KR100710008B1

KR100710008B1 - ＳｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎＯ의 체세포 처리에 의한 복제효율 증진 방법

Info

Publication number: KR100710008B1
Application number: KR1020060009923A
Authority: KR
Inventors: 진동일; 나루세겐지; 박창식
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2006-02-02
Filing date: 2006-02-02
Publication date: 2007-04-23

Abstract

본 발명은 체세포 복제수정란의 배발달율을 향상시키기 위한 것으로 (1) 공여핵 세포인 체세포를 streptolysin O를 포함하는 배지에서 체외배양하는 단계; 및 (2) 상기 체외배양된 체세포를 유전물질이 제거된 수핵난자에 이식하고 융합하여 체세포 복제수정란을 제조하는 단계; 로 이루어진 것을 특징으로 하는 체세포 복제수정란의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면 SLO를 공여핵 세포에 처리한 후 수핵난자에 핵이식을 하였을 때 핵이식 후 융합율과 배반포까지의 배발달율이 유의성있게 증가하므로 체세포 복제 효율을 증진시킬 수 있다.

핵이식, 배발달율, 공여핵 세포, streptolysin O, 세포융합, 복제수정란, 체세포복제

Description

ＳｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎＯ의 체세포 처리에 의한 복제 효율 증진 방법{Method for improvement of cloning efficiency by treatment of somatic cell with Streptolysin O}

도 1은 공여핵 세포를 SLO로 처리하여 배발달율을 높이기 위한 본 발명의 복제 수정란 제조 공정을 나타내는 개념도.

도 2는 SLO를 처리한 공여핵 세포로부터 핵이식하고 세포 융합 후 6일간 배양하여 형성된 배반포의 사진.

본 발명은 체세포 복제수정란의 배발달율을 향상시키기 위한 것으로, 보다 상세하게는 공여핵 세포의 세포막에 SLO를 이용하여 작은 구멍을 형성시켜 핵이식 후 세포융합을 용이하게 함으로써 융합율과 배반포까지의 배발달율을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다.

1997년 영국의 Wilmut 등이 유선세포를 이용하여 복제양 돌리를 만들어 낸 후(Nature, 385: 810~813) 다양한 체세포를 이용한 여러 가지 동물의 복제 생산이 보고되고 있다. 체세포 복제기술은 우수형질 개체 확보, 멸종위기에 처한 동물의 보존, 질환 모델 동물의 생산, 인체 장기 공여 동물 생산 등 그 응용 분야가 매우 넓으며, 의학분야에서도 활용가치가 매우 높은 기술이다.

체세포 복제는 체세포를 공여핵 세포로 하여 공여핵 세포의 핵과 유전물질을 가진 수핵 난자를 융합하여 복제수정란을 제조하고, 체세포가 치환된 복제수정란을 최초의 분화(differentiation)가 일어나는 배반포기까지 체외배양한 후 대리모에 이식하여 개체로 발생시키는 단계를 거친다. 체세포 복제수정란이 생산된 후 가장 중요한 것은 이식된 체세포 핵이 통상적인 정자와 난자의 결합에 의해 생성된 핵과 동일하게 난자의 세포질과 조화롭게 일련의 발생과정을 수행하여야 한다는 것이다. 그러나, 체세포 핵치환 복제수정란의 체외발달율은 극히 저조하여 실제 복제에 성공할 확률이 매우 낮은 실정이며, 특히 돼지의 경우에는 핵치환된 복제수정란의 배반포기까지의 체외 발달율이 더욱 저조한 것으로 알려져 있다.

따라서 체세포 복제를 효과적으로 진행하기 위해서는 핵치환된 복제수정란의 착상 전단계인 배반포기까지의 체외 발달율을 증가시킬 수 있는 개선 방법의 필요성이 절실하다. 복제수정란 제조 시 체세포 핵 이식 후 통상 전기자극에 의해 공여핵 세포와 수핵 난자의 세포 융합을 유도하는데, 이는 전기자극이 세포에 가해지는 동안 공여핵 세포의 세포막과 수핵 난자의 세포막이 일시적으로 불안정한 상태하에 놓이게 되어 두 세포막이 융합하게 함으로써 공여핵 세포의 핵과 수핵 난자의 세포질로 구성된 복제수정란을 형성하는 것이다. 이러한 융합과정에서 공여핵 세 포의 핵과 수핵 난자의 세포질이 보다 효과적으로 융화되어 복제수정란을 형성할 수 있다면 체세포 복제수정란의 체외발달율이 향상될 수 있을 것으로 기대된다. 체세포는 특히 세포의 크기가 작아서 전기 융합시 어려움이 많아 융합율을 높이기 위한 방법의 개선이 필요하며, PHA-P(phytohemaglutinin-P) 또는 cytochalsain B 등의 화학물질을 첨가하여 융합율을 높이려는 시도가 행해진 바 있다(Bio. Reprod., 56, 194-199; Mol. Reprod. Dev., 61:187-191).

한편, Streptolysin O(SLO)는 알파나선 형태의 박테리아의 엔도톡신의 일종으로 콜레스테롤과 결합하여 세포의 원형질막에 구멍을 형성하는 것으로 알려져 있다. 포유동물세포막에 큰 구멍(pore)를 형성하는 것으로 알려져 있다. SLO는 세포막의 콜레스테롤에 결합한 후 세포막에 스며들어 다형결합을 하면서 구멍을 형성하여 세포를 죽게 하는 것으로 알려져 있는데, 세포의 다른 내부(internal) 막에는 구멍을 형성하지 않고 원형질막에만 선택적으로 직경 약 13nm의 구멍을 형성한다. SLO에 의해 형성되는 구멍은 단백질이나 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 등이 통과하기에는 충분하나, 다른 세포내 물질들은 통과하지 못한다. 따라서, 이러한 SLO의 세포막구멍형성 능력을 활용하면 체세포에 SLO를 약하게 처리함으로써 세포막에 작은 구멍을 형성시켜 세포내로 원하는 물질들(단백질이나 핵산 등)을 주입할 수 있다. 이러한 성질을 이용하여 섬유세포주를 SLO로 처리한 후 면역세포인 T-cell 세포추출물이나 insulin을 분비하는 β-cell 추출물과 배양시켜 T-cell이나 β-cell의 유전자조절물질들이 섬유아세포에서도 유전자조절에 관여하는지에 대한 연구(Hakelien et al., 2004, Biochem. Biophys. Res. Commun. 316:834-841; Hakelien et al., 2002, Nature Biotech. 20:460-466; Landsverk et al., 2002, EMBO Report 3:384-389) 등에 응용되고 있으나, 아직까지 체세포 복제 효율을 높이기 위하여 사용된 바는 없다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 공여핵 세포의 세포막에 작은 구멍을 형성시켜 핵이식 후 세포융합을 용이하게 함으로써 융합율과 배반포까지의 배발달율을 향상시키기 위한 방법을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 (A) 공여핵 세포인 체세포를 streptolysin O를 포함하는 배지에서 체외배양하는 단계; 및 (B) 상기 체외배양된 체세포를 유전물질이 제거된 수핵난자에 이식하고 융합하여 체세포 복제수정란을 제조하는 단계; 로 이루어진 것을 특징으로 하는 체세포 복제수정란의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 체세포 복제수정란의 제조 및 배양에 관련된 용어의 정의는 통상적으로 사용되는 정의를 따른다. 또한, 체세포의 SLO 처리를 제외한 체세포 복제수정란의 제조 및 배양을 위한 체세포 및 수핵난자의 준비, 핵이식, 융합 및 복제수정란의 배양과 관련된 구체적인 조건은 통상적으로 알려진 복제수정란의 제조 및 배양방법에 따른다. 본 발명의 실시예에서는 공여핵 세포의 체세포로 돼지섬유아세포를, 수핵난자로 돼지 난포란을 체외 성숙시켜 사용하였으나, 이에 한정된 것은 아니다. 예를 들어 공여핵 세포로 사용되는 체세포는 성체세포 및 태아세포 모두 사용 가능하며, 성체 세포는 상피세포, 신경세포, 표피세포, 각질세포, 조혈세포, 연골세포, 림프세포, 대식세포, 단핵세포, 근육세포 등을, 태아세포로는 태야섬유아세포, 귀상피섬유아세포 등을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면 공여핵 세포인 체세포의 핵을 수핵난자에 이식하기 전에 SLO를 처리하여 체세포의 막에 구멍을 형성시킨다. 이를 위하여 SLO가 함유된 Ca²⁺-free 배지에서 체세포를 배양하여 체세포 막에 구멍을 형성시키고, 그 결과 얻어진 체세포로부터 SLO를 제거하기 위하여 원심분리하여 세척하였다. 이때, 사용되는 SLO의 농도는 50~500ng/ml로 배양시간은 50분에서 1시간인 것이 바람직하며, 너무 높은 농도에서 긴 시간동안 배양하면 세포막에 큰 구멍들이 너무 많이 생성되어 세포가 생존할 수 없게 된다. SLO의 농도가 너무 낮을 경우에는 세포자체의 보호기능에 의해 세포막에 적당한 구멍이 생성되지 않을 우려가 있다. 이때 사용되는 배지로는 Ca²⁺-free 배지로서 2가 이온이 없는 배지를 사용하여 세포들끼리의 접착을 막아 세포막면적이 넓게 하여 사용하는 것이 효율적이다. 실시예에서는 DMEM 배지를 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니며, 세포들의 종류에 따라 RPMI나 HBSS 또는 Hams medium 등 다양한 배지에서도 사용가능하다.

상기 체세포를 SLO로 처리하기 전에 트립신으로 먼저 처리하면 배양접시에 부착된 세포를 유리시키고 세포기리의 접착을 이환시켜 SLO가 세포막전체에 넓게 되어 SLO의 처리효과가 효과적으로 나타날 수 있어 트립신 처리 단계를 추가하는 것이 바람직하다. 체세포를 트립신으로 처리할 때에는 0.25% 트립신 용액으로 37-39℃에서 약 3-5분정도 처리하여 단일세포로 만든 후 SLO 처리에 들어간다.

도 1은 본 발명에 의한 체세포 복제수정란의 제조 및 배양을 위한 핵이식까지의 과정을 보여주는 모식도이다. 도 1은 (1) 단계는 트립신 처리에 의해 세포와 세포를 분리하여 단일세포를 얻는 과정이다. (2) 단일세포로 분리된 체세포에 SLO를 처리하면 세포막에 구멍이 형성된다. (3) 세포막에 형성된 SLO를 제거한 후 (4)에 수핵난자에 체세포를 이식하는 과정을 보여주고 있다. 상기 과정에 의해 체세포를 이식한 수핵난자에 전기자극을 가하여 체세포와 수핵난자를 융합시켜 형성한 복제수정란을 배양하면서 난할율, 총세포수, 융합율 및 배반포 형성율을 조사한 결과, 난할율 및 총세포수에는 큰 차이가 없었으나 융합율과 배반포 형성율은 대조구에 비하여 유의적으로 증가하였으며 특히 배반포 형성율은 1.4배로 증가하였다.

도 2는 본 발명에 의한 방법에 의해 제조된 복제수정란을 6일간 체외 배양하여 얻어진 배반포의 사진이다.

본 실험에서는 SLO를 돼지섬유아세포에 처리한 후 성숙난자에 핵이식을 하였을 때 핵이식 후 융합율과 배반포까지의 배발달율이 유의성있게 증가하는 것을 보여주고 있다. 이로써, SLO에 의한 체세포 처리가 복제수정란의 배발달율을 크게 향상시킨 것을 확인할 수 있었다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 난포란의 회수와 체외 성숙 난포란의 준비

도축장에서 도살 직후 암돼지의 난소를 적출하고 30-35℃의 0.9% NaCl에 보존하여 실험실에 운반한 후, 18-guage 주사기를 이용하여 직경 약 2-6mm 난포에서 난포란과 난포액을 함께 흡입하여 채취하였다. 돼지 난포란의 체외성숙을 위하여 기본배지로 TCM-199(no. 31100-035; Gibco, Grand Island, NY)배양액을 사용하였고, 여기에 0.1%(w/v) polyvinyl alcohol(PVA), 3.05 mM D-glucose, 0.91 mM sodium pyruvate, 0.57 mM L-cysteine, 0.5㎍/㎖ LH (L-5269, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), 0.5㎍/㎖ FSH(F-2292, Sigma), 10 ng/㎖ EGF(E-4127, Sigma), 75 ㎍/㎖ penicillin, 50㎍/㎖ streptomycin, 그리고 0.05%(v/v) MEM vitamins(Sigma, M-6895를 첨가하여 사용하였다. 배양액을 4-well dish의 각 웰에 500㎕ 씩 분주한 후 mineral oil로 피복한 다음 난포란 50개씩을 옮겨 38.5℃, 5% CO₂ 배양기에서 22시간동안 배양하였고, 이 후 호르몬이 첨가되지 않은 배양액으로 20-22시간 배양함으로써 총 42-44시간 배양시켜 체외 성숙을 유도하였다. 성숙시킨 난포란은 0.1% hyaluronidase하에서 피펫을 사용하여 난구세포를 제거하였다.

2. 체세포의 준비

공여핵 세포로는 35일령 돼지 태아로부터 확립한 돼지 섬유아세포를 이용하였는데 5% FBS, 5% FCS 및 75㎍/㎖ penicillin G 및 50㎍/㎖ streptomycin이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)액 내에서 배양하여 5-10 passage한 것을 이용하였다. 핵이식에 사용하는 체세포는 동결보존 된 것을 융해한 후 배양하여 융합(confluent)한 상태에서 한번 더 passing을 한 후 배양하여 세포밀도를 높게 한 후 이용하였다.

3. SLO 를 이용한 공여핵 세포의 처리

단일 세포를 분리하기 위하여 돼지 섬유아세포를 0.25% 트립신(trypsin)과 0.5mM EDTA 용액으로 38.5℃ 배양기에서 5분간 배양한 후 tube에 옮겨 200ng/㎖ streptolysin O (SLO; Sigma, S-5265)이 함유된 Ca²⁺-free DMEM(Gibco, 21068-028)액에서 50분 동안 38.5℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그 세포를 원심 분리에 의해 1000rpm에서 5분간 원심분리하고 2번 세척한 후 마지막으로 세포 pellet을 Ca ²⁺-free DMEM로 재부양시켜 사용 전 까지 배양기에서 배양하였다.

4. 핵이식, 세포융합 및 체외 배양

0.3% BSA, 7.5㎍/㎖ cytochalasin B 및 0.5 mM Hepes(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)가 함유된 TCM199액에서 미세조작기를 이용하여 제1극체와 주변의 세포질을 흡입하여 metaphase Ⅱ기 염색체를 제거하는 방법으로 탈핵을 하였고, 그 후 그 위치에 공여핵 세포를 주입하였다.

세포융합은 1.0 mM CaCl₂·H₂O, 0.1 mM MgCl₂·6H₂O 및 0.5 mM Hepes를 첨가한 0.3 M mannitol용액을 넣은 wire chamber(1mm 폭)에서 1.2kV/cm의 직류전류로 BTX Elector-Cell Manipulator 2001(BTX, San Diego, CA)를 이용하여 30 μsec 2회 통전하여 실시하였다. 핵이식된 난자는 세포융합용액으로 3번 세척한 후, PZM-3 배양액을 500㎕ 분주된 4 well dish에 옮겨 38.5℃, 5% CO₂배양기에서 6일간 배양하였다. 배양 후 융합율과 성공적으로 융합된 난자에 대한 난할율과 배반포 형성율 및 총 세포수 등을 조사하여 표 1에 나타내었다. 총 세포수는 각각의 배반포기 수정란의 세포수를 낸 것으로 배반포기까지 발달된 수정란의 평균세포수로 Hoechst 33342용액을 이용하여 측정하였다.

본 연구에서는 SLO를 처리하지 않은 군을 대조구로 하여 SLO 처리구에 대하여 대조구와 함께 4회 이상 반복실험을 실시하였으며, 도출된 모든 실험결과의 통계처리는 SAS/STAT 6.03 package를 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시한 후, Duncan's 검정(DMRT)에 의하여 처리구간 유의성 검정을 하여, P<0.05 이하의 유의성만을 통계학적 차이가 있는 것으로 인정하였다.

SLO처리구와 무처리구에서 난할율(78.8±3.5 vs 77.9±5.0)과 총세포수(30.0±12.3 vs 29.7±15.2)에서는 유의적인 차이가 없었으나, 융합율(80.5±0.3 vs 90.6±1.2)과 배반포 형성율(19.7±0.2 vs 27.3±0.2)에서는 SLO처리구가 유의적으로(P<0.05) 높게 나타났다(도 2). 그러므로 핵이식 전에 태아섬유아세포를 SLO로 처리하면 핵이식 후 융합율과 복제수정란의 배발달을 유의적으로 증가시키는 것으로 확인되었다.

이상과 같이 본 발명에 의하면 SLO를 공여핵 세포에 처리한 후 수핵난자에 핵이식을 하였을 때 핵이식 후 융합율과 배반포까지의 배발달율이 유의성있게 증가하므로 체세포 복제 효율을 증진시키는 효과를 얻을 수 있다.

Claims

(A) 공여핵 세포인 체세포를 streptolysin O를 포함하는 배지에서 체외배양하는 단계; 및

(B) 상기 체외배양된 체세포를 유전물질이 제거된 수핵난자에 이식하고 융합하여 체세포 복제수정란을 제조하는 단계;

로 이루어진 것을 특징으로 하는 복제수정란의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

(A) 단계의 streptolysin O를 포함하는 배지는 streptolysin O를 포함하는 Ca²⁺-free DMEM 배지인 것을 특징으로 하는 체세포 복제수정란의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 streptolysin O의 농도는 50~500ng/㎖인 것을 특징으로 하는 체세포 복제수정란의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 streptolysin O의 처리 전에 공여핵 세포를 트립신으로 처리하는 공정을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 체세포 복제수정란의 제조 방법.