KR20040065214A - 토끼 난모세포를 이용한 체세포 배아의 제조방법 - Google Patents
토끼 난모세포를 이용한 체세포 배아의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 포유류 세포 또는 세포핵을, 핵 공여체와 다른 종의 핵제거된 난모세포, 바람직하게는 핵제거된 토끼 난모세포내로 이식하여, 핵전달 유닛을 형성시키고, 이러한 핵전달 유닛을 적절한 조건 하에서 다양한 이식전 단계까지 발달시키는 것을 포함하는, 핵전달 유닛 (nt-유닛, 체세포 배아라고 칭할 수도 있음)의 제조방법; 및 이러한 방법으로 얻어진 nt-유닛의 용도를 개시한다.
Description
핵전달 방법은 공여세포 또는 세포핵을 핵제거된 난모세포 내로 이식하는 것과 관련이 있다. 얻어진 핵전달 유닛 (nt-units)은 여러가지 이식전 단계로 발달되어, 대리모에게 이식됨으로 해서 살아있는 동물을 출산시킨다. 이 방법은 1950년대말 양서류에 성공적으로 적용되었다. Briggs와 King은 흑반왜 (rananigromaculata)의 엔테릭 상피의 상피핵을 난모세포 내로 전달함으로써 핵전달된 개구리를 수득하였다. 핵전달법은 1980년대 후반까지는 포유동물에게 적용되지 않았다. 이 방법은 예컨대 배아 할구, 내부세포 매스, 핵전달 중 말단 배아 세포 등 여러가지 핵 공여 세포를 이용하여 여러가지 수준의 성공을 거두었다 (Collas 외, Mol. Reprod. Dev., 38: 264-267, 1994; Keefer 외, Biology of Reproduction, 50: 935-939, 1994; Sims 외, PNAS, 90:6155-6159, 1993).
영국의 Wilmut Ian 등 (Nature 385, 810-813, 1997)은 최초로 살아있는 양에서 체세포 핵전달에 성공하였고 그의 공여 세포는 다 자란 유선으로부터 유도된 것이었다. 1998년, 미국의 과학자들은 마우스의 체세포 핵의 연속적인 핵전달에 완전히 성공하였다 (Wakayama 외, Nature, 394: 369-374, 1998). 1999년, 과학자들은 포배기의 마우스 nt-유닛으로부터 마우스의 핵전달 배아 줄기 세포 (ntES 세포)를 수득하였다 (Teruhiko 외, PANS 96: 14984-14989, 1999). 성인의 (adult) 체세포를 이용한 핵이식기술의 성공은 기술적 진전이었을 뿐만 아니라 기술개발을 이해하는데도 진전을 보인 것이었다. 이러한 사실은 고도로 분화된 성인 체세포 핵이 체세포 핵을 재프로그램화함으로써 새로운 개체를 형성토록 하는 것이 가능하다는 것과 이들을 재개발시킬 수 있음을 보여주는 것이다.
이종간 핵이식 기술은 공여 세포 또는 세포핵을 핵공여체와 종을 달리하는 종의 핵제거된 난모세포내로 이식하는 것과 관련이 있다. 결과적인 nt-유닛을 배양하여 포배를 얻는다. 동물 클로닝의 경우, 포배기의 nt-유닛을 자궁내로 이식하여 살아 출생하는 동물을 얻는다. 치료적 클로닝에서는, 인간의 체세포 핵을 핵공여체로서 사용할 경우, 포배기의 nt-유닛를 분할하여 배아 줄기 세포를 얻는다.
Tanja Dominko 등 (Biology of Reproduction, 60(6), 1496-502)은 여러종 (예컨대 소, 양, 돼지, 원숭이 및 래트)의 포유동물의 체세포 핵을 핵제거된 소의 난모세포 내로 이식하여 nt-유닛를 형성시켰다. 이들 이종간 nt-유닛로부터 포배가 얻어졌다. 이 실험은 공여 세포 또는 세포핵을 핵 공여체와 다른 종의 핵제거된 난모세포내로 이식함으로써 핵전달 유닛을 얻을 수 있음을 보여주는 것이다. 이종간 핵전달로부터 결과된 nt-유닛들은 적어도 포배까지 발달할 잠재력을 갖는다. 어떤 포유동물종의 난모세포가 다른 포유동물종의 체세포핵을 효과적으로 재프로그램할 수 있다는 사실은 재프로그래핑을 제어하는 메카니즘이 포유동물에서 대부분 보존된다는 것을 입증해주는 것이다.
인체용 의약을 위해, 인간 체세포 핵을 재프로그래밍하기 위해 대량의 난모세포가 필요로되는 치료적 클로닝에서 이종간 체세포 핵전달 기술이 이용될 수 있다. 인간의 난모세포는 매우 귀하기 때문에, 임상적 및 실험적 필요성을 만족시키기란 대단히 어렵고 따라서 실험적 용도와 임상적 용도의 두가지 모두를 충족시키기 위해서는 다른 소스의 난모세포를 찾을 필요가 있을 것이다.
상기한 바와 같이, 소의 난모세포는 이종간 핵전달기술에 흔히 사용되고 있다. 자극 기술에 의해 암소의 난소나 생식관으로부터 성숙한 난모세포를 직접 얻을 수 있다. 그러나, 이들 기술은 매우 복잡하기 때문에 그 아웃풋은 불임성 (8-10세포)이고 더 많은 수의 소를 필요로 하게 되어 비용도 매우 많이들게 된다 (각각의 소로부터 8-10개의 난모세포를 얻을 수 이쓰며, 이들에 21일의 소의 자연적인 발정기간동안 배란 촉진을 위해 5일 동안 인공 호르몬을 주입한다). 따라서. 살아있는암소로부터 성숙한 난모세포를 얻는데는 매우 많은 비용이 든다.
보다 입수하기 쉬운 소의 난모세포 소스로는 도살장의 것을 들 수 있으나, 입수가능한 난모세포는 종종 늙거나, 약하거나, 병들거나, 장애를 갖는 동물이나, 예컨대 결핵, 구제역등과 같은 병원균에 감염된 동물들의 것이다; 즉, 난모세포의 품질이 종종 불안정한것이다. 게다가, 도살장의 암소는 대대 여러지역에서 오는 것들이어서 이들의 유전적 배경도 대개 불투명하다. 한편, 얻어진 난모세포는 시험관내에서 18 내지 24시간 동안 배양시켜 성숙시킨 후에라야 사용가능하다. 뿐만 아니라, 시험관내 성숙된 난모세포들은 종종 생체내에서 성숙된 난모세포만큼 양호하지 못하다.
발명의 목적
본 발명자들은 예컨대 성인 인간의 체세포나 세포핵을 핵제거된 동물의 난모세포내로 이식함으로써 핵전달 유닛 (nt-유닛)을 얻을 수 있음을 발견하였다. 이종간 핵전달로부터 얻어진 nt-유닛는 적어도 포배까지 발달될 잠재력을 갖는다. 그 결과는 인간의 체세포 핵이 핵제거된 난모세포내로 이식되어 포배기까지 발달된 후 재프로그램될 수 있다는 첫번째 증거였다. 이러한 결과는 토끼과 (leporid) 동물, 예컨대 토끼의 핵제거된 난모세포 내로 인간의 세포 또는 세포핵을 이식시켜 포배기로 발달할 수 있는 nt-유닛를 생산하는, 이종간 핵이식 가능성을 더욱 입증해준다.
따라서, 본 발명의 한가지 목적은 이종간 핵전달에 의해 nt-유닛를 제조하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간의 핵 또는 동물세포 또는 세포핵을 종을 달리하는 핵 공여체로부터의 핵제거된 난모세포내로 이식하는 것을 포함하는 nt-유닛의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 특별한 목적은 비-인간 포유동물종의 핵제거된 난모세포내로 인간 세포의 핵을 이식하는 것을 포함하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간 세포 또는 세포 핵을 예컨대 토끼의 핵제거된 난모세포와 같은, 핵제거된 동물의 난모세포내로 이식하는 것을 포함하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 예컨대 성숙한 체세포핵과 같은 인간의 핵을 핵제거된 인간 난모세포 내로 이식하는 것을 포함하는 방법을 제공하는데 있다.
전술한 그리고 기타목적과 함께 본 발명의 장점과 특징이 하기 설명으로부터 더욱 명료히 드러날 것이다. 본 발명의 특성은 다음의 바람직한 구체예의 설명과 첨부된 특허청구범위를 참조로 더욱 명료하게 이해될 것이다.
본 발명은 일반적으로 핵 공여체와 다른 종의 핵제거된 (enucleated) 난모세포 내로 포유 세포 또는 세포핵을 이식하는 것과 관련된, 이종간 핵전달 (cross-species nuclear transfer)에 관한 것이다. 결과적인 핵전달 유닛 (nt-units)은 다양한 이식전 (pre-implantation) 단계에 도달할때까지 배양된다. 이들 nt-유닛은 핵전달 배아 줄기 세포 (ntES cells: nuclear transfer embryonic stem cells)를 생산하는데 유용하다. 특히, 본 발명은 nt-유닛 및, 인간의 세포 또는 세포핵을 핵제거된 동물의 난모세포, 더욱 바람직하게는, 토끼과 (leporid)의 난모세포, 가장 바람직하게는 토끼의 핵제거된 난모세포내로 이식함으로써 그로부터 유도된 배아 줄기 세포에 관한 것이다.
도 1은 인간 포피로부터 얻어진 섬유아세포의 사진이다.
도 2는 토끼 난모세포의 사진이다.
도 3은 4배기의 nt-유닛 (체세포를 투명대 (zona pellucid)에 주입함으로써 수득)의 사진이다.
도 4는 상실배기의 nt-유닛 (체세포를 투명대에 주입함으로써 수득)의 사진이다.
도 5는 포배기의 nt-유닛 (체세포를 투명대에 주입함으로써 수득)의 사진이다.
도 6은 부화포배기의 nt-유닛 (체세포를 투명대에 주입함으로써 수득)의 사진이다.
도 7은 4배기의 nt-유닛 (체세포를 난모세포의 세포질내로 주입함으로써 수득)의 사진이다.
도 8은 상실배기의 nt-유닛 (체세포를 난모세포의 세포질내로 주입함으로써 수득)의 사진이다.
도 9는 포배기의 nt-유닛 (난모세포의 세포질내로 체세포를 주입함으로써 수득)의 사진이다.
도 10은 부화 포배기의 nt-유닛 ((난모세포의 세포질내로 체세포를 주입함으로써 수득)의 사진이다.
도 11은 필적할만한 효과를 갖는 상이한 단계의 포배들의 공여체로부터의 체세포를 보여주는 표이다.
도 12는 토끼 난모세포에 의해 재프로그램된 인간의 체세포로부터 유도된 ntES 세포 콜로니의 사진이다.
도 13은 26번째 계대에서의 ntES 세포의 정상적인 인간의 핵형 (karyotype)을 나타내는 사진이다.
본 발명에서, 핵전달 또는 핵이식은 상호동의적으로 사용된다.
본 발명에서 핵전달 유닛 (nt-유닛)과 체세포 배아는 상호동의적으로 사용된다.
본 발명에서, 핵전달 배아 줄기 세포 (ntES 세포) 또는 체세포 유도된 배아 줄기 세포 (S-ES: somatic cell derived embryonic stem cell)은 상호동의적으로 사용된다.
본 명세서에서 "핵이식 (nuclear transplantation)"이라는 용어는 핵제거된 난모세포내로 공여 세포 또는 세포핵이 이식되는 것을 의미한다. 결과적인 nt-유닛를 다양한 이식전 단계 (예컨대 포배기)까지 배양시켜, 동물 클로닝의 경우, 살아서 동물을 출생시키게끔 한다. 핵전달에 있어서, 예컨대 영장류, 유제류, 양서류, 설치류와 같은 다양한 종의 체세포 또는 세포핵들을 모두 핵 공여체로서 사용할 수 있다. 인간의 난모세포 뿐만 아니라, 영장류, 유제류, 양서류, 설치류등으로부터 유래된 다른 종의 난모세포도 핵이식에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 "동종간 핵이식 기술"이라는 용어는 공여세포 또는 세포핵을 동일한 종으로부터의 핵제거된 난모세포 내로 이식시키는 것을 포함하는 것이다. "이종간 핵이식 기술"이라는 용어는 공여세포 또는 세포핵을 핵 공여체와 다른 종의 핵제거된 난모세포 내로 이식하는 것을 포함하는 것이다.
본 명세서에서 "핵전달 유닛 (nt-유닛)"라는 용어는 핵 공여체와 핵제거된 난모세포의 조합으로부터 유도된 유닛을 가리킨다. 핵 공여체와 핵제거된 난모세포는 동종 또는 이종으로부터의 것일수 있다. 결과적인 nt-유닛는 모든 이식전 단계까지 발달될 수 있는 잠재력을 가지며, 그에 따라 명명된다. 예컨대, 포배기까지 발달된 nt-유닛는 포배기의 nt-유닛로 칭해진다.
바람직한 구체예에서, 예컨대 토끼와 같은 적절현 작은 동물을 핵전달의 난모세포 공여체로서 사용한다.이들 동물에게 표준식을 제공함으로써, 질병을 쉽게 방지할 수 있고 따라서 SPF (specific pathogen free: 특수 병원균 없음) 상태로 만들수 있기 때문에, 사육비용도 감소된다. 7-9일간의 토끼의 자연적인 발정기간동은 배란을 촉진하기 위해 4일동안 인공적으로 호르몬이 주입된 각각의 과배란 (superovulated) 토끼로부터 일반적으로 약 30개의 난모세포를 얻는다.
본 발명자들은 인간 세포 또는 세포핵, 특히 인간 섬유아세포를 핵제거된 토끼의 난모세포 내로 이식함으로써 얻어진 nt-유닛이 포배기까지 발달할 수 있는 잠재력을 지닌 nt-유닛를 생산할 수 있음을 발견하였다. 인간의 세포핵이 토끼 난모세포에 의해 효율적으로 재프로그램될 수 있다는 사실에 기초해서, 인간의 체세포가 영장류, 유제류 및 기타 설치류와 같은 다른 비-토끼 포유동물종의 난모세포내로 이식될 수 있을 것으로 기대함직하다. 또한, 유사한 방법을 이용함으로써, 예컨대 포배기와 같은 여러가지 이식전 단계의 nt-유닛를 생산하기 위해 인간의 난모세포 내로 인간 세포 또는 핵을 이식하는 것도 가능하다.
따라서, 최광의로, 본 발명은 핵 공여체와 종을 달리하는 종의 핵제거된 난모세포 내로 포유동물 (인간을 비롯)의 세포 또는 세포핵을 이식함으로써 다양한 이식전단계의 nt-유닛를 생산하는 방법에 관한 것이다. 예컨대, 본 발명은 비-인간 포유동물종의 핵제거된 난모세포 내로 인간 세포 또는 세포핵을 이식함으로써 포배기의 nt-유닛를 생산하는 것을 포함할 수 있다. 얻어진 nt-유닛는 배아 줄기 세포 또는 배아 줄기-유사 세포 또는 기타 유형의 임상요법을 위한 배아-유도된 줄기 세포를 수득하는데 이용될 수 있다.
치료적 클로닝 접근방법은 환자의 체세포를 핵제거된 포유동물의 난모세포로 이식하여 ntES 세포를 분리하기 위해 다양한 이식전 단계의 nt-유닛를 생산하는 것을 포함한다. 결과적인 ntES 세포들은 환자와 동일한 유전형을 가지며 환자의 면역체계에 의해 "자기자신"으로서 인식될 것이기 때문에, 환자의 면역계에 의해 거부되지 않을 것이다. 치료적 클로닝은 이식의료분야에서 흔히 관찰되는 면역거부 문제를 해결하는 접근방법을 제공해준다.
치료적 클로닝으로부터 유도된 ntES 세포들은 질병치료에 이용가능하다. 따라서, 인간의 체세포 핵을 재프로그램하는데 이용되는 비인간 난모세포는 다음의 요구사항을 만족해야만 한다. 첫째로, 난모세포는 예컨대 박테리아, 바이러스, 미코플라즈마등과 같이 인간을 감염시킬 수 있는 여하항 병원체도 지녀서는 안된다. 둘째, 이들은 인간의 핵을 효율적으로 재프로그램하여 nt-유닛을 포배 또는 부화 포배 (hatching blastocysts)로 발달시킬 수 있어야 한다. 뿐만 아니라, 이들의 유전적 배경은 깨끗하고 그 품질은 안정해야만 하며, 충분한 양으로 확보가능하여야 한다.
소와 양의 난모세포에 비해, 토끼의 난모세포는 몇몇 장점이 있다. 이들은 저렴한 비용으로 얻기가 훨씬 쉽고, 그 품질이 더 안정하며, 보다 청정한 유전적 배경을 가지며, 핵이식에 앞서 시험관내에서 성숙하기 위한 부가적인 공정을 필요로 하지 않는다. 특정 구체예에서, 본 발명은 인간의 세포 또는 세포핵을 핵제거된 토끼의 난모세포내로 이식함으로써,배아 줄기 세포 또는 배아 줄기 유사 세포 또는 기타 유형의 배아-유도된 줄기 세포를 수득하는데 이용가능한 nt-유닛을 생산하는 방법을 제공한다. 상기한 바와 같이, 난모세포 공여체로서 대형 유제류 동물 세포 (소와 양의 난모세포를 포함)만을 사용하여 왔다. 소와 양의 난모세포에 비해, 토끼의 난모세포는 저비용으로, 보다 쉽게 얻을 수 있고, 대량으로 생산가능하다는장점을 갖는다. 가장 중요한 것은, SPF (특수 병원균 없음) 등급의 동물로부터 토끼 및 토끼 난모세포를 얻을 수 있고, 무병원균 난모세포는 궁극적으로 무병원균 ntES 세포를 얻는데 중요하기 때문에, 인간의 질병을 치료하는데 결과적인 줄기 세포들을 이용할 경우 치료적 클로닝에 있어서 이러한 요구사항은 극히 중요한 것이다.
본 발명자들은 또한 토끼 난모세포가 포배 생산을 위해 인간의 세포를 효율적으로 재프로그램할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 토끼의 난모세포는 연구 및 치료적 클로닝 분야에서 인간의 난모세포를 대체하는데 있어서 소와 양보다 바람직한 것이다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 세포 또는 세포핵을 핵제거된 동물의 난모세포, 더욱 바람직하게는 토끼과의 난모세포, 가장 바람직하게는 토끼의 핵제거된 난모세포내로 이식함으로써 다양한 이식전 단계의 인간의 nt-유닛를 제조하는 것을 포함한다.
일반적으로, nt-유닛은 다음 단계를 포함하여 이루어지는 종간 (interspecies) 핵전달 공정에 의해 제조될 것이다:
(i) 핵 공여체로서 소망되는 포유류의 세포 또는 세포핵을 수득한다;
(ii) 예컨대 포유동물 및 더욱 바람직하게는 토끼과, 예컨대 토끼와 같은 적합한 소스로부터 난모세포를 수득한다;
(iii) 상기 난모세포의 핵을 제거한다;
(iv) 포유동물의 세포 또는 세포핵을 핵제거된 난모세포 내로 이식하여 nt-유닛를 활성화시킨다;
(v) 얻어진 nt-유닛를 배양하여 포배 또는 부화 포배를 수득한다.
핵전달 기술
핵전달 기술 또는 핵이식 기술은 논문을 통해 잘 알려져 있으며 발명의 배경란에서 인용된 여러가지 참조문헌을 통해 설명되어 있다. 예컨대, 특히, Wilmut 외, Nature, 385:810-813, 1997; Campbell 외, Biology of Reproduction, 49(5): 933-942, 1993; Collas 외, Mol. Reprod. Dev. 38;264-267, 1994: Keefer 외, Biology of Reproduction, 50:935-939, 1994; Sims 외, PNAS, 90:6155-6159, 1993: 또한, 특허문헌 WO 94/26884, WO 94/24274; 및 WO 90/03432. 이들 모두는 본문에 그 전내용이 참조되었음.
핵 공여체
본 발명에서, 핵 공여체로서 사용된 세포들은 인간 세포, 바람직하게는 인간의 섬유아세포로부터 유도된 것들이다.
인간 또는 동물의 세포, 바람직하게는 포유동물 세포들은 공지기술에 따라 수득 및 배양할 수 있다. 본 발명에서 이용가능한 인간 및 동물 세포들로는 상피세포, 신경세포, 표피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, 유핵 적혈구, 대식세포, 단핵세포, 섬유아세포, 심근세포 및 기타 근육세포등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 뿐만 아니라, 핵전달에 사용되는 인간 세포들은 상이한 기관, 예컨대 피부, 폐, 췌장, 간, 위장, 소장, 심장, 생식기관, 방광, 신장, 요도 및 기타 배뇨기관 등으로부터 수득가능하다. 어디까지나 이들은 적합한 공여 세포의 예시일 뿐이다. 적합한 공여 세포, 즉, 본 발명에서 이용가능한 세포들은 신체의 모든 세포 또는 기관으로부터 얻을 수 있다. 여기에는 모든 체세포가 포함된다.
난모세포
핵전달에 사용되는 난모세포는 포유류와 양서류를 비롯한 다양한 동물로부터 얻어질 수 있다. 난모세포의 적절한 포유동물 소스로는 양, 소, 돼지, 말, 토끼, 기니피그, 마우스, 햄스터, 래트, 영장류등을 들 수 있다. 바람직한 구체예에서, 난모세포는 토끼과, 예컨대 토끼로부터 얻는다.
성숙한 핵분열 중기 II (metaphase)의 난모세포를 과배란된 토끼 또는 비-과배란된 토끼의 생식관으로부터 발정기 개시 15 내지 24시간 후에 또는, 인간의 융모막 고나도트로핀 (hCG: human chorinoc gonadotropin) 또는 유사한 호르몬을 주입한지 바람직하게는 15 내지 18시간 후에 외과적으로 얻을 수 있는 것으로 밝혀졌다.
난모세포의 분리방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 기본적으로, 이 방법은 포유동물이나 양서류, 예컨대 토끼의 난소나 생식관으로부터 난모세포를 분리하는 것을 포함한다.
핵전달시 난모세포의 성숙도는 핵전달법의 성공여부를 가늠하는 중요한 요소인 것으로 보고되어왔다 (Prather 외, Differentiation, 48, 1-8, 1991 참조). 일반적으로, 이전의 성공적인 포유동물의 배아 클로닝은 수용체 난모세포로서 핵분열 중기 II의 난모세포를 사용하였다. 이는, 이 시기의 난모세포가, 가임 (fertilizing) 정자와 유사한 방식으로, 도입된 핵을 재프로그램하도록 효과적으로"활성화"되어, nt-유닛을 생산할 수 있기 대문이다.
핵제거 (enucleation)
본 발명에서 뉴질랜드 토끼로부터 수득된 성숙한 난모세포를 인간의 융모막 고나도트로핀 (hCG)를 주입한지 14 내지 24시간 후에 핵제거시켜야 하는 것으로 밝혀졌다. 핵제거에 앞서, 난모세포들을 난구세포 (cumulus cells) 제거에 앞서 히알루로니다제를 함유하는 M2 배양배지 (Sigma)에 넣는다. 이것은, 내경이 매우 작은 피펫을 이용한 반복적인 피펫팅 또는 보텍싱에 의해 수행가능하다. 이이서 스트리핑된 난모세포를 극체 함유여부에 대해 스크리닝하여, 극체 존재로 확인된, 선택된 핵분열 중기 II 난모세포를 핵전달 및 핵제거에 사용한다.
일반적으로, 동물의 난소로부터 수집된 미숙한 난모세포는 원하는만큼, 난모세포가 핵분열중기 II기에 달할 때까지 시험관내에서 성숙시켜야만 한다.
뉴질랜드 토끼의 경우, 핵제거는 인간의 융모막 고나도트로핀 (hCG)이 주입된지 20시간 이전, 바람직하게는 16 내지 18시간 경과시 수행되는 것이 좋다.
핵제거는 극체 및 그와 인접한 세포질 제거를 위해 마이크로피펫을 이용하여 마이크로시술을 수행한다. 핵제거의 효율은 제거도니 극체와 염색질을 Hoechst 33342 염료로 염색시켜, 자외선하에서 DNA를 신속히 관찰함으로써 평가할 수 있다.
nt-유닛의 조제
기술분야의 공지기술에 따라, nt-유닛는 투명대내로 예컨대 주사하고 세포질내로 주사함으로써 얻을 수 있다.
투명대내로의 주사:
핵제거된 난모세포의 난황주위의 공간 (perivitelline space) 내로 동물 또는 인간의 단일 체세포 또는 세포핵을 전달시킨다. 체세포 토끼 난모세포의 막을, 인간 융모막 고나도트로핀 (hCG)를 주사한지 16 내지 20시간 후, 예컨대 만니톨 및 수크로스와 같은 전기융합 (electrofusion) 배지에서 90-120V의 전기충격을 약 60μsec 동안 1-2회 또는 더 자주 인가함으로써 0.5 mm 챔버내에서 전기융합시킨다. 일반적인 활성화는 전기융합후 이보다 짧은 기간, 예컨대, 일반적으로 24시간 이내에, 바람직하게는 4-9시간만에 행하는 것이 좋다. 융합 후, 결과적인 nt-유닛을 적절한 배지, 예컨대 RD, M199, DMEM 배양배지에 넣는다.
세포질막을 일시적으로 파괴시키는데 충분한 전기충격을 가함으로써 전기융합을 수행한다. 세포질막의 이러한 파괴는 막이 신속히 재생되므로 매우 짧게 일어난다. 기본적으로, 두개의 인접한 막이 파괴되면, 재생시, 지질 이중층이 서로 혼합되어 두개의 세포들 사이에 작은 채널이 열리게된다. 이러한 작은 오프닝의 열역학적인 불안정성으로 인해, 이것은 두 세포들이 하나로 융합될 때까지 확대된다. 이에 관해서는 Prather 등의 미국특허 4,997,384를 참조하면 된다 (본문에 전부 참조됨). 예컨대 수크로스, 만니톨, 소르비톨 및 포스페이트 완충액과 같은 다양한 전기융합배지가 이용될 수 있다. 융합은 Sendai 바이러스를 융해성 제제로 사용함으로써 수행할수도 있다.
nt-유닛은 공지방법에 의해 활성화가능하다. 이러한 방법에는 예컨대, 즉, 기본적으로는 nt-유닛에 차가운, 실제로 냉온 충격을 가함으로써 nt-유닛을 생리적 온도보다 낮은 온도 (sub-physiological temperature)에서 배양하는 것이 포함된다. 이것은 nt-유닛을 생리적 온도보다 낮은 실온에서 배양함으로써 가장 간편하게 수행가능하다.
적절한 난모세포 활성화법은 Susko-Parrish 등의 미국특허 5,496,720호에 설명된 방법으로 본문에 참조되었다.
예컨대, 난모세포 활성화는 다음과 같이 연속적으로 행해질 수 있다:
(i) 난모세포 중의 이가 양이온 (divalent cations)의 수준을 증가시켜;
(ii) 난모세포 중의 세포성 단백질의 포스포릴화를 감소시킨다.
이가 양이온 수준을 증가시키는 방법은 일반적으로 6-디메틸-아미노 퓨린, 스타우로스포린, 2-아미노퓨린 및 스핑고신과 같은 세린-쓰레오닌 키나아제 저해제와 같은 키나아제 저해제를 부가함으로써 수행될 것이다.
한편, 세포성 단백질의 포스포릴화는 예컨대 포스파타제 2A 및 포스파타제 2B와 같은 포스파타제를 난모세포내로 도입함으로써 저해시킬 수 있다.
세포질내로의 주사:
또한, 전기영동 융합을 이용하기보다 난모세포의 세포질내로 핵을 직접 주사하는 것과 같은 다른 방법을 핵전달에 이용할 수 있다 (Collas 및 Barnes, Mol. Reprod. Dev., 38:264-267 1994).
nt-유닛의 배양
활성화된 nt-유닛을 시험관내 배양시켜 포배를 얻을 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예들인 다음 실시예에서, nt-유닛을 RD 배양 배지에서 배양시켰을 때 최고의 포배 배양 효과가 얻어졌다 (상세내용은 실시예 참조).
38℃ 파라핀층 및 5% CO2하에서, 예컨대, RD, M199, DMEM 등과 같은 조직 배양배지 50 마이크로리터로 이루어진 마이크로드롭스 배양배지에 활성화된 nt-유닛을 전달시킬 수 있다.
본 발명자들의 경험에 의하면, 인간의 체세포/핵제거된 토끼 난모세포 유도된 nt-유닛의 경우, 포배는 nt-유닛를 활성화시킨지 약 6-7일 후에 얻어진다.이종간 핵전달을 통해 수득된 nt-유닛은 전형적으로, 난모세포 공여체종보다는, 핵공여체종의 것에 유사한 외관과 세포특성을 나타낼 것이다. 예컨대, 인간 체세포 핵과 핵제거된 토끼 난모세포 사이에 형성된 nt-유닛은, 배양한지 약 3-4일만에 포배를 형성하는 토끼의 배아보다는, 약 6-7일만에 포배를 형성하는 인간의 배아와 유사한 발달 스케쥴을 나타내는 것이다.
토끼 배아용 배양 및 유지를 위한 배지는 문헌을 통해 잘 알려져 있으며, 예컨대 DMEM+15% FCS; M199+15% FCS; RD+15% FCS 등을 들 수 있다. 상기한 것들은 또한 과립구, 난관세포, 자궁세포 및 STO 세포와 같은 다양한 세포종류와 함께 공동배양될 수도 있다.
본 발명에서, 결과적인 nt-유닛은 의료분야에 응용될 수 있는 인간의 배아 줄기 세포 또는 배아 줄기-유사 세포 또는 기타 유형의 배아-유도성 줄기 세포를 유도하는데 사용될 수 있음으로 해서, 수많은 유전병을 치료하는데 새로운 방법을 제공해줄 것이다.
실질적인 응용예로, 예컨대 팬더와 같은 멸종위기의 종을 구하는데 핵이식기술을 이용할 수 있다. 이러한 종들에서는, 암컷 난모세포의 수가 적기 때문에, 암컷 난모세포를 더 많은 수로 얻기가 힘들다. 공여체 세포로서 이들의 핵을 다른 종의 핵제거된 난모세포내로 이식한다. 얻어진 nt-유닛를 시험관내에서 배양시켜 포배를 얻고 대리모에게 이식시켜 정상적인 개체로 발육시킨다.
본 발명을 보다 명료하게 설명하기 위해, 다음 실시예를 들어 설명한다.
실시예 1
핵전달을 위한 핵 공여체 세포의 조제
동의하에 행해진 수술에서 얻어진 포피 조직을 다져서 PBS로 세정한 다음 100 rpm에서 5분간 원심분리하고 상등액을 버렸다. 다져진 조직을 37℃에서 30분간 0.05% 트립신/0.02% EDTA (Gibco)로 분해시켰다. 세포 현탁액을 제거하고 1000 rpm에서 5분간 원심분리시켰다. 상등액을 폐기하고 90% DMEM (Gibco) + 10% FBS (Hyclon) + 50 IU/ml 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco)에서 세포 펠릿을 배양하엿다. 플레이트에 재현탁시켜서 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시키면서 배지는 3일마다갈아주었다. 세포성장이 컨플루언트해질 때까지 계대시켜 7 내지 20회째 계대 세포를 핵공여 세포로서 사용하였다 (도 1).
난모세포 조제
2.5-3kg의 성숙한 뉴질랜드 암컷 토끼에게, 100IU PMSG (i.m.) (The first bio-pharmaceutical company, Shanghai) 주사한 다음, 72시간 후에 100 IU hCG (i.v.) 주사함으로써 과배란시켰다. 예비-개스처리한 (pre-gassed) M2 용액 (Sigma)를 이용하여 hCG를 주사한지 14-16시간 후에 성숙한 난모세포를 난관으로부터 플러싱시켰다. 300 IU/ml 히알루로니다제를 함유하는 용액 내로 난모세포를 넣어 할구 세포들을 제거하였다. 해부용 렌즈로 관찰하고 입자들을 분산시킨 후 유리제 바늘로 난모세포를 집었다. 이엇 난모세포 (도 2)를 M2 용액으로 3번 세척하였다.
핵전달 공정
투명대내로의 주사:
7.5μg/ml 사이토칼라신 B (Sigma)가 첨가된 M2 배지에서 난모세포를 조작하고 인큐베이션시킨 다음, 실온에서 10분간 유지시킨 후 경사진 바늘로 핵을 제거하였다. 그 후, 핵제거된 토끼 난모세포의 난황주의의 공간 내로 단일의 공여체 섬유아세포를 넣어서 nt-유닛을 형성시켰다. 0.3M Glucose (Sigma); 0.1 mM MgCl2(Sigma); 0.05 mM CaCl2(Sigma)를 함유하는 융합 완충용액에 nt-유닛를 평형시키고 HV 120V의 1회의 직류전기 충격을 60μ초간 가하여 자극시켰다. 자극 후, nt-유닛를 DMEM 42.5% (Gibco), RPMI-1640 42.5% (Gibco), 및 15% FBS (Hyclone)으로 구성된 RD 배지에서 인큐베이션시켰다. 6-7일 후, 포배가 얻어졌다 (도 3-6, 11).
세포질내로의 주사
7.5μg/ml 사이토칼라신 B (Sigma)가 첨가된 M2 배지에서 난모세포를 인큐베이션시킨 다음, 실온에서 10분간 유지시킨 후 경사진 바늘로 핵을 제거하였다. 그 후, 핵제거된 토끼 난모세포의 세포질 내로 단일의 공여체 섬유아세포를 넣어서 nt-유닛을 형성시켰다. 많은 nt-유닛를 DMEM 42.5% (Gibco), RPMI-1640 42.5% (Gibco), 및 15% FBS (Hyclone)으로 구성된 RD 배지에서 인큐베이션시켰다. 5-7일 후, 포배가 얻어졌다 (도 7-10.
실시예 2
인간의 핵전달 배아 줄기 세포주의 수립
포배기의 nt-유닛를 상기한 바와 같이 수득하고, 투명대를 스트리핑하기 위해 포배보다 직경이 작은 유리제 바늘 (3 mm 직경의 유리제 파이프로부터 스트레치됨)을 이용하여 피펫으로 업앤드 다운시켰다. 이어서, 포배의 내부 세포 매스를 분리하고 피더층 (feeder layer)에 옮긴 다음 79% DMEM (Gibco), 20% FBS (Hyclone), 1% 비-필수 아미노산 스톡 (Gibco), 0.1 mM β-머캅토에탄올 (Gibco), 10 ng/ml LIF (R&D), 10 ng/ml bFGF (R&D) 및 10μM Forskolin (Sigma) 중에서 37℃에서 5% CO2중에서 배양하고, 이틀마다 배지 절반을 갈아주었다.
배양 2-4일 후, 세포 매스들이 피더 상에서 자라는 것으로 관찰되었다. 7-20일 후, 콜로니들이 관찰되었다 (도 12). 효소 또는 기계적 수단에 의해 콜로니들을 분산시켜 신선한 피더층을 함유하는 플레이트에 옮겼다. 20회 계대 후, ntES 세포들을 동결보존시켰다.
섬유아세포 피더층
피더 세포들을 13-14일된 마우스 배아로부터 유도시켰다. 무균 조건 하에서 배아의 머리, 간, 심장 및 식도를 제거한 후, 배아의 나머지 부분을 잘게 다져서, 0.05% 트립신/0.02% EDTA (Gibco)를 함유하는 예열시킨 용액에서 37℃ 절단시켰다. 세포 현탁액을 제거하고 1000 rpm에서 5분간 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 90% DMEM (Gibco); 10% FBS (Hyclone); 50 IU 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco), 1% 비필수 아미노산 스톡 (Gibco) 및 0.1 mM β-머캅토에탄올 (Gibco) 중에서 재현탁시킨 다음 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 3회 계대시킨 후, 피더층을 10mM 미토마이신 C (Sigma)로 3-4시간 처리한 다음 4-웰 또는 96-웰 플레이트에서 계대시켰다. 5% CO2를 함유하는 37℃의 습한 인큐베이터에서 피더층을 배양시켜 ntES 배양체 제조에 사용하였다.
실시예 3
핵형분석 (karyotyping)
10μg/ml 콜히친을 세포배지에 넣었다. 37℃에서 4시간 후, 세포들을 플레이트로부터 제거하고 세포들을 1000 rpm에서 8분간 원심분리시켰다. 상등액을 폐기하고 예열시킨 0.05M KCl 중에서 세포 펠렛을 재현탁시키고 37℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 1000 rpm에서 8분간 원심분리하고, 상등액을 폐기하고 세포 펠릿을 고정용액 (메탄올:차가운 아세트산 = 3:1)에 재현탁시킨 다음 실온에서 15분간 유지시켰다. 1000 rpm에서 8분간 원심분리시키고, 상등액을 폐기한 다음 세포 펠릿을 실온에서 15분간 고정 용액 중에서 다시 현탁시켰다. 1000 rpm에서 8분간 원심분리한 후, 세포 펠렛을 유리플레이트에 넣어서 GIEMSA로 염색시켜 핵형을 분석하였다. 그 결과 중 하나를 도 13에 나타내었다.
이제까지 특정 구체예를 들어 본 발명을 설명하였으나, 당업자라면 본 발명의 진정한 정신과 범위를 이탈함이 없이 여러가지 변화와 변형을 가할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 모든 변형은 본 발명의 상세한 설명과 첨부된 특허청구범위 내에 속하는 것이다.
Claims (15)
- 공여체의 체세포 또는 세포핵을 핵 공여체와 다른 종의 핵제거된 난모세포 내로 이식하고, 결과적인 핵전달 유닛을 배양하여 적절한 조건하에서 후기 이식전 단계까지 배양하는 것을 포함하는, 핵전달 유닛의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 핵 공여체 세포가 인간 세포이고, 바람직하게는, 배아 또는 성인 체세포이고, 더욱 바람직하게는 성인 섬유아세포인 방법.
- 제 1항에 있어서, 난모세포를 포유류 또는 양서류로부터 얻는 방법.
- 제 3항에 있어서, 난모세포를 인간으로부터 얻는 방법.
- 제 3항에 있어서, 난모세포를 토끼과, 바람직하게는 토끼로부터 얻는 방법.
- 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 난모세포가 분할기의 중기, 바람직하게는 핵분열 중기 II의 시기의 것인 방법.
- 제 1항에 있어서, 결과적인 핵전달 유닛을 실온에서 배양하거나 또는 활성화제를 사용함으로써 활성화시키는 방법.
- 제 7항에 있어서, 활성화제가 만니톨 전기융합 용액, 글루코스 전기융합 용액, 소르비톨 전기융합 용액 및 포스페이트 완충용액 중에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 글루코스 완충용액인 것인 방법.
- 제 1항에 있어서, 활성화된 핵전달 유닛을 RD 배지, M199 배지 및 DMEM 배지중에서 선택된 배지, 더욱 바람직하게는 RD 배지에서 배양시켜 2-4세포, 8-세포, 상실배, 포배 및 부화 포배기를 비롯한 다양한 이식전 단계의 핵전달 유닛을 수득하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 활성화된 핵전달 유닛을 RD 배지, M199 배지 및 DMEM 배지 중에서 선택된 배지에서 배양시켜 예컨대 과립구, 난관세포, STO 세포 (마우스 섬유아세포)와 같은 다양한 세포 종류와 함께 공-배양 시스템을 형성시켜, 2-4세포, 8-세포, 상실배, 포배 및 부화 포배기를 비롯한 다양한 이식전 단계의 핵전달 유닛을 얻는 방법.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 방법에 따라 얻어진 모든 이식전 단계의 핵전달 유닛.
- 제 11항에 있어서, 인간의 세포 또는 세포핵을 토끼과의 핵제거된 난모세포에 이식함으로써 얻어진, 모든 이식전 단계의 핵전달 유닛.
- 제 11항에 있어서, 성인 섬유아세포 또는 그의 핵을 토끼의 핵제거된 난모세포내로 이식시킴으로써 얻어진, 모든 이식전 단계의 핵전달 유닛.
- 인간 배아 줄기 세포 또는 배아 줄기-유사 세포 또는 기타 유형의 배아-유도된 줄기 세포를 제조하는데 있어서의, 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따라 얻어진 모든 이식전 단계의 핵전달 유닛의 용도.
- 치료방법 및 상업적 용도에 있어서, 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따라 얻어진 모든 이식전 단계의 핵전달 유닛의 용도.
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