KR100427217B1 - 체세포 복제동물의 생산을 위한 세포융합방법 및수핵난자의 탈핵방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 체세포 복제동물의 생산을 위한 세포융합방법에 관한 것으로, 전기융합시 저전압, 단시간내에 양압을 가하면서 전기를 직접 공여핵과 난모세포에 가하는 방법을 특징으로 한다. 전기융합시 조건은 전압이 DC 23~28V, 횟수는 1회, 시간은 10㎲이다.
또한 본 발명은 체세포 복제동물의 생산방법중 수핵난자의 탈핵시 고정용 피펫으로 음압을 주어 탈핵함을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 체세포 복제동물의 생산을 위한 세포융합방법에 관한 것으로, 전기융합시 저전압, 단시간내에 양압을 가하면서 전기를 직접 공여핵과 난모세포에 가하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 체세포 복제동물의 생산방법중 수핵난자의 탈핵시 고정용 피펫으로 음압을 주어 탈핵하는 방법에 관한 것이다.
근래에 생명공학 또는 유전자조작 기술의 발달에 따라 복제동물 생산에 성공하는 사례들이 보고되고 있다.
일반적으로 복제동물을 생산하기 위하여 1) 수핵난자 및 공여핵의 준비(Maturation and Cell culture), 2) 난구세포 제거(Denuding), 3) 투명대 절개(Cutting), 4) 탈핵(Enucleation), 5) 핵 이식(Nuclear Transplantation), 6) 세포융합(Cell Fusion), 7) 세포질 활성화(Activation), 8) 체외배양(In vitro culture), 9) 대리모에의 이식(Embryo Transplantation) 10) 산자생산(Offspring)의 단계로 진행된다.
1) 수핵난자의 준비(Cytoplast)
공여핵을 이식 받게되는 수핵난자는 성숙난자의 탈핵과정을 통해 확보하게 된다. 탈핵은 복제과정중 가장 먼저 이루어지며 일반적으로 세포골격 억제제(cytoskeletal inhibitor)인 사이토칼라신 B(cytochalasin B)로 처리하여 세포골격에 의한 세포질의 파괴를 억제한 후 미세조작에 의해 처리되며, 수핵난자로는 일반적으로 M II(metaphase II)의 난자가 이용되고 있다. 난소에는 여러개의 난포가 존재한다. 이 난포내에는 미성숙 난자가 있으며 주사기로 난포액을 흡입하여 난자를 얻게 된다. 현미경을 통해 질이 좋은 미성숙난을 채취하여 24시간 동안 배양하면 제2 감수분열 중기의 성숙난자를 얻을 수 있다.
소의 경우는 체외성숙 기술이 보편화되어 있기 때문에 체외성숙 난자를 이용하고 있으나 돼지는 현재까지 체외성숙 난자의 발육능이 저조한 현상 등의 이유로 체내성숙 난자가 이용되기도 한다.
일반적으로 제1극체 주위 세포질중 20∼30%를 제거하여 탈핵한 후 Hoechst 33342 등으로 형광염색하여 탈핵 여부를 판단하게 된다.
2) 공여핵의 준비(Karyoplast)
현재 공여핵으로 이용되는 체세포는 세포분열의 휴지기에 존재하는 세포가 주로 이용되고 있다. 인위적으로 세포배양의 영양물질을 줄임으로써 이런 휴지기(G0기)를 유도할 수 있다. 이론상 우리 몸의 모든 세포가 이에 해당하나 채취와 배양이 용이한 세포가 많이 이용되고 있다. 대표적인 것으로 귀, 꼬리 등에서 일부 조직을 채취하여 얻은 세포가 공여핵으로 사용된다.
체세포를 공여핵으로 이용할 경우 세포의 탈분화(dedifferentiation), 즉 리프로그래밍에 더 많은 시간이 요구된다. 특히 이미 분화된 세포의 세포시계를 되돌려 미분화 상태로 만들기 위해서는 분열 및 분화가 정지된 상태(quiescence)인 G0기로 조절하는 것이 핵 이식에 의한 복제에 있어 수월한 것으로 알려져 있다. 배양된 체세포의 세포주기 조절은 혈청기아(serum starvation)를 통해 G0기로 유도하는 것으로 이루어진다. 세포주기에 있어 G0기와 G1기의 핵형은 염색체의 수(n)나 유전물질의 양(c)에 있어서 2n-2c 상태이다. 자연상태의 세포주기중 G1기로 동기화된(synchronization) 상태에도 핵 이식 자체는 가능한 것으로 보고되어 있으나 유전자의 완벽한 리프로그래밍을 위해서는 G0기로 유도하는 것이 효율적인 것으로 알려져 있다. 결국 혈청기아에 의한 G0기 유도가 세포주기 동기화에 의한 정상핵형 유지의 측면보다는 리프그래밍의 과정에서 거쳐야 할 필수적인 과정으로 받아 들여지고 있다.
3) 난구세포 제거(Denuding)
수핵난자는 난구세포로 둘러싸여 있으며 미세조작을 위해 효소를 이용 난구세포를 제거해준다.
4) 투명대 절개(Cutting) 및 탈핵(Enucleation)
수핵난자는 투명대라고 하는 단단한 구조로 둘러싸여 있으며, 난자의 핵을 제거하기 위해서는 투명대를 미세한 유리침을 이용하여 일부 절개한 후 압력을 주어 핵을 포함한 약간의 세포질을 제거하거나(squeeze), 유리침을 절개된 투명대 사이에 삽입하여 세포질을 흡입하는 방법(aspiration)이 있다.
5) 이식(Injection)
새 유리관으로 공여핵을 흡입한 후 절개된 투명대 사이로 세포를 주입한다. 공여핵 세포를 수핵난자 내에 이식하는 방법은 크게 세포융합(cell fusion)과 세포질내 직접주입법(intracytoplasmic cell injection;ICCI)으로 대별되며, 세포융합법에는 핵 이식 후 화학물질에 노출, 불활성화된 센다이 바이러스(Sendai virus) 주입, 전기자극 등의 방법이 있으며 최근에는 간편하고 재현성이 우수한 전기자극법이 보편적으로 이용된다. 후자는 인간의 불임클리닉에서 이용하는 정자직접주입법(intracytoplasmic sperm injection;ICSI)을 응용한 것으로 공여핵의 크기가 작아 융합이 어려운 경우에 시도하고 있다.
6) 융합(Fusion) 및 세포 활성화(Activation)
이식된 세포와 난세포질의 융합을 위하여 전기자극이 이용될 수 있다. 융합은 (-),(+) 전극 사이에 핵 이식란을 위치시킨 후 전압을 걸어줌으로서 이루어진다. 핵 이식란의 이후 발육을 위해서는 수정과정에서 보이는 칼슘의 유입인 활성화의 과정이 필요하며 약품이나 또는 전기자극으로 이를 유도할 수 있다.
일반적으로 정자와 융합된 난자는 정자로부터의 어떤 인자에 의해 세포내 칼슘이온농도가 증가하고 성숙인자로 알려진 MPF(maturation/ mitosis/ meiosis/ metaphase promoting factor) 수준의 감소, 피질과립반응(cortical granule reaction), 감수분열 재개 및 제2극체 방출 등의 현상을 보인다. 난자의 인위적인 활성화 기법도 세포내 칼슘이온의 유입을 통해 수정시 보이는 난자의 활성을 유도하는 것으로 전기자극법 및 칼슘이온운반체(Ca-ionophore, A23187)와 단백질합성억제제의 병행처리법 등 전통적으로 몇가지 방법이 이용되고 있다. 통전에 의한 난자의 활성화가 전기적 세포융합과 동시에 이뤄질 수 있기 때문에 간편하게 이용될 수도 있으나 현재는 칼슘이온운반체 계열의 이오노마이신(ionomycin)과 인산화억제물질의 하나인 6-DMAP(6-dimethylaminopurine)에 의한 융합후 활성화가 보편적으로 적용되고 있다. 6-DMAP는 활성화에 의해 저하된 MPF 수준의 재상승을 억제하며 연이어 나타나는 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 수준의 저하를 유도하여 전핵을 형성시킨다. 한편 MPF 수준이 높은 상황에서 융합된 외래핵은 일시적으로 핵막붕괴 및 염색체가 응축되는데 이 경우 염색체는 곧 S기로 돌입되어 G0/G1기로 동기화되지 않은 세포의 경우 염색체 이상이 초래될 수 있으며 이런 과정을 리모델링이라 한다. 체세포 복제가 이루어지기 전, 수정란 할구의 핵 이식시에는 이와 같은 리모델링이 수정란의 복제에 필수과정은 아닌 것으로 알려져 있다. 따라서 세포주기와는 무관하게 활성화 시킨 다음 행해지는 융합이 보편적이다.
최근에는 전기융합이 이루어지고 일정 시간이 경과한 다음 화학적 또는 전기적 방법에 의한 활성화로 리모델링을 유도한 핵 이식란이 우수한 발육률을 보여, 융합후 일정시간 동안 높은 MPF 수준을 유지하여 리모델링을 거치는 것이 이식된 핵의 리프로그래밍에 유효할지 모른다는 주장이 제기되고 있다. 체세포 복제의 경우 G0/G1기의 세포만이 공여핵으로 이용되기 때문에 융합후 활성화를 실시한 경우에도 이론적으로는 핵형이상이 유발되지 않는다.
리프로그래밍이란 핵 이식란이 일반적인 수정란처럼 분할 및 발육에 적응하는 과정을 말하며 다음과 같은 몇 가지 사실이 이의 증거가 된다. 첫째, 핵 이식란이 배반포와 같은 특정 단계까지의 발육에 소요되는 기간이 (초기에는 일부 지연되는 현상이 나타나기도 함) 일반적인 체외수정란의 배양시간과 큰 차이가 없다. 2세포기로의 분할에 소요되는 배양시간이 정상적인 수정과정에 비해 다소 지연되지만 이는 핵 이식란이 세포융합 후 단백질 교환 등 일련의 과정을 경과하는데 소요되는 기간이 아닌가 추정된다. 둘째, 공여핵의 핵막이 전핵에서 처럼 심하게 증대되는 현상(nuclear swelling)을 보인다. 핵 이식란은 융합 후 2시간 이내에 핵막의 증대가 나타나지 않으면 배반포로 발육되지 않는 것으로 알려져 있다. 셋째, 유전자의 전사과정(transcription)이 신속하게 억제된다. 이는 핵소체, RNA 및 펩타이드의 관찰에 의해 확인되고 있으며, GFP(green fluorescence protein)를 표지로 한 체세포 핵 이식의 결과에서도 간접적으로 확인할 수 있다. 넷째, nuclear lamins 및 ribosomal protein을 포함한 특정 분자의 변화상을 들 수 있다. 수정시 정자는 프로타민(protamine)과 같은 독특한 형태의 핵단백질을 지니고 난자에 들어오는데 핵이식시의 공여핵은 이러한 프로타민을 가지고 있지 않다. 그러나 핵 이식란은 융합 후 이와 같은 핵단백질이 나타나며, 이 현상은 세포질내의 특정 단백질이 DNA와 결합하고 즉각적인 유전자 발현을 통해 나타나게 된다. 다섯째, 메틸화(methylation)의 변화를 들 수 있다. 메틸화란 유전자의 특정 위치의 불활성화와 관련된 것으로 분화과정에서 유전자의 여러 부위에서 메틸화가 진행된다. 이론적으로 핵 이식란이 리프로그래밍이 된다면 탈메틸화 및 재메틸화 과정을 거쳐야 정상적인 발육 및 분화단계를 거쳐 발육이 가능할 것이다. 최근 여러 연구팀에서 이에 대한 확인을 시도하고 있으며 탈메틸화 처리를 통한 핵 이식란의 발육을 향상 시키기 위하여 노력하고 있으나 아직까지 확실한 결과는 나타나지 않고 있다. 이렇듯 리프로그래밍에 의한 수정란은 자신의 생물학적 시계를 되돌리게 되나 복제동물의 조기 노화 가능성 등에 관하여는 아직 논란이 많다. 이에 대한 해답을 구하기 위해 노화와 관련된 telomerase activity를 측정하는 등 분자생물학적 기법을 이용한 접근이 시도되고 있다.
7) 체외배양 및 체내이식
핵 이식란의 배양 및 수정란 이식은 체내 또는 체외 수정란의 배양이나 이식에서와 동일한 방법이 이용되며 융합 후 정상적으로 분할한 핵 이식란의 경우 배반포로의 발생율은 체외 수정란과 큰 차이를 보이지 않는다. 그러나 배반포를 이식한 후의 산자생산율은 체내 또는 체외 수정란의 이식 성적에 비해 저조한 편이다. 이는 착상의 실패, 조기 태아사 또는 거대 태아에 의한 난산 등의 문제점에 기인되는 것으로 생각되고 있다. 작성한 핵 이식란은 온도와 습도가 소의 체내 환경과 유사하게 조절된 배양기에서 착상 직전의 배반포(포배기)까지 배양한다.
체세포 핵 이식 과정에서 생산된 동물이 완벽한 복제를 의미하는 것은 아니며 우유의 생산이나 번식성 등은 세포질 내의 미토콘드리아 DNA와의 유관성이 제기되고 있어 실용화 추구와 동시에 이에 대한 연구도 병행되어야 할 것이다. 미토콘드리아는 세포의 대사와 밀접한 관련이 있으므로 이종간 핵 이식에 의해 접근하려는 시도가 행해지고 있다. 특히 이러한 시도를 통해 이종간 핵 이식이 성공한다면 희귀동물의 증식보존이 가능해지는 등 환경 파괴로 감소되는 유전자원의 보존 측면에서 획기적인 대안이 될 것이다. 수태율과 분만 성적이 뛰어나고 건강한 대리모를 선정하여 배양한 핵 이식란을 자궁에 이식하여 준다.
상기 방법은 일반적인 체세포 복제동물을 만들어 내는 과정이다.
종래의 전기융합 방법은 도1에 나타낸 바와같이 전극 (+,-) 사이에 핵이 치환된 난자를 넣고 전기적 융합을 한다. 전기적 자극은 논문으로 보고된 사항중에 보편화된 전압과 펄스 그리고 전압의 반복회수를 통해 융합을 시도한다. 일반적으로 복제소의 경우 1.75kv/㎝, 15㎲ 및 2회의 펄스(pulse)를 준다. 이러한 융합을 할 때 염색체 이상을 일으키지 않으며, 세포질 분열을 활성화 하여 배를 재구성하기 위해서 혈청기아배양을 하여 세포를 휴지기로 만들어 공여핵 세포로 사용한다. 이러한 공여핵으로 혈청기아배양을 하면 크기가 작지 않아도 G0/G1기의 세포를 확률적으로 많이 얻을수 있으며, 핵과 세포질이 유출된 난모세포에 넣는다. 공여핵 크기가 작은 세포는 G0/G1기의 세포라고 보는 것이 확률적으로 매우 높다. 일반적 세포배양을 통한 세포중에서도 크기가 작은 것은 G0/G1기의 세포이며 공여핵으로도사용될 수 있다. 공여핵의 크기가 작으면 세포질과 핵이 제거된 난모세포 안에서 난모세포 세포질에 원활히 융합이 되지 않는다. 작업자가 작업을 하는 과정과 핵이 치환된 난모세포를 융합용 판에 옮기는 과정에서 이러한 세포들은 공간안에서 이동을 하게 되며 전기적 융합은 적당한 공여핵과 난모세포 세포질 사이의 접근이 된 후에만 가능하게 된다. G0/G1기로 생각되는 공여핵을 난모세포질 사이에 넣어서 전기융합을 가하기 전에 접근성을 높이기 위해 세포질을 다치지 않는 위치 깊숙히 공여핵을 치환 시킨다.
전기융합 방법중 가장 보편화된 기술은 혈청기아배양을 한 공여핵 중에 크기가 좀 큰 세포를 사용하여 핵과 세포질이 노출된 난모세포 안에서 난모세포의 세포질에 밀착성을 얻은후 전기적 융합을 하는 것이다. 이러한 융합용 공여핵은 크기가 크면 융합이 잘되고, 세포 크기가 작을수록 세포는 발육율이 좋다. 융합시 전압이 높으면 융합은 잘되나 발육이 낮거나 멈춰버린다(lysis). 통전시에는 만니톨(Mannitol)이나 짐메르만 세포융합배지(Zimmerman Cell Fusion Medium)와 같은 비전해질 용액을 사용한다. 이러한 비전해질 용액을 융합판 안에 채워서 그 안에 핵이 치환된 난모세포를 넣고 전기적 융합을 시도한다.
종래에는 공여핵을 세포질 구석부분에 넣어서 밀착성을 높이려고 하였지만 전극과 직각의 상태가 아니다. 따라서, 융합판의 융합액에서 입의 공기압으로 유리관을 이용하거나 가느다란 유리관을 이용하여 손으로 난자의 위치를 움직여 (-)전극와 공여핵이 직각이 되도록 바꿔줘야 하는 불편함이 있다. 또한 고전압을 사용 하므로 난자가 lysis 되는 문제점도 발생한다.
본 발명에서는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 저전압, 단시간내에 양압을 가하면서 전기를 직접 공여핵과 난모세포에 가하여 효과적으로 융합시키는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
또한 본 발명은 체세포 복제동물의 생산방법중 수핵난자의 탈핵시 고정용 피펫으로 음압을 주어 탈핵하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
도1는 종래의 융합용 판(chamber)을 나타낸 도이다.
도2는 본 발명의 실시예에 의한 수핵난자의 탈핵과정을 나타낸 도이다.
도3은 본 발명의 탈핵 및 이식하기 위한 작업용 디쉬를 나타낸 도이다.
도4는 본 발명의 전기융합에 사용하는 바늘을 나타낸 도이다.
도5는 본 발명의 실시예에 의한 전기융합방법을 나타낸 도이다.
도6은 본 발명의 실시예 의해서 최종 생성된 복제 송아지를 나타낸 도이다.
본 발명은 체세포 복제동물의 생산을 위한 세포융합방법에 관한 것으로, 전기융합시 저전압, 단시간내에 양압을 가하면서 전기를 직접 공여핵과 난모세포에 가하는 방법을 특징으로 한다. 전기융합시 조건은 전압이 DC 23~28V, 횟수는 1회, 시간은 10㎲임을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 체세포 복제동물의 생산방법중 수핵난자의 탈핵시 고정용 피펫으로 음압을 주어 탈핵하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 체세포는 소의 난구세포, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포이며, 계대배양, 혈청기아배양 또는 동결보존에 의해 보존처리한다.
본 발명에서 사용하는 배양액은 다음과 같다.
체세포 배양액은 DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium, Gibco BRL Cat No. 11995-065)에 10% FBS(Gibco BRL Cat No. 16000-044)와 1% 항생제(Gibco BRL Cat No. 15240-062)를 첨가하여 사용한다.
난구세포 제거에 사용하는 0.1% 하이알루로니데이즈(Hyaluronidase; SIGMA,H-3506) 용액은 100㎖의 인산염완충용액(PBS; Gibco BRL Cat No. 14190-144)에 하이알루로니데이즈 0.1g을 첨가하여 만들고, 만들어진 액을 2㎖씩 캡튜브에 분주하여 냉동실(-70℃)에 보관하면서 사용한다.
전기융합배지(Electrofusion media) 제조를 위해서는 수크로즈(SIGMA, s-1888) 47.92g, 마그네슘 아세테이트(SIGMA, m-2545) 0.0535g, 칼슘 아세테이트(SIGMA, c-4205) 0.008g, K2HP04(SIGMA, p-3786) 0.087g, 글루타치온(SIGMA, g-6013) 0.0155g 및 BSA(SIGMA, a-4919) 0.005g 으로 이루어진 짐메르만 세포융합배지(Zimmerman Cell Fusion Medium; ZCFM)를 염산으로 최종 pH를 7.2~7.4로 맞추어 냉장실에서 15일 동안 보관하며 사용한다.
탈핵 및 체세포 주입에 사용하는 PHA-P(Phytohematoglutinin; L-9132) 용액은 PHA-A 5㎎을 인산염완충용액 10㎖에 섞어 100㎕씩 에펜도르프 시험관에 분주한 다음, 실험에 사용할 경우 에펜도르프 시험관에 400㎕의 TCM-199를 첨가하여 작업용 미소적을 만들어 사용한다. 이때 최종 농도는 100㎕/㎖이 되도록 한다.
체세포 주입 후 난자 활성화를 위한 6-DMAP(SIGMA D-2629)는 CR1aa용액 10㎖에 6-DMAP 0.0031g을 첨가하여 용해 및 여과 후(0.22㎛ 필터사용) 에펜도르프 시험관에 분주시키고 냉동보관(1.9mM)한다.
체세포 주입 후 난자 활성화를 위한 Ca2+-Ionophore(A23187)는 DMSO(SIGMA D-5879) 1.66㎖에 Ca2+-Ionophore(A23187) 1㎎을 녹여 1mM을 제조한 다음 최종농도가 5μM 이 되도록 CR1aa 배지내에 첨가하여 사용하고 원액을 냉동 보관한다.
체외배양액 제조시 사용되는 파이루베이트 저장액(Pyruvate stock; SIGMA, p-5280)은 파이루빈산(pyruvic acid) 66㎎을 증류수 30㎖에 용해시킨후 여과하여 1.5㎖씩 캡튜브에 분주하여 냉동보관한다(-20℃).
CR1aa 저장액은 NaCl(Sigma s-5886) 3.772g, KCl(Sigma p-5405) 0.132g 및 NaHCO3(Sigma s-5761)1.254g을 3차 증류수에 넣어 용해한 후 여과하여 냉장 보관한다.
체세포 주입 후 활성화 시킨 난자 배양시 배양액(culture medium)은 CR1aa용액[CR1aa stock 57㎖ + Hemicalcium lactate(SIGMA, l-4883) 0.033g + Pyruvate stock 1.2㎖ + BME amino acid(SIGMA, b-6766) 1.2㎖ + L-Glutamin(SIGMA, g-5763) 0.0088g + MEM nonessential amino acid(Gibco BRL 07167 Cat No. 11140-050) 0.6㎖ + 항생제(Gibco BRL Cat No. 15240-062) 600㎕]을 사용한다.
난자 세정용액은 인산염완충용액에 10% FBS(Gibco BRL Cat No. 20012-027)와 1% 항생제를 첨가하여 사용한다.
난자 배양용(IVM) 및 안정화시킬 때는 TCM-199(Gibco BRL Cat No. 12340-030)에 10% FBS와 1% 항생제를 첨가하여 0.22㎛ 주사기 필터를 사용하여 여과시킨 후 사용한다.
탈핵 여부를 확인하기 위해서 사용하는 Hoechst 33342(SIGMA, B-2261)는 25㎎의 Hoechst에 증류수를 5㎖ 섞어 희석(5m/㎖ 의 stock)시킨 다음, Stock 1~2㎕씩 에펜도르프 시험관에 분주, 냉동보관한다. 사용시에는 시험관에 10% FBS를 첨가하고 CR1aa용액 1㎖를 첨가하여 희석시킨 후 사용한다(최종농도 5~10㎍/㎖). 10~15분간 정치한 다음 형광현미경으로 탈핵여부를 판단한다.
마이크로 피펫은 풀러(Puller; Narishigae, PC-10), 마이크로포지(Microforge; Narishige, MF-9) 등과 같은 기기들을 사용하여 제작한다.
고정용 유리관(Holding pipette)은 나리시게(Narishige) GD-1을 사용하여 추를 부착하지 않고, 풀링단계(Pulling step, 단계 1)에 고정한 후, 온도를 80℃로 조정한다.
절개용 유리관(Cutting pipette)은 나리시게 G-1을 사용하여 추(소 1개, 대 1개)를 부착하고, 풀링단계(단계 1 - 단계 2)에 고정한 후, 온도를 80~101.5℃로 조정한다.
핵 이식용 유리관(Injection pipette)은 나리시게 G-1을 사용하여 추(소 1개)를 부착하고, 풀링단계(단계 1 - 단계 2)에 고정한 후, 온도를 80~101.5℃로 조정한다. 피펫 내부에 세포가 붙는 것을 방지하기 위해 불화수소(Hydrofluoric acid)로 2~3번 세척한 후 증류수로 세척을 하고 I-Gepal(SIGMA, I-3021)로 코팅한다.
난자의 세정 및 운반용 피펫은 알코올 램프를 이용하여 내경이 300㎛ 이상이 되도록 하고, 한번 사용한 것은 폐기한다.
본 발명의 체세포 복제동물의 생산방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
도축장에서 난소를 채취한다. 검란 준비를 위해서 1㎝ 간격의 격자 눈금을그은 60㎜ 디쉬와 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 인산염완충용액을 준비한다. 채취한 난소로부터 18게이지 바늘이 장착된 l0㎖ 일회용 주사기를 사용하여 2∼6㎜의 난포를 흡입한다. 먼저 난구세포가 충분히 부착되어 있고 세포질이 균질한 난자를 선발하여 2∼3회 10% 혈청(Gibco BRL Cat No. 20012-027) 및 1% 항생제가 첨가된 인산염완충용액에서 세정을 한 후 최종 배양인 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에 골라 놓고 500㎕ 당 70∼80개의 난자를 넣은 후 미네랄오일(SIGMA, m-3516)로 도포한다.
난구세포 및 체세포를 체취한 후 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 4~5일 동안 배양을 실시하고 인산염완충용액으로 1~2회 세척한 후 0.05% 트립신, 1mM EDTA 용액(Gibco BRL Cat No. 15400-054)을 첨가하여 배양기 안에서 5분간 정치하면 바닥에 붙은 세포가 떨어지게 되는데, 이 세포를 인산염완충용액으로 세정후 회수하여 원심분리 세척하여 적당량을 새로운 페트리디쉬에 분주하고 배지를 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양한다. 페트리디쉬에 세포가 가득차면 적당량을 분주하여 동결튜브에 나누어서 동결저장을 시키고 필요시 마다 하나씩 꺼내어 사용한다.
체외성숙은 5% CO2, 95% 습도로 조정된 배양기 내에서 20∼22시간 배양한다.
세정용 마우스 피펫(내경 200㎛이상)을 이용하여 TCM-199 배양액에 있던 난자(oocyte) 20~25개 정도를 1개 군으로 하여 PHA-P가 첨가된 TCM-199 배양액으로 이동시킨다. 2개의 피펫을 움직여서 고정용 피펫의 12시 방향에 제1극체(The firstpolar body)가 위치하도록 하고, 고정용 피펫을 난자의 9시 방향에 밀착시킨 뒤 유압을 걸어 난자를 고정시킨다. 절개용 피펫을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 뒤 세포질이 다치지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시킨다. 고정용 피펫에 양압을 걸어 난자를 분리하고 고정용 피펫을 절개용 피펫이 통과한 제1극체 상단부의 투명대에 접촉시키고 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개한다.
절개한 난자에 고정용 피펫을 이동시키고 난자의 절개창을 고정용 피펫의 내경에 위치시킨 후 제 1극체를 포함하여 세포질 20~30%를 음압을 주어서 탈핵을 실시한다(도2). 이러한 방법은 탈핵시 인위적으로 외부힘을 가하지 않으므로 탈핵될 부분만 흡입을 하고 난자내 세포질막 파괴를 예방할 수 있다. 또한 고정용 피펫을 미네랄오일로 채워서 사용하는데 이는 난자가 탈핵과정중 바이러스와 접할 수 있는 기회를 차단하여 준다. 이와같은 방법으로 탈핵할 때는 고정용 피펫의 내경이 투명대가 절개된 크기 보다 약간 크게(20~30㎛) 한다. 다시 양압을 주면 고정되었던 난자와 세포질이 분리된다. 탈핵된 난자를 세포질로 부터 분리하여 TCM-199로 2~3회 세척하고 핵 이식 전까지 배양용 TCM-199에 넣어 보관한다. 탈핵 후의 난자는 매우 취약하기 때문에 마우스 피펫은 최소한 내경이 300㎛ 이상 되는 것을 사용하여 작업 후 난자의 세포질이 절개창을 통해 빠져 나오지 않도록 주의한다.
탈핵 및 이식하기 위한 작업용 디쉬는 플라스틱 접시에 실리콘을 도포한 후, 가로×세로 크기가 2~4㎠의 유리판을 실리콘 위에 놓고 눌러서 부착시킨다. 유리판에 작업용 드롭을 생성한 후 표면에 미네랄오일을 소량 도포한다. 그러면 오일이 유리판 전체에 얇게 퍼지며, 표면장력으로 인해 드롭 형태를 유지한다(도3).
유리판에 보통 4~5개의 작업용 드롭을 만들며, 위부터 2개는 탈핵용 미소적, 2~3개는 이식용 미소적으로 각각 드롭을 형성시킨 후 오일로 도포한다. 탈핵이 끝난 난자를 배양기에서 안정화 시킨 후 이식용 드롭으로 옮긴다. 그러면 한개의 드롭안에 탈핵난자와 공여핵이 상하부분으로 나뉘어 위치한다. 공여핵의 크기가 난자에 비해 작기 때문에 주입용 피펫의 위치를 드롭안에서 공여핵을 장착한 후, 공여핵을 난자의 절개창을 통해 주입한다. 같은 드롭안에 공여핵과 난자가 공존하기 때문에 다른 위치의 드롭에서 공여핵을 장착하고 주입용 피펫을 난자가 있는 드롭으로 이동해서 주입하는 것에 비해 작업 시간이 줄어들고, 오일등이 공여핵에 묻거나 움직이는 도중 압력 차이로 인한 공여핵의 소실을 막을 수 있다. 주입용 마이크로인젝터는 주사기 부분에 미네랄오일을 넣은후 피스톤의 전진, 후진 하는 힘으로 유압을 주게 된다. 하지만 이러한 오일은 통상적으로 피스톤 앞부분에만 오일을 채우는 경우가 많은데, 이럴 경우 주사기안 피스톤의 전,후진 할 때에 일정한 유격을 얻을 수 없으며, 공여핵 주입시 정확한 압 조절이 힘들다. 그러므로 피스톤 뒷부분에도 같은 미네랄오일을 도포하면 전,후진시에 일정한 유격을 얻을 수 있다. 또 피스톤 앞부분 주사기에 약간의 공기방울을 두면 피스톤의 전,후진시 급격한 유격이 일어나는 것을 방지하는 압력 완충작용을 한다.
절개창을 양 피펫과 1시 방향에 수직으로 놓고 고정용 피펫으로 고정한다. 이식용 피펫을 절개창으로 주입하고, 유압을 걸어 한개의 공여핵 세포를 주입시킨다. 주입시 난자의 세포질이 다치지 않도록 주의한다.
핵 이식된 난자를 융합할때 비전해질 용액인 짐메르만 세포융합 배지를 사용하는데, 4-웰 디쉬의 1번 웰에 짐메르만 세포융합 배지 : TCM-199 = 7:3, 2번 웰에 9:1 로 만들어 분주하고 나머지 2개의 웰에는 100% 짐메르만 세포융합 배지를 분주하여 핵 이식된 난자를 1번→2번→3번→4번 순으로 이동시키면서 평형시킨다. 바늘은 끝부분이 구부러지지 않은 것을 사용한다. 전기의 방향은 융합할 두개의 세포막에 직각이 되도록 해야 하며, 융합판에 핵이 치환된 난모세포를 유리관으로 흡입하여 융합판에 올려놓는다. (+)극에 체세포가 위치하도록 하고, (-)극에 세포질이 위치하도록 정렬한 후, 짐메르만 세포융합 배지에서 바로 양압을 주면서 전기를 가한다(도4).
공여핵을 (+)극으로 누르면서 세포질과 밀집성을 높인후 통전을 시키면 융합률이 높아진다. 보통 공여핵이 있는 부분에 직류전기(+)를 가하며, 교류는 잘 사용하지 않는다(도5).
챔버를 사용할때는 보통 분자량이 큰 비전해질 용액 안에서 가늘게 뽑은 유리피펫을 이용하거나 입의 압으로 위치를 조정하여 챔버의 양극전선과 주입한 공여핵이 직각이 되도록 하는 방법을 일반적으로 사용하고 있다. 이 과정에서 공여핵과 난모세포의 세포질 사이의 밀착성이 떨어진다. 따라서 이러한 밀착성을 확보하기 위하여 공여핵을 세포질의 구석에 주입한다.
전압과 공여핵 크기, 공여핵과 세포질과의 밀착성, 전극과 공여핵과의 위치등이 융합을 시도하는 체세포 복제 수정란에서 중요한 요소이며, 전압의 세기, 전기를 가하는 횟수 및 지속기간도 중요한 요소이다. 상기 조건들 외에 공여핵과 전극과의 방향성, 공여핵의 크기에 따른 난모세포와의 밀착성 및 공여핵의 G0,G1기상태의 유도세포 여부도 중요한 요소이다.
융합배지의 특성을 달리하는 배양액에서, 흐르는 전류가 일정하다고 할 때 (I=V/R), 저항이 낮으면 (만니톨 저항 100 기준으로 인산염완충용액 저항 1) 가하는 전압도 낮다. 즉 융합을 시도하는 융합용액에 따라서 그 전압을 달리줘도 같은 효과를 가져온다. 직접 난자에 전기를 가하는 방식에서 사용하는 23~28 volt 이하에서는 융합이 잘 되지 않으므로, 이 전압을 전후로 융합배지의 저항값을 조절하면 난자를 배양하는 배양액에 가까운 용액에서도 융합이 가능하다. 많은 실험을 통해 융합이 잘되는 전압과 간격, 시간의 분포는 대략 1)BTX 453 챔버 사용시(3.2㎜), 580 volt, 20㎲, 1회(융합이 안되었을 때 30~40분 뒤 확인 후 재융합); 2)BTX 450-1 챔버 사용시(1㎜), 180 volt, 20㎲, 1회(융합이 안되었을 때 30~40분 뒤 확인 후 재융합)이다. 상기 두가지 방법은 동일한 전기적 성질로 융합을 시도하는 방법이다. 즉 거리에 따라서 난자에 가해지는 그 전기적 성질이 동일하다. 난자에 직접 전기를 가하는 방식에 적용하면, 융합이 잘되는 전압은 난자의 크기 평균인 135㎛ 에서 전압이 24.3 volt이다.
이하, 본 발명에 의한 체세포 복제동물의 생산을 위한 세포융합방법 및 수핵난자의 탈핵방법을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 체세포 배양
1) 공여핵 세포 분리
젖소의 귀 선단에서 1~2㎠ 넓이의 피부 조직을 절제한 다음, 50㎖ 시험관에 인산염완충용액을 준비하여 절제된 조직을 넣어 4℃로 냉장 보관하였다. 다시 인산염완충용액으로 세정한 다음, 멸균된 집게로 고정한 후 체모를 포함한 피부와 연골조직을 멸균된 가위 날(blade)로 분리하여 연골조직과 연한 피부 내측의 조직을 채취하였다. 조직편을 인산염완충용액으로 세정한 후, 칼날로 세절한 다음 2~3회 1800rpm에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 최종 원심세정 후 침전 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM으로 옮겨 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양하였다.
2) 계대배양
페트리디쉬의 배양액을 버리고 인산염완충용액로 1~2회 세척한 후 0.05% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 배양기 안에서 5분간 정치하였다. 이 세포를 인산염완충용액으로 세정후 회수하여 1800rpm에서 5분정도 원심분리 세척하여 적당량을 새로운 페트리디쉬에 분주하고 배지를 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양하였다.
3) 혈청기아 배양
10% FBS가 첨가된 DMEM에서 배양하여 증식중인 세포주를 0.5% FBS가 첨가된 배양액으로 교체하고 3~10일간 배양 후 공여핵으로 제공하였다.
4) 세포주의 동결보존 및 융해
배양중인 세포를 트립신 3㎖로 처리하여 분리시키고, 0.5% 인산염완충용액 7㎖를 첨가하여 총 10㎖로 만든 후 15㎖ 원심분리관에 넣어 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 동결액[DMEM 45㎖ + D-글루코스 10g(SIGMA, G-7021) + 헤페스 0.1192g(SIGMA H-9136) + DMSO 4㎖(SIGMA D-5879) + FBS 30㎖] 10㎖를 첨가하여 이를 cryotube에 1㎖씩 분주하고 -70℃ 냉동고에 넣어 18~24시간 보관한 후 액체 질소 탱크에 넣어 보관하였다.
액체질소 탱크에서 cryotube를 꺼내어 37℃ 온수에 넣어 융해시키고 융해된 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM으로 옮겨 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에서 배양하였다.
5) 공여핵용 단일 세포의 분리
공여핵이 배양된 페트리디쉬 내의 배양액을 버리고 0.05% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 5분 정치시킨 후, 0.5% FBS가 첨가된 인산염완충용액으로 세정후 회수하여 1200rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 모았다. 상층액을 모두 버리고 세포의 수가 적당량이 되도록 0.5% 인산염완충용액을 첨가하여 세포를 부유한 후 이식용 디쉬에 옮겨 담았다.
실시예 2 : 난자의 체외성숙
도축장에서 채취해 온 난소에서 난포의 직경이 3~5㎜ 크기의 것만 골라 18게이지 주사바늘과 일회용 주사기를 이용하여 난포액과 함께 난자를 뽑은 후 실체현미경 하에서 세포질과 난구세포가 균일한 미성숙 난포란만 선별하여 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액에 넣은 후 20~22시간 동안 5% CO2, 95% 습도로 조정된 배양기 내에서 배양하였다.
실시예 3 : 난구세포 제거
0.1% 하이알루로니데이즈용액 안에 체외성숙시킨 난자를 넣고 5분간 와동(vortexing) 하여 난구세포를 제거하거나, 0.1% 하이알루로니데이즈 용액이 들어있는 4-웰 디쉬 또는 일반 디쉬 안에서 100~200㎕ 피펫을 사용하여 피펫팅을 함으로써 난구세포를 제거하였다. 피펫팅 중간에 난구세포가 제거된 난자는 선별해서 다른 디쉬로 옮기고 난구세포가 제거되지 않은 것만 계속 피펫팅을 해주었다. 이 작업 시간은 10~15분 이내로 하였다.
실시예 4 : 절개 및 탈핵
작업용 디쉬에 PHA-P가 첨가된 TCM-199으로 미세소적을 만들어 그 안에서 작업을 실시하였다.
1) 절개 과정
작업용 디쉬를 조작판(maniplator plate)위에 놓는 다음, 피펫을 장착하였다. 조작장치(Manipulator)의 왼쪽 암(arm)에 고정용 피펫을 장착한 후 조작장치의 오른쪽 암에 절개용 피펫을 장착하였다. 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고 절개용 피펫은 3시 방향에 위치시켰다. 피펫 조정기를 중립에 놓아 피펫이 상,하 좌우로 자유롭게 움직일 수 있도록 조정하였다. 두 피펫을 작업용 미세소적내로 상하 이동시키면서 피펫이 디쉬의 테두리에 닿지 않도록 각도를 조정하고 피펫 끝을 미소적의 중앙에 위치시켰다. 세정용 마우스 피펫(내경 200㎛이상)을 이용하여 TCM-199 배양액에 있던 난자 20~25개 정도를 1개 군으로 하여 PHA-P가 첨가된 TCM-199 배양액으로 이동시켰다. 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자에 먼저 초점을 맞춘뒤, 2개의 피펫을 상하로 움직여 초점을 조정하였다. 2개의 피펫을 움직여서 고정용 피펫의 12시 방향에 제 1극체(The first polar body)가 위치하도록 하였다. 고정용 피펫을 난자의 9시 방향에 밀착시킨 뒤 유압을 걸어 난자를 고정시켰다. 절개용 피펫을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 뒤 세포질이 다치지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시켰다. 고정용 피펫에 양압을 걸어 난자를 분리하고 고정용 피펫을 절개용 피펫이 통과한 제1극체 상단부의 투명대에 접촉시키고 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개하였다.
2) 탈핵과정
절개한 난자를 고정용 피펫으로 이동시킨 후 난자의 절개창을 고정용 피펫의 내경에 위치시킨 후 제1극체를 포함하여 세포질 20~30%를 음압을 주어서 탈핵을 실시하였다. 이때 절개한 창은 9시 방향으로 하였다.
다시 양압을 주어 고정되었던 난자와 탈핵된 세포질을 분리시켰다. 탈핵된 난자는 TCM-199으로 2~3회 세척하고 핵 이식 전까지 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에 넣어 보관하였다.
실시예 5 : 공여핵 세포 이식
작업용 디쉬를 조작판에 위치시켰다. 절개용 피펫을 이식용 피펫으로 교체시키고, 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에서 2~3회 세척후 주입용 미세소적으로 이동시켰다. 이식용 피펫을 공여핵 세포가 있는 미소적에 넣고 약 10㎛ 크기의 공여핵 세포를 흡입한 후 피펫을 주입용 미소적으로 이동시켰다.
유리판에 보통 4~5개의 작업용 드롭을 만들고, 위부터 2개는 탈핵용 미소적,2~3개는 이식용 미소적으로 각각 드롭을 형성시킨 후 미네랄오일로 도포하였다. 탈핵이 끝난 난자를 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에서 안정화 시킨 후 이식용 드롭으로 옮겼다.
절개창을 양 피펫과 1시 방향에 수직으로 놓고 고정용 피펫으로 고정한 후, 이식용 피펫을 절개창으로 주입하고, 유압를 걸어 한개의 공여핵 세포를 주입하였다.
실시예 6 : 세포융합
통전방법에 따른 융합률을 비교하였다.
1) 챔버(Chamber) 이용
2개 전극(1.0mm Chamber No. 450-1)에 짐메르만 세포융합배지 0.4㎖를 넣고 BTX ECM 2001 조작기와 연결시켰다. 1㎜ 전극사이에 공여핵이 이식된 난자를 위치 시켰다. 공여핵이 (+)극을 향하도록 하고 전극과 직각을 이루게 가느다란 유리관으로 위치를 조정하고, 실체현미경을 보면서 5~10개를 한군으로 하였다. 위치를 조정한 후 통전을 시켰다. 이때 세포융합 조건은 전압이 DC 180V, 횟수(Times)는 1회, 시간 20㎲로 조정하였다. 비융합시 1회 반복하였다.
2) 바늘(Needle) 이용
120㎜ 디쉬에 짐메르만 세포융합배지를 절반 정도 채운 후 FHK(Fujihira, ET-3) 융합기와 연결시켰다. 전기의 방향은 융합할 2개의 세포막에 직각이 되도록 하였다. 융합판에 핵이 치환된 난모세포 전체를 유리관으로 흡입하여 융합판에 올려놓고, 짐메르만 세포융합배지에서 바로 양압을 주면서 전기를 가하였다. 이때 세포융합 조건은 전압이 DC 25V, 횟수는 1회, 시간은 10㎲로 조정하였다.
챔버와 바늘을 이용한 방법 모두 (+)극에 체세포가 위치하도록 하고, (-)극에 세포질이 위치하도록 정렬하였다.
상기 융합방법에 따른 융합율을 표1에 나타내었다.
| 주입(갯수) | 융합(갯수(%)) | 배양(갯수(%)) | 난할(갯수(%)) | 배반포(갯수(%)) | |
| 1) 챔버(1㎜) | 1855 | 958(51.6%) | 796(83.1%) | 597(75.0%) | 176(29.48%) |
| 2) 바늘 | 2170 | 1485(68.9%) | 1350(90.3%) | 1100(81.5%) | 352(32%) |
표1에서 나타난 바와같이, 바늘을 이용하여 압력을 주면서 통전하는 경우가 챔버에서 융합하는 방식보다 더 융합률이 높게 나타남을 알 수 있다.
실시예 7 : 활성화
통전이 끝난 핵 이식란은 배양용 TCM-199 으로 옮겨 30분간 배양하고 그 후 정상적인 융합이 일어난 난자만 선별하여 활성화 시켰다.
Ca2+-Ionophore(A23187)가 첨가된 CR1aa 용액에서 5분간 활성화 시킨 난자를 6-DMAP가 첨가된 CR1aa 용액에서 3시간 동안 활성화 시켰다. 활성화가 끝난 난자를 CR1aa 배지에서 2~3회 세척하여 배양을 실시하였다. 이 때, 처음 3일 동안은 BSA가 첨가된 CR1aa-2 배지[CR1aa용액 20㎖ + BSA 0.06g(SIGMA, a-4919)] 에서 배양을 하고, 배양 3일 후에는 BSA와 FBS가 첨가된 CR1aa-1 배지[CR1aa용액 19㎖ + FBS 1㎖ + BSA 0.03g] 에서 배양하였다. 배반포로 성장한 후기 수정란중 상태가 좋은 것은 2개를 한군으로, 보통의 상태는 3개를 한군으로 하여 대리모 소의 자궁에 인공수정시술을 하였다.
배반포 성숙률은 핵 이식 복제과정 중의 체외배양에서 대리모에 이식하기 전단계까지 발육된 후기 수정란의 상태를 말한다.
본 발명의 각 실시예에 따른 체세포 복제동물의 생산 결과를 표2에 나타내었으며, 본 발명의 실시예 의해서 최종 생성된 체세포 복제 송아지는 도6에 나타내었다.
| 융합난자수 | 융합률(%) | 배양(%) | 분할률(%) | 배반포성숙률(%) | 이식두수 | 임신중 | 분만산자 | |
| 젖소 | 424 | 300(70.7) | 271 (90.3) | 222 (82) | 71(32) | 30 | 16 | 1 |
본 발명의 전기융합방법은 공여핵과 난모세포에 직접 압력과 전기를 가하므로 기존 방식에 비해 전압과 시간을 줄일수 있으며, 통전시 공여핵의 밀접성을 좋게하여 융합 효율을 높이는 효과가 있다.
또한 탈핵시 난모세포의 세포질을 배양된 형태로 유지하면서 탈핵할 수 있게 한다.
Claims (4)
- 체세포 복제동물의 생산을 위한 세포융합방법에 있어서, 전기융합시 저전압, 단시간내에 양압을 가하면서 전기를 직접 공여핵과 난모세포에 가하는 것을 특징으로 하는 세포융합방법
- 제1항에 있어서, 상기 전기융합시 조건은 전압이 DC 23~28V, 횟수는 1회, 시간은 10㎲임을 특징으로 하는 세포융합방법
- 체세포 복제동물의 생산방법에 있어서, 수핵난자의 탈핵시 고정용 피펫으로 음압을 주어 탈핵함을 특징으로 하는 체세포 복제동물의 생산방법
- 삭제
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