KR20090115081A - 개과 동물의 복제 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개과 동물의 복제방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 개과동물의 생체로부터 회수된 최적의 성숙 난자로부터 탈핵 난자를 제조하고, 개과 동물의 체세포를 공여 핵 세포로 이용하여, 상기 탈핵 난자에 최적화된 조건으로 핵 이식을 수행하여 핵 이식란을 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 개과 동물을 복제해 내는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 복제된 개과 동물에 관한 것이다.
본 발명은 최적기의 성숙난자 회수를 가능하게 하고, 난자 융합 및 활성화 효율을 향상시켜 생산효율을 증대시키며 아울러, 고가의 반려동물의 번식, 희귀 멸종 위기의 개과 동물을 보존하는데 기여할 것이다. 뿐만 아니라, 질환 모델동물 생산 및 유용 단백질 생산 등 의학연구 분야 전반에 지대한 공헌을 할 것이다.
복제, 핵 이식, 난자 융합, 활성화, 개과 동물

Description

개과 동물의 복제 생산 방법{Cloning Method Of Canids}
본 발명은 개과 동물의 복제방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 개과동물의 생체로부터 회수된 최적의 성숙 난자로부터 탈핵 난자를 제조하고, 개과 동물의 체세포를 공여 핵 세포로 이용하여, 상기 탈핵 난자에 최적화된 조건으로 핵 이식을 수행하여 핵 이식란을 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 개과 동물을 복제해 내는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 복제된 개과 동물에 관한 것이다.
근래에 생명공학 또는 유전자 조작기술의 발달에 따라 유용한 작물들의 원하는 형질들을 조합한 다양한 재조합 식물체들의 생산 성공사례가 발표되어 왔고, 최근에는 예컨대 양 등과 같은 복제 동물들의 생산에 성공한 사례들도 보고되고 있다. 복제동물의 생산은 현실적으로 생명공학 분야에서도 실로 고도로 축적된 기술적 뒷받침이 전제된 후에야 비로소 가능한 것이므로, 이러한 점에서 상기 복제동물의 생산은 당해 기술 수준의 척도가 되는 것이다. 최근 세포융합 또는 세포 직접주입에 의한 체세포 핵이식 기술이 발전되면서 복제동물의 생산이 본격적으로 이루어 지고 있다.
체세포 핵이식 기술은 번식과정에서 일어나는 난자와 정자와 수정이 일어난 후 이루어지는 과정을 거치지 않고 단일 성체 세포로 개체를 생산해내는 방법을 일컬으며 상기 기법을 이용해 생산된 복제란은 발정 동기화된 대리모에 이식함으로써 새로운 개체를 발생시키는 방법을 말한다. 체세포 핵 이식 과정을 약술하면 미성숙 난자를 각종 호르몬과 성장인자가 배합된 배지에 24-72hr을 배양 성숙과정을 거치면 2차 감수분열 중기까지 성숙하게 된다. 이를 체외 성숙 난자라고 한다. 호르몬에 의한 과배란 처치로 회수되는 난자를 체내 성숙 난자라고 한다. 각 이러한 방법으로 생산된 성숙난자는 미세조작기를 통해 난자의 반수체를 제거하고 상기 탈핵난자의 위란강 또는 세포질 내에 복제하고자 하는 동물의 체세포를 주입한다. 그 후 탈핵 난자와 위란강 또는 세포질에 주입된 체세포를 전기적 자극을 통하여 물리적으로 융합시킨다. 융합된 난자는 다시 추가적인 전기자극 또는 화학물질에 의해 활성화 과정을 거친다. 이렇게 생산된 복제란은 발정동기화된 대리모에 외과적 이식방법 또는 비외과적 이식방법을 통해 대리모의 난관 또는 자궁에 이식하여 산자를 생산한다.
영국 로슬린 연구소의 윌멋 (Wilmut) 박사는 전술한 체세포 복제기술을 통해 최초로 복제양 돌리를 생산한데 이어 많은 국내외 복제 연구자들에 의해 소, 마우스, 염소, 돼지, 토끼 및 개 등에서 복제동물을 생산하게 되었다. (WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577). 본 발명자들 역시 체세포 핵이식 기법을 통해 개과 동물을 복제해 내는 방법에 관한 발명을 한 바 있다. (출원번호 10-2005-0067736)
특히, 개과 동물의 번식생리는 성숙된 상태에서 배란이 이루어지지 않고 배란 후에 난관에서 성숙과정이 일어남으로써 다른 포유류와 상이한 번식생리를 가지고 있다. 따라서, 개과 동물에서는 체외성숙 (in vitro maturation)으로 생산된 난자를 사용할 수 없는 단점이 있다. 따라서, 체내에서 배란되어 성숙된 난자만이 체세포 핵이식에 사용될 수 있다.
본 발명자들은 개과 동물의 복제에 관하여 연구한 결과, 혈청 프로게스테론의 증감양상을 통해 배란 최적기를 판단할 수 있으며 이를 통해 판단한 결과 개체별로 성숙 난자의 회수 최적기가 다르다는 것을 확인하였고, 전기적 융합시 본 발명 이전의 최적의 조건으로 알려진 전압에 비해 그 전압 수치가 낮을 때 보다 높은 융합율을 보임을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 핵 이식란 활성화 조건 및 방법상의 더욱 효과적인 방법을 찾아내어 건강한 복제견을 생산해냄으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
이에, 본 발명자들은 혈청 프로게스테론의 증감양상을 통해 배란 최적기를 판단할 수 있으며 이를 통해 판단한 결과 개체별로 성숙 난자의 회수 최적기가 다르다는 것을 알아내고, 아울러, 핵 이식란 활성화 조건 및 방법상의 더욱 효과적인 방법을 찾아냄으로써 건강한 복제견을 생산하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 체세포 핵이식 기술을 이용하여 최적의 조건에서 개과 동물의 핵 이식란을 생산하는 방법 및 이에 의해 제조된 개과 동물의 핵 이식란을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 제조된 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는 복제된 개과 동물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 체세포 핵이식 기술을 이용하여 최적의 조건에서 개과 동물의 핵 이식란을 생산하는 방법 및 이에 의해 제조된 핵 이식란을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는 복제된 개과 동물의 생산방법 및 이에 의하여 생산된 복제된 개과 동물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식'은 핵이 없는 세포에 다른 세포의 핵 DNA 를 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식란'은 공여 핵 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 세포, 배아 세포, 태아 세포 및/또는 동물 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '공여 핵 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '수핵 난자'는 탈핵 과정을 통해 본래의 핵이 제거되고 공여 핵 세포로부터 핵을 전달받는 난자를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '성숙 난자'는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 난자를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '탈핵 난자'는 난자의 핵이 제거된 것을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '융합'은 공여 핵 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마 막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 공여 핵 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 공여 핵세포가 수핵 난자의 위란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '활성화'는 핵 전이 단계 전, 핵 전이 단계 동안 및 핵 전이 단계 후에 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다.
바람직하게는, 본 발명에서는 핵 전이 단계 후 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한 달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.
본 발명에서 '개과 동물'로는 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및 너구리가 포함될 수 있다. 바람직하게는 개 또는 늑대가 포함된다. 상기 개는 야생의 늑대가 가축화된 것으로 알려져 있으며 이에 따라 늑대와 개는 염색체 수가 동일하고 임신기간, 성 호르몬의 변화가 유사한 양상을 나타낸다(Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21:1057-1066).
본 발명은 최적기에 회수된 성숙난자를 이용하여 체세포 핵 이식 기술에 의해 개과 동물을 복제함에 있어서, 핵 이식란의 전기융합 조건과 활성화 조건을 최적화하여 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법을 제공하며, 이에 의하여 제조된 핵 이식란, 및 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는 복제된 개과동물의 생산방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 제 1 견지에 의하면, 본 발명은 (a) 개과 동물의 성숙난자로부터 탈핵난자를 제조하는 단계; (b) 개과 동물의 조직으로부터 체세포를 분리하여 공여 핵 세포를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 탈핵 난자에 상기 공여 핵 세포를 미세주입하고, 전압이 1.3~2.3 kV/cm인 조건으로 전기 융합시키는 단계;를 포함하여 이루어지는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 개과 동물의 성숙난자는 개과 동물의 생체 내로부터 회수되는 것을 특징으로 하며, 상기 생체 내로부터 회수는 개과 동물의 배란일로부터 70 ~ 90 시간, 바람직하게는 75 ~ 90시간에 수행한다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 체세포는 개과 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 적혈구, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아세포, 태좌세포 및 배아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 상기 체세포는 섬유아세포 또는 난구세포일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 전기융합은 전압 1.3~2.3kv/cm로, 바람직하게는 1.5~2.0kv/cm로, 가장 바람직하게는 1.8kv/cm로, 15~45㎲ 동안 1~3회 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 전기융합만으로 융합과 활성화를 동시에 달성할 수 있지만, 융합된 난자를 활성화시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 융합된 난자의 활성화에 있어서 화학적인 활성화 방법으로서, DMAP (6-dimethyl aminopurine)를 2-4시간 동안 융합된 난자에 처리할 수 있다. 바람직하게는 상기 DMAP (6-dimethyl aminopurine)를 2 시간 처리하는 것이 좋다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 개과 동물은 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및 너구리로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 바람직하게는 상기 개과 동물은 개, 늑대 또는 여우일 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 개과동물의 핵 이식란을 생산하는 방법을 보다 구체적으로 설명한다.
제1단계: 수핵 난자의 탈핵
개과 동물은 다른 포유동물의 경우와는 달리 배란 후 수시간 동안 난관에 머물면서 미성숙 난자가 성숙 난자가 된다. 포유동물의 경우 난자는 성숙 난자, 즉 제2차 감수분열 중기(metaphase II)에 배란이 되는데 반해, 개과 동물의 난자는 제1차 감수분별 전기에 배란되어 난관 내에서 48-120시간 동안 머물면서 성숙과정을 거치는 것이 특징이다. 이러한 특징적인 번식 생리와 더불어 많은 연구진들의 연구(Lee et al, Reprod. Domest. Anim., 42(6):561-5, 2007; Lee et al, Zygote, 15(4):347-53, 2007)에도 불구하고 개과 동물에 있어서 난자의 체외성숙 (in vitro maturation) 효율은 여전히 낮은 편이다. 따라서 개과 동물의 생체 내에서 성숙된 난자를 회수하여 체세포 핵이식의 수핵난자로 사용하는 것이 가장 바람직하다.
성숙난자를 회수하기 위해 개과 동물에 있어서 배란적기를 판단하는 방법은 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 질세포 도말검사를 통해 각화상피세포가 70%이상임을 확인하였을 때를 최적기로 판단하는 방법과 초음파 영상을 통해 난포의 성장과 발육상태를 실시간으로 확인하는 방법 및 혈장 프로게스테론을 측정하여 적기를 판단하는 방법들이 있다.
본 발명에서는 수핵난자를 제공하는 공여견의 혈중 프로게스테론의 농도를 측정함으로써 난자 성숙 정도를 판단하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 혈장 프로게스테론 농도가 4.0~7.5ng/mL일 때를 배란일로 간주하여 난자를 회수한다. 특히, 난자의 혈장 프로게스테론이 급하게 상승(≥3.6ng/ml/day) 하는 개체들의 경우 배란일로부터 70-80시간째 (성숙 수핵난자 회수율 87.6%) 회수하는 것이 최적기이고, 천천히 상승 (<3.6ng/ml/day)하는 개체들의 경우 배란일로부터 80-90시간째 (성숙 수핵 난자 회수율 69.6%) 회수하는 것이 가장 바람직하다. 이는 개체별로 프로게스테론의 증가 속도에 차이가 있기 때문이다.
또한, 생체 내 성숙 난자를 회수하는 방법으로는 대상 동물을 마취한 후 개복시키는 것을 포함하는 외과적 방법을 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 생체 내 성숙 난자의 회수는 당업계에 공지된 방법인 난관 절제법을 사용할 수 있다. 상기 난관 절제법은 난관을 수술적으로 잘라낸 후 배아 수집 배지를 난관 내부에 관류시켜 관류액을 수득하고 상기 관류액으로부터 난자를 회수하는 방법이다. 또한, 생체 내 성숙 난자는 카테터를 난관채에 장착한 후 난관-자궁 접합부위에 주사침을 이용하여 관류액을 주입함으로써 회수할 수 있다. 이 방법은 난관을 손상시키지 않기 때문에 난자를 공여하는 동물을 다음 발정에도 이용할 수 있다는 장점이 있다.
따라서, 바람직하게는 생체 내 성숙 난자의 회수는 난관을 손상시키지 않는 카테터를 이용한 방법을 사용한다. 보다 바람직하게는, 카테터를 이용한 난자 회수 방법에 있어서, 본 발명자들이 개발한 니들의 앞부분이 둥글게 처리되어 있어 난관 입구에 장착이 용이한 16 게이지 존대(Sonde)를 이용하여 난자를 회수할 수도 있다. 이 방법은 앞부분이 둥글게 처리된 난자 회수용 니들을 난관 내에 삽입-결찰한 후 난관-자궁 접합부에 난자회수용 배지를 관류시켜 상기 난자 회수용 니들에 관류액이 유입되도록 하고 상기 관류액을 현미경으로 검경하여 성숙한 난자를 수득하는 방법이다.
성숙한 난자를 회수한 다음에는 난자의 반수체 핵을 제거하여 탈핵난자를 제조한다. 난자의 탈핵은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(미국특허 제4994384호, 미국특허 제5057420호, 미국특허 제5945577호, 유럽특허 공개공보 제0930009A1, 대한민국특허 제342437호, Kanda et al, J. Vet. Med. Sci., 57(4):641-646, 1995; Willadsen, Nature, 320:63-65, 1986, Nagashima et al., Mol. Reprod. Dev. 48:339-343 1997; Nagashima et al., J. Reprod Dev 38:37-78, 1992; Prather et al., Biol. Reprod 41:414-418, 1989, Prather et al., J. Exp. Zool. 255:355-358, 1990; Saito et al., Assis Reprod Tech Andro, 259:257-266, 1992; Terlouw et al., Theriogenology 37:309, 1992).
바람직하게는, 수핵 난자의 탈핵은 크게 두 가지 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 한 가지 방법으로는 성숙한 수핵 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 미세침을 이용하여 수핵 난자의 투명대 일부를 절개하여 절개창을 형성하고 이를 통하여 제1극체, 난자의 핵 및 세포질(가능한 적은 양)을 제거하는 것이다. 다른 방법으로는 수핵 난자의 난구 세포를 제거한 다음 난자를 염색하고 미세 흡입 피펫(aspiration pipet)을 이용하여 제1극체 및 난자의 핵을 제거하는 것이다.
보다 바람직하게는, 난자에 절개창을 형성하여 쥐어짜기 (Enucleation; Squeezing method)방법으로 탈핵한다. 이는 홀딩 마이크로 피펫으로 수핵 난자를 고정한 후 제1극체와 난자 핵 그리고 일부 세포질을 제거하는 방법으로 수행한다.
보다 구체적인 방법은 이하와 같다. 예를 들어, 절개한 난자를 회전시켜 절개창을 수직으로 위치시킨 후 고정용 피펫을 난자의 밑 부위에 위치시켜 난자가 아래쪽으로 움직이지 못하도록 받친 뒤 절개 피펫을 난자의 위에서 눌러 제 1극체를 포함하여 세포질을 10∼30% 탈핵을 실시한다. 또는 난자의 절개창을 3시 방향에서 수직으로 회전시킨 후 고정용 피펫과 절개 피펫을 아래 위에서 눌러서 제 1극체를 포함하여 세포질의 10∼30% 탈핵을 실시한다. 탈핵시킨 1군의 난자는 TCM-W로 3회 세정하고 핵이식 전까지 IVM용 TCM 199(B-①)에 정치시킨다. 탈핵 후의 난자는 매우 취약하기 때문에 마우스 피펫은 최소한 내경이 300㎛이상 되는 것을 사용하여 작업 후 난자의 세포질이 절개창을 통해 빠져나오지 않도록 주의한다.
제2단계: 공여 핵 세포의 제조
공여 핵 세포로는 개과 동물로부터 유래된 체세포가 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 사용된 체세포로는 개과 동물의 배아세포(embryonic cell), 태아세포(fetus cell), 유세포(juvenile cell), 성체세포(adult cell), 바람직하게는 성체세포로부터 수득될 수 있는 난구, 피부, 구강 점막, 혈액, 골수, 간, 폐, 신장, 근육 및 생식기관 등과 같은 형태의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 적혈구, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 사용되는 체세포로는 태아 및 성체 섬유 아세포, 난구세포일 수 있다. 나아가, 본 발명에서 사용되는 공여 핵 세포는 상기 야생형 체세포에 특정 유전자를 삽입하거나 조작하여 염색체를 유전자 이식방법이나 유전자 적중법을 이용하여 형질전환시킨 것일 수 있다. 상기 유전자 이식방법이나 유전자 적중법은 당업계에 공지된 방법이므로 당업자라면 용이하게 실시할 수 있다.
공여 핵 세포로서 제공되는 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있으며 상기 표본으로부터 공지된 방법을 사용하여 단일세포를 수득할 수 있다. 예를 들면, 대상동물로부터 조직의 일부를 무균적으로 절개하여 상기 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 수득하고 이를 미세하게 세절하여 교원질 분해 효소(collagenase)로 처리한 다음 조직 배양용 배지에서 배양한다. 조직 배양용 배지에서 3~4일 배양 후에 배양 접시(dish)에 자라는 것을 확인하고, 완전히 다 자라면 일부는 추후 사용을 위하여 동결하여 액체 질소에 보관하며, 나머지는 핵 이식에 이용하기 위하여 계속 배양을 실시한다. 계속하여 배양하여 핵이식에 사용할 세포는 10번 계대 배양 이하를 전제로 하여 세포가 과도하게 커지는 것을 방지한다. 상기에서 조직 배양용 배지로는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들면, TCM-199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 등이 있다.
제3단계: 공여 핵 세포의 미세주입 및 융합/활성화
탈핵 난자에 공여 핵 세포의 미세주입은 이식용 피펫을 사용하여 공여 핵 세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입함으로써 수행할 수 있다.
상기 공여 핵 세포의 미세주입이 완료된 탈핵 난자는 세포 조작기를 이용하여 전기적으로 공여 핵 세포와 융합시킨다. 전기적 융합에서 전류는 교류 또는 직류일 수 있으며, 바람직하게는 전압 1.3~2.3kV/cm 조건으로 수행할 수 있다.
보다 바람직하게는 직류전압 1.3~2.3kv/cm로, 바람직하게는 1.5~2.0kv/cm로, 가장 바람직하게는 1.8kv/cm로, 15~45㎲ 동안 1-3회 수행할 수 있다. 1회 통전에 의해 융합이 이루어지지 않은 경우에, 동일한 전압과 시간 조건으로 추가로 전기 융합을 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 전압이 1.3kV/cm 미만이거나 또는 2.3kV/cm을 초과하는 경우에는 60% 미만의 낮은 융합율을 보인다.
공여 핵 세포와 난자의 전기적 자극에 의한 융합은 융합용 배지 내에서 수행할 수 있다. 상기 융합용 배지로는 만니톨, MgSO4, 헤페스(Hepes), BSA가 혼합된 배지를 사용할 수 있다. 바람직하게는 0.3~0.5 M mannitol, 0.1~0.3 mM MgSO4, 0.1~0.3 mM 헤페스 및 0.05~0.1 % (w/v) BSA가 혼합된 배지에서 수행될 수 있다.
제4단계: 융합된 핵 이식란의 활성화
융합된 핵 이식란의 활성화는 체외성숙단계에서 제2감수분열 중기에 멈추어있는 세포주기를 재개시키는 과정을 의미한다. 이를 위해서는 세포주기를 정지시키는 물질인 MPF, CSF 등의 높은 활성도는 낮추고, 제2감수분열 중기에서 후기로 전이를 촉진하는 APC의 낮은 활성도는 높여주어야 한다.
일반적으로 핵 이식란을 활성화시키기 위해서는 세포 내 Ca2+ 이온의 농도를 증가시켜 염색체 응축과 배아발달을 유도해야 하며, 이를 위해 물리적인 방법, 화학적인 방법, 또는 전기적인 방법이 사용된다. 물리적인 방법으로는 기계적인 자극, 열, 그리고 직류를 이용하는 방법이 있다. 화학적 방법으로는 에탄올, 이노시톨 트리포스페이트, Ca2+ 또는 Sr2+, 사이토칼라신 B, 칼슘 아이오노포어, 6-디메틸아미노퓨린, 사이클로헥시미드, 그리고 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 같은 물질로 처리하는 방법이 있다. 상기 화학적 방법으로, 바람직하게는 DMAP(6-dimethylaminopurine)를 2-4시간 동안 융합된 난자에 처리하는 방법을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 칼슘 이오노포어 5~10μM을 37~39℃에서 3~6분 동안 처리 한 다음 6-디메틸아미노퓨린 1.5mM~2.5mM을 37~39℃에서 2-4시간 동안 처리한다. 본 발명의 일 실험예에서는 상기 핵 이식란을 6-디메틸아미노퓨린이 첨가된 배지에서 핵 이식란의 염색형의 변화를 관찰한 결과 2시간 처리한 군에서 양질의 핵 이식란의 지표인 농축 염색질이 높음으로써 4시간 처리에 비해 더 우수함을 확인하였다. 전기적인 활성화 방법으로서, 직류전압 1.3~2.3kV/cm 조건으로 15~45㎲ 동안 1~3회 수행할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제 2 견지에 의하면,
본 발명은 상기의 방법에 의하여 제조된 핵 이식란을 제공한다. 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에서 제조한 개의 핵 이식란을, 2008년 5월 6일자로 한국생명공학연구원 유전자은행 (KCTC, 대전광역시 유성구 어은동 52번지)에 기탁번호 KCTC 11331BP로 기탁하였다. 상기 핵 이식란은 동결 보존한 후 필요한 때에 이를 용해시켜 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제 3 견지에 의하면, 본 발명은 상기 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는 복제된 개과 동물의 생산방법을제공한다. 바람직하게는 상기 개과 동물은 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및 너구리로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에 의하면, 개과 동물의 복제 효율을 높이기 위해 다음 전략 중 적어 도 하나를 선택할 수 있다.
1. 수핵 난자로는 개과 동물의 배란일로부터 70~90시간째에 생체내로부터 회수된 난자를 사용한다.
2. 전기 융합은 1.3~2.3kv/cm의 조건으로 수행한다.
3. 핵 이식란의 활성화는 융합된 난자에 DMAP (6-dimethyl aminopurine)를 2-4시간 동안 처리한다.
또한, 본 발명의 제 4 견지에 의하면, 본 발명은 상기 방법에 의하여 생산된 복제된 개과 동물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 난자 공여견에 따른 최적기 판단과 난자 융합과 활성화의 최적 조건에 기한 복제 개의 생산 방법과 이를 이용한 반려동물로서 효율적으로 개과 동물을 복제하는 방법을 제공한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 개과 동물의 공여 난자에 따른 최적기 판단과 난자 융합과 활성화의 최적 조건에 기한 복제 개의 생산 방법과 이를 이용한 반려동물로서 효율적으로 개과 동물을 복제하는 방법을 제공함으로써, 의약학, 수의학 분야에서 복제 개과 동물을 이용한 약제 또는 장기 등의 생산 등과 관 련된 무한한 응용가능성이 있으며, 본 발명에 따라 복제 개과 동물을 생산하는 기술은 반드시 개과 동물에 국한되지 않고 향후의 광범위한 시도에 따라 변형되어 상이한 종의 동물들에도 적용될 수 있을 것이다.
이하에서는 본 발명을 하기의 실시를 위한 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실기 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 개로부터 수핵 난자의 회수
수핵 난자의 회수를 위해 사용한 개는 1~3살의 잡종 암캐로 수암생명공학연구원의 사육관리 연구소에서 확립한 표준에 따라 사육하였다. 발정기가 시작된 개를 대상으로 혈청 프로게스테론의 농도를 매일 측정하여 배란일을 결정하고, 프로게스테론의 증감에 따라 배란일로부터 70~90시간 후의 성숙 난자를 회수하였다.
혈청 프로게스테론의 농도는 혈액 3-5ml을 매일 채취하고 원심분리하여 혈청을 수득한 다음 Cobas E411 프로게스테론 진단기기 (Roche, Ltd, Switzerland)를 사용하여 분석하였다. 프로게스테론 농도가 4.0~7.5ng/mL가 되면 배란일로 간주하였다. (Lee et al., Nature, 4;436(7051):641, 2005)
배란된 난자의 성숙 시기는 배란 후 48~72시간째 인 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 배란 후 70~90시간째의 난자를 다음과 같은 방법으로 회수하였 다. 먼저, 체내 성숙 난자의 채취시기에 이른 암캐에 전처치로 엔로프록사신(Enlofloxacin), 세파졸린 (Cefazolin), 아트로핀 설페이트(Atropin sulfate, 0.05mg/kg)를 투여하고 전마취로 아세프로마진 말레이트(acepromazine maleate, 0.025mg/kg)와 케타민(ketamine, 5mg/kg)을 투여하여 마취시켰다. 전마취 상태의 실험견은 수술시에는 이소플루란(isoflurane)을 투여함으로써 유지하였다.
상기 마취된 개를 대상으로 무균적으로 외과 수술을 수행하여 중간 복부 부분을 5~10cm를 절개하여 난관이 노출되도록 하였다. 그 다음 특수 제작된 경구용 존대를 난관 복강구에 삽입하고 삽입된 존대가 고정되도록 일시적으로 봉합사를 이용하여 상기 존대를 고정시켰다. 그 다음, 난관-자궁 접합부에 24 게이지 IV 카테터를 장착하여 난자 회수용 배지(표 1)를 관류시킴으로써 관류액이 16게이지 니들쪽으로 흘러 나가게 하였다. 상기 관류액을 멸균 페트리 디쉬에 회수하고 현미경으로 검경하여 성숙 난자를 선별하였다.
난자 회수용 배지
성분 함량
TCM powder 1L 용 (Gibco 31100-027) 9.9g
Penicillin/ Streptomycin 1%
HEPES 완충액 2.38g
FBS 10%(v/v)
NaHCO3 0.1680g
BSA 5mg/L
< 실시예 2> 수핵 난자의 탈핵
헤페스-버퍼를 첨가하여 제조한 TCM-199 배지(표 2)에 0.1%(v/v) 히알루로니다제(Sigma, USA)를 첨가한 후 상기 실시예 1에서 수득한 난자를 넣고 반복적으로 피펫팅함으로써 난구세포를 제거하였다. 그 다음 난구세포가 제거된 난자를 5㎍/mL 비스벤지미드(Hoechst 33342)로 15분간 염색하고 형광 도립 현미경을 이용하여 × 200의 배율로 관찰하여 제1극체가 확인된 난자만을 선별하였다. 10%(v/v) FBS가 첨가된 TCM-199(표 2)에 선별된 난자를 넣고 미세조작장치(micromanipulator, TE2000-E; Nikon Corporation, Tokyo, Japan)를 이용하여 탈핵을 수행하였다. 즉, 홀딩 마이크로 피펫(150㎛ 직경)으로 수핵 난자를 고정한 후 제1극체와 난자 핵 그리고 일부 세포질(5% 이하)을 제거하였다. 상기 과정을 거쳐 탈핵된 난자는 10%(v/v) FBS가 첨가된 TCM-199 배지(표 2)에 넣어 보관하였다.
TCM-199 배지 조성
성분 함량
TCM199 liquid 89ml
pyruvic acid 0.0099g
Penicillin/ Streptomycin 1%
FBS 10%
< 실시예 3> 공여 핵 세포의 제조
공여 핵 세포로는 개로부터 수득한 성체섬유아세포를 사용하였다. 이를 위해 먼저 골든 리트리버 (Golden Retriever, 5살)의 복부 피부 조직을 분리하였다. 상기 복부 피부 조직을 DPBS (Dulbecco hosphate Buffered Saline)로 3회 세척하고 외과용 칼로 잘게 세절하였다. 상기 세절한 피부조직을 20% (v/v) FBS가 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지(DMEM Life Technologies, Rockville, MD)와 여과한 4mg/ml의 교원질 분해 효소(collagenase; Type II, Life Technologies)를 6:1의 비율로 혼합한 배지에 넣고 38℃, 5.0% CO2의 조건 하의 포화습도 배양기에서 24시간 동안 처리하였다. 교원질 분해 효소(collagenase)에 의해 분해된 세포를 Ca2+ 및 Mg2+ 무첨가 DPBS로 2회, 10% (v/v) FBS가 첨가된 DMEM으로 1회 각각 300ㅧ g로 3분간 원심 분리하여 세척한 후 100mm 플라스틱 배양용 접시에 옮겼다. 그 다음 상기 세포를 10%(v/v) FBS, 0.1mM 베타 머캅토에탄올, 1mM 글루타민, 25mM NaHCO3 및 1%(v/v) 최소 필수 배지 비필수 아미노산 용액(Life Technologies)이 첨가된 DMEM 배지에서 38℃, 5.0% CO2의 조건 하의 포화습도 배양기 내에서 6~8일간 배양하였다. 부착되지 않은 세포는 제거하고 부착된 나머지 세포는 0.1% 트립신 및 0.02% EDTA를 이용하여 1분간 트립신 분해하여 4 내지 6일 간격으로 계대배양하였다. 그 다음 70%(v/v) DMEM, 10%(v/v) DMSO 및 20% (v/v) FBS로 이루어진 냉동용 배지에 넣고 -196℃의 액체 질소에 보관하였다.
< 실시예 4> 탈핵 난자에 공여 핵 세포의 미세주입 및 융합
상기 <실시예 2>에서 제조한 탈핵 난자에 상기 <실시예 3>에서 제조한 공여 핵 세포를 미세주입하였다. 상기 <실시예 2>의 미세조작장치상의 절개용 피펫을 이식용 피펫으로 교체한 후 정치된 탈핵 난자를 헤페스-버퍼를 첨가하여 제조한 TCM-199 배지(표 2) 처리하고 탈핵 난자의 절개창을 고정용 피펫으로 고정한 다음 이식용 피펫을 절개창으로 삽입하여 <실시예 3>에서 단일세포로 분리된 섬유아세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입하였다.
상기에서 공여 핵 세포가 주입된 난자를 융합 배지(0.3M 만니톨, 0.1mM MgSO4, 0.5mM 헤페스 및 0.05% BSA)에 넣고 스테인레스 스틸 전극이 장착된 세포 융합 챔버(BTX 453, 3.2mm gap; BTX, San Diego, CA)로 옮겼다. 3분간 평형시킨 다음 BTX 전기-세포 조작장치(Electro-Cell Manipulator)를 이용하여 상기 난자를 전압 1.8kv/cm으로 15㎲간 직류 전류를 1회 통전하여 핵 이식란을 융합시켰다. 융합된 핵 이식란을 입체 현미경으로 검경하여 1,095개를 선별하였고 이를 mSOF(modified synthetic oviductal fluid)(표 3)에서 2시간 동안 배양하였다.
mSOF의 조성
성분 부피
NaCl(54.44) KCl(74.55) KH2PO4(136.1) Sod. Lactate Kanamycin Phenol-Red 2.900-3.100g/ml 0.2669g 0.0810g 0.28ml 0.0375g 0.0050g Stock-T 2ml
NaHCO3(84.01) 1.0531g/50ml Stock-B 2ml
Sod. Pyruvate(110.0) 0.0182g/5ml Stock-C 200㎕
MgCl26H2O(147.0) 0.0996g/10ml Stock-M 200㎕
CaCl22H2O(203.3) 0.2514g/10ml Stock-D 200㎕
Glucose (180) 0.27024g/10ml 200㎕
Glutamine (146.1) 0.14618g/10ml 200㎕
Citric Acid(192) 0.096g/10ml Stock-CA 200㎕
HEPES(238.3) 0.5958g/10ml Stock-E 200㎕
EAA(Gibco 11051-018) 400㎕
NEAA(Gibco 11140-019) 200㎕
ITS(I-3146) 100㎕
BSA(fatty acid free) 0.1600g
Hyaluronic Acid 0.5mg/ml
1N NaOH 총 20ml
Distilled water 총 20ml
< 실시예 5> 핵 이식란의 활성화
상기 <실시예 4>의 핵 이식란을 10μM 이오노포어(Sigma)가 함유된 mSOF에 넣고 39℃에서 4분간 배양한 다음 세척하고 1.9mM 6-디메틸아미노퓨린이 첨가된 mSOF(표 3)에서 38~39℃의 5% 이산화탄소, 5% 산소가 유지되는 배양기에서 2시간 배양하여 활성화시켰다.
또한, 본 발명자들은 상기에서 제조한 핵 이식란 중 하나를 2008년 5월 6일자로 한국생명공학연구원 유전자은행 (KCTC, 대전 광역시 유성구 어은동 52번지)에 기탁번호 KCTC 11331BP로 기탁하였다.
< 실시예 6> 대리모 이식 및 복제견의 생산
상기 <실시예 5>의 핵 이식란을 외과적 수술방법에 의해 대리모의 난관에 이식하였다. 이식은 핵 이식란을 활성화한 후, 대리모의 준비상태에 따라 수행하였다. 즉, 대리모가 바로 준비되는 경우에는 이식을 바로 수행하였다. 대리모는 질병에 이환되지 않으며 정상적인 발정주기가 반복되며 자궁상태가 정상인 잡종견을 사용하였다. 이를 위해 먼저 전처치 과정으로 대리모에 0.1mg/kg 아세프로마진(acepromazine)과 6mg/kg 프로포폴(propofol)을 혈관주사하여 마취시켰고, 2% 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 흡입마취상태를 유지하였다. 마취된 개의 수술부위를 무균처리하고 난관을 노출시키기 위해 일반적인 개복수술법에 따라 배 중앙부분을 5~10cm 절개하였다. 절개창을 최소화하기 위해 난소 고리(Ovarian hook)를 이용하여 난소와 난관 및 자궁을 절개창으로 견인하였다. 견인된 난소의 난소간막을 조심스레 다루어 난관의 개구부를 인지하고 1.0ml 튜버큘린(tuberculin) 주사기(Latex free, Becton Dickinson & CO. Franklin lakes, NJ 07417)가 장착된 3.5F 톰캣 카테터(Tom cat catheter, Sherwood, St. Louis, MO)를 난관 내로 넣어 카테터 전방에 충분한 공간을 확보하고 핵 이식란을 주입하였다.
수술 후 감염을 방지하기 위하여 광범위 항생제를 3일간 투여하였다. 임신여부는 대리모에 핵 이식란을 이식한 후 25일째에 3.5 MHZ 커브드 프로브가 장착된 SSD-900 초음파 스캐너 (Aloka Co. LTD, Japan)를 이용하여 검사하였다. 임신상태는 초기에 임신을 확인한 후 매주 모니터하였다.
그 결과, 4마리의 개에게서 임신 사실을 확인하였다. 그 중 한 마리는 유산하였고, 나머지 한 마리로부터 핵 이식란을 이식한지 60일 후에 2007년 3월 25일 자연분만으로 2마리의 복제견이 분만되었다. 두 마리 중 한 마리 복제견의 체중은 360g으로 건강하였으나 다른 한마리는 분만후 만 하루만에 사망하였다. 복제견의 이름은 "수덕;SooDog"(Soo-am dog)으로 명명하였다. 또한, 두 마리의 대리모에서 핵 이식란을 이식한지 60일 후에 2007년 4월 14일 자연분만으로 복제견을 분만하였고 이름은 "아리;Ari"라 명명하였고, 2007년 5월 4일 제왕절개 수술로 복제견을 분만하였고 이름은 "주몽;Joomong"으로 명명하였다.
< 실험예 1> 복제견의 유전적 동질성 조사
본 발명의 방법에 따라 상기 <실시예6>에서 수득한 복제견과 <실시예 3>의 체세포를 제공한 공여견의 체세포 게놈 정보가 동일한지 조사하기 위해 복제견, 공여견의 체세포, 대리모, 체세포에서 게놈 DNA를 분리한 후 유전정보를 비교하였다. 태어난 복제견과 대리모로부터는 피부조직의 단편을 회수하였다. 공여견의 체세포는 계대 배양하여 분석에 사용하였다. 각각의 시료는 -80℃ 냉동고에 보관하였다가 페놀 추출 및 에탄올 침전을 수행하여 게놈 DNA를 얻었다.
분리한 DNA를 50ul TE buffer에 용해시키고 개과 동물에 특이적인 마커 <PEZ1, FHC 2054, FHC 2010, PEZ5, PEZ20, PEZ12, PEZ3, PEZ6, PEZ8, FHC 2079>(Ref: Canine STR analyses in forensic practice: Observation of a possible mutation in a dog hair. Int J Legal Med (2002) 116 :286-288)를 이용하여 마이크로 세틀라이트 분석을 하였다. 즉, 게놈 DNA상에 위치한 마커들의 서열을 기초로 하여 형광 표지된 특이적 프라이머를 작제하고, PCR를 이용하여 유전자를 증폭하여 이를 자동 DNA 분석기(ABI 373: Applied Biosystems,Foster City, CA)로 확인하였다. PCR 수행 조건은 94℃에서 1분간 1회 전변성시킨 후 94℃에서 20초간 변성, 58℃에서 20초간 어닐링, 74℃에서 20초간 신장하는 단계를 30회 수행하고 74℃에서 5분간 1회 후신장 단계를 거치도록 하였다.
Figure 112009026483499-PAT00001
실험 결과, 복제견 Soodog은 공여견인 골든 리트리버로부터 분리한 체세포와 유전적으로 완전한 동일형임을 확인할 수 있었다. 반면, 복제견 Soodog과 대리모 (잡종견)은 유전적으로 상이함을 확인할 수 있었다.(표 5)
Figure 112009026483499-PAT00002
< 실험예 2> 개과 동물의 난자 회수 최적기 판단방법
최적의 개과 동물의 성숙 난자를 회수하기 위하여, 상기 실시예1과 동일한 방법으로 혈장 프로게스테론 농도가 3.5~4.5ng/mL일 때를 배란일로 보고 시간이 경과됨에 따라 회수된 성숙 난자의 개수를 확인하였다.
실험 결과, 개체별로 혈장 프로게스테론이 급하게 상승하는 그룹의 경우 70-80시간째 회수하는 것이 성숙 난자 회수율이 87.6%인 것으로 나타나 난자 회수의 최적기였다. 반면 천천히 상승하는 그룹의 경우 80-90시간째 회수하는 것이 성숙 난자 회수율이 87.6%인 것으로 나타나 난자 회수의 최적기였다.
Figure 112009026483499-PAT00003
< 실험예 3> 핵 이식란의 전기적 융합 조건의 최적화
핵 이식란의 전기적 융합 조건을 최적화하기 위하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 탈핵 난자에 공여 핵 세포를 미세주입한 후 전압조건을 각각의 조건으로 달리하여 융합시킨 다음 융합된 핵 이식란을 입체 현미경으로 검경하여 융합여부를 확인하였다. 공여 핵 세포가 주입된 난자를 융합 배지(0.3M 만니톨, 0.1mM MgSO4, 0.5mM 헤페스 및 0.05% BSA)에 넣고 스테인레스 스틸 전극이 장착된 세포 융합 챔버(BTX 453, 3.2mm gap; BTX, San Diego, CA)로 옮겼다. 3분간 평형시킨 다음 BTX 전기-세포 조작장치(Electro-Cell Manipulator)를 이용하여 상기 난자를 전압 조건 각각 1.3kv/cm로 15㎲간 또는 30㎲간, 1.8kv/cm로 15㎲간 또는 30㎲간, 2.3kv/cm로 15㎲간 또는 30㎲간 직류 전류를 1회 통전하여 핵 이식란을 융합시켰다. 융합된 핵 이식란을 입체 현미경으로 검경하여 187개를 선별하였고 이를 mSOF(modified synthetic oviductal fluid)(표 3)에서 2시간 동안 배양하였다.
실험 결과, 전압 조건이 1.3kv/cm일 때 약 65%, 1.8kv/cm일 때 약 85%, 2.3kv/cm일 때 약 70%의 융합율을 보여, 1.8kv/cm일 때 융합율이 가장 높은 것으로 확인되었다. 시간별 융합율은 큰 차이를 나타내지 않았다(표 7).
Figure 112009026483499-PAT00004
< 실험예 4> 개과 동물 핵 이식란의 활성화 조건의 최적화
상기 <실시예 4>에서 수득한 핵이식란을 10μM 이오노포어(Sigma)가 함유된 mSOF에 넣고 39℃에서 4분간 배양한 다음 세척하고 1.9mM 6-디메틸아미노퓨린이 첨가된 mSOF(표 3)에서 38~39℃의 5% 이산화탄소, 5% 산소가 유지되는 배양기에서 2 또는 4시간 배양하여 콘포칼 현미경 (Eclipse C1si, Nikon Corporation, Tokyo, Japan)을 이용해 염색질의 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 4시간 배양시보다 2시간 배양시 농축 염색질과 발달 중기형 염색질이 많은 것으로 나타났다. 농축 염색질과 발달 중기형 염색질이 많은 것이 최적의 배아 조건이다. 따라서, 핵이식란은 핵융합 이후 6-디메틸아미노퓨린 첨가된 mSOF(표 3)에서 2시간 처리하는 것이 이상 염색질 형성을 저해하고 농축 염색질과 같은 양질의 핵이식란을 획득할 수 있는 최적의 조건이었다.
Figure 112009026483499-PAT00005
본 발명은 우량 동물의 번식, 희귀·멸종동물의 보존, 특정영양물질의 생산, 치료용 생체물질 생산, 장기이식용 동물 생산, 질병질환 동물 생산, 세포·유전자 치료와 같은 의학적으로 가치를 지니는 장기이식 대체용 동물의 생산 등과 같은 분야에서 넓게 활용될 수 있다. 복제동물을 생산할 수 있는 능력은 장차 의약학, 수 의학 등 산업분야에서 무한한 이용가능성이 잠재된 것으로 기대되고 있으므로, 복제동물의 생산은 기술혁신의 실로 획기적인 개가라고 할 수 있다. 이러한 복제된 개의 생산 방법의 기본 원리는 또한 다른 동물들을 복제하는데에도 응용될 수 있으므로, 향후 구체적 세부기술의 개발 여하에 따라 적용될 수 있는 동물의 범위도 넓어질 수 있을 것으로 전망된다.
도 1는 본 발명의 방법에 따라 생산된 복제란의 핵융합 이후 배양 시간에 따른 염색질의 변화를 나타낸 사진이다. A-C) 핵 융합 이후 2시간 배양시 염색질; A-B) 농축 염색질; C) 발달 중기형 염색질; D-F) 핵 융합 이후 4시간 배양시;의 염색질의 변화를 나타낸 사진이다.
도 2은 본 발명의 방법에 따라 생산된 복제견 25주령의 수덕의 사진(a) 및 복제견 22주령의 아리의 사진(b) 및 복제견 19주령의 주몽의 사진이다.
<110> HWANG, Woo Suk <120> Cloning Method of Canids <150> KR 10-2008-0040756 <151> 2008-04-30 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PEZ1 <400> 1 ggctgtcact tttccctttc 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PEZ1 <400> 2 caccacaatc tctctcataa atac 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for FHC 2054 <400> 3 gccttattca ttgcagttag gg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for FHC 2054 <400> 4 atgctgagtt ttgaactttc cc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for FHC 2010 <400> 5 aaatggaaca gttgagcatg c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for FHC 2010 <400> 6 ccccttacag cttcattttc c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PEZ5 <400> 7 gctatcttgt ttcccacagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PEZ5 <400> 8 tcactgtata caacattgtc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PEZ20 <400> 9 cctaaattag aggtctaacc 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PEZ20 <400> 10 gtaagcggga atgtgctcct c 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PEZ12 <400> 11 gtagattaga tctcaggcag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PEZ12 <400> 12 taggtcctgg tagggtgtgg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PEZ3 <400> 13 cacttctcat acccagactc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PEZ3 <400> 14 caatatgtca actatacttc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PEZ6 <400> 15 atgagcactg ggtgttatac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PEZ6 <400> 16 acacaattgc attgtcaaac 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PEZ8 <400> 17 tatcgacttt atcactgtgg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PEZ8 <400> 18 atggagcctc atgtctcatc 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for FHC 2079 <400> 19 cagccgagca catggttt 18 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for FHC 2079 <400> 20 attgattctg atatgcccag c 21

Claims (16)

  1. (a) 개과 동물의 난자로부터 탈핵난자를 제조하는 단계; (b) 개과 동물의 조직으로부터 체세포를 분리하여 공여 핵 세포를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 탈핵 난자에 상기 공여 핵 세포를 주입하고, 전압이 1.3~2.3 kV/cm인 조건으로 전기 융합시키는 단계;를 포함하여 이루어지는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법으로 제조된 개과 동물의 핵 이식란.
  2. 제 1항에 있어서, 기탁번호 KCTC 11331BP인 핵 이식란.
  3. 제 1항에 따른 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는 복제된 개과 동물의 생산방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 핵 이식란은 기탁번호 KCTC 11331BP인 핵 이식란인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 따른 방법에 의하여 생산된 복제된 개과 동물.
  6. (a) 개과 동물의 난자로부터 탈핵난자를 제조하는 단계; (b) 개과 동물의 조직으로부터 체세포를 분리하여 공여 핵 세포를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 탈핵 난자에 상기 공여 핵 세포를 주입하고, 전압이 1.3~2.3 kV/cm인 조건으로 전기 융합시키는 단계;를 포함하여 이루어지는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 개과 동물의 난자는 개과 동물의 생체 내로부터 회수된 것임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 생체 내로부터 난자의 회수는 개과 동물의 배란일로부터 75 ~ 90 시간에 수행하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 6 항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 체세포는 개과 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 적혈구, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아세포, 태좌세포 및 배아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 6 항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 전기융합은 직류 전압 1.3~2.3 kV/cm 조건으로 15~45 ㎲ 동안 1~3 회 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 7 항에 있어서, 상기 융합된 난자의 활성화는 융합된 난자에 직류전압 1.3~2.3 kV/cm 조건으로 15~45 ㎲ 동안 1~3 회 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 7 항에 있어서, 상기 융합된 난자의 활성화는 DMAP (6-dimethyl aminopurine)를 2~4시간 동안 융합된 난자에 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 6 항에 있어서, 상기 개과 동물이 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및 너구리로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  15. (a) 개과 동물의 난자로부터 탈핵난자를 제조하는 단계; (b) 개과 동물의 조직으로부터 체세포를 분리하여 공여 핵 세포를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 탈핵 난자에 상기 공여 핵 세포를 주입하고, 전기 융합시키는 단계;를 포함하여 이루어지는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 개과 동물의 난자는 개과 동물의 배란일로부터 75 ~ 90 시간에 생체 내로부터 회수된 것임을 특징으로 하는 방법.
  16. (a) 개과 동물의 난자로부터 탈핵난자를 제조하는 단계; (b) 개과 동물의 조직으로부터 체세포를 분리하여 공여 핵 세포를 제조하는 단계; (c) 상기 탈핵 난자에 상기 공여 핵 세포를 주입하고, 전기 융합시키는 단계; 및 (d) 융합된 난자를 활성화시키는 단계를 포함하여 이루어지는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 융합된 난자의 활성화는 DMAP (6-dimethyl aminopurine)를 2~4시간 동안 융합된 난자에 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
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