이식용 피펫보다 위쪽에 위치한 것을 특징으로 하는 이중 피펫.
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