ES2284197T3 - Transferencia nuclear con celulas donadoras fetales y adultas diferenciadas. - Google Patents
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Abstract
Un método para clonar un mamífero bovino, que comprende: (i) insertar un fibroblasto o núcleo celular bovino diferenciado propagador deseado en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT); (ii) activar la unidad de transferencia nuclear resultante; (iii) cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa de desarrollo superior a la etapa de 2 células; y (iv) transferir dicha unidad de NT cultivada a un mamífero hospedante bovino, de tal manera que la unidad de NT desarrolle un feto.
Description
Transferencia nuclear con células donadoras
fetales y adultas diferenciadas.
La presente invención se refiere a
procedimientos de clonación en los que los núcleos celulares
derivados de células bovinas diferenciadas, fetales o de adultos,
se transplantan a oocitos bovinos enucleados. Los núcleos se
reprograman para dirigir el desarrollo de embriones clonados, que a
continuación pueden ser transferidos a hembras receptoras para
producir fetos y descendencia, o se usan para producir células de la
masa celular interna cultivada (en lo sucesivo abreviadamente CICM,
por la expresión inglesa Cultured Inner Cell Mass). Los
embriones clonados también pueden combinarse con embriones
fertilizados para producir embriones quiméricos, fetos y/o
descendencia.
Son muy conocidos los métodos para obtener in
vitro líneas de células madre embrionarias (en lo sucesivo
abreviadamente ES, por la expresión inglesa Embryonic Stem)
a partir de embriones de ratón en la fase de preimplantación
temprana (Véase, por ejemplo, Evans et al., Nature,
29:154-156 (1981); Martin, Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 78:7634-7638 (1981)). Las células ES
pueden ser sometidas a pases en un estado no diferenciado, siempre
que esté presente una capa alimentadora de fibroblastos (Evans et
al., Id.) o una fuente inhibidora de la diferenciación (Smith
et al., Dev. Biol.; 121:1-9
(1987)).
Previamente se ha descrito que las células ES
poseían numerosas aplicaciones. Por ejemplo, se sabe que las
células ES pueden usarse como modelo in vitro para
diferenciación, especialmente para el estudio de genes que están
implicados en la regulación del desarrollo temprano. Las células ES
de ratón pueden dar lugar a quimeras de línea germinal cuando se
introducen en embriones de ratones en la fase de preimplantación,
demostrando así su pluripotencia (Bradley et al.,
Nature, 309:255-256 (1984)).
Debido a su capacidad para transferir su genoma
a la siguiente generación, las células ES tienen utilidad potencial
para la manipulación de la línea germinal de ganado usando células
ES con o sin modificación genética deseada. Además, en el caso del
ganado, por ejemplo, de los ungulados, los núcleos de embriones de
ganado similares en la fase de preimplantación mantienen hasta el
final el desarrollo de los oocitos enucleados (Smith et al.,
Biol. Reprod., 40:1027-1035 (1989); y Keefer
et al., Biol. eprod., 50:935-939 (1994)).
Estos está en contraste con los núcleos de embriones de ratón, que
más allá de la etapa de ocho células después de la transferencia no
apoyan, según se informa, el desarrollo de oocitos enucleados
(Cheong et al Biol. Reprod.,, 48:958 (1993)). Por
consiguiente, las células ES del ganado son muy deseables debido a
que proporcionan una fuente potencial de núcleos donantes
totipotentes, manipuladas genéticamente o de otra forma, para
procedimientos de transferencia nuclear.
Algunos grupos de investigación han descrito el
aislamiento de líneas celulares embrionarias aparentemente
pluripotentes. Por ejemplo, Notarianni et al., J. Reprod.
Fert. Suppl., 43:255-260 (1991), describen el
establecimiento de líneas celulares pluripotentes, aparentemente
estables de cerdo y blastocistos de oveja que presentan algunas
características morfológicas y de crecimiento similares a las de las
células en cultivos primarios de la masa celular interna aisladas
inmunoquirúrgicamente de blastocistos de oveja. También, Notarianni
et al., J. Reprod. Fert. Suppl.,
41:51-56 (1990) describen el mantenimiento y
diferenciación en el cultivo de supuestas líneas celulares
embrionarias pluripotentes de blastocistos de cerdo. Gerfen et
al., Anim. Biotech, 6(1):1-14 (1995)
describen el aislamiento de líneas celulares embrionarias de
blastocistos porcinos. Estas células se mantienen establemente en
capas alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón sin el uso
de medio acondicionado y se ha descrito que durante el cultivo se
diferencian en diversos tipos de células diferentes.
Además, Saito et al., Roux's Arch. Dev.
Biol., 201:134-141 (1992) describen líneas
celulares similares a citoblastos embrionarias bovinas que
sobreviven tres pases, pero que se perdieron después del cuarto
pase. Handyside et al., Roux's Arch. Dev. Biol.,
196:185-190 (1987) describen el cultivo de masas
celulares internas aisladas inmunoquirúrgicamente de embriones de
oveja en condiciones que permitan el aislamiento de líneas de
células ES de ratón procedentes de la ICM de ratón. Handyside et
al. describen que en dichas condiciones, las ICM de oveja
atacan, se extienden y desarrollan áreas de células tanto similares
a las células ES como al endodermo, pero que después de cultivo
prolongado sólo son evidentes las células similares al
endodermo.
Recientemente, Cherny et al., Theriogenology,
41:175 (1994) describieron líneas celulares derivadas de células
germinativas primordiales de bovino aparentemente pluripotentes
mantenidas en cultivo a largo plazo. Estas células, después de
aproximadamente siete días de cultivo, produjeron colonias similares
a células ES que se teñían positivamente con fosfatasa alcalina
(AP), presentaban la capacidad de formar cuerpos embrioides y
diferenciarse espontáneamente en al menos dos tipos de células
diferentes. Estas células se cree que también expresan el mRNA para
los factores de trascripción OCT4, OCT6 y HES1, un modelo de genes
de homeosecuencia que se cree que son expresados exclusivamente por
células ES.
También recientemente, Campbell et al.,
Nature, 380:64-68 (1996) describieron la
producción de corderos vivos por transferencia nuclear de las
células del disco embrionario (ED) de embriones ovinos de nueve días
cultivados en condiciones que promueven el aislamiento de líneas de
células ES en el ratón. Los autores llegaron a la conclusión de que
las células ED de embriones ovinos de nueve días son totipotentes
por transferencia nuclear y que su totipotencia se mantiene en el
cultivo.
Van Stekelenburg-Hamers et
al., Mol. Reprod. Dev., 40:444-454 (1995),
describieron el aislamiento y la caracterización de líneas
celulares supuestamente permanentes procedentes de células de la
masa celular interna de blastocistos bovinos. Los autores aislaron
y cultivaron la masa celular interna (en lo sucesivo abreviadamente
ICM, por la expresión inglesa Inner Cell Mass) de
blastocistos bovinos de 8ó 9 días en diferentes condiciones para
determinar que células alimentadoras y medios de cultivo apoyan más
eficazmente la unión y producción de células de la ICM bovina.
Llegaron a la conclusión de que la unión y producción de las células
cultivadas de la ICM se mejora por el uso de células alimentadoras
(fibroblasto de ratón) STO (en lugar de células epiteliales de
útero bovino) y por el uso de suero tratado con carbón (en lugar de
suero normal) para complementar el medio de cultivo. Van
Stekelenburg et al. describieron, sin embargo, que sus líneas
celulares parecían células epiteliales más que células
pluripotentes de la ICM.
Smith et al., en el documento WO
94/24274, publicado el 27 de Octubre de 1994, Evans et al.,
en el documento WO 90/03432, publicado el 5 de Abril de 1990 y
Wheeler et al., en el documento WO 94/26889, publicado el 24
de Noviembre de 1994, describen el aislamiento, la selección y
propagación de células madre de animales que aparentemente pueden
usarse para obtener animales transgénicos. Evans et al.
describieron también la derivación de células madre embrionarias
aparentemente pluripotentes de especies porcinas y bovinas que se
supone son útiles para la producción de animales transgénicos.
Además, Wheeler et al., en el documento WO 94/26884,
publicado el 24 de Noviembre de 1994, describieron células madre
embrionarias que se supone son útiles para la fabricación de
ungulados quiméricos y transgénicos.
De este modo, basándose en lo anterior, es
evidente que muchos grupos han intentado producir líneas de células
ES, por ejemplo, debido a su aplicación potencial en la producción
de embriones clonados o transgénicos y en el transplante
nuclear.
También se ha descrito el uso de células de la
masa celular interna (ICM) de ungulados para el transplante
nuclear. Por ejemplo, Collas et al., Mol. Reprod.
Dev., 38:264-267 (1994) describe el transplante
nuclear de las ICM bovinas por microinyección de las células
donantes lisadas en oocitos maduros enucleados. Collas et
al. describieron el cultivo in vitro de embriones durante
siete días produciendo quince blastocistos que, por transferencia a
receptores bovinos, dieron como resultado cuatro embarazos y dos
nacimientos. También, Keefer et al., Biol. Reprod.,
50:935-939(1994), describieron el uso
de células de la ICM bovinas como núcleos donantes en
procedimientos de transferencia nuclear, para producir blastocistos
que, por transplante a receptores bovinos, dieron como resultado
diversa descendencia viva. Además, Sims et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993),
describieron la producción de terneros por transferencia de núcleos
procedentes de células de la ICM bovinas cultivadas in vitro
a corto plazo en oocitos maduros enucleados.
También se ha descrito la producción de corderos
vivos por transferencia nuclear de células del disco embrionario
cultivadas (Campbell et al., Nature,
380:64-68(1996)). Aún más, se ha descrito el
uso de células embrionarias pluripotentes bovinas en la
transferencia nuclear y la producción de fetos quiméricos (Stice
et al., Biol. Reprod., 54:100-110 (1996);
Collas et al, Mol. Reprod. Dev.,
38:264-267 (1994)). Collas et al. demostraron
que podrían usarse células de la granulosa (células adultas) en un
proceso de clonación de bovinos para producir embriones. Sin
embargo, no se demostró el desarrollo más allá de las etapas
embrionarias tempranas (etapa de blastocisto). Por otra parte, las
células de la granulosa no se cultivan fácilmente y se obtienen sólo
a partir de las hembras. Collas et al. no intentaron
propagar las células de la granulosa en cultivo ni intentaron
modificar genéticamente dichas células.
Aunque son posibles las multiplicaciones de
genotipos con células embrionarias como donantes, los métodos
actuales plantean algunos problemas. Por ejemplo, por los métodos
actuales, la clonación del embrión sólo puede realizarse con un
número limitado de núcleos donantes embrionarios (menos de 100) o
con líneas celulares in vitro. Se desconoce si el genoma
embrionario codifica un genotipo superior hasta que el animal
clonado se hace adulto.
También se plantean problemas en el área de
producción de mamíferos transgénicos. Por los métodos actuales, se
introduce DNA heterólogo en embriones tempranos o líneas celulares
embrionarias que se diferencian en diversos tipos de células en el
feto y finalmente se desarrollan en un animal transgénico. Sin
embargo, se requieren muchos embriones tempranos para producir un
animal transgénico y, por lo tanto, este proceso es muy poco eficaz.
Tampoco hay ningún método sencillo y eficaz para seleccionar un
embrión transgénico antes de que transcurra el tiempo y aumente el
gasto para colocar los embriones en las hembras receptoras. Además,
las técnicas de direccionamiento a genes específicos no pueden
realizarse fácilmente con procesos transgénicos de embriones
tempranos.
Las células madre embrionarias en ratones han
permitido a los investigadores seleccionar células transgénicas y
realizar procesos de direccionamiento a genes. Esto permite aplicar
más ingeniería genética que la que es posible con otras técnicas
transgénicas. Sin embargo, las líneas de células madre embrionarias
y otras líneas celulares embrionarias deben mantenerse en un estado
no diferenciado lo que requiere capas alimentadoras y/o la adición
de citoquinas a los medios. Incluso aunque se tomen estas
precauciones, estas células experimentan con frecuencia una
diferenciación espontánea y no pueden emplearse para producir
descendencia transgénica por los métodos actualmente disponibles.
Además, algunas líneas celulares embrionarias han de ser propagadas
de modo que no conduzcan a procesos de direccionamiento a genes.
No obstante, a pesar de lo que se ha descrito en
la bibliografía, se necesitan métodos mejorados de clonación de
células de mamíferos.
Un objeto de la invención es proporcionar
métodos nuevos y mejorados para producir células bovinas
clonadas.
Un objeto más específico de la invención es
proporcionar un nuevo método para clonar células bovinas que implica
el transplante del núcleo de una célula bovina diferenciada
propagadora en un oocito enucleado de la misma especie.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
método para multiplicar mamíferos bovinos adultos que hayan
demostrado una superioridad genética u otros rasgos deseables.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
método mejorado para producir mamíferos bovinos transformados por
ingeniería genética o transgénicos (es decir, embriones, fetos,
descendencia).
Un objeto más específico de la invención es
proporcionar un método para producir mamíferos bovinos transformados
por ingeniería genética o transgénicos por el que se inserta,
elimina o modifica un gen deseado en un fibroblasto bovino
diferenciado o un núcleo celular antes del uso de dicho fibroblasto
bovino o núcleo celular para la formación de una unidad de
transferencia nuclear (en lo sucesivo abreviadamente NT, por la
expresión inglesa Nuclear Transfer).
Otro objeto de la invención es proporcionar
mamíferos bovinos transformados por ingeniería genética o
transgénicos (es decir, embriones, fetos, descendencia) obtenidos
por transplante del núcleo de un fibroblasto bovino diferenciado
propagador en un oocito enucleado de la misma especie como la célula
diferenciada.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
nuevo método para producir células de la CICM de mamífero que
implica el transplante de un núcleo de un fibroblasto bovino
diferenciado propagador en un oocito enucleado de la misma especie
como la célula diferenciada.
Otro objeto de la invención es proporcionar
células de la CICM producidas por transplante del núcleo de un
fibroblasto bovino diferenciado propagador a un oocito enucleado de
la misma especie como la célula diferenciada.
Otro objeto de la invención es usar dichas
células de la CICM para terapia o diagnosis.
Un objeto específico de la invención es usar
dichas células de la CICM para tratamiento o diagnosis de cualquier
enfermedad en la que el transplante de células, tejidos u órganos
sea terapéuticamente o diagnósticamente beneficioso. Las células de
la CICM pueden usarse en la misma especie o en otras especies.
Otro objeto de la invención es usar tejidos
procedentes de embriones, fetos o descendencia de NT para el
tratamiento o diagnosis de cualquier enfermedad en la que el
transplante de células, tejidos u órganos sea terapéuticamente o
diagnósticamente beneficioso. Los tejidos pueden usarse en la misma
especie o en otras especies.
Otro objeto específico de la invención es usar
las células de la CICM producidas de acuerdo con la invención para
la producción de células, tejidos u órganos diferenciados.
Otro objeto específico de la invención es usar
in vitro las células de la CICM producidas de acuerdo con la
invención, por ejemplo para el estudio de la diferenciación celular
y para ensayos, por ejemplo para estudios de fármacos.
Otro objeto de la invención es usar las células,
tejidos u órganos isogénicos o singénicos obtenidos de las células
de la CICM producidas de acuerdo con la invención en métodos
mejorados de terapia de transplante. Dichas terapias incluyen, como
ejemplo, tratamiento de enfermedades y lesiones que incluyen las
enfermedades de Parkinson, Huntington, Alzheimer, ALS, lesiones de
la médula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular,
diabetes, enfermedades hepáticas, enfermedades cardiacas,
sustitución de cartílagos, quemaduras, enfermedades vasculares,
enfermedades del tracto urinario, así como para el tratamiento de
defectos inmunes, transplante de médula ósea, cáncer, entre otras
enfermedades.
Otro objeto de la invención es proporcionar
células de la CICM transformadas por ingeniera genética o
transgénicas producidas insertando, eliminando o modificando un gen
deseado en un fibroblasto bovino diferenciado propagador o núcleo
celular antes de usar dicha célula diferenciada o núcleo celular en
la formación de una unidad de NT.
Otro objeto de la invención es usar las células
de la CICM transformadas por ingeniería genética o transgénicas
producidas de acuerdo con la invención en terapia génica, en
particular en el tratamiento y/o prevención de las enfermedades y
lesiones antes citadas.
Otro objeto de la invención es usar las células
de la CICM producidas de acuerdo con la invención o células de la
CICM transgénicas o transformadas por ingeniería genética producidas
de acuerdo con la invención como donantes nucleares para el
transplante nuclear.
De este modo, en un aspecto, la presente
invención proporciona un método para clonar un mamífero bovino (por
ejemplo, embriones, fetos, descendencia). El método comprende:
- (i)
- insertar un fibroblasto bovino diferenciado propagador o un núcleo celular en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de NT;
- (ii)
- activar la unidad de transferencia nuclear resultante;
- (iii)
- cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa superior a la etapa de desarrollo de 2 células; y
- (iv)
- transferir dicha unidad de NT cultivada a un mamífero hospedante bovino, tal que la unidad de NT se desarrolle en un feto.
Las células, tejidos y/u órganos del feto se
usan ventajosamente en la zona del transplante de células, tejidos
y/u órganos.
La presente invención incluye también un método
de clonación de un mamífero transformado por ingeniería genética o
transgénico, por el que se inserta, elimina o modifica un gen
deseado en el fibroblasto bovino diferenciado o núcleo celular antes
de la inserción de la célula de mamífero diferenciada o núcleo
celular en el oocito enucleado.
La presente invención también proporciona
mamíferos obtenidos de acuerdo con el método anterior y la
descendencia de dichos mamíferos.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método para producir células de la CICM bovina. El
método comprende:
- (i)
- insertar un fibroblasto bovino diferenciado propagador o un núcleo celular en un oocito bovino, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT);
- (ii)
- activar la unidad de transferencia nuclear resultante;
- (iii)
- cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa superior a la etapa de desarrollo de 2 células; y
- (iv)
- cultivar células obtenidas de dicha unidad de NT cultivada para obtener células de la CICM bovinas.
Las células de la CICM se usan ventajosamente en
la zona del transplante de células, tejidos y órganos.
De acuerdo con lo antes expuesto y otros
objetos, ventajas y aspectos de la invención que serán evidentes de
aquí en adelante, la naturaleza de la invención puede comprenderse
más claramente con referencia a la siguiente descripción detallada
de las realizaciones preferidas de la invención y a las
reivindicaciones que se acompañan.
La presente invención proporciona procedimientos
mejorados para clonar mamíferos bovinos por transferencia nuclear o
transplante nuclear. En la presente solicitud de patente, se usa de
forma intercambiable transferencia nuclear o transplante nuclear o
NT.
De acuerdo con la invención, los núcleos
celulares derivados de fibroblastos bovinos, fetales o de adultos,
diferenciados propagadores se transplantan a oocitos de mamíferos
enucleados de la misma especie que la de los núcleos donantes. Los
núcleos se reprograman para dirigir el desarrollo de los embriones
clonados, que a continuación pueden ser transferidos a hembras
receptoras para producir fetos y descendencia, o ser usados para
producir células de la CICM. Los embriones clonados pueden
combinarse también con embriones no humanos fertilizados para
producir embriones, fetos y/o descendencia quiméricos.
Los métodos de la técnica anterior han usado
tipos de células embrionarias en procedimientos de clonación. Estos
incluyen el trabajo de Campbell et al., (Nature,
380:64-68, 1996)y Stice et al.,
(Biol. Reprod., 54:100-110, 1996). En
ambos estudios, las líneas celulares embrionarias se obtuvieron de
embriones de menos de 10 días de gestación. En ambos estudios, se
mantuvieron las células sobre una capa alimentadora para evitar una
clara diferenciación de la célula donante que se va a usar en el
procedimiento de clonación. La presente invención usa células
diferenciadas.
No se esperaba que los embriones clonados con
núcleos donantes diferenciados pudieran desarrollarse hasta etapas
embrionarias y fetales avanzadas. El dogma científico ha sido que
sólo los tipos de células embrionarias o no diferenciadas podían
dirigir este tipo de desarrollo. No se esperaba que pudiera ser
producido un gran número de embriones clonados a partir de estos
tipos de células diferenciadas. Tampoco se esperaba el hecho de que
pudieran obtenerse fácilmente nuevas líneas celulares embrionarias
transgénicas a partir de embriones clonados transgénicos.
De este modo, de acuerdo con la presente
invención, es posible la multiplicación de genotipos superiores de
mamíferos bovinos. Esto permitirá la multiplicación de animales
adultos con superioridad genética demostrada u otros rasgos
deseables. Se acelerará el progreso, por ejemplo, en muchas especies
importantes de ungulados. Por la presente invención, existen
potencialmente mil millones de células fetales o de adultos que
pueden recogerse y usarse en el procedimiento de clonación. Esto
dará potencialmente como resultado un gran número de descendencia
idéntica en un corto periodo de tiempo.
La presente invención permite también la
simplificación de los procedimientos transgénicos trabajando con
una fuente celular diferenciada que puede ser propagada clonalmente.
Esto elimina la necesidad de mantener las células en un estado no
diferenciado, y de este modo, realizar más fácilmente las
modificaciones genéticas, tanto la integración aleatoria como el
direccionamiento a genes. También, combinando la transferencia
nuclear con la capacidad de modificar y seleccionar estas células
in vitro, este procedimiento es más eficaz que las técnicas
anteriores con embriones transgénicos. De acuerdo con la presente
invención, estas células pueden propagarse clonalmente sin
citoquinas, medios acondicionados y/o capas alimentadoras,
simplificando y facilitando más el procedimiento transgénico.
Cuando en los procedimientos de acuerdo con la invención se usan
células transfectadas, se producen embriones transgénicos que
pueden desarrollarse en los fetos y la descendencia. Estos
embriones clonados transgénicos también pueden usarse para producir
líneas celulares de la CICM u otras líneas celulares embrionarias.
Por consiguiente, la presente invención elimina la necesidad de
obtener y mantener in vitro una línea celular no
diferenciada que es apropiada para las técnicas de ingeniería
genética.
La presente invención también puede aplicarse
para producir células de la CICM, fetos o descendencia que pueden
usarse, por ejemplo, en el transplante de células, tejidos y
órganos. Tomando una célula fetal o de adulto de un animal y
usándola en el procedimiento de clonación, pueden obtenerse una
variedad de células, tejidos y posiblemente órganos a partir de
fetos clonados como los desarrollados por organogénesis. También
pueden aislarse células, tejidos y órganos de la descendencia
clonada. Este proceso puede proporcionar una fuente de
"materiales" para muchas terapias médicas y veterinarias
incluyendo la terapia celular y génica. Si las células se vuelven a
transferir al animal del que proceden, se evita el rechazo
inmunológico. Además, debido a que de estos clones pueden aislarse
muchos tipos de células, pueden aplicarse otras metodologías, tales
como quimerismo hematopoyético, para evitar el rechazo inmunológico
entre animales de la misma especie así como entre diferentes
especies.
De este modo, en un aspecto, la presente
invención proporciona un método para clonar un mamífero bovino. En
general, el mamífero bovino se obtendrá por un proceso de
transferencia nuclear que comprende las siguientes etapas:
- (i)
- obtener fibroblastos bovinos diferenciados propagadores deseados para ser usados como fuente de núcleos donantes;
- (ii)
- obtener oocitos a partir de un mamífero de la misma especie como las células que son la fuente de los núcleos donadores;
- (iii)
- enuclear dichos oocitos;
- (iv)
- transferir la célula diferenciada o el núcleo celular deseados al oocito enucleado, por ejemplo por fusión o inyección, para formar unidades de NT;
- (v)
- activar las unidades de NT resultantes;
- (vi)
- cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa superior a la etapa de desarrollo de 2 células; y
- (vii)
- transferir dicha unidad de NT cultivada a un mamífero hospedante bovino, tal que la unidad de NT desarrolle un feto.
La presente invención incluye también un método
para clonar un mamífero bovino transgénico o transformado por
ingeniería genética, por el que se inserta, elimina o modifica un
gen deseado en el fibroblasto bovino diferenciado o un núcleo
celular antes de la inserción del fibroblasto bovino diferenciado o
el núcleo celular en el oocito enucleado.
La presente invención también proporciona
mamíferos bovinos obtenidos de acuerdo con el método anterior y la
descendencia de dichos mamíferos.
La presente invención proporciona además el uso
de fetos de NT y descendencia de NT y quimérica en el campo de
transplantes de células, tejidos y órganos.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método para producir células de la CICM bovinas. El
método comprende:
- (i)
- insertar un fibroblasto bovino diferenciado propagador deseado o un núcleo celular en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT);
- (ii)
- activar la unidad de transferencia nuclear resultante;
- (iii)
- cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa superior a la etapa de desarrollo de 2 células; y
- (iv)
- cultivar las células obtenidas a partir de dicha unidad de NT cultivada para obtener las células de la CICM bovinas.
Las células de la CICM se usan ventajosamente en
el campo de transplantes de células, tejidos y órganos, o en la
producción de fetos o descendencia, incluyendo fetos o descendencia
transgénicos.
Preferiblemente, las unidades de NT se
cultivarán hasta un tamaño de al menos 2 a 400 células,
preferiblemente de 4 a 128 células, y más preferiblemente hasta un
tamaño de al menos aproximadamente 50 células.
Las técnicas de transferencia nuclear o las
técnicas de transplante nuclear son conocidas en la bibliografía y
están descritas en muchas de las referencias citadas en el
Fundamento de la invención. Véanse, en particular, Campbell et
al., Theriogenology, 43:181 (1995); Collas et al.,
Mol. Report Dev., 38:264-267(1994);
Keefer et al., Biol. Reprod.,
50:935-939(1994); Sims et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993); WO
94/26884; WO 94/24274 y WO 90/03432, que se incorporan en su
totalidad en la presente memoria como referencia. También las
Patentes de EE.UU. N^{os} 4.944.384 y 5.057.420 describen
procedimientos para el transplante nuclear bovino.
Las células de mamífero diferenciadas son las
células que han pasado la etapa embrionaria temprana. Más
particularmente, las células diferenciadas son aquellas que al
menos han pasado la etapa de disco embrionario (día 10 de la
embriogénesis bovina). Las células diferenciadas pueden obtenerse
del ectodermo, mesodermo o endodermo.
Los fibroblastos pueden obtenerse por métodos
muy conocidos.
Los fibroblastos son un tipo de células ideales
debido a que pueden obtenerse en grandes cantidades desarrollando
fetos y animales adultos. Los fibroblastos están algo diferenciados
y, por consiguientes, antes se consideraban un tipo de células no
adecuada para usar en los procesos de clonación. En gran medida,
estas células pueden propagarse fácilmente in vitro en el
doble de tiempo y pueden propagarse clonalmente para uso en procesos
de direccionamiento a genes. De nuevo la presente invención
presenta la novedad de usar tipos de células diferenciadas. La
presente invención es ventajosa debido a que las células pueden
propagarse, modificarse genéticamente y seleccionarse in
vitro
fácilmente.
fácilmente.
Los oocitos se obtendrán de animales
bovinos.
Los métodos para aislar los oocitos son muy
conocidos en la técnica. Esencialmente, comprenderán aislar oocitos
de los ovarios o tracto reproductor de un animal bovino. Una fuente
fácilmente disponible de oocitos bovinos son los materiales de los
mataderos.
Para el uso satisfactorio de técnicas tales como
la ingeniería genética, la transferencia nuclear y la clonación,
los oocitos deben madurarse generalmente in vitro antes de
que puedan usarse como células receptoras para la transferencia
nuclear, y antes que puedan ser fertilizadas por la célula
espermática para desarrollarse en un embrión. Este proceso requiere
generalmente recoger oocitos inmaduros (profase I) de ovarios
bovinos obtenidos en un matadero y madurar los oocitos en un medio
de maduración antes de fertilización o enucleación hasta que el
oocito alcanza la etapa de metafase II, que en el caso de oocitos
bovinos tiene lugar generalmente alrededor de 18-24
horas después de la aspiración. Para los fines de la presente
invención, este periodo de tiempo se conoce como "periodo de
maduración." Como se usa en la presente memoria para el cálculo
de periodos de tiempo, "aspiración" se refiere a la aspiración
del oocito inmaduro de folículos ováricos.
Adicionalmente, los oocitos en la etapa metafase
II, que han sido madurados in vivo, se han usado
satisfactoriamente en las técnicas de transferencia nuclear.
Esencialmente, los oocitos maduros en la metafase II, se extraen
quirúrgicamente de vacas o vaquillas no superovuladas o
superovuladas 35 a 48 horas después del comienzo del estro o
después de inyección de gonadotropina coriónica humana (hCG) o una
hormona similar.
Se ha descrito que la etapa de maduración del
oocito en la enucleación y transferencia nuclear es significativa
para el éxito de los métodos de NT. (Véase, por ejemplo,Prather
et al., Differentiation, 48, 1-8,
1991). En general, las prácticas de clonación de embriones de
mamífero satisfactorias utilizan el oocito en la etapa metafase II
como oocito receptor debido a que se cree que en esta etapa el
oocito puede ser o está suficientemente "activado" para tratar
el núcleo introducido como lo hace un esperma fertilizante. En
animales domésticos, y especialmente en el ganado, el periodo de
activación del oocito varía generalmente entre aproximadamente
16-52 horas, preferiblemente alrededor de
28-42 horas después de la aspiración.
Por ejemplo, los oocitos inmaduros puede lavarse
en medio de cultivo de embriones de hámster (HECM) tamponado con
HEPES como ha sido descrito por Seshagine et al., Biol.
Reprod., 40, 544-606, 1989, y a continuación
ponerse en forma de gotas en un medio de maduración que consiste en
50 microlitros de medio de cultivo tisular (en lo sucesivo
abreviadamente TCM, de la expresión inglesa Tissue Culture
Medium) 199 que contiene 10% de suero de ternero fetal que
contiene gonadotropinas apropiadas, tales como hormona luteinizante
(LH) y hormona estimulante del folículo (FSH), y estradiol bajo una
capa de parafina ligera o silicona a 39ºC.
Después de un periodo de maduración fijado, que
varía de aproximadamente 10 a 40 horas, y preferiblemente alrededor
de 16-18 horas, se enuclearán los oocitos. Antes de
la enucleación preferiblemente se separarán los oocitos y se
colocaran en HECM que contenga 1 miligramo por mililitro de
hialuronidasa antes de la retirada de las células cúmulo. Esto
puede efectuarse pipeteando repetidamente con pipetas de orificio
muy fino o mezclando brevemente con vórtice. A continuación se
seleccionan los oocitos separados con relación a los cuerpos
polares, y los oocitos que están en la metafase II seleccionados,
determinados por la presencia de cuerpos polares, se usan a
continuación para la transferencia nuclear. Sigue después la
enucleación.
La enucleación puede realizarse por métodos
conocidos, tales como los descritos en la Patente de EE.UU. Nº
4.994.384, que se incorpora en la presente memoria como referencia.
Por ejemplo, se colocan oocitos en la metafase II en HECM, que
contiene opcionalmente 7,5 microgramos por mililitro de citocalasina
B, para enucleación inmediata, o puede colocarse en un medio
adecuado, por ejemplo un medio de cultivo de embriones, tal como
CR1aa, más 10% de suero de vaca en estro, y a continuación
enuclearse más tarde, preferiblemente no más de 24 horas más tarde,
y más preferiblemente 16-18 horas más tarde.
La enucleación puede realizarse
microquirúrgicamente usando una micropipeta para extraer el cuerpo
polar y el citoplasma adyacente. A continuación pueden
seleccionarse los oocitos para identificar los que se han enucleado
satisfactoriamente. Esta selección puede efectuarse tiñendo los
oocitos con 1 microgramo por mililitro de colorante 33342 de
Hoechst en HECM, y a continuación examinando los oocitos con
irradiación ultravioleta durante menos de 10 segundos. Los oocitos
que han sido enucleados satisfactoriamente pueden colocarse a
continuación en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo, CR1aa
más 10% de suero.
En la presente invención, los oocitos receptores
serán enucleados preferiblemente en un momento que varía desde
aproximadamente 10 horas hasta aproximadamente 40 horas después de
la iniciación de la maduración in vitro, más preferiblemente
desde aproximadamente 16 horas hasta aproximadamente 24 horas
después de la iniciación de la maduración in vitro, y más
preferiblemente alrededor de 16-18 horas después de
la iniciación de la maduración in vitro.
A continuación se transferirá un único
fibroblasto bovino al espacio perivitelino del oocito bovino
enucleado usado para producir la unidad de NT. El fibroblasto
bovino y el oocito enucleado se usarán para producir las unidades
de NT de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, las células pueden fusionarse por electrofusión. La
electrofusión se realiza proporcionando un impulso de electricidad
que sea suficiente para provocar una rotura transitoria de la
membrana plasmática. Esta rotura de la membrana plasmática es muy
pequeña debido a que la membrana se reconstituye rápidamente. Por
tanto, si se induce la rotura de dos membranas adyacentes y por
reconstitución se entremezclan las bicapas lipídicas, se abrirán
pequeños canales entre las dos células. Debido a la inestabilidad
termodinámica de dicha abertura pequeña, se ampliará hasta que las
dos células sean una. Véase como referencia la Patente de EE.UU.
4.997.384 de Prather et al., (incorporada en su totalidad en
la presente memoria como referencia) para un estudio adicional de
este proceso. Puede usarse una variedad de medios de electrofusión
incluyendo, por ejemplo, sacarosa, manitol, sorbitol y solución
tampón de fosfato. La fusión también puede efectuarse con el virus
Sendai como agente fusógeno (Graham, Wister Inot. Symp.
Monogr., 9, 19, 1969).
Además, en algunos casos (por ejemplo, con
núcleos donantes pequeños) puede ser preferible inyectar el núcleo
directamente en el oocito en lugar de usar la fusión por
electroporación. Dichas técnicas están descritas por Collas y
Barnes, Mol. Reprod. Dev.,
38:264-267(1994), e incorporadas en su
totalidad en la presente memoria como referencia.
Preferiblemente, el fibroblasto bovino y el
oocito se electrofusionan en una cámara de 500 \mum por aplicación
de un impulso eléctrico de 90-120 V durante
aproximadamente 15 \mus, aproximadamente 24 horas después de la
iniciación de la maduración del oocito. Después de la fusión, las
unidades de NT fusionadas resultantes se colocan a continuación en
un medio adecuado hasta activación, por ejemplo, el medio CR1aa.
Típicamente la activación se efectuará lo más pronto posible,
típicamente antes de 24 horas, y preferiblemente antes de alrededor
de 4-9 horas.
La unidad de NT puede activarse por métodos
conocidos. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, cultivar la unidad
de NT a temperatura sub-fisiológica, esencialmente
aplicando a la unidad de NT un choque de temperatura fría o
realmente fresca. Esto puede realizarse convenientemente cultivando
la unidad de NT a la temperatura ambiente, que es fría con relación
a las condiciones fisiológicas de temperatura a la que están
expuestos normalmente los embriones.
Alternativamente, la activación puede
conseguirse por aplicación de agentes de activación conocidos. Por
ejemplo, se ha demostrado que la penetración de oocitos por el
esperma durante la fertilización activa la perfusión de los oocitos
proporcionando mayores números de embarazos viables y multiplicando
genéticamente vacas idénticas después de la transferencia nuclear.
También pueden usarse tratamientos tales como choque eléctrico y
químico para activar los embriones de NT después de la fusión. Los
métodos adecuados de activación de oocitos son el objeto de la
Patente de EE.UU. Nº 5.496.720, de Susko-Parrish
et al., incorporada en su totalidad en la presente memoria
como referencia.
Además, la activación puede efectuarse
simultánea o secuencialmente:
- (i)
- aumentando los niveles de cationes divalentes en el oocito, y
- (ii)
- reduciendo la fosforilación de las proteínas celulares en el oocito.
\global\parskip0.970000\baselineskip
Esto se efectuará generalmente introduciendo
cationes divalentes en el citoplasma del oocito, por ejemplo,
magnesio, estroncio, bario o calcio, por ejemplo en forma de un
ionóforo. Otros métodos para aumentar los niveles de cationes
divalentes incluyen el uso de choque eléctrico, tratamiento con
etanol y tratamiento con agentes quelantes enjaulados.
La fosforilación puede producirse por métodos
conocidos, por ejemplo por adición de inhibidores de quinasas, por
ejemplo inhibidores de
serina-treonina-quinasa, tales como
6-dimetil-aminopurina,
estaurosporina, 2-aminopurina y esfingosina.
Alternativamente, la fosforilación de las
proteínas celulares puede ser inhibida por introducción de una
fosfatasa en el oocito, por ejemplo, fosfatasa 2A y fosfatasa
2B.
En una realización, la activación por NT se
efectúa exponiendo brevemente la unidad de NT fusionada a un medio
TL-HEPES que contiene ionomicina 5 \muM y 1 mg/ml
de BSA, seguido por lavado en TL-HEPES que contiene
30 mg/ml de BSA aproximadamente 24 horas después de la fusión y
preferiblemente alrededor de 4 a 9 horas después de la fusión.
Las unidades de NT activadas pueden cultivarse a
continuación en un medio de cultivo in vitro adecuado hasta
la generación de células y colonias de células de la CICM. Los
medios de cultivo adecuados para cultivar y madurar los embriones
son muy conocidos en la técnica. Ejemplos de medio conocidos, que
pueden usarse para el cultivo y mantenimiento de embriones bovinos,
incluyen Ham's F-10 + 10% de suero de ternero fetal
(FCS), Medio de Cultivo Tisular -199 (TCM-199) +
10% de suero de ternero fetal,
Tirodes-Albúmina-Lactato-Piruvato
(TALP), solución salina tamponada de fosfato (PBS) de Dulbecco,
medios de Eagle y Whitten. Uno de los medios más comunes usados
para la recogida y maduración de oocitos es TCM-199
y 1 a 20% de suplemento de suero que incluye suero de ternero
fetal, suero de neonato, suero de vaca estrual, suero de cordero o
suero de novillo. Un medio de mantenimiento preferido incluye
TCM-199 con sales de Earl, 10% de suero de ternero
fetal, piruvato de Na 0,2 mM y 50 \mug/ml de sulfato de
gentamicina. Cualquiera de lo anterior puede también implicar el
cultivo conjunto con una variedad de tipos de células, tales como
células de la granulosa, células del oviducto, células BRL y células
uterinas y células STO.
Otro medio de mantenimiento está descrito en la
Patente de EE.UU. Nº 5.096.822 de Rosenkrans, Jr. et al.,
que se incorpora en la presente memoria como referencia. Este medio
de embriones, denominado CR1, contiene las sustancias nutritivas
necesarias para mantener un embrión.
El medio CR1 contiene L-lactato
de hemicalcio en cantidades que varían de 1,0 mM a 10 mM,
preferiblemente de 1,0 mM a 5,0 mM. El L-lactato de
hemicalcio es L-lactato al que se ha incorporado una
sal de hemicalcio. El uso de L-lactato de
hemicalcio es significativo porque un único componente satisface dos
requisitos importantes en el medio de cultivo: (i) el requisito del
calcio necesario para la compactación y disposición del
citoesqueleto; y (ii) el requisito del lactato para el metabolismo
y transporte de electrones. El L-lactato de
hemicalcio sirve también como mineral valioso y fuente de energía
para el medio necesario para la viabilidad de los embriones.
Ventajosamente, el medio CR1 no contiene suero,
tal como suero de ternero fetal, ni requiere el uso de un cultivo
conjunto de células animales u otros medios biológicos, es decir
medios que comprenden células animales, tales como células
oviductales. Los medios biológicos pueden ser algunas veces
desventajosos porque pueden contener microorganismos o factores
traza que pueden ser perjudiciales para los embriones y que son
difíciles de detectar, caracterizar y eliminar.
Ejemplos de los componentes principales en el
medio CR1 incluyen L-lactato de hemicalcio, cloruro
de sodio, cloruro de potasio, bicarbonato de sodio y una cantidad
menor de seroalbúmina bovina exenta de ácidos grasos (Sigma
A-6003).
Adicionalmente, puede añadirse al medio una
cantidad definida de aminoácidos esenciales y no esenciales. El CR1
con aminoácidos es conocido por la abreviatura "CR1aa."
El medio CR1 contiene preferiblemente los
siguientes componentes en las siguientes cantidades:
- cloruro de sodio
- 114,7 mM
- cloruro de potasio
- 3,1 mM
- bicarbonato sódico
- 26,2 mM
- L-lactato de hemicalcio
- 5 mM
- BSA exenta de ácidos grasos
- 3 mg/ml.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una realización, la unidad de embriones de NT
activados se colocan en un medio CR1aa que contiene DMAP 1,9 mM
durante aproximadamente 4 horas seguido por lavado en HECM y a
continuación se cultivan en CR1aa que contiene BSA.
Por ejemplo, las unidades de NT activadas pueden
ser transferidas al medio de cultivo CR1aa que contiene DMAP
(Sigma) 2,0 mM y cultivadas en condiciones ambientales, por ejemplo,
a aproximadamente 38,5ºC, 5% de CO_{2} durante un tiempo
adecuado, por ejemplo, aproximadamente de 4 a 5 horas.
A continuación, se lavan preferiblemente la
unidad o unidades de NT cultivadas y se colocan a continuación en
un medio adecuado, por ejemplo medio CR1aa que contiene 10% de FCS y
6 mg/ml contenidos en placas de pocillos que contienen
preferiblemente una capa alimentadora confluente adecuada. Las capas
alimentadoras adecuadas incluyen, como ejemplo, fibroblastos y
células epiteliales, por ejemplo fibroblastos y células epiteliales
uterinas de ungulados, fibroblastos de pollo, fibroblastos de
múridos (por ejemplo, ratón o rata), líneas celulares alimentadoras
STO y SI-m220 y células BRL.
En una realización, las células alimentadoras
comprenden fibroblastos embrionarios de ratón. La preparación de
una capa alimentadora de fibroblastos adecuada se describe en el
ejemplo siguiente y es conocida por los expertos en la técnica.
Las unidades de NT se cultivan sobre la capa
alimentadora hasta que las unidades de NT alcanzan un tamaño
adecuado para ser transferidas a una hembra receptora o para obtener
células que pueden usarse para producir células o colonias de
células de la CICM. Preferiblemente, estas unidades de NT se
cultivarán hasta al menos aproximadamente 2 a 400 células, más
preferiblemente alrededor de 4 a 128 células y más preferiblemente
al menos alrededor de 50 células. El cultivo se efectuará en
condiciones adecuadas, es decir, aproximadamente a 38,5ºC y 5% de
CO_{2}, cambiando el medio de cultivo para optimizar el
crecimiento aproximadamente cada 2-5 días,
preferiblemente cada 3 días.
Los métodos para la transferencia de embriones y
el tratamiento del animal receptor en la presente invención son los
procedimientos estándares usados en la industria de la transferencia
de embriones. Para el éxito de la presente invención son
importantes transferencias sincrónicas, es decir, la etapa del
embrión de NT está en sincronía con el ciclo estral de la hembra
receptora. Esta ventaja y cómo mantener los receptores están
revisados por Siedel, G.E., Jr. ("Critical review of embryo
transfer procedures with cattle" en Fertilization and
Embryonic Development in Vitro (1981) L. Mastroianni, Jr. y J.D.
Biggers, ed., Plenum Press, New York, NY, página 323), cuyo
contenido se incorpora en la presente memoria como referencia.
La presente invención también puede usarse para
clonar mamíferos bovinos transformados por ingeniería genética o
transgénicos. Como se ha explicado anteriormente, la presente
invención es ventajosa porque los procesos transgénicos pueden
simplificarse trabajando con una fuente celular diferenciada que
puede propagarse por clonación. En particular, las células
diferenciadas usadas para núcleos donantes tienen un gen insertado,
eliminado o modificado deseado. Las células diferenciadas
genéticamente alteradas se usan a continuación para el transplante
nuclear con oocitos enucleados.
Cualquier método conocidos para insertar,
suprimir o modificar un gen deseado a partir de una célula de
mamífero puede usarse para alterar el fibroblasto bovino
diferenciado que se usa como donante nuclear. Estos procedimientos
pueden eliminar todo el gen o parte de él, y el gen puede ser
heterólogo. Está incluida la técnica de recombinación homóloga, que
permite la inserción, supresión o modificación de un gen o genes en
un sitio o sitios específicos en el genoma celular.
La presente invención puede usarse por
consiguiente para proporcionar mamíferos adultos con genotipos
deseados. La multiplicación de bovinos adultos con superioridad
genética comprobada u otros rasgos deseables es particularmente
útil, incluyendo animales transgénicos o transformados por
ingeniería genética, y animales quiméricos. Además, las células y
los tejidos procedentes del feto de NT, incluyendo fetos
transgénicos y/o quiméricos, pueden usarse en transplante de
células, tejidos y órganos para el tratamiento de numerosas
enfermedades como las descritas a continuación con relación al uso
de células de la CICM.
Para la producción de células y líneas celulares
de la CICM, después que se obtienen las unidades de NT del tamaño
deseado, las células se retiran mecánicamente de la zona y a
continuación se usan. Esto se efectúa preferiblemente recogiendo el
grupo de células que comprende la unidad de NT, que contendrá
típicamente al menos alrededor de 50 células, lavando dichas
células y extendiendo dichas células sobre una capa alimentadora,
por ejemplo fibroblastos irradiados. Típicamente, las células usadas
para obtener las células madre o colonias de células se obtendrán
de la porción interna de la unidad de NT cultivada que tienen un
tamaño de al menos preferiblemente 50 células. Sin embargo, también
pueden usarse unidades de NT de menores o mayores números de
células así como células de otras porciones de la unidad de NT para
obtener células ES y colonias de células. Las células se mantienen
en la capa alimentadora en un medio de crecimiento adecuado, por
ejemplo, alfa-MEM complementado con 10% de FCS y
\beta-mercaptoetanol (Sigma) 0,1 mM y
L-glutamina. El medio de crecimiento se cambia tan
frecuentemente como sea necesario para optimizar el crecimiento, por
ejemplo, aproximadamente cada 2-3 días.
\newpage
Este proceso de cultivo da como resultado la
formación de células o líneas de células de la CICM. El experto en
la técnica puede variar como desee las condiciones de cultivo para
optimizar el crecimiento de las células de la CICM particular.
También, las células de la CICM bovinas transformadas por ingeniería
genética o transgénicas pueden producirse de acuerdo con la
presente invención. Es decir, los métodos antes descritos pueden
usarse para producir unidades de NT en los que se ha introducido un
gen o genes deseados o a partir de los cuales todo o parte de un
gen o genes endógenos han sido eliminados o modificados. Las
unidades de NT transformadas por ingeniería genética o transgénicas
pueden usarse a continuación para producir células de la CICM
transformadas por ingeniería genética o transgénicas.
Las células y líneas de células de la CICM
resultantes tienen numerosas aplicaciones terapéuticas y de
diagnóstico. Más especialmente, dichas células de la CICM pueden
usarse para terapias de transplantes de células. Las células de la
CICM tienen aplicación en el tratamiento de numerosos estados
morbosos. Las unidades de NT pueden también usarse tal cual en el
tratamiento de estados morbosos.
A este respecto, se sabe que las células madre
embrionarias (ES) son capaces de diferenciarse en casi cualquier
tipo de células, por ejemplo, células madre hematopoyéticas. Por
consiguiente, las células de la CICMproducidas de acuerdo con la
invención deben poseer similar capacidad de diferenciación. Las
células de la CICM de acuerdo con la invención serán inducidas a
diferenciarse para obtener los tipos de células deseados de acuerdo
con los métodos conocidos. Por ejemplo, las células de la CICM
objeto pueden ser inducidas a diferenciarse en células madre
hematopoyéticas, células de músculos, células del músculo cardíaco,
células hepáticas, células de cartílagos, células epiteliales,
células del tacto urinario, etc., cultivando dichas células en un
medio de diferenciación y en condiciones que proporcionen la
diferenciación celular. El medio y los métodos que dan como
resultado la diferenciación de las células de la CICM son conocidas
en la técnica así como las condiciones de cultivo adecuadas.
Por ejemplo, Palacios et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 92:7530-7537 (1995)
describen la producción de células madre hematopoyéticas a partir
de una línea de células embrionarias sometiendo las células madre a
un procedimiento de inducción que comprende cultivar inicialmente
agregados de dichas células en un medio de cultivo en suspensión
que carece de ácido retinoico seguido por el cultivo en el mismo
medio que contiene ácido retinoico, seguido por transferencia de
agregados celulares a un sustrato que proporciona la unión
celular.
Por otra parte, Pedersen, J. Reprod. Fertil.
Dev., 6:543-552 (1994) en un artículo de
recapitulación hace referencia a numerosos artículos que describen
métodos para la diferenciación in vitro de células madre
embrionarias que producen diversos tipos de células diferenciadas
que incluyen células hematopoyética, células de los músculos,
células del músculo cardiaco, células nerviosas entre otras.
Además, Bain et al., Dev. Biol.,
168:342-357 (1995) describen la diferenciación in
vitro de células madre embrionarias produciendo células
neurales que poseen propiedades neuronales. Estas referencias son
ilustrativas de los métodos estudiados para obtener células
diferenciadas de las células madre embrionarias. Estas referencias
y en particular las descripciones que se refieren a métodos para
diferenciar las células madre embrionarias se incorporan en la
presente memoria en su totalidad como referencia.
De este modo, usando métodos y medios de
cultivos conocidos, un experto en la técnica puede cultivar las
células de la CICM objeto de la invención, incluyendo células de la
CICM transformadas por ingeniería genética o transgénicas, para
obtener tipos de células diferenciadas deseadas, por ejemplo,
células neurales, células de los músculos, células hematopoyéticas,
etc.
Las células de la CICM objeto de la invención
pueden usarse para obtener cualquier tipo de células diferenciadas
deseadas. Los usos terapéuticos de dichas células diferenciadas no
son paralelos. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas
pueden usarse en tratamientos médicos que requieran transplante de
médula ósea. Dichos procedimientos se usan para tratar muchas
enfermedades, por ejemplo, cánceres en estado tardío, tales como
cáncer de ovario y leucemia, así como enfermedades que comprometen
el sistema inmune, tal como el SIDA. Las células madre
hematopoyéticas pueden obtenerse, por ejemplo, fusionando células
somáticas adultas de un paciente con cáncer o SIDA, por ejemplo
células epiteliales o linfocitos con un oocito enucleado, obteniendo
células de la CICM como se ha descrito antes, y cultivando dichas
células en condiciones que favorezcan la diferenciación, hasta que
se obtienen células madre hematopoyéticas. Dichas células
hematopoyéticas pueden usarse en el tratamiento de enfermedades
como el cáncer y el SIDA.
Alternativamente, las células somáticas adultas
de un paciente con un trastorno neurológico pueden fusionarse con
un oocito enucleado, obteniendo células de la CICM, y dichas células
pueden cultivarse en condiciones de diferenciación para producir
líneas celulares neurales. Las enfermedades específicas tratables
por transplante de dichas células neurales humanas incluyen, como
ejemplo, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer,
ALS y parálisis cerebral infantil, entre otras. En el caso
específico de la enfermedad de Parkinson, se ha demostrado que las
células neurales de cerebro fetal transplantadas realizan las
conexiones apropiadas con las células circundantes y producen
domapina. Esto puede dar como resultado la reversión a largo plazo
de los síntomas de la enfermedad de Parkinson.
La mayor ventaja de la presente invención es que
proporciona un suministro esencialmente ilimitado de células
isógenas o singénicas humanas adecuadas para transplante. Por
consiguiente, se evitará el importante problema asociado con los
métodos de transplante actuales, es decir el rechazo del tejido
transplantado que puede plantearse debido al rechazo del hospedante
frente al injerto o del injerto frente al hospedante.
Tradicionalmente, el rechazo se evita o reduce por la
administración de fármacos anti-rechazo, tal como
ciclosporina. Sin embargo, dichos fármacos presentan efectos
secundarios adversos importantes, por ejemplo inmunodepresión,
propiedades carcinógenas, así como el hecho de ser muy caros. La
presente invención debe eliminar, o al menos reducir en gran parte,
la necesidad de fármacos anti-rechazo.
Otras enfermedades y estados tratables por
terapia con células isógenas incluye, como ejemplo, lesiones de la
médula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular, diabetes,
enfermedades hepáticas, es decir, hipercolesterolemia, enfermedades
cardiacas, sustitución de cartílagos, quemaduras, úlceras de pie,
enfermedades gastrointestinales, enfermedades vasculares,
enfermedades nefríticas, enfermedades del tracto urinario y
enfermedades y estados relacionados con el envejecimiento.
Esta metodología puede usarse para sustituir
genes defectuosos, por ejemplo, genes defectuosos del sistema
inmune, genes de fibrosis quística, o para introducir genes que den
como resultado la expresión de proteínas terapéuticamente
beneficiosas, tales como factores del crecimiento, linfoquinas,
citoquinas, enzimas, etc. Por ejemplo, el gen que codifica el
factor del crecimiento derivado del cerebro puede introducirse en
células humanas de la CICM, diferenciarse las células en células
neurales y transplantarse estas células a un paciente con
enfermedad de Parkinson para retardar la perdida de células neurales
durante dicha enfermedad.
Anteriormente, los tipos de células
transfectadas con BDNF variaban desde las células primarias hasta
las líneas de células inmortalizadas, células derivadas neurales o
no neurales (mioblasto y fibroblasto). Por ejemplo, ya se habían
transfectado astrocitos con el gen del BDNF usando vectores
retrovirales, y las células se habían injertado en un modelo de
rata con la enfermedad de Parkinson (Yoshimoto et al.,
Brain Research, 691:25-36, (1995)).
Esta terapia ex vivo redujo hasta un 45%
los síntomas similares a la enfermedad de Parkinson en las ratas 32
días después de la transferencia. También, el gen de la
tirosina-hidroxilasa ha sido colocado en astrocitos
con resultados similares (Lundberg et al., Develop.
Neurol., 139:39-53 (1996) y citados en la
presente memoria como referencia).
Sin embargo, dichos sistemas ex vivo
plantean algunos problemas. En particular, los vectores retrovirales
usados actualmente son regulados por disminución in vivo y
el transgen es sólo expresado transitoriamente (revisado por
Mulligan, Science, 260:926-932(1993)).
También, dichos estudios usaron células primarias, astrocitos, que
tienen una vida útil finita y se replican lentamente. Dichas
propiedades afectan adversamente a la velocidad de transfección e
impiden la selección de células transfectadas establemente. Por otra
parte, es casi imposible propagar una gran población de células
primarias con un gen diana para utilizar en técnicas de
recombinación homólogas. En contraste, las dificultades asociadas a
sistemas retrovirales deben eliminarse por el uso de células de la
CICM de mamífero.
Los genes que pueden introducirse en las células
de la CICM objeto del invento incluyen, como ejemplo, factor de
crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos
básico, factor de crecimiento neutrófico derivado de células
gliales, factor de crecimiento similar a la insulina (I y II),
neurotrofina-3, neurotrofina-4/5,
factor neutrófico ciliar, AFT-1, genes de las
citoquinas (interleuquinas, interferones, factores estimuladores de
colonias, factores de necrosis tumoral (alfa y beta), etc.), genes
que codifican enzimas terapéuticas, etc.
Además del uso de las células de la CICM en el
transplante de células, tejidos y órganos, la presente invención
incluye también el uso de células bovinas en el tratamiento de
enfermedades humanas. De este modo, las células de la CICM, los
fetos de NT y la descendencia de NT y quimérica (transgénica o no
transgénica) de especies bovinas puede usarse en el tratamiento de
estados morbosos humanos en los que está justificado el transplante
de células, tejidos u órganos. En general, las células de la CICM,
los fetos y la descendencia de acuerdo con la presente invención
pueden usarse en la misma especie (autóloga, sinérgica o
aloinjertos) o en otras especies distintas (xenoinjertos). Por
ejemplo, las células del cerebro de fetos de NT bovinos puede usarse
para tratar la enfermedad de Parkinson.
Además, las células de la CICM objeto de la
invención pueden usarse como modelo in vitro de
diferenciación, en particular para el estudio de genes que están
implicados en la regulación de un desarrollo temprano. También, los
tejidos y órganos con células diferenciadas que utilizan las células
de la CICM objeto de la invención pueden usarse en estudios de
fármacos.
Además, las células de la CICM pueden usarse
como donantes nucleares para la producción de otras células y
colonias de células de la CICM.
Con el fin de describir más claramente la
presente invención, se proporcionan los siguientes Ejemplos.
Se obtuvieron cultivos primarios de fibroblastos
bovinos y porcinos de fetos (45 días de embarazo para los fetos de
ganado y 35 días para los fetos de cerdo). Se extrajeron
asépticamente la cabeza, el hígado, el corazón y el tracto
alimentario, los fetos se desmenuzaron e incubaron durante 30
minutos a 37ºC en solución de tripsina-EDTA (0,05%
de tripsina/0,02% de EDTA; GIBCO, Grand Island, NY). Los
fibroblastos se extendieron sobre cápsulas de cultivos tisulares y
se cultivaron en el medio alfa-MEM (BioWhittaker,
Walkersville, MD) complementado con 10% de suero de ternero fetal
(FCS) (Hyclone, Logen, UT), penicilina (100 U.I./ml) y
estreptomicina (50 \mul/ml). Los fibroblastos se dejaron crecer y
se mantuvieron en una atmósfera humidificada de aire con 5% de
CO_{2} a 37ºC.
Se aislaron fibroblastos adultos del pulmón de
una vaca (de aproximadamente cinco años). El tejido de pulmón
desmenuzado se incubó durante la noche a 10ºC en solución de
tripsina-EDTA (0,05% de tripsina/0,02% de EDTA;
GIBCO, Grand Island, NY). El tejido recogido al día siguiente y las
células separadas se incubaron durante una hora a 37ºC en solución
de tripsina-EDTA precalentada (0,05% de
tripsina/0,02% de EDTA; GIBCO, Grand Island, NY) y se trataron con
tres lavados e incubaciones en tripsina consecutivos (una hora). Los
fibroblastos se extendieron sobre cápsulas de cultivo tisular y se
cultivaron en un medio alfa-MEM (BioWhittaker,
Walkersville, MD) complementado con 10% de suero de ternero fetal
(FCS) (Hyclone, Logen, UT), penicilina (100 U.I./ml) y
estreptomicina (50 \mul/ml). Los fibroblastos pueden aislarse
prácticamente en cualquier momento del desarrollo, variando desde
aproximadamente después de la etapa del disco embrionario hasta la
vida adulta del animal (bovinos, desde el día 12 a 15 después de la
fertilización hasta una edad de 10 a 15 años). Este procedimiento
puede usarse también para aislar fibroblastos de otros mamíferos,
incluyendo ratones.
El siguiente procedimiento de electroporación se
realizó tanto para fibroblastos embrionarios (ganado y cerdos) como
adultos (ganado). También pueden usarse procedimientos estándares de
microinyección para introducir el DNA heterólogo en los
fibroblastos, sin embargo, en este ejemplo se usó la electroporación
debido a que es un procedimiento más fácil.
Las placas de cultivo que contenían fibroblastos
propagadores se incubaron en solución de
tripsina-EDTA (0,05% de tripsina/0,02% de EDTA;
GIBCO, Grand Island, NY) hasta que las células formaron una
suspensión de una única célula. Las células se centrifugaron a 500
g y se volvieron a poner en suspensión a 5 millones de células por
ml con solución salina tamponada de fosfato (PES).
La construcción del gen informador contenía el
promotor de citomegalovirus y el gen de fusión de
beta-galactosidasa y
neomicina-fosfotransferasa
(beta-GEO). A la cámara de electroporación se
añadieron el gen informador y las células a una concentración final
de 50 \mug/ml. Después del impulso de electroporación, los
fibroblastos se volvieron a transferir al medio de crecimiento
(medio alfa-MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD)
complementado con 10% de suero de ternero fetal (FCS) (Hyclone,
Logen, UT), penicilina (100 U.I./ml) y estreptomicina (50
\mul/mi)).
El día después de la electroporación, se
seleccionaron los fibroblastos unidos para la integración estable
del gen informador. Se añadió G418 (400 \mug/ml) al medio de
crecimiento durante 15 días (intervalo: 3 días hasta el final de la
vida útil de las células cultivadas). Este fármaco mata las células
que carecen del gen de beta-GEO, puesto que no
expresan el gen de resistencia a la neomicina. Al final de este
tiempo, estaban presentes colonias de células transgénicas
estables. Cada colonia se propagó independientemente de las otras.
Se tiñeron los fibroblastos transgénicos con X-gal
para observar la expresión de beta-galactosidasa, y
se confirmó que daba una integración positiva usando la
amplificación por PCR del gen de beta-GEO y se
sometió a desplazamiento sobre gel de agarosa.
En el procedimiento de transferencia nuclear
(NT) se usó una línea de células (CL-1) procedentes
de una colonia de fibroblastos embrionarios bovinos como núcleos
donantes. Los procedimientos de NT generales son los descritos
anteriormente.
Oocitos de matadero se maduraron in
vitro. Se separaron los oocitos de las células cúmulo y se
enuclearon con una micropipeta biselada aproximadamente 18 a 20
horas post maduración (hpm). La enucleación se confirmó en un medio
TL-HEPES más Hoechst 33342 (3 \mug/ml; Sigma). A
continuación las células donantes individuales (fibroblastos) se
colocaron en el espacio perivitelino del oocito receptor. Se
fusionaron el citoplasma del oocito bovino y el núcleo donante
(unidad de NT) usando técnicas de electrofusión. A la unidad de NT
se aplicó un impulso de fusión que consistía en 120 V durante 15
\mus en una cámara de 500 \mum. Esto ocurrió a las 24 hpm. Las
unidades de NT se colocaron en el medio CR1aa hasta 26 a 27 hpm.
El procedimiento general usado para activar
artificialmente los oocitos ha sido descrito anteriormente. La
activación de la unidad de NT se inició entre 26 y 27 hpm. En
resumen, las unidades de NT se expusieron durante cuatro minutos a
ionomicina (5 gM; CalBiochem, La Jolla, CA) en
TL-HBPES complementado con 1 mg/ml de BSA y se
lavaron a continuación durante cinco minutos en
TL-HEPBS complementado con 30 mg/ml de BSA. Durante
todo el tratamiento con ionomicina, las unidades de NT también se
expusieron a DMAP 2 mM (Sigma). Después del lavado, las unidades de
NT se transfirieron a una microgota del medio de cultivo CR1aa que
contenía DMAP 2 mM (Sigma) y se cultivaron a 38,5ºC en 5% de
CO_{2} durante cuatro a cinco horas. Los embriones se lavaron y
colocaron a continuación en un medio CR1aa más 10% de FCS y 6 mg/ml
de BSA en cuatro placas de pocillos que contenían una capa
alimentadora confluente de fibroblasto embrionario de ratón. Las
unidades de NT se cultivaron tres días más a 38,5ºC y 5% de
CO_{2}. El medio de cultivo se cambió cada tres días hasta 5 a 8
días después de la activación. En este momento pueden usarse
embriones de NT en la etapa de blastocistos para producir las
líneas de células de la CICM (masa celular interna cultivada) o los
fetos transgénicos. La masa celular interna de estas unidades de NT
puede aislarse y colocarse sobre una capa alimentadora. Además, las
unidades de NT se transfirieron a hembras receptoras. Los embarazos
fueron abortados a los 35 días de gestación. Esto dió como
resultado dos fetos transgénicos clonados que tenían el gen de
beta-GEO en todos los tejidos comprobados. De esta
manera, este es un método rápido y fácil de preparar líneas de
células de la CICM y fetos transgénicos. Este procedimiento conduce
en general a líneas de células de la CICM y fetos con el gen
diana.
La Tabla siguiente resume los resultados de
estos experimentos.
Se usó una línea de la CICM procedente de
embriones de NT transgénicos (una célula CL-1
transferida a un oocito enucleado) para producir embriones y fetos
quiméricos. Se desagregaron colonias de células de la CICM
transgénicas usando 1-5 mg/ml de pronasa o 0,05% de
tripsina/EDTA combinado con métodos de desagregación mecánica de
modo que se produjeran grupos de cinco o menos células. Se inactivó
la actividad de tripsina o pronasa haciendo pasar la células por
múltiples lavados de 30 a 100% de suero de ternero fetal. Las
células desagregadas se colocaron en placas de micromanipulación
que contenían un medio TL-HEPES. También se
colocaron embriones fertilizados en estas placas y se usaron
herramientas de micromanipulación para producir los embriones
quiméricos. Se inyectaron ocho a diez células de la CICM
transgénicas en embriones fertilizados en la etapa de
8-16 células. Estos embriones se cultivaron in
vitro hasta la etapa de blastocistos y a continuación se
transfirieron a animales receptores.
Un total de 6 embriones quiméricos en la etapa
de blastocistos fueron transferidos no quirúrgicamente a dos
hembras receptoras. Después de cinco semanas de gestación se
recuperaron 3 fetos. Diversos tejidos de los tres fetos, incluyendo
las células reproductoras de la gónada (que sugiere quimeras de la
línea reproductora), se seleccionaron por amplificación por PCR e
hibridación por transferencia Southern del producto amplificado a
un fragmento de beta-galactosidasa. De los tres
fetos, dos fueron positivos a la contribución debido a las células
de la CICM transgénicas. Ambos fetos tuvieron una contribución de la
CICM transgénica a la gónada.
Se usaron las mismas líneas de células de la
CICM transgénicas para producir embriones de NT. Se usaron
procedimiento de NT descritos en el Ejemplo 1 excepto que se usaron
células de la CICM en lugar de fibroblastos como la célula donante
fusionadas con el oocito enucleado. Se desagregaron las colonias de
células de la CICM transgénicas usando 1-5 mg/ml de
pronasa o 0,05% de tripsina-EDTA combinada con
métodos de desagregación mecánica de modo que se produjeran grupos
de cinco o menos células. La actividad de tripsina o pronasa se
inactivó haciendo pasar las células a través de múltiples lavados
de 30 a 100% de suero de ternero fetal antes de transferir las
células a oocitos enucleados. Los resultados se recogen en la Tabla
1 (grupo tercero). Se produjeron cinco embriones en la etapa de
blastocistos.
Claims (19)
1. Un método para clonar un mamífero bovino, que
comprende:
- (i)
- insertar un fibroblasto o núcleo celular bovino diferenciado propagador deseado en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT);
- (ii)
- activar la unidad de transferencia nuclear resultante;
- (iii)
- cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa de desarrollo superior a la etapa de 2 células; y
- (iv)
- transferir dicha unidad de NT cultivada a un mamífero hospedante bovino, de tal manera que la unidad de NT desarrolle un feto.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que se inserta, elimina o modifica un DNA deseado en dicho
fibroblasto o núcleo celular diferenciado, dando como resultado la
producción de una unidad de NT genéticamente alterada.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que se usa microinyección o electroporación para insertar un
DNA heterólogo.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
2 ó 3, en el que el fibroblasto o núcleo celular bovino diferenciado
procede del mesodermo, ectodermo o endodermo.
5. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que el fibroblasto o núcleo
células bovino diferenciado es una célula adulta o núcleo
celular.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fibroblasto o núcleo
celular bovino diferenciado es una célula o núcleo celular fetal o
embrionario.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que el oocito enucleado es
madurado antes de la enucleación.
8. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que la unidad de
transferencia nuclear fusionada se activa por exposición a
ionomicina y 6-dimetilaminopurina.
9. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, que comprende además combinar la
unidad de NT clonada con un embrión no humano fertilizado para
producir un embrión quimérico.
10. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, que comprende además desarrollar
los fetos hasta obtener la descendencia.
11. Un método para producir una línea de células
de la CICM [masa celular interna cultivada] bovina, que
comprende:
- (i)
- insertar un fibroblasto o núcleo celular bovino diferenciado propagador deseado en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuada para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT);
- (ii)
- activar la unidad de transferencia nuclear resultante;
- (iii)
- cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa de desarrollo superior a la etapa de 2 células; y
- (iv)
- cultivar las células procedentes de dicha unidad de NT para obtener una línea de células de la CICM bovina.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que se inserta, elimina o modifica un DNA deseado en
dicho fibroblasto o núcleo celular bovino diferenciado, dando como
resultado la producción de una unidad de NT genéticamente
modificada.
13. El método de la reivindicación 11 ó 12, en
el que la línea de células de la CICM bovina resultante es inducida
a diferenciarse.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación
11 ó 12, que comprende además combinar la unidad de NT clonada con
un embrión no humano fertilizado para producir una quimera.
\newpage
15. Un método de acuerdo con la reivindicación
14, que comprende además desarrollar la línea de células de la CICM
bovina quimérica hasta un embrión bovino quimérico.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, que comprende además desarrollar el embrión quimérico hasta un
feto quimérico.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación
16, que comprende además desarrollar el feto quimérico hasta una
descendencia bovina quimérica.
18. Un método para clonar un mamífero bovino,
que comprende:
- (i)
- insertar una célula o núcleo celular de la CICM bovino diferenciado propagador deseado en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT);
- (ii)
- activar la unidad de transferencia nuclear resultante;
- (iii)
- cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa de desarrollo superior a la etapa de 2 células; y
- (iv)
- transferir dicha unidad de NT cultivada a un mamífero bovino hospedante, de tal manera que la unidad de NT se desarrolle hasta obtener un feto.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación
18, que comprende además desarrollar el feto hasta obtener una
descendencia.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/781,752 US5945577A (en) | 1997-01-10 | 1997-01-10 | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
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