JP2011508600A - 形質転換された複製犬の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)犬から採取した体細胞株から供与核細胞を製造して、目的遺伝子を含有するDNA構造体を導入して発現させるステップ、
(b)前記目的遺伝子が導入された供与核細胞に、ロスコビチン(Roscovitine)、シクロヘキシミド(Cycloheximide)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ブチロラクトンI(Butyrolactone I)、アフィディコリン(Aphidicolin)、デメコルチン(Demecolcine)、ミモシン(Mimosine)、コルヒチン(colchicine)及びヘキスト33342(Hoechst 33342)で構成された群から選択される細胞周期同期化誘導物質を添加して培養するステップ、
(c)前記培養された供与核細胞を脱核された犬受核卵に移植して、形質転換された核移植卵を製造した後、活性化させるステップ、及び
(d)前記活性化した核移植卵を代理母に移植して産子を生産するステップ、を含む目的遺伝子が導入されたイヌ科動物を生産する方法を提供する。
本発明において使われる用語に対する定義は以下の通りである。
本発明において使われる用語「目的遺伝子」とは、生物体内において発現して、各々の機能を行える、使用者の意図に符合する遺伝子を称する用語であり、特に、このような目的遺伝子の体内導入及び発現は特定疾患の治療のための遺伝子治療に有効利用することができる。
(a)犬から採取した体細胞株から供与核細胞を準備して、目的遺伝子を含有するDNA構造体を前記供与核細胞に導入して発現させるステップ、
(b)前記目的遺伝子が導入された供与核細胞を培養するステップ、
(c)前記培養された供与核細胞を脱核された犬受核卵に移植して形質転換された核移植卵を製造した後、活性化させるステップ、及び
(d)前記活性化した核移植卵を代理母に移植して、産子を生産するステップを含む。
一般にほ乳動物(例えば牛、豚、羊など)の卵子は、成熟卵子、即ち、第2次減数分裂中期(metaphase II)に排卵されるが、イヌ科動物の卵子は他の動物とは異なって第1次減数分裂期に排卵されて、卵管内に48〜72時間留まって成熟する特徴がある。
生体内の成熟卵子を回収する方法は、対象動物を麻酔した後に開腹させることを含む外科的手法を使用できる。より具体的には、生体内の成熟卵子の回収は当業界に公知された方法である卵管切除法を使用できる。前記卵管切除法は卵管を手術的に切り出した後、胚芽収集培地を卵管内部に管流させて、管流液を収得して前記管流液から卵子を回収する方法である。
体細胞核移植技術による目的遺伝子を発現する形質転換動物の生産には供与核細胞が必要である。本発明における供与核細胞としては犬から由来した体細胞を使用する。具体的には、本発明において使用された体細胞としては犬の胚芽細胞(embryonic cell)、胎児細胞(fetus cell)、幼若細胞(juvenile cell)、成体細胞(adult cell)、望ましくは成体細胞から収得される卵球、皮膚、口腔粘膜、血液、骨髄、肝、肺、腎臓、筋肉及び生殖器官などの形態の組織から由来したものである。
本発明の前記第2段階において準備した供与核細胞は、前記体細胞に特定遺伝子を挿入したり操作して、染色体を遺伝子移植法や遺伝子ターゲッティングを利用して、形質転換させたものであってもよい。このような遺伝子移植や遺伝子ターゲッティングは、当業界に公知された方法であるため、当業者ならば容易に実施することができる。遺伝子ターゲッティングはこれに限るものではないが、例えば、核移植後化学物質に露出、不活性化されたウイルス注入、電気刺激(electroporation)等の方法がある。
本発明の一具体例として、RFP(red fluorescent protein)遺伝子を導入することができる。この時、レトロウイルスベクター配列を含んでいるプラスミドpLHCRW(SEQ ID NO.:1)[5'LTR:1-589、psi sequence:659-1468、HygroR:1510-2544、CMVp:2838-3649、DsRed2:3686-4363、WPRE:4409-5000、3'LTR:5085-5678]を導入ベクターとして使用できる(図1)。
ウイルスベクターの感染によってRFP遺伝子が導入された細胞はハイグロマイシン(150μg/mL)が含まれていた培地に6日間培養してRFP遺伝子が発現する細胞だけを選抜及び増殖させた後、トリプシン酵素処理によって、単細胞にする。このような単細胞を顕微鏡相で紫外線フィルターを利用して観察して、赤色を帯びる細胞だけを選別して、核移植に利用する。
本発明は複製犬の生産効率を向上させるために、核移植直前段階において目的遺伝子が導入された供与核細胞に細胞周期同期化誘導物質を添加して培養する。
本発明は前記前段階において形質転換された供与核細胞の形質をそのまま有する動物を生産するため体細胞核移植(somatic cell nuclear transfer、SCNT)を介した複製技術を用いる。即ち、核移植卵を生産する。
第1段階において準備した脱核卵子に形質転換された供与核細胞の微細注入は移植用ピペットを使用して、供与核細胞を脱核卵子の細胞質と透明帯との間に注入することによって行う。
融合した核移植卵の活性化は成熟過程において一時的に停止した細胞周期を再稼動させる段階である。これのためには細胞周期停止要素であるMPF、MAPキナーザなどの細胞信号伝達物質の活性を低下させなければならない。
さらには、本発明による犬の形質転換された核移植卵は、代理母に移植されて、産子を出生させることによって複製犬を生産するため使用する。犬の場合は体外培養しないで活性化後直ちに移植するが、前記移植は当業界に公知された方法を使用して行うことができ、望ましくはカテーテルを使用して複製胚芽を移植する。
卵子供与者として、実験には1〜5年齢の雑種メス犬を使用した。前記卵子供与者として使用した犬はソウル大学の飼育管理研究所の基準に従って飼育した。自然に発情期が始まった犬を対象に膣細胞塗抹検査(vaginal smear)と血清プロゲストロンの濃度を毎日測定して、排卵日を決めて、排卵日から48〜72時間後に手術を行って、卵子を回収した。
前記収得した卵子を表1の卵子回収用培地に入れて、Hyaluronidase(Sigma、USA)を反復的にピペッティングハムロソ卵丘細胞を取り除いた。次に、卵丘細胞が取り除かれた卵子を5μg/mLヘキスト(Hoechst 33342)で5分間染色して蛍光倒立顕微鏡を利用して×200の倍率で観察して、第1極体が確認された卵子だけを選別した。
供与核細胞では犬から収得した成体線維芽細胞を使用した。このために先ず犬の耳皮膚組織を分離した。前記耳皮膚組織断片をDPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)で3回洗浄して手術用メスで細かく刻んだ。前記刻まれた皮膚組織を1mM EDTAが含まれたDMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培地(DMEM Life Technologies、Rockville、MD)に入れて300×gで2分間遠心分離した後、60mmプラスチック培養用皿(Becton Dickinson、Lincoln Park、NJ)で培養した。
(1)遺伝子導入用ベクター製作
RFP遺伝子が含まれたpLHCRWプラスミドは次の通り準備された。
商業的に市販されているpRevTRE(Clontech Mountain View、CA、USA)のTRE配列を取り除いた後、その位置にCMV promoter(米国のClontechdptj、購入したpLNCXから分離)とDsRed2遺伝子(米国のClontechdptj、購入したpDsRed2-C1から分離)、そしてWPRE(Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)配列(Woodchuck肝炎ウイルス2ゲノムDNAからcloning)を含有するフラグメントを順に挿入して、最終pLHCRWプラスミドを構築した。
PT67細胞(Clontech Mountain View、CA、USA)を一時的にpLHCRWでトランスフェクションさせ、トランスフェクションされたPT67細胞から収得したウイルスをGP2-293細胞(Clontech Mountain View、CA、USA)に感染させた。LHCRW-感染したGP2-293細胞を2週間ハイグロマイシン(150μg/mL)を利用して選別して、このようなHygR(hygromycin-resistant)細胞をpVSV-G(Clontech Mountain View、CA、USA)にトランスフェクションしてVSV-G蛋白質を発現させた。
レトロウイルスベクターを利用してRFP遺伝子を雌犬(BF3)及び雄犬(BF4)胎児線維芽細胞の供与細胞に導入し、安定した移入細胞(transfectant)(BF3/RFP及びBF4/RFP)をhygromycin selectionで分離しようとした。抗生剤を利用した細胞選別のために遺伝子導入後2〜3日間隔で6日間ハイグルロマイシンを150μg/mL容量で適用して選別を行った(図2のb)。
ロスコビチンを処理しない対照群とロスコビチンを24時間処理した処理区間に、脱核された卵子に微細注入方法を利用して、犬の体細胞移植を行った後、核の形成及び変化において差を調べた。
これらの結果から、ロスコビチン処理後体細胞移植した場合に妊娠の割合が非常に有意に向上したことを確認することができた。
(1)脱核卵子に供与核細胞の微細注入及び融合
前記実施例2で製造した脱核卵子に、前記実施例4で製造したRFP遺伝子が導入された供与核細胞を微細注入した。RFP遺伝子が導入された供与核細胞は脱核卵子の周卵腔(perivitelline)空間に次のような方法で微細注入した。微細注入時静置された脱核卵子を100/mLフィトヘマグルチニン(phytohemagglutinin)が含まれていた表1の培地に処理して、脱核卵子の切開窓を固定用ピペットで固定した後、移植用ピペットを切開窓で挿入して、実施例3で単一細胞に分離された線維芽細胞を脱核卵子の細胞質と透明帯との間に注入した。
電気刺激1時間後に供与核細胞と卵子細胞質体の融合を立体顕微鏡(stereomicroscope)で観察した。融合した受精卵を選別し、これを10%(v/v)FBSが添加されたTCM−199(表2)で1.5〜4時間培養した。
前記細胞融合過程済みの形質転換核移植卵は10μmイオノフォア(Sigma)が含まれている変形された合成卵管液(modified synthetic oviductal fluid、mSOF)(表5)に入れて39℃で4分間培養して、核移植卵の活性化を誘導した。次に、前記核移植卵を洗浄して1.9mM 6−ジメチルアミノプリンが添加されたmSOFで4時間追加培養した。前記核移植卵は代理母に移植する前までミネラルオイルで覆われたmSOF 25μL微細油滴(microdrop)で培養した。
形質転換SCNT群(SCNT-BF3/REF)、非形質転換SCNT群(SCNT-BF3)及び単位発生(parthenogenetic)群毎にin vitro胚発生率を比較して調べた(表6)。
前記実施例5の核移植卵を発情同期化された代理母の卵管に外科的手術方法を使用して移植した。移植は前記で核移植卵を活性化した後4時間以内に行った。代理母では病気に移患されなく、正常な発情周期が繰り返され、子宮状態が正常なメス犬を使った。全体344個の胚(287 BF3/RFP及び57 BF4/RFP)を、代理母20頭の卵管に移植した。その中16頭にはBF3/RFP胚を、4頭にはBF4/RFP胚を移植した。
核移植による子犬の特性を以下表8にまとめた。形質転換された複製子犬は遺伝学的に各々供与細胞と同一であった。
実施例6で生産された各々の形質転換産子は肉眼的方法及び分子生物学的方法で遺伝子分析を行った。RFP発現複製犬は外見観察及び組織を利用したサザンブロット及び顕微鏡の紫外線フィルターを利用してRFP発現及び遺伝子導入を分析した。
分子生物学的検査で、先ずサザンブロットで産子のGenomic DNAを分析した。サザンブロット分析でRFP遺伝子プロブの合成のためのプリマーとして、pDsRed2-C1(Clontech、Mountain View、CA、USA)ヌクレオチド配列606-623位置及び1270-1287位置に該当する5´- CGCCACCATGGCCTCCTC-3´(SEQ ID NO.:2)及び5´-CAGGAACAGGTGGTGGCG-3´(SEQ ID NO.:3)を使用した。前記プロブ(3905 bp)をthe PCR DIG Probe Synthesis kit(Roche、Mannheim、Germany)を利用して合成して、アガロスゲル電気泳動によって分離精製して、混成化前にdigoxigeninで標識した。
RT−PCR結果を図4に示した。即ち、RFP遺伝子の転写レベルにおける発現を確認した。
Texas red filter setを備えたLeica inverted microscopeと特定DsRed filter setを備えたLeica upright stereomicroscopeを利用して赤い蛍光の発色を検出した。前記赤い蛍光発色は540±0nmにおける放出として現れ、600±5nmの最大透過率の波長でemission filterによって検出される。
さらに、Fluorescence in situ hybridization(FISH)分析でRFP遺伝子の挿入を確認した。
Claims (9)
- 次のステップを含む、目的遺伝子が導入された形質転換複製犬の生産方法:
(a)犬から採取した体細胞株から供与核細胞を製造して、目的遺伝子を含有するDNA構造体を導入して発現させるステップ、
(b)前記目的遺伝子が導入された供与核細胞に、ロスコビチン(Roscovitine)、シクロヘキシミド(Cycloheximide)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ブチロラクトンI(Butyrolactone I)、アフィディコリン(Aphidicolin)、デメコルチン(Demecolcine)、ミモシン(Mimosine)、コルヒチン(colchicine)及びヘキスト33342(Hoechst 33342)で構成された群から選択される細胞周期同期化誘導物質を添加して培養するステップ、
(c)前記培養された供与核細胞を脱核された犬受核卵に移植して、形質転換された核移植卵を製造した後、活性化させるステップ、及び
(d)前記活性化した核移植卵を代理母に移植して産子を生産するステップ。 - 前記(a)ステップの体細胞は犬の卵丘細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、角質細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、マクロファージ、単球細胞、筋肉細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、胚芽幹細胞、胚芽生殖細胞、胎児細胞、胎座細胞及び胚芽細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記体細胞は線維芽細胞または卵丘細胞であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記(a)ステップの目的遺伝子を含有するDNA構造体は、前記目的遺伝子の発現に適切なプロモーターをさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記(b)ステップの前記細胞周期同期化誘導物質はロスコビチンであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記(b)ステップの前記細胞周期同期化誘導物質の濃度が5μM乃至30μMであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 請求項1の方法によって生産された目的遺伝子が導入されている形質転換複製犬。
- 次のステップを含む、目的遺伝子が導入されている、形質転換複製犬の生産用核移植卵の製造方法:
(a)犬から採取した体細胞株から供与核細胞を製造して、目的遺伝子を含有するDNA構造体を導入して発現させるステップ、
(b)前記目的遺伝子が導入された供与核細胞に、ロスコビチン(Roscovitine)、シクロヘキシミド(Cycloheximide)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ブチロラクトンI(Butyrolactone I)、アフィディコリン(Aphidicolin)、デメコルチン(Demecolcine)、ミモシン(Mimosine)、コルヒチン(colchicine)及びヘキスト33342(Hoechst 33342)で構成された群から選択される細胞周期同期化誘導物質を添加して培養するステップ、及び
(c)前記培養された供与核細胞を脱核された犬受核卵に移植して融合させるステップ。 - 請求項8に記載の方法により製造された形質転換複製犬の生産用核移植卵。
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