KR20010076941A

KR20010076941A - 이종간 핵이식 방법 및 그를 이용한 야생동물 복제수정란과 그 생산 방법

Info

Publication number: KR20010076941A
Application number: KR1020000004382A
Authority: KR
Inventors: 황우석; 이병천; 박종임; 용환율; 조종기; 김기연; 신수정; 안국준; 현상환; 노상호; 임정묵; 이병동; 송길영
Original assignee: 황우석
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2001-08-17

Abstract

본 발명의 호랑이 복제수정란 생산 방법은, (a)도축난소로부터 미성숙난자를 채취, 배양하는 단계; (b)호랑이의 신체조직으로부터 세포주를 분리하여 보존하는 단계; (c)상기 (a)단계에서 준비된 성숙난자의 투명대 일부를 절개하고 세포질의 10∼30%를 제거하여 탈핵을 실시하는 단계; (d)상기 (b)단계에서 준비된 공여세포를 상기 (c)단계의 탈핵된 난자에 이식하는 단계; (e)상기 (d)단계에서 이식 및 밀착시킨 작성란을 DC 조건의 전압으로 전기융합시키는 단계; (f)상기 융합세포를 융합과 동시에 또는 화학물질이 첨가된 배지내에서 활성화시키는 단계; 및 (g)상기 활성화된 세포를 후활성화 및 미소적 배지내에서 배양한 후 검란하는 단계를 포함한다.

공여핵원용 세포는 호랑이의 귀로부터 분리된 세포이고, 이 체세포들의 보존처리는 계대배양, 혈청기아배양 또는 동결보존에 의해 이루어질 수 있다.

Description

이종간 핵이식 방법 및 그를 이용한 야생동물 복제 수정란과 그 생산 방법{Embryo from wild animal with inter-species nuclear transplantation and method for production thereof }

본 발명은 야생동물의 복제 수정란 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세히는 핵이식 기술을 통해 소 유래 미성숙 난자를 채취, 탈핵하고 여기에 야생동물 조직으로 부터 분리한 체세포의 핵을 이식함으로써 체세포 복제에 의한 야생동물의 복제 수정란의 생산 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 한 바람직한 실시예에 따르면 호랑이 귀 조직으로부터 분리한 체세포의 핵을 소 유래 수핵난자에 이식하여 생산된 호랑이의 임신가능한 복제수정란이 제공된다.

본 발명은 소의 난자를 수핵난으로하여 야생동물의 핵과 소의 수핵란과의 이종간 핵이식을 수행함으로써 체세포 복제에 의해 임신 가능한 야생동물의 복제수정란을 생산하는데 그 목적이 있다.

본 발명에 따르면, 다음과 같은 공정단계들로 구성되는 호랑이의 복제수정란 생산 방법이 제공된다:

(a) 도축난소로부터 미성숙난자를 채취 배양하는 단계;

(b) 호랑이의 신체조직을 채취, 세포주를 분리하는 단계;

(c) 상기 (a)단계에서 준비된 성숙난자의 투명대 일부를 절개하고 세포질의 10∼30%를 제거하여 탈핵을 실시하는 단계;

(d) 상기 (b)단계에서 준비된 공여세포를 상기 (c)단계의 탈핵된 난자에 이식하는 단계;

(e) 상기 (d)단계에서 이식 및 밀착시킨 작성란을 DC 조건의 전압으로 전기융합시키는 단계;

(f) 상기 융합된 세포를 융합과 동시에 또는 화학물질이 첨가된 배지내에서 활성화시키는 단계; 및

(g) 상기 활성화된 세포를 후활성화 및 미소적 배지내에서 배양시키는 단계.

본 발명의 한 실시예에 따르면, 상기 (b) 단계의 세포는 호랑이의 귀로부터 분리된 세포이다.

또한, 상기 (b) 단계의 보존처리는 계대배양, 혈청기아배양 또는 동결보존에 의해 이루어질 수 있다.

이하에서는 본 발명 방법에 따라 수행된 바람직한 실시예 및 실험예를 구체적으로 기재한다.

실시예 1 : 핵이식

핵 이식준비 과정은 다음과 같이 수행하였다.

제1단계 : Micro 피펫의 준비

Micro피펫을 준비함에 있어서 사용기기는,

Puller(Narishige PC-10), Microforge(Narishige MF-9), Glinder(Narishige EG-4) 등이다.

우선, 절개 및 탈핵용 피펫(cutting & Enucleation 피펫) 제조를 위해, 유리관(Drummond; Sigma, P-2174 or narishige)을 사용하여 추(Light 1개와 heavy 1개 또는 light 2개, heavy 1개)를 부착하고 Pulling step으로 Step 2에 고정한 다음, 온도(heat 1 : 101℃, heat 2 : 101.5℃)를 조정한다.

두번째로, 공여핵세포 이식용 피펫(Injection pipette, 내경 30∼40㎛) 제조를 위해 유리관(Drummond; Sigma, P-2174 or narishige)을 사용하여 추(Light 1개) 또는 추를 제거하고 Pulling step으로 Step 2에 고정한 다음 온도를(heat 1 : 101℃, heat 2 : 101.5℃) 조정한다.

다음에, 고정용 피펫(Holding pipette, 내경 70∼130㎛) 제조(2가지)를 위해 다음과 같이 수행하였다.

i) 유리관(Drummond; Sigma, P-2174)을 사용하는 경우 :

추(Light 1개 ∼light 2개, heavy 1개)를 부착하고 Pulling step(Step 1)에 고정한 다음 온도(heat 2 : 101.5℃)를 조정한다.

ii) 유리관(Narishige G-1 or GD-1)을 사용하는 경우

추(Light 1개, heavy 1개)를 부착하고 Pulling step(Step 1)에 고정한 다음, 온도(heat 2 : 101.5℃)를 조정한다.

넷째로, 난자의 세정 및 운반용 피펫 제조를 위해

알코올 램프를 이용하여 내경이 300㎛ 이상이 되도록 하고, 사용시 한번 이용한 것은 폐기하였다.

다섯째로, 난구세포제거(Denuding용)용 피펫 제조를 위해

알코올램프를 이용하여 내경이 약 130㎛인 것을 여러개 만들어 준비하였다.

제2단계 : 배양액의 조제

배양액(medium)은 다음과 같이 준비하였다.

IVM용 TCM-199으로 체외수정과 동일하게 제조하고, TCM-W으로, 사용 당일에는 작업용 미소적을 작성하되 9ml의 TCM-W에 1ml의 FBS(FCS)를 넣어 10%FBS TCM-W를 만든 후, 필요한 점적 수만큼 100㎕ 피펫을 이용하여 20∼30㎕ 점적을 적정한 크기(35mm, 60mm, 100mm등)의 디쉬에 만들고, 미네랄 오일로 도포한 다음 사용한다.

또, 하이알루로니데이즈(Sigma, H-3506) solution을 제조하기 위해서는, 5ml의 TCM-W에 하이알루로니데이즈(Hyaluronidase) 0.0500g을 첨가하여 원액(stock)을만들었다. 만들어진 원액은 111㎕씩 eppendorf 시험관에 분주하여 냉동실에 보관하였다. 사용시에는 TCM-W를 1ml 분주하여 최종농도를 0.1%로 맞추어 35mm 디쉬에 분주하여 난구세포제거(denuding)에 이용한다.

그리고, Cytochalasin B(sigma, C-6762) solution 제조를 위해,

DMSO(Sigma, D-5879) 133㎕에 1mg의 사이토칼라신 B(cytochalasin B)를 녹이면 농도는 7.5mg/ml이 되는데, 이것을 eppendorf 시험관에 1㎕씩 분주해서 냉동실에 보관한다. 사용할때는 여기에 10% FBS(또는 FCS)첨가 TCM-W를 1ml 첨가하여 절개 및 탈핵(cutting & enucleation) 미소적 제작에 이용한다.

또한, PHA-P(Phytohematoglutinin: L-9132) solution 제조법은 5mg의 PHA를 10ml의 TCM-W와 섞은 후 100㎕씩 eppendorf 시험관에 분주한 다음, 실험에 사용할 경우 eppendorf 시험관에 400㎕의 TCM-W를 첨가하여 작업용 미소적을 만들어 사용한다. 이때 최종 농도는 100㎍/ml이 되도록 한다.

그리고, 전기융합 및 활성화 배지(Electrofusion and Activation media) 제조를 위해서는 Mole 농도에 따른 만니톨(Sigma, M-1902)의 첨가량 (100ml기준)을 0.28M 만니톨: 5.1016g; 0.25M 만니톨: 4.555g; 0.26M 만니톨: 4.7372g; 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂포함하고, 기타 첨가물(만니톨 mole 농도에 관계없음): 0.1mM MgSO₄또는 MgCl₂, 0.1mM CaCl₂(융합과 활성 동시군에서 첨가); Hepes 0.5mM; BSA 0.05%을 첨가하되 DW를 100ml까지 첨가한다.

pH를 7.2∼7.4로 맞추고, 5ml 시험관에 약 4ml씩 분주하여 냉동(장기간) 혹은 냉장실(단기)에 보관한다.

한편, DMAP(Sigma, D-2629)제조법은 10ml IVC용액에 0.0031g DMAP을 첨가하여 용해 및 여과후(0.22㎛ filter 사용) eppendort 시험관에 분주시키고 냉동보관(1.9mM)한다.

또, Cycloheximide(Sigma, C-7698)는, Ethanol 100ml에 Cycloheximide 1g을 녹여 ×1000배 Stock을 작성 최종농도10㎍/㎖가 되도록 IVC medium에 첨가하여 사용한다.

그리고, Ionomycin(Sigma, I-0634)은, DMSO(Sigma, D-5879) 1.34ml에 1mg의 Ionomycin을 녹여 1mM 원액을 제조한 다음, 최종농도 5㎛이 되도록 1% BSA TCM-W 또는 IVC medium내에 첨가하여 사용하고 원액을 냉동보관한다.

Ca²⁺Ionophore(A23187)는, DMSO(Sigma, D-5879) 1.66ml에 1mg의 Ca²⁺Ionophore(A23187)를 녹여 1mM 원액 제조시 최종농도 5㎛가 되도록 1% BSA, TCM-W 또는 IVC medium내에 첨가하여 사용하고 원액을 냉동보관한다.

배양액(culture Medium)은 CR2aa를 사용하고(No. 2), Hoechst 33342 (Sigma, B-2261)는 25mg의 Hoechst에 증류수를 5ml 섞어 희석(5mg/ml 의 stock)시킨 다음, Stock 1∼2㎕씩 eppendorf 시험관에 분주, 냉동보관한다. 그리고, 사용시에는 시험관에 10% FBS 첨가하고 TCM-W를 1ml 첨가하여 희석시킨 후 사용(최종농도 5∼10㎍/ml)한다.

10∼15분간 정치한 다음 암실, 형광현미경으로 탈핵여부를 판단할 수 있다.

Nocodazole stock (Sigma, M-1404)은, DMSO(Sigma, D-5879) 2.5ml를 10mg의 nocodazole병에 넣어 희석시킨 다음 50∼100㎕씩 eppendorf 시험관에 분주(4mg/ml의 stock)하고 Stock 1㎕를 원하는 배양액 10ml에 첨가(0.4㎍/m)한다.

Acid Tyrode's(Sigma, T-1788) 제조법은 Embryo tested된 완제품으로 미소적(25㎕)을 만들어 오일도포 후 사용한다.

제3단계 : 미분간섭 현미경 작업용 디쉬 제작

미분간섭(Differential Interference Contrast, DIC)현미경 작업용 디쉬는 다음과 같이 제작하였다.

50mm 디쉬(Falcon 1006) 뚜껑에 직경 1∼3cm로 천공한 다음 Silicon (ShinEtsu KE45)을 디쉬 내부의 구멍주위에 도포한 후, 가로×세로 크기가 2∼4cm의 커버글라스를 실리콘위에 놓고 눌러서 부착시킨다.

끝으로, 알코올로 세정한다.

제4단계 : DIC 현미경용 미소적 제작

DIC 현미경용 미소적 제작법은 다음과 같이 제작하였다.

DIC용 작업용 디쉬의 커버글라스 위에 20㎕ 피펫을 이용하여 5∼10㎕ 미소적을 세로로 분주한 다음(미소적의 개수는 난자 20∼30개당 1개씩 계산) 1㎖ 피펫을 이용하여 4㎖정도의 미네랄 오일(sigma, M-3516)을 미소적 주위에 도포한다. 이때, 각 과정에 적합한 배지로 미소적을 형성시킨다.

제5단계 : 공여핵원용 체세포 준비

공여핵원용 체세포(Somatic cell line for donor)의 준비는 다음과 같이 수행하였다.

세포주는 호랑이 조직(Tissue)에서 분리하였다(다음 실험예 참조).

실험예 1 : 귀(ear)에서의 세포 분리

성체 또는 어린 동물의 귀 선단에서 떼어낼 부위 주변의 체모를 깎고, 소독용 알코올과 베타딘으로 소독한다. 멸균된 기구로 1∼2cm²넓이의 피부 조직을 절제한 다음, 50 ml 시험관에 PBS용액을 준비하여 절제된 조직을 넣어 4℃로 냉장 보관하여 실험실로 운반한다.

다시 PBS 용액으로 세정한 다음, 멸균된 집게로 고정한 후, 체모를 포함한 피부와 연골조직을 멸균된 가위, 날(blade)로 분리하여, 연골조직과 면한 피부 내측의 조직을 채취한다.

조직편을 다시 PBS 용액으로 세정 후 칼날(blade)로 세절한 다음, 0.25% 트립신, 1mM EDTA 용액과 0.8% 콜라게나제형(Collagenase type III) II(GIBCO BRL, Life Technologies, USA) 용액의 혼합액을 첨가하여 39℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기내에서 배양한다.

정치 후 원심 분리용 시험관에 옮겨 와동(vortexing)과 피펫작업(pipetting) 후, PBS 용액을 첨가하여 같은 조건으로 원심세정한다.

최종 원심세정 후, 침전 세포를 10% FCS, 1% 비필수 아미노산 용액, P/S 첨가 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles medium, GIBCO BRL, Life Technologies, USA)에 부유시킨 후, 세포 배양용 페트리디쉬로 옮겨 39℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기내에서 배양한다.

세포가 배양접시 바닥면에 부착하여 분열 증식하여 단층이 형성되면 이를 1차 세포주의 성립으로 간주한다.

실험예 2 : 계대 배양

단층이 형성된 1차 세포주의 계대배양을 다음과 같이 실시하였다.

페트리디쉬의 배양액을 버리고, 상기 실험예 1의 0.25% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 1 내지 2분 정치 후, 배양용 배지로 교체한다.

피펫팅하여 세포를 배양 배지 중에 재부유시킨 다음 적당량을 새로운 페트리디쉬에 분주한 후, 배지를 첨가하여 39℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기내에서 배양한다.

실험예 3 : 혈청기아(serum starvation) 배양

상기 실험예 1의 10% FCS 1% 비필수 아미노산 용액, P/S 첨가 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium, GIBCO BRL, Life Technologies, USA)에서 배양, 증식중인 세포주를 0.5 % FCS 첨가 배양액으로 교체하고, 3 내지 10일간 배양 후 공여핵원으로 제공하였다.

실험예 4 : 세포주의 동결보존

유착상태의 세포를 상기 실험예와 같은 방법으로 재부유하여 세포 수가 1 X 10⁵/ml로 되도록 조절한 다음, 세포를 포함한 전체 배양액 중에 DMSO(Dimethyl sulfoxide, Sigma, USA)가 10% 농도가 되도록 첨가하여 희석한 후 Cryovial(Corning, USA)에 봉입한다.

Cryovial을 -70℃ 냉동고에 넣어 18∼24시간 보관한 후 액체 질소 탱크에 넣어 보관한다.

실험예 5 : 동결보존 세포주의 융해

액체질소 탱크에서 Cryovial 을 꺼내어 37℃ 온수에 넣어 융해시키고, 융해된 세포를 원심 분리용 시험관에 넣고 상기 실험예 1의 PBS를 첨가하여 1,500rpm, 2분간 원심 세정한다. 상층액을 버리고 세포 침전물을 조심스럽게 하여 원심 세정을 2 회 반복한다.

실험예 6: 체세포의 핵상관찰(Giemsa Stain 이용)

Giemsa stain을 이용하여 체세포의 핵상관찰을 위해 다음 준비물을 사용하였다. 즉, 저장처리용액 (0.9% sodium citrate 용액 또는 0.56% KCL 용액); 고정액 (메탄올 : acetic acid = 3 : 1); 5% Giemsa; 슬라이드 글라스; 15ml 시험관

체세포의 관찰과정으로는,

디쉬내의 세포를 부유시킨 후(Single cell), 15ml 시험관에서 1500rpm으로 2분간 원심분리하여 세포 펠릿(pellet)을 얻는다.

다음, 펠릿(pellet)에 저장액을 첨가하고 부유하여 15분간 수화시킨 다음 총 부피의 1/3에 해당하는 고정액을 첨가한다.

그 후, 원심분리시킨(1500rpm, 2분) 다음, 고정액으로 세척하고(원심분리→ 상층액 제거→재부유, 3회), 마지막 원심분리 후 적정농도가 되도록 고정액을 남겨 세포 부유 슬라이드위에 점적(최대한 확산하도록)시키고나서, 공기중에서 건조시킨다.

그리고 Giemsa 용액내에서 15분간 염색시킨 다음, 증류수를 이용하여 여분의 염색액을 슬라이드에서 제거한다.

그 후, 저배율(4×10)에서 고배율(10×40)로 관찰한다.

실시예 2 : 이종간(야생동물) 핵이식

제1단계 : 체외성숙(In vitro maturation)

체외성숙(In vitro maturation)을 위한 배지(Medium)는 다음과 같이 준비하였다.

배양(culture)용 TCM199(No. 3); 세척(washing)용-TCM199(No. 2);

혈청(FBS, 1ml씩 분주되어 있는 것); E₂(No. 7); FSH(No. 7)

상기 배양액을 준비하여 4-웰(well) 디쉬(dish)에 0.5㎕ E₂을 분주하고, 알코올을 휘발시킨다. 12.5㎕ FSH(NO.7)을 분주하고 FBS 1㎖를 배양용 TCM199 9㎖에 첨가한 후 각각의 웰에 0.45mL씩 분주한다. 스퀴즈 보틀(Bottle)을 이용하여 웰 사이에 증류수를 분주한다. 35mm 디쉬에 남은 TCM 199 2.5ml를 분주하여 최종 세척액으로 사용한다.

난소채취는 생리식염수(35℃)와 가위, RP장갑, 장화등을 준비하여 도축장에서 난소를 채취한다.

검란준비를 위하여는 1cm 간격의 격자 눈금을 그은 100mm 디쉬와 세척용 TCM199을 2ml씩을 분주한 35mm 디쉬를 준비한다. 채취한 난소로부터 18G 니들(needle)이 장착된 10ml 주사기를 사용하여 2∼6mm의 난포를 흡입한다.

다음에, 검란 및 세정을 수행한다. 먼저 난구세포가 충분히 부착되어 있고 세포질이 균질한 난자를 선발하고, 선발한 난자는 3회의 세정을 거쳐 최종 배양용 TCM199에 골라 놓고 각 웰 당 20∼50개의 난자를 35㎕씩 뽑아 분주한다.

체외성숙을 수행함에 있어서는 5% CO₂배양기내에서 24시간 배양한다.

제2단계 : 난구세포 제거(Denuding)

준비물(Preparation)은 다음과 같았다; 세정용 피펫, 제거용 피펫, 하이알루로니데이즈, TCM-W 작업용 미소적

작업과정(Procedure)은 다음과 같았다.

IVM 16∼22시간의 난자를 세정용 마우스 피펫을 이용하여 TCM-W에 1회 세정한다.

하이알루로니데이즈(No. B-③)용액내에 난자를 분주한다.

제거용 피펫으로 난구세포를 벗긴다. TCM-W에 3회정도 세정하고 정치시킨다. 상기 작업은 신속하게 수행하는 것이 바람직하다.

제3단계 : 절개 및 탈핵

준비물(Preparation)은 다음과 같았다.

작업용 디쉬(No. C), 작업용 미소적 - 사이토칼라신 B(Cytochalasin B), 피펫 : 고정용 피펫, 절개 및 탈핵용(cutting & Enucleation) 피펫

절개 및 탈핵과정(Procedure)은 다음과 같았다.

작업용 디쉬를 조작판(manipulator plate)위에 위치하도록 놓는 다음, 피펫을 장착한다.

조작장치(Manipulator)의 왼쪽 암(arm)에 고정용 피펫을 장착한 후 조작장치의 오른쪽 암(arm)에 절개용 피펫을 장착한다.

피펫의 방향 및 위치를 예컨대 다음과 같이 조정한다.

즉, 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고 절개용 피펫은 3시 방향에 위치시킨다. 피펫 조정기를 중립에 놓아 피펫이 상하 좌우로 자유롭게 움직일 수 있도록 조정한다. 두 피펫을 작업용 점적내로 상하 유동시키면서 피펫이 디쉬의 테두리에 닿지 않도록 각도를 조정하고 피펫 끝이 미소적의 중앙에 위치시킨다.

세정용 마우스 피펫(내경 200㎛이상)을 이용하여 TCM-W에 있던 난자(oocyte) 10∼30개 정도를 1개 군으로 하여 절개 및 탈핵 후 점적으로 이동시킨다.

다음 방식으로 절개를 실시하였다:

즉, 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자(oocyte)에 먼저 초점을 맞춘 뒤, 2개의 피펫을 상하로 움직여 초점을 조정한다. 2개의 피펫을 움직여서 파지용 피펫의 12시 방향에 제 1극체(The first polar body)가 위치하도록 한다. 파지용 피펫을 난자(oocyte)의 9시 방향에 밀착시킨 뒤 유압을 걸어 난자(oocyte)를 고정시킨다. 절개 피펫을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 뒤 세포질이 다치지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시킨다. 파지용 피펫에 양압을 걸어 난자를 분리하고 파지용 피펫을 절개 피펫이 통과한 제 1극체 상단부의 투명대에 접촉시키고 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개한다.

탈핵(Enucleation; Squeezing method)은 다음과 같이 수행하였다.

절개한 난자를 회전시켜 절개창을 수직으로 위치시킨 후 고정용 피펫을 난자의 밑 부위에 위치시켜 난자가 아래쪽으로 움직이지 못하도록 받친 뒤 절개 피펫을 난자의 위에서 눌러 제 1극체를 포함하여 세포질을 10∼30% 탈핵을 실시한다.

또는 난자의 절개창을 3시방향에서 수직으로 회전시킨 후 고정용 피펫과 절개 피펫을 아래 위에서 눌러서 제 1극체를 포함하여 세포질의 10∼30% 탈핵을 실시한다. 탈핵시킨 1군의 난자는 TCM-W로 3회 세정하고 핵이식 전까지 IVM용 TCM 199(B-①)에 정치시킨다. 탈핵 후의 난자는 매우 취약하기 때문에 마우스 피펫은 최소한 내경이 300㎛이상 되는 것을 사용하여 작업후 난자의 세포질이 절개창을 통해 빠져 나오지 않도록 주의한다.

제4단계 : 공여핵원용 단일 세포의 분리

페트리 디쉬내의 배양액을 버리고 상기 실험예 1의 0.25% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 1∼2분 정치시킨후, 1% FCS 첨가 PBS(-)(GIBCO BRL, Life Technologies, USA)에 피펫팅에 의해 재부유시키고, 세포의 수가 적당량이 되도록 조절하여 (2,000/0.1ml) Eppendorf 시험관에 분주시켰다.

제5단계 : 공여세포 이식(Injection)

준비물(Preparation)은 다음과 같았다; 작업용 디쉬, 작업용 점적 만들기-PAH, 피펫 : 고정용 피펫, 주사용 피펫, 공여 세포 미소적(Donor 세포 준비 참조)

작업과정(Procedure)은 다음과 같았다.

작업용 디쉬를 조작판(manipulator plate)에 위치시킨다.

절개 피펫을 주사용 피펫으로 교체시킨다.

IVM 배지내에 있는 난자(oocyte)를 세정용 마우스 피펫을 이용하여 TCM-W 점적에서 1∼3회 세정후 주입용 미소적으로 이동시킨다.

이식용(Injection) 피펫을 공여세포 미소적에 넣고 20∼40㎛크기의 1개 이상의 공여세포를 흡입한 뒤 피펫을 주입용 미소적으로 이동시킨다.

절개창을 양 피펫과 1시방향에 수직으로 놓고 고정용 피펫으로 고정한다.

이식용(Injection) 피펫을 절개창으로 주입하고, 유압을 걸어 1개의 공여세포을 주입시킨다.

작성된 핵이식란 군을 마우스 피펫으로 세정용 미소적으로 옮겨 1∼3회 세정하고 정치시킨다.

실시예 4 : 세포융합(Cell Fusion)

세포융합에 필요한 준비물(Preparation)은 다음과 같았다; 기기-BTX ECM 2001

만니톨(Manitol)을 4-웰 디쉬의 3개의 웰(1번, 2번, 3번 웰, 순서는 상관없음)에 0.4ml∼1ml 분주하고, 나머지 1개의 웰 (4번)에는 10% TCM-W가 첨가된 만니톨을 제조한다.

만일 융합과 활성화를 동시에 실시할 경우는 Ca²⁺첨가 융합배지를 사용하며, 융합후 활성화군에서는 Ca²⁺를 배제한 융합배지를 사용한다.

다음, 2개 전극(3.2mm chamber No. 453)에 만니톨을 0.2∼1ml 넣고 BTX-세포 조작기와 연결시킨다.

이때, 세포융합 조건은 다음과 같았다.

DC 조건 : 전압(Voltage)은 0,75∼2.25kv/cm이며, 횟수(Times)는 1∼2회, 시간(Seconds)은 회수×시간 총 60㎲ 이내로 조정한다.

작업과정(Procedure)은 다음과 같았다.

작업 1시간전 BTX를 가동하여 예열한 다음 세정용 마우스 피펫에 10∼20㎕의 만니톨을 빨아들인 후 핵이식란이 있는 TCM-W 미소적에 첨가한다.

1분 이상 정치시킨 후 세정용 마우스 피펫을 이용하여 4번 웰(10% TCM-W 만니톨)에 핵이식란을 주입한다.

1분 이상 정치시킨 후 세정용 마우스 피펫을 이용하여 1번 웰에 넣고, 같은 방법으로 2번 웰에 핵이식란을 이동시킨다.

마우스 피펫을 이용하여 핵이식란을 하나씩 2개 전극 사이에 놓고 공여세포가 (+)전극을 향하도록 정렬시킨다.

통전을 실시하고 융합한 핵이식란은 3번 웰에 모아서 1개 군의 융합이 끝나면 TCM-W로 옮겨 3회 세정한다.

Cytochalasin B 미소적내에서 30∼60분간 처리후, 융합·활성을 동시에 실시하게 될 군은 후활성화(postactivation) 과정으로, 융합 후에 활성화시킬 군은 상기의 화학물질을 이용하여 활성화시킨다.

활성화(Activation)는 다음과 같이 실시하였다.

융합과 동시에 일렉트로퓨젼(elecrofusion) 방법으로 활성화를 유도하는 경우에는 Ca²⁺첨가 융합배지내에서 일렉트로퓨젼(electrofusion)을 실시한다.

Ionomycin(B-⑨)처리법으로 활성화를 유도하는 경우에는, B-⑨, 50㎕ 점적내에서 4분간 정치(빛에 민감하므로 되도록 빛의 유입을 차단)하고, 35mm 디쉬내 10% FBS 혹은 30mg/ml BSA 첨가하고 세정용 매질하에서 이노마이신 (Ionomycin)을 제거한 뒤 5분간 정치시킨다.

실시예 5 : 융합 후 활성화(Postactivation)

Cycloheximide 25㎕ 미소적 내에 5∼10개 정도의 작성란을 침지하여 6시간 배양하였고, DMAP 25㎕ 미소적 내에 5∼10개 정도의 작성란을 침지하여 4시간 배양시켰다.

배양은 다음과 같이 수행하였다.

상기 실시예 1 제2단계의 배양액(Culture medium) 중 택일하여 5% CO₂배양기 또는 5% CO₂, 7% O₂, 88% N₂에서 5∼8일간 배양한다. 활성화(Activation) 후 24시간 전후로 검란, 발육단계별로 구분하여 미소적내에 배치한다.

매일 아침, 저녁으로 검란하여 이후 발육을 관찰한다.

이상과 같이, 수핵란으로는 소의 난자를 이용하고 야생동물인 호랑이의 여러 조직으로부터 세포주를 분리보존하고, 최초 세포의 세포막의 일부를 절개하고 세포질의 10 내지 30%의 탈핵을 실시한 다음, 상기 공여세포를 상기 핵이 탈핵된 난자에 이식하여 전기융합시키고 활성화 및 후활성화 단계 후, 배양 및 성숙시킴으로써, 야생동물 보존의 일환으로 체세포의 복제에 의해 임신가능한 호랑이의 수정란을 생산할 수 있게 된다.

이하에서는 전술한 본 발명의 각각의 공정에 사용되는 다양한 배지들의 종류와 그 조성을 표 1과 표 2에 제시하였고 표 3에는 호랑이 복제 수정란 작성 이후 발육을 나타냈다.

본 발명에서 생산한 8세포기의 수정란은Bos taurus coreanaeembryos/TcEar로 명명하고 2000년 1월 7일생명공학연구소 미생물기탁센터에 KCTC 0719BP로 기탁하였다.

TCM-Culture medium

성 분	농 도
TCM liquidNa-pyruvateP/S	Gibco 11150-0591mM1% (Penicilin 10000IU, Streptomycin 10mg)

CR2aa medium

성 분	Develope I	Develope II	CR-Wash
NaCl^o	114mM	114mM	114mM
KCl^o	3.1mM	3.1mM	3.1mM
NaHCO₃ ^O	25mM	25mM	2mM
NaH₂PO₄	0.35mM	0.35mM	0.34mM
Sod.Lactate^r	15mM	15mM	15mM
CaCl₂·2H₂O^d	2mM	-	2mM
MgCl₂·6H₂O^d	0.5mM	0.5mM	0.5mM
EAA	-	1%	-
NEAA	1%	1%	1%
Insulin	1%	1%	1%
Glutamine	-	1mM	1
Glycine	0.37mM	0.37mM	0.37mM
Citrate	0.33mM	0.33mM	0.33mM
HEPES	-	-	10.5mM
Na-pyruvate	0.3mM	0.3mM	-
Glucose	-	1.5mM	-
Phenol-Red	10㎍/ℓ	10㎍/ℓ	10㎍/ℓ
BSA	3㎎/㎖	-	3/㎖
FCS	-	10%	-
Kanamycin	0.75㎍/㎖	0.75㎍/㎖	0.75㎍/㎖

호랑이 복제 수정란작성 이후 발육

융합난자수	융합률(%)	분할률(%)	2cell	4∼7cell	8cell	배반포 개수
272	139(51)	96(73)	20	19	23	0

상기 실시예와 실험예를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의해 야생동물의 보전의 한 방법으로 핵이식을 이용하여 야생동물의 복제수정란 생산이가능하게 됨에 따라, 장차 축산학 및 의약학 분야에서 복제동물 및 이를 이용한 약제 또는 장기 등의 대량 생산 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따라 복제 동물을 생산하고 그와 관련된 응용분야가 개척될 수 있는 가능성이 있어 본 발명은 축산학, 의약학 및 동물복제산업상 매우 유용한 발명이다.

Claims

호랑이의 복제수정란 생산방법에 있어서,

(a) 도축난소로부터 미성숙난자를 채취·배양하는 단계;

(b) 호랑이의 신체의 다양한 조직으로부터 세포주를 분리하여 보존하는 단계;

(c) 상기 (a)단계에서 준비된 성숙난자의 투명대 일부를 절개하고 제 1극체와 함께 세포질의 10 내지 30%를 제거하여 탈핵을 실시하는 단계;

(d) 상기 (b)단계에서 준비된 공여세포를 상기 (c)단계의 탈핵된 난자에 이식하는 단계;

(e) 상기 (d)단계에서 이식 및 밀착시킨 작성란을 DC 조건의 전압으로 전기융합시키는 단계;

(f) 상기 융합된 세포를 융합과 동시에 또는 화학물질이 첨가된 배지내에서 활성화시키는 단계; 및

(g) 상기 활성화된 세포를 후활성화 및 미소적 배지내에서 배양한 후 검란하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 복제수정란의 생산 방법
제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 세포주가 호랑이 귀로부터 분리된 세포주임을 특징으로 하는 복제수정란의 생산 방법
제 1 항 또는 제 2 항에 의해 생산된 호랑이의 복제수정란Bos taurus coreanaeembryos/TcEar(KCTC 0719BP).