KR101832485B1

KR101832485B1 - 목적유전자를 조건적으로 발현하는 복제된 개과동물의 생산방법

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Publication number: KR101832485B1
Application number: KR1020110010193A
Authority: KR
Inventors: 이병천; 오현주; 박정은; 김민정; 김건아; 권모선; 구본철; 장구; 김태완
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-02-01
Filing date: 2011-02-01
Publication date: 2018-04-16
Also published as: KR20120089067A

Abstract

본 발명은 특정 유전자의 도입 및 체세포 핵이식 기술을 이용하되, 특히 Tet-on system을 이용하여 복제된 개과동물에서 목적유전자를 조건적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 체세포에 목적유전자 및 rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터(reverse tetracycline transactivator) 서열을 도입한 후, 핵이식 복제 기술을 접목하여 목적유전자를 조건적으로 발현시킬 수 있는 복제된 개과동물을 제공함으로써, 형질전환된 복제개과동물의 안정적인 성장 및 목적유전자 발현 시기의 조절이 가능하다. 이로써 본 발명은 인간 및 동물의 질환모델동물 또는 면역거부반응 없이 인체에 이식가능한 장기나 치료용 세포를 공급하는 동물의 생산 가능성을 제공한다.

Description

목적유전자를 조건적으로 발현하는 복제된 개과동물의 생산방법{Method for Producing Cloned Canidae Conditionally Expressing Transgene}

본 발명은 특정 유전자의 도입 및 체세포 핵이식 기술을 이용하되, 특히 Tet-on system을 이용하여 복제된 개과동물에서 목적유전자를 조건적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다.

형질전환 동물생산을 위한 목적유전자 도입방법으로 고든 (Gordon) 등이 제시한 전핵 내 미세주입법 (pronuclear microinjection)이 있는데 이 방법은 목적유전자를 수정란의 전핵에 직접주입하는 방법으로 마우스를 비롯한 실험동물에서 많이 이용되고 있지만 산업동물에서는 극히 낮은 생산효율 (소 0.5 %, 돼지1.5 %, 양2.5 %)과 모자이키즘 (Mosaicism)이 대부분의 경우에 나타나는 단점이 있다. 이를 극복하기 위해 목적유전자가 도입된 형질 전환체세포를 이용한 동물복제기술이 대안으로 제시되고 있다. 형질전환동물 복제기술은 유전자가 도입된 세포만을 핵이식함으로써 모자이키즘이 없는 100％ 형질전환 핵 이식란을 생산하여 대리모이식을 통해 형질전환복제동물을 효율적으로 생산할 수 있다. 또한 이 과정에서 체세포의 성을 미리 판별하여 인위적으로 태어나는 복제동물의 성을 조절할 수 있어 산업적 유용성이 극대화될 수 있다.

형질전환복제동물 생산을 위한 유전자도입 기술의 기본 단계로 RFP (red fluorescent protein) 또는 GFP (green fluorescent protein) 유전자의 도입이 실험되고 있다. 이는 염색체 단백질 표지 및 특정 염색체부위의 태깅 (tagging)의 용이성, 세포질의 많은 단백질과 결합이 가능하며 그 무해성으로 인한 것이며, 살아있는 세포에서 같은 성질의 세포골격사 (cognate cytoskeletal filaments)를 발현시키는데 많이 이용되고 있다. 1994년 샬피 (Chalfie)등은 해파리 (Aequorea victoria)에서 얻은 RFP를 형광성 단백질 인식지표로 적용하여 돼지의 배아를 비롯한 살아있는 세포의 다양한 분자생물학적 변화를 관찰하였다. 이후 더욱 기능이 향상된 ERFP (enhanced RFP)가 개발되어 여러 동물에서 마커 유전자 (marker gene)로 이용되고 있다.

그러나, 형질전환을 위한 목적유전자 도입에 있어, 실험적으로 널리 이용되는 GFP, RFP의 경우는 그 무해성으로 문제가 없으나, 실질적으로 다른 목적유전자를 도입할 경우, 목적유전자가 배아발달 시기에서 지속적으로 발현되어 심각한 발달 장애가 발생하는 경우가 대부분이며, 이에 의해 배아발달기 이후에 발현되는 유전자를 이용할 수 없고, 연구할 수도 없는 문제가 있어온 바, 형질전환동물의 안전한 성장 이후에 목적유전자를 조건적으로 발현시키는 기술의 개발이 필요한 실정이었다.

이에 조건적으로 유전자를 발현시키기 위한 연구가 진행되어 왔으며, 그 중 널리 쓰이는 tetracycline-inducible system (Tet-off system)의 개발은 1992년 처음으로 개발되었으나 (Gossen et al., Proc . Natl . Acad . Sci., 89:5547-5551, 1992), 현재까지는 주로 설치류와 닭에서 적용되어 오고 있다. Original system은 두 종류의 형질전환 주를 제작하되, 하나는 유전자에 transactivator를 지닌 것이고 다른 하나는 inducible promoter를 지닌 것으로 제작하여, 두 주를 교배시켜서 transactivator와 inducible promoter를 모두 가지고 있는 후손에서만 inducible system이 작동하게 되는 원리를 이용한 것이다.

그러나 마우스의 경우 번식주기가 4~5일이고, 임신기간이 19~21일, 성 성숙이 4-7주 (Laboratory animal medicine, 2^nd edition)인 반면에, 대동물은 일반적으로 교배가 쉽지 않다. 특히 대동물 중 개는 일년에 한 두 번 밖에 발정이 오지 않고, 임신기간은 63일이고, 성 성숙이 되는데 걸리는 시간도 9~12개월로 설치류와 비교하여 한 세대에서 다음 세대로 넘어가는데 걸리는 시간이 매우 길다. 또한 설치류보다 더 넓은 사육공간 및 유지시설이 필요하다. 따라서 기존의 방법을 사용하여 inducible system을 개에 도입하는 것은 시간과 비용적 측면에서 감당할 수 없을 뿐 아니라 인력의 소모도 극심하였다.

이러한 문제점을 극복하고자, transactivator와 inducible promoter를 모두 포함하는 single-cassette Tet-off system을 도입하는, 한단계 업그레이드 된 system이 개발되었다. 2006년, 대동물에서는 최초로 transactivator와 inducible promoter를 모두 포함하는 single-cassette Tet-off system을 poliovirus를 이용하여 도입함으로써, 형질전환돼지가 생산된 것이 보고된 바 있다 (Kue et al., FASEB Journal, 20:1200-1202, 2006). 그러나, Kue 등이 생산한 형질전환돼지의 경우와 같이, microinjection (전핵내미세주입) 방법을 이용하여 형질전환동물을 생산할 경우, mosaicism의 유발, 다양한 copy number의 목적유전자가 도입으로 인한 동일한 형질의 형질전환동물을 생산하지 못하는 등의 문제가 보고되었다.

한편, 개의 경우 독특한 종-특이적 생식 특성으로 인해 다른 가축에 비해 체세포핵이식에 의한 복제가 매우 어렵다는 것이 여러 차례 보고된 바 있다.

본 발명자는 상기 문제점을 해결하기 위하여, 중, retrovirus를 이용한 핵공여세포 형질전환 후, 체세포핵이식 기법을 이용하면, microinjection에 의해 유발되는 문제점을 해결할 수 있으며, germ line transmission까지 확보가 됨을 발견하고, 형질전환된 복제개의 생산방법을 발명한 바 있다 (한국 공개특허 제10-2009-0075637호).

이에 본 발명자는 배아발달기 이후에 발현되는 유전자의 현실적 발현을 위해 목적유전자를 조건적으로 발현 (Tet-on) 하는 형질전환 복제개를 만들기 위해 연구하던 중, single-cassette Tet-off system과 개의 체세포핵이식기법을 접목시켜 개과동물에 최적화된 Tet-on system을 개발하고, 최초로 Tet-on system이 작동하여, 목적유전자를 조건적으로 발현하는 개 (산자)를 성공적으로 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 특정 유전자의 도입 및 체세포 핵이식 기술을 이용하되, 특히 Tet-on system을 이용하여 복제된 개과동물에서 목적유전자를 조건적으로 발현시키는 방법 및 특정 유전자를 조건적으로 발현하는 개과동물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 개과동물에서 채취한 체세포주로부터 공여 핵 세포를 준비하고, 목적유전자 및 rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터 서열을 함유하는 DNA 구조체를 상기 공여 핵 세포에 도입하여 발현시키는 단계; (b) 상기 목적유전자 및 rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터 서열이 도입된 공여 핵 세포를 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 공여 핵 세포를 탈핵된 개 수핵난에 이식하여 형질전환된 핵이식란을 제조한 다음, 활성화시키는 단계; 및 (d) 상기 활성화된 핵이식란을 대리모에 이식하여 산자를 생산하는 단계를 포함하는, 목적유전자를 조건적으로 발현시키는 복제된 개과동물의 생산방법 및 복제된 개과동물을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 개과동물에서 채취한 체세포주로부터 공여 핵 세포를 준비하고, 목적유전자 및 rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터(reverse tetracycline transactivator) 서열을 함유하는 DNA 구조체를 상기 공여 핵 세포에 도입하여 발현시키는 단계; (b) 상기 목적유전자 및 rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터 서열이 도입된 공여 핵 세포를 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 공여 핵 세포를 탈핵된 개 수핵난에 이식하여 형질전환된 핵이식란을 제조한 다음, 활성화시키는 단계; (d) 상기 활성화된 핵이식란을 대리모에 이식하여 산자를 생산하는 단계; 및 (e) 산자의 성장 이후 테트라싸이클린(tetracycline)계열 화합물을 처리하여 목적유전자를 발현시키는 단계를 포함하는 복제된 개과동물에서 목적유전자를 조건적으로 발현시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 체세포에 목적유전자 및 rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터(reverse tetracycline transactivator) 서열을 도입한 후, 핵이식 복제 기술을 접목하여 목적유전자를 조건적으로 발현시킬 수 있는 복제된 개과동물을 제공함으로써, 형질전환된 복제개과동물의 안정적인 성장 및 목적유전자 발현 시기의 조절이 가능하다. 이로써 본 발명은 인간 및 동물의 질환모델동물 또는 면역거부반응 없이 인체에 이식가능한 장기나 치료용 세포를 공급하는 동물의 생산 가능성을 제공한다.

도 1은 유전자 도입을 위하여 구축한 pTet2-GPTW 벡터의 모식도이다.
도 2는 디옥시싸이클린을 처리하지 않은 형질전환체세포 (Dox (-))과 디옥시싸이클린을 처리한 형질전환체세포 (Dox (+))의 사진 및 형광이미지 사진이다.
도 3은 디옥시싸이클린(1ug/ml)을 5일간 처리한 후 중단하였을 때 날짜별로 형광 감도를 나타낸 그래프이다 (1 ~ 13일).
도 4는 Tet-on eGFP 2와 Tet-on eGFP 3 형질전환 복제개의 생후 3일째 사진이다.
도 5는 Tet-on eGFP 개들에게 eGFP 유전자가 있는지 여부를 검사한 서던 블롯 결과를 나타내는 젤 사진이다 (P: Tet-on eGFP 세포, N: 정상개).
도 6은 Tet-on eGFP 2 개의 모든 부위에 eGFP 유전자가 있는지 여부를 검사한 서던 블롯 결과를 나타내는 젤 사진이다 (P: Tet-on eGFP 세포, N: 정상개).
도 7은 Tet-on eGFP 3 개에 디옥시싸이클린을 처리하였을 때 (2주차) 및 처리 중단하였을 때(9주차) 발바닥 사진 및 형광 사진이다.
도 8은 Tet-on eGFP 3 개의 피부조직에 eGFP가 발현되는지 여부를 2, 3, 6, 9주차 피부조직을 이용하여 살펴본 웨스턴 블롯결과 이다(P: Tet-on eGFP 세포, N: 정상개).
도 9는 Tet-on eGFP 3 개 및 그가 출산한 4마리의 강아지의 사진이다.
도 10은 Tet-on eGFP 3 개가 출산한 4마리의 강아지 중 3마리에게 eGFP 유전자가 검출됨을 확인한 PCR 결과 사진이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 ‘목적유전자’는 생물체 내에서의 발현되어 각각의 기능을 수행할 수 있는, 사용자의 의도에 부합하는 유전자를 총칭하는 용어로서, 특히, 이러한 목적유전자의 체내 도입 및 발현은 특정 질환의 치료를 위한 유전자 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식란'은 공여 핵 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '공여 핵 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '계대배양 (Subcultury)' 은 세포는 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양 접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양 접시에서 배양하는 방법으로 세포를 증식시키는데 이때 세포를 동물에서 떼어 내어 일차, 이차, 삼차 등등 계속하여 배양하는 방법 즉, 주기적으로 새로운 배지를 교환함으로써 세포주를 보존하는 방법을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '수핵 난자'는 탈핵 과정을 통해 본래의 핵이 제거되고 공여 핵 세포로부터 핵을 전달받는 난자를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '탈핵 난자'는 난자의 핵이 제거된 것을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '융합'은 공여 핵 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마 막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 공여 핵 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 공여 핵 세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '활성화'는 핵 전이 단계 전, 핵 전이 단계 동안 및 핵 전이 단계 후에 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다. 바람직하게는, 본 발명에서는 핵 전이 단계 후 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.

본원 명세서에 사용된 용어 '벡터(vector)'는 외래 유전자를 숙주세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주세포 내로 유입될 수 있어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여야 한다. 상기 벡터에 의하여 특정 유전자에 외래 유전자를 삽입시키거나 특정 유전자 형질발현을 붕괴 (knock-out)시킬 수 있다. 본 발명의 일례에서는 형질전환 핵 이식 배아에 대한 마커인 eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) 유전자를 삽입시켰다.

본 발명에서 사용된 용어 '형질전환 (transgenesis)'은 어떤 생물이 원래는 지니고 있지 않은 외부 유전자를 염색체상에 인위적으로 삽입하거나, 원래 지니고 있는 유전자를 제거하여 그 생물의 유전적 형질 일부를 변화시키는 것이다. 형질전환의 방법은 여러 가지가 있으나 가장 많이 사용되는 방법으로는 지질 매개 유전자 도입 (lipid mediated gene transfer), 정자 매개 유전자 도입 (sperm mediated gene transfer), 전기천공법 (electroporation), 상동성 재조합 (homologous recombination), 미세주입법 등이 대표적이다.

본 발명에서 사용된 용어 '형질전환 동물 (transgenic animal)'은 '유전자 조작 동물' 이라 불리우기도 하며 동물 자신이 원래 가지고 있지 않은 외래의 유전자를 재조합하여, 이를 동물의 염색체 상에 인공적으로 삽입시키거나 원래 가지고 있는 유전자를 상동성 재조합 방법을 이용하여 제거하여, 그 형질의 일부가 변화된 동물을 말한다. 따라서, 본원에서 형질전환 동물은 인간이 필요로 하는 생리활성 물질을 생산하는 생물반응기 (Bioreator), 특정 질환을 유전적으로 나타내는 질환모델 동물, 인간의 이식용 장기 및 치료용 세포 등을 생산할 수 있는 형질전환 동물 등을 의미한다.

본 발명에서 '개과 동물 (canidae)'은 크게 개족 (Tribe Canini)과 여우족 (Tribe Vulpini)으로 나눌 수 있고, 개, 늑대, 재칼, 여우, 승냥이, 너구리, 코요테 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 개 또는 늑대가 포함된다. 상기 개는 야생의 늑대가 가축화된 것으로 알려져 있으며 이에 따라 늑대와 개는 염색체 수가 동일하고 임신기간, 성 호르몬의 변화가 유사한 양상을 나타낸다 (Seal US et al ., Biology Reproduction, 21:1057-1066, 1979). 본 발명에 있어서 상기 '개과 동물'이라는 용어에 대하여, '개'로 단순히 줄여서 혼용하여 쓰기도 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 체세포 단계에서, 특정 목적유전자를 조건적으로 발현시키기 위한 Tet-on 시스템의 도입 기술과 체세포 핵이식 기술을 병합하여, 원하는 특정 목적유전자를 개과동물에서 조건적으로 발현시키는 방법 및 상기 방법에 따라 생산된 복제개에 관한 것이다.

상기 목적유전자를 개과동물에서 조건적으로 발현시키는 방법은 크게,

(a) 개과동물에서 채취한 체세포주로부터 공여 핵 세포를 준비하고, 목적유전자 및 rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터 서열을 함유하는 DNA 구조체를 상기 공여 핵 세포에 도입하여 발현시키는 단계;

(b) 상기 목적유전자 및 rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터 서열이 도입된 공여 핵 세포를 배양하는 단계;

(c) 상기 배양된 공여 핵 세포를 탈핵된 개 수핵난에 이식하여 형질전환된 핵이식란을 제조한 다음, 활성화시키는 단계;

(d) 상기 활성화된 핵이식란을 대리모에 이식하여 산자를 생산하는 단계; 및

(e) 산자의 성장 이후 테트라싸이클린(tetracycline)계열 화합물을 처리하여 목적유전자를 발현시키는 단계.

이 때, (a) 단계의 목적유전자 및 rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터 서열을 함유하는 DNA 구조체는 상기 목적유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 함유하고 있는 것을 특징으로 한다.

목적유전자의 조절을 위한 프로모터는 당 업계에서 일반적으로 쓰이는 프로모터일 수 있다. 바람직하게는 PGK 프로모터일 수 있다.

이하에서는, 상기 목적유전자로서 eGFP 유전자를 선택하여, 상기 eGFP 유전자를 조건적으로 발현시키는 방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명한다. 당업자의 필요에 따라서, 목적유전자가 eGFP 유전자 외 다른 유전자일 수 있음은 자명하다.

제1단계: 수핵 난자의 탈핵

일반적으로 포유동물(예컨대 소, 돼지, 양 등)의 난자는 성숙난자, 즉 제2차 감수분열 중기(metaphase Ⅱ)에 배란되는 것에 반해, 개과 동물의 난자는 다른 동물과는 달리 제1차 감수분열의 전기에 배란되어 난관 내에서 48∼72시간 동안 머물면서 성숙되는 특징이 있다.

수핵 난자는 개과 동물의 미성숙난자, 성숙난자, 초기 노화, 중간노화, 심한 노화 단계의 난자일 수 있다. 바람직하게는, 개에서 회수된 미성숙 난자를 체외에서 성숙시켜 이용하거나 개과 동물의 체내에서 성숙된 난자를 회수하여 이용할 수 있다. 개과 동물의 미성숙 난자는 체외에서의 핵 성숙률이 매우 낮으며, 배란시기 및 번식 생리가 다른 포유동물과는 달라서, 개과 동물의 수핵 난자는 개과 동물의 생체 내에서 성숙된 난자를 회수하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로 개과 동물로부터 성숙 난자의 회수는 개과 동물의 배란이 이루어 진 후 약 48∼72시간째, 보다 바람직하게는 72시간째에 수행하는 것이 가장 바람직하다.

상기에서 개과 동물의 배란일은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 배란일을 결정하는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 질세포 도말검사(vaginal smear), 혈중 호르몬 수준 측정 및 초음파 진단 시스템을 사용할 수 있다. 개과 동물의 발정의 시작은 외음부 팽창 및 장액성 혈액성의 배출 및 수컷의 승가 허용 여부를 통해 확인할 수 있다.

개과 동물의 배란일을 질세포 도말검사와 혈중 프로게스테론 농도 검사를 수행함으로써 결정한 결과 무각화 상피 세포가 80%이상이고 혈중 프로게스테론 농도가 약 4.0ng/mL 이상으로 처음 도달할 때 배란이 이루어짐을 알 수 있었다.

생체 내 성숙 난자를 회수하는 방법으로는 도살장에서 성숙난자를 회수할 수 있다. 보다 구체적으로, 생체 내 성숙 난자의 회수는 당업계에 공지된 방법인 난관 절제법을 사용할 수 있다. 상기 난관 절제법은 난관을 수술적으로 잘라낸 후 배아 수집 배지를 난관 내부에 관류시켜 관류액을 수득하고 상기 관류액으로부터 난자를 회수하는 방법이다.

또한, 생체 내 성숙 난자는 카테터를 난관채에 장착한 후 난관-자궁 접합부위에 주사침을 이용하여 관류액을 주입함으로써 회수할 수 있다. 이 방법은 난관을 손상시키지 않는 장점이 있다.

성숙한 난자를 회수한 다음에는 난자의 반수체 핵을 제거한다. 난자의 탈핵은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(미국특허 제4994384호, 미국특허 제5057420호, 미국특허 제5945577호, 유럽특허 공개공보 제0930009A1, 대한민국특허 제342437호, Kanda et al, J. Vet . Med . Sci., 57(4):641-646, 1995; Willadsen, Nature, 320:63-65, 1986, Nagashima et al., Mol. Reprod. Dev. 48:339-343 1997; Nagashima et al., J. Reprod Dev 38:37-78, 1992; Prather et al., Biol . Reprod 41:414-418, 1989, Prather et al., J. Exp . Zool. 255:355-358, 1990; Saito et al., Assis Reprod Tech Andro, 259:257-266, 1992; Terlouw et al., Theriogenology 37:309, 1992).

바람직하게는, 수핵 난자의 탈핵은 크게 두 가지 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 한 가지 방법으로는 성숙한 수핵 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 미세침을 이용하여 수핵 난자의 투명대 일부를 절개하여 절개창을 형성하고 이를 통하여 제1극체, 난자의 핵 및 세포질(가능한 적은 양)을 제거한다. 다른 방법으로는 수핵 난자의 난구 세포를 제거한 다음 난자를 염색하고 미세 흡입 피펫(aspiration pipette)을 이용하여 제1극체 및 난자의 핵을 제거한다. 보다 바람직하게는, 난자의 탈핵은 수핵 난자의 상태를 육안으로 평가하여 생존율이 높은 난자에 대해서 흡입 방법을 사용하고, 그렇지 않은 난자에 대해서는 절개창을 형성하는 방법을 사용한다.

제2단계: 공여 핵 세포의 준비

체세포 핵이식 기술에 의한 목적유전자를 발현하는 형질전환동물의 생산에는 공여 핵 세포가 필요하다. 본 발명에서의 공여 핵 세포로는 개과동물으로부터 유래된 체세포를 사용한다. 체세포는 도살장에서 수득가능하며, 살아있는 개과동물에서도 얻을 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 사용된 체세포로는 개의 배아세포(embryonic cell), 태아세포(fetus cell), 유세포(juvenile cell), 성체세포(adult cell), 바람직하게는 성체세포로부터 수득될 수 있는 난구, 피부, 구강 점막, 혈액, 골수, 간, 폐, 신장, 근육 및 생식기관 등과 같은 형태의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 체세포로는 태아 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다. 가장 바람직하게는, 개의 태아 및 성체에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.

공여 핵 세포로서 제공되는 상기 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있으며 상기 표본으로부터 이하와 같은 방법을 사용하여 최적화된 조건으로 배양된 단일세포를 수득할 수 있다.

대상동물로부터 조직의 일부를 채취하여 세포를 분리한 다음 기본 조직 배양용 배지에서 배양한 후 세포주기 동기화 유도 물질을 첨가하여 재배양한 다음 완전히 자라면 트립신을 처리하여 회수한 후 공여 핵 세포로 사용할 수 있다.

일 구체예를 들어 설명하면, 우선, 대상동물로부터 조직의 일부를 무균적으로 절개하여 상기 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 수득하고 이를 미세하게 세절하여 트립신으로 처리한 다음 조직 배양용 배지에서 배양한다. 상기 조직 배양용 배지로는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들면, TCM-199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 등이 있다. 조직 배양용 배지에서 3-4일 배양 후에 배양 접시(dish)에 자라는 것을 확인하고, 배양한 후 완전히 다 자라면 트립신 처리하여 일부는 추후 사용을 위하여 동결하여 액체 질소에 보관하며, 나머지는 핵 이식에 이용하기 위하여 계속 배양을 실시한다. 계속하여 배양하여 핵이식에 사용할 세포는 새로운 배양접시에서 배양한 후, 트립신 처리하여 세포를 단일세포로 제조한 후 핵이식에 사용한다.

유전자 도입에 이용될 체세포는 최적조건에서 성장시킨 후 효소처리 (trypsin-EDTA)를 통해 단세포로 만들어 계대배양하면서 최소한 실험 하루 전에 신선한 배양액으로 교체하고, 실시 4시간 전에 다시 신선한 배양액을 공급한다. 생화학적 매개체에 따라 최적의 세포밀도가 될 때까지 세포를 배양하여 유전자를 도입시킨다.

제3단계: 목적유전자 및 rtTA2 ^S - M2 트랜스엑티베이터 서열의 체세포 도입 및 배양

본 발명의 상기 제2단계에서 준비한 공여 핵 세포는, 상기 체세포에 특정 목적유전자를 삽입하거나 조작하여 염색체를 유전자 이식방법이나 유전자 적중법을 이용하여 형질전환시킨 것일 수 있다. 이러한 유전자 이식방법이나 유전자 적중법은 당업계에 공지된 방법이므로 당업자라면 용이하게 실시할 수 있다. 유전자 적중법은 이에 한하는 것은 아니나 예를 들어, 핵이식 후 화학물질에 노출, 불활성화된 바이러스 주입, 전기자극(electroporation) 등의 방법이 있다.

1. 목적유전자 도입용 벡터 제작 및 감염

본 발명의 일 구체예로서, eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) 유전자를 도입할 수 있다. 이 때, 상업적으로 시판되고 있는 레트로 바이러스 벡터 서열을 포함하고 있는 플라스미드 pLHCRW[5'LTR:1-589, psi sequence:659-1468, HygroR:1510-2544, CMVp:2838-3649, DsRed2:3686-4363, WPRE:4409-5000, 3'LTR:5085-5678]을 도입 벡터로 사용할 수 있다.

상기 pLHCRW 플라스미드에, 상업적으로 시판되고 있는 pTRE-Tight(Clontech Mountain View, CA, USA)에 mCMV (minimal cytomegalovirus promoter), eGFP (enhanced green fluorescent protein), PGK (phosphoglycerate kinase promotor), rtTA2^s-M2 (reverse tetracycline transactivator) 및 WPRE (Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element sequence) 서열 (Woodchuck 간염 바이러스 2 게놈 DNA 로부터 cloning)을 함유하는 프래그먼트를 차례로 삽입하여 최종 pTet2-GPTW 플라스미드를 구축할 수 있다. 각 서열정보는 아래와 같다. 또한, 레트로바이러스 생산 세포는 Koo et al.의 제시한 공정에 따라 설계할 수 있다(FASEB, 20: 2251-2260, 2006).

서열번호 1 : TRE-Tight-mCMV

g atctcgagtt tactccctat cagtgataga gaacgtatgt cgagtttact

ccctatcagt gatagagaac gatgtcgagt ttactcccta tcagtgatag agaacgtatg

tcgagtttac tccctatcag tgatagagaa cgtatgtcga gtttactccc tatcagtgat

agagaacgta tgtcgagttt atccctatca gtgatagaga acgtatgtcg agtttactcc

ctatcagtga tagagaacgt atgtcgaggt aggcgtgtac ggtgggaggc ctatataagc

agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagaattc gagctcggta cccggg

서열번호 2 : eGFP

tggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc

tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg

gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg

tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc

ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg

agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg

agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca

acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg

acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca

gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc

tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc

gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg

agctgtacaa gtaaagcggc cgcg

서열번호 3 : PGK promoter

aattcg tcgactagac tcgaggaatt ctaccgggta

ggggaggcgc ttttcccaag gcagtctgga gcatgcgctt tagcagcccc gctgggcact

tggcgctaca caagtggcct ctggcctcgc acacattcca catccaccgg taggcgccaa

ccggctccgt tctttggtgg ccccttcgcg ccaccttcta ctcctcccct agtcaggaag

ttcccccccg ccccgcagct cgcgtcgtgc aggacgtgac aaatggaagt agcacgtctc

actagtctcg tgcagatgga cagcaccgct gagcaatgga agcgggtagg cctttggggc

agcggccaat agcagctttg ctccttcgct ttctgggctc agaggctggg aaggggtggg

tccgggggcg ggctcagggg cgggctcagg ggcggggcgg gcgcccgaag gtcctccgga

ggcccggcat tctgcacgct tcaaaagcgc acgtctgccg cgctgttctc ctcttcctca

tctccgggcc tttcgacctg cagccca

서열번호 4 : rtTA2^s-Mw

atgtcta gactggacaa

gagcaaagtc ataaacggcg ctctggaatt actcaatgga gtcggtatcg aaggcctgac

gacaaggaaa ctcgctcaaa agctgggagt tgagcagcct accctgtact ggcacgtgaa

gaacaagcgg gccctgctcg atgccctgcc aatcgagatg ctggacaggc atcataccca

cttctgcccc ctggaaggcg agtcatggca agactttctg cggaacaacg ccaagtcatt

ccgctgtgct ctcctctcac atcgcgacgg ggctaaagtg catctcggca cccgcccaac

agagaaacag tacgaaaccc tggaaaatca gctcgcgttc ctgtgtcagc aaggcttctc

cctggagaac gcactgtacg ctctgtccgc cgtgggccac tttacactgg gctgcgtatt

ggaggaacag gagcatcaag tagcaaaaga ggaaagagag acacctacca ccgattctat

gcccccactt ctgagacaag caattgagct gttcgaccgg cagggagccg aacctgcctt

ccttttcggc ctggaactaa tcatatgtgg cctggagaaa cagctaaagt gcgaaagcgg

cgggccggcc gacgcccttg acgattttga cttagacatg ctcccagccg atgcccttga

cgactttgac cttgatatgc tgcctgctga cgctcttgac gattttgacc ttgacatgct

ccccggg

서열번호 5 : WPRE

aatcaacct

ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg

ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc

attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt

gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc

attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg

gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact

gacaattccg tggtgttgtc ggggaagctg acgtcctttc catggctgct cgcctgtgtt

gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg

gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc

cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc ctgt

이처럼, 상기 eGFP 유전자를 도입시키는 경우에 사용되는 벡터는 PGK 프로모터를 함유하고 있지만, 각 목적에 필요한 유전자를 함유하는 벡터(DNA 구조체)가 각 목적유전자의 발현에 적합한 프로모터를 함유할 수 있음은 당업자에게 자명한 사항이다. 또한, 상동성 재조합(homologous recombination)을 위하여 목적유전자와 유사한 구조체를 함유할 수 있음도 당업자에게 자명한 사항이다.

본 발명의 일 구체예로서, PT 67 세포(Clontech Mountain View, CA, USA)를 일시적으로 pTet2-GPTW로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 PT 67세포로부터 수득한 바이러스를 이용하여 GP2-293 세포(Clontech Mountain View, CA, USA)를 감염시킨다. pTet2-GPTW-감염된 GP2-293 세포를 2주 동안 하이그로마이신 (150 μg/ml)을 이용하여 선별하고, 이러한 Hyg^R(hygromycin-resistant) 세포들을 pVSV-G(Clontech Mountain View, CA, USA)에로 트랜스펙션 하여 VSV-G 단백질을 발현시킨다.

트랜스펙션 후 48시간 후에 VSV-G 단백질로 포장된 바이러스들을 수득한다. 바이러스를 생산하는 세포를 포함한 모든 세포는 4.5 g/l 글루코오스(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA), 소 태아 혈청(10%) 및 페니실린/스트렙토마이신(100 μg/ml)을 함유하고 있는 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양한다. 상기의 감염 및 트랜스팩션된 GP2-293 세포로부터 수거한 바이러스-함유 배지는 0.45㎛ 포어(pore) 크기의 필터를 통해 여과한 후 개 (beagle)의 섬유아세포들을 감염시키는데 사용한다. 감염과정을 거친 섬유아세포 (Tet-on eGFP 세포)는 하이그로마이신 (150 μg/ml)으로 6일간 선별한다.

본 발명은 다른 관점에서 이러한 목적유전자를 효율적으로 도입시킬 수 있는 벡터에 관한 것이다.

2. 목적유전자가 도입된 공여 핵 세포의 선별, 증식 및 동결보존

바이러스 벡터의 감염을 통하여 목적유전자가 도입된 세포는 하이그로마이신 (150 μg/ml)이 함유된 배지에 6일간 배양하여 목적유전자가 발현하는 세포만을 선발 및 증식시킨 후, 트립신 효소처리에 의해 단세포로 만든다. 이러한 단세포들을 현미경 상에서 자외선 필터를 이용하여 관찰하여 적색을 띄우는 세포만을 선별하여 핵이식에 이용한다.

eGFP 유전자 벡터에 이용된 양성 마커(positive marker)인 하이글로마이신(hyglomycin) 저항유전자는 eGFP 유전자와 함께 세포내로 도입되어 발현되면 하이글로마이신 저항성단백질을 생산한다. 따라서 적중된 세포를 항생제가 포함된 세포배양액에 배양하면 eGFP 유전자 벡터가 도입된 세포는 생존하게 되고, 그 외의 세포들은 항생제의 독성에 의해 사멸되어 일정 시간 후 배양 용기에는 유전자가 적중된 세포만 증식한다.

항생제를 통한 선별 과정이 이루어지면 정상 배양으로 전환하고, 세포의 신속한 증식과 배양시 세포 사멸에 의한 불필요한 손실을 감소시키기 위해 적절한 성장인자와 세포사멸 억제제 등을 첨가하는 방법을 적용한다. 증식 배양한 세포의 효율적 보존을 위해 최적 조건을 확립하여 각 단계마다 동결을 실시한다.

3. 세포 주기 동기화 물질 존재 하에서 목적유전자 및 트랜스엑티베이터가 도입된 공여 핵 세포의 배양 (선택적)

본 발명은 복제 개의 생산 효율을 향상시키기 위하여, 핵 이식 직전 단계에서 목적유전자가 도입된 공여 핵 세포에 세포 주기 동기화 유도 물질을 첨가하여 배양할 수 있다.

사용할 수 있는 세포 주기 동기화 유도 물질로는 Cdk(cyclin-dependent kinase) 저해제로 G0/G1기를 블로킹하는 로스코비틴(Roscovitine); G0/G1기를 블로킹하는 사이클로헥사마이드(Cycloheximide); G0/G1기를 블로킹하는 디엠에스오 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO); Cdk(cyclin-dependent kinase) 저해제로 G1/S기를 블로킹하는 부티로락톤 I(Butyrolactone I); DNA 폴리머라아제 A,D의 저해제로 S 초기를 블로킹하는 아피디콜린(Aphidicolin); 유사분열 중기에서 M기를 블로킹하는 디메콜신(Demecolcine);DNA 복제 저해제로서 S기를 블로킹하는 미모신(Mimosine); 미소관 저해제로서 G2/M기를 블로킹하는 콜치신(colchicine); 및 DNA 토포이소머라아제로서 훽스트 33342(Hoechst 33342) 등이 있고, 각각의 물질에 대한 화학 구조식은 앞서 설명한 바와 같다. 바람직하게는 로스코비틴, 사이클로헥사마이드, 디엠에스오을 사용하고, 더욱 바람직하게는 로스코비틴을 사용할 수 있다.

핵 이식을 하기 직전에, 상기 세포에 로스코비틴을 첨가하여 추가 배양 한 후, 트립신 처리하여 세포를 회수하여 체세포 핵이식을 실시한다. 이 때 첨가하는 로스코비틴의 농도는 바람직하게는 5~30μM, 보다 바람직하게는 10~20μM이며, 배양시간은 바람직하게는 18~72시간, 보다 바람직하게는 24~48시간 동안 배양할 수 있다.

일 구체예로서, 새로운 배양접시에서 배양한 후, 세포의 농도가 약 60% 정도에 달하였을 때 로스코비틴 15μM을 18-24시간 동안 처리한 후, 트립신 처리하여 세포를 단일세포로 제조한 후 핵이식에 사용할 수 있다.

제4단계: 체세포의 핵이식을 통한 핵 이식란의 생산

본 발명은 상기 전 단계에서 형질전환된 공여 핵 세포의 형질을 그대로 지닌 동물을 생산하기 위해 체세포 핵이식(somatic cell nuclear transfer, SCNT) 을 통한 복제기술을 접목한다. 즉, 핵 이식란을 생산한다.

1. 공여 핵 세포의 미세주입 및 융합

제1단계에서 준비한 탈핵 난자에 형질전환된 공여 핵 세포의 미세주입은 이식용 피펫을 사용하여 공여 핵 세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입함으로써 수행한다.

상기에서 공여 핵 세포의 미세주입이 완료된 탈핵 난자는 세포 조작기를 이용하여 전기적으로 공여 핵 세포와 융합시킨다. 전기적 융합에서 전류는 교류 또는 직류일 수 있다. 특히, 전기적 융합에서 전류는 교류 또는 직류일 수 있으며, 바람직하게는 전압이 2.0∼6.0 kV/cm 조건으로 수행할 수 있으며 보다 바람직하게는 직류전압이 3.0∼5.0 kV/cm 조건으로 10∼30 ㎲ 동안 1∼3 회 수행할 수 있다. 가장 바람직하게는, 전압 3.5∼5.0 kV/cm 조건으로 15㎲ 동안 2회 수행할 수 있다.

상기 전기적 융합시의 전압 범위는 지금까지 알려진 다른 종에서의 일반적인 전기적 융합시의 전압 범위보다 매우 높은 특징이 있다. 이 같은 범위는 전기융합의 최적화된 조건으로서, 보다 높은 복제효율로 복제개를 생산할 수 있게 한다.

상기 공여 핵 세포와 난자의 전기적 자극에 의한 융합은 다양한 융합용 배지, 예를 들면 짐머맨 (Zimmerman), 소비톨 (sorbitol) 또는 만니톨 (manintol) 등의 내에서 수행할 수 있다. 바람직하게는 만니톨, MgSO₄, 헤페스, BSA가 혼합된 배지를 사용할 수 있다.

탈핵된 난자에 형질 전환된 체세포핵 이식을 하고, 전기 융합을 실시한 후, 난자의 핵은 리모델링 과정을 겪게 되는데, 이때 리모델링이 원활하게 잘 일어난 증거로, 전기융합 후 약 1시간이 지나면 융합란에서 조숙 염색체 응축 (premature chromosome condensation) 현상이 일어나게 된다. 그리고, 상기 조숙 염색체 응축 과정을 잘 겪은 융합란이 리모델링과 활성화 후 리프로그래밍까지 잘 일어나게 된다고 알려져 있다.

본 발명의 로스코비틴 등의 세포주기 동기화 유도물질을 처리한 공여 핵 세포를 이식한 경우에는, 그렇지 않은 경우에 비하여 더 높은 비율로 조숙 염색체 응축(premature chromosome condensation, PCC)가 일어나며, 융합란의 활성화 후에도 계속적인 핵의 팽윤과 재응축이 일어나게 된다. 특히, PCC(premature chromosome condensation), NE(nuclear enlargement), NS(nuclear swelling)는 핵이 시간에 지남에 따라 정상적으로 발달할 때, 겪게되는 현상들로(핵 리모델링), 시간의 흐름에 따라서 PCC → NE → NS 의 순서대로 과정을 겪게 되는데, 로스코비틴 등의 세포주기 동기화 유도물질을 처리한 공여 핵 세포를 이식한 복제수정란에서 PCC가 유의하게 더 높은 비율로 일어나는 등 상기 핵 리모델링이 더욱 활성화되어 나타남을 특징으로 한다.

2. 융합된 핵 이식란의 활성화

융합된 핵 이식란의 활성화는 성숙과정에서 일시적으로 정지되어진 세포주기를 다시 가동시키는 단계이다. 이를 위해서는 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키나아제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시켜야 한다.

일반적으로 핵 이식란을 활성화하는 방법은 전기적 방법 및 화학적 방법이 있다. 본 발명에서는 핵 이식란의 활성화를 위한 방법으로 화학적 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 화학적 방법은 전기적 활성화 방법에 비해 본 발명에 따른 핵 이식란의 활성화를 보다 많이 촉진할 수 있다. 상기에서 화학적 방법으로는 에탄올, 이노시톨 트리포스페이트, 2가 이온(예를 들어 Ca² ⁺ 또는 Sr² ⁺), 미소관 억제제(microtubule inhibitors, 예를 들어 사이토칼라신 B), 2가 이온 이오노포어(ionophore)(예를 들어, Ca² ⁺ 이오노포어 이노마이신), 단백질 키나제 억제제(예를 들어, 6-디메틸아미노퓨린), 단백질 합성 억제제(예를 들어, 사이클로헥시미드), 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate)와 같은 물질을 처리하는 방법이 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 핵 이식란의 활성화를 위한 화학적 방법으로는 칼슘 이오노포어와 6-디메틸아미노퓨린을 핵 이식란에 동시에 처리하거나 단계적으로 처리하는 방법을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 칼슘 이오노포어 5∼10μM을 37~39℃에서 3∼6분 동안 처리한 다음 6-디메틸아미노퓨린 1.5mM ~ 2.5mM을 37∼39℃에서 4∼5시간 동안 처리한다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상술한 방법에 의해 제조된 개의 형질 전환된 핵 이식란에 관한 것이다.

제5단계: 핵 이식란의 대리모 이식 및 산자생산

나아가, 본 발명에 따른 개의 형질 전환된 핵 이식란은 대리모에 이식되어 산자를 출생시킴으로써 목적유전자를 조건적으로 발현하는 복제개를 생산하는데 사용될 수 있다. 개의 경우는 체외 배양하지 않고 활성화 후 바로 이식하는데, 상기 이식은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며 바람직하게는 카테터를 사용하여 복제 배아를 이식할 수 있다.

핵 이식란을 이식하여 정상적으로 태아로 발생시킬 수 있는 대리모를 선발한다. 경산개 중 발정기를 파악하여 이식적기를 선정한다. 일반적으로, 적당한 이식시기는 발정 징후를 보이기 시작하고부터 대략 48∼72시간 후이므로 핵 이식란의 대리모 이식은 이로부터 계산하여 핵 이식란의 체외발육 단계와 시기를 동기화하여 정한다. 대리모의 바람직한 발정주기 평가는 프로게스테론 농도를 기준으로 하였다.

핵 이식란의 대리모 이식은 개복수술에 의하여 대리모의 난관에 이식을 수행한다. 상기 대리모 이식에 있어서 상기 핵 이식란은 1세포기, 즉 바로 만들어진 복제란이거나 2 세포기 또는 4 세포기의 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 1세포기의 것이다. 이를 위해서 상기 핵 이식란의 대리모 이식은 활성화한 후 4시간 이내에 수행하는 것이 바람직하다. 또한 상기 핵 이식란은 대리모가 준비되기 전까지 미네랄 오일이 덮여진 mSOF 25㎕ 미세유적(microdrop)에서 배양할 수 있다. 대리모는 난자를 제공한 개와 발정주기가 동일하거나 1일 이내로 늦은 것을 선택한다.

핵이식란의 이식 후 약 4주째에 초음파 검사를 실시하여 임신여부를 확 인한다. 이 후에도 2주일 간격으로 초음파검사를 통하여 임신지속여부 및 태아의 발육상태 등을 확인한다.

태아의 출산은 분만간격이 30분 이상이 지났는데도 산자가 태어나지 않으면 분만을 도와야 하며, 분만 예정일이 지난 경우는 호르몬 제제 주사 또는 제왕절개와 같은 수술방법을 통하여 산자를 생산하게 된다.

본 발명에 따른 산자, 즉 형질전환된 복제개는 목적유전자를 전혀 발현하지 않아 정상조건에서 정상적인 성장이 가능하다.

제6단계 : 산자에 조건을 가하여 목적유전자 발현 및 자손 전달

제5단계에서 생산된 산자는 정상조건에서 성장할 경우, 정상 개와 차이점이 없다. 단, 목적유전자의 발현을 위해서는 rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터(reverse tetracycline transactivator) 를 자극하여 조건적으로 발현시킬 수 있다. rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터의 자극에는 테트라싸이클린(tetracycline)계열 화합물을 이용할 수 있다. 테트라싸이클린 계열 화합물에는 클로르테트라싸이클린(Chlortetracycline), 테트라싸이클린(Tetracycline), 옥시테트라싸이클린(Oxytetracycline), 데메클로싸이클린(Demeclocycline), 메타싸이클린(Methacycline), 디옥시싸이클린(Doxycycline) 및 미노싸이클린(Minocycline)이 있을 수 있다. 한편, 가장 바람직하게는 디옥시싸이클린을 이용할 수 있다.

테트라싸이클린 계열 화합물의 투여량은 그 세포독성으로 인해 너무 과용량으로 투여하면 개과동물의 사멸을 야기할 수 있다. 한편, 너무 낮은 용량으로 투여할 경우, 목적유전자의 발현, 즉 Switch-ON이 일어나지 않을 수 있다. 본 발명에서는 개과동물에게 바람직하게는 10 내지 200 mg/kg 의 용량으로, 격일로 처리하는 것이 동물 독성을 최소화하면서 목적유전자를 성공적으로 발현시킬 수 있는 처리방법임을 확인하였다. 가장 바람직하게는 100 mg/kg 의 용량으로, 격일로 2주간 처리한다. 2주 처리 후 처리를 중단하더라도, 그 이후 7주간 목적유전자 발현이 지속됨을 확인하였다.

나아가, 형질전환된 산자를 교배하여 자손을 얻을 경우, 목적유전자가 조건적으로 발현되는 형질이 유전법칙에 따라 전달됨을 확인하였다. 이러한 특징은 인간 및 동물의 질환모델동물 또는 면역거부반응 없이 인체에 이식가능한 장기나 치료용 세포를 공급하는 개과동물의 생산 가능성을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 방법에 따라 제조된 복제개는, 대동물, 특히 개과동물 특유의 어려움에도 불구하고 공여 핵 세포 또는 공여자와 표현형이 유사하고 완전히 동일한 유전적 특성을 가지는 바, 의심할 바 없이 복제된 동물로써, 디옥시싸이클린 조건을 가하였을 때 목적유전자를 성공적으로 신체 전체에 대해 발현시킨다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아닌 것은 당업자에게 자명할 것이다.

수핵 난자의 회수 및 탈핵

(1) 수핵난자의 회수

난자 공여자로 실험에 사용한 개는 20~35kg의 개였으며, 서울대학교의 사육관리 연구소 (SNU-090508-5)의 기준에 따라 각자 분리된 내부 시설에서 사육하였다.

혈중 프로게스테론의 농도는 혈액 3-5ml을 매일 채취하고 원심분리하여 혈장을 수득한 다음 DSL-3900 ACTIVE 프로게스테론 코팅된 튜브 방사선면역 분석 키트(Diagnostic Systems Laboratories, Inc., USA)를 사용하여 분석하였다. 프로게스테론 농도가 4.0∼7.5ng/ml가 되면 배란일로 간주하였다(Hase et al., J. Vet. Med.Sci., 62:243-248, 2000).

질세포 도말검사는 발정기의 초기 증후가 나타난 날로부터 매일 표본을 수득함으로써 수행하였다. 질세포 표본은 면봉을 외음부로 삽입함으로써 수집하였고 이를 슬라이드 글라스 위에 도말하였다. 그 다음 디프-퀴(Diff-Quik) 염색액(International chemical co., Japan)으로 염색한 후 현미경으로 검경하여 표피세포가 상피세포 인덱스(cornified index, Evans J.M. et al., Vet. Rec, 7:598-599, 1970)의 80%이상인 경우를 배란시기로 간주하였다.

본 발명자들은 상술한 방법에 따라 배란시기를 확인한 후 개복술을 통하여 난자 공여자 개로부터 다음과 같은 방법으로 회수하였다.

먼저, 난자 공여자인 암캐에 케타민 HCl(ketamine HCl) 6mg/kg과 자일라진(xylazine) 1mg/kg을 투여하여 전 마취시키고, 이소플루란(isoflurane)을 흡입시킴으로써 마취상태를 유지하였다.

상기 마취된 개의 생식열구(bursal slit)를 통하여 난관의 술 모양의 말단에 접근하고 앞부분이 둥글게 처리된 니들을 삽관하였다. 삽입된 니들을 수술용 봉합사로 고정하였다. 이 때, 3cm 플라스틱 튜브(직경 2mm) 및 지혈겸자(hemostatic forceps)를 이용한 퀵-릴리즈 장치(quick-release device)를 사용하였다. 그 다음 난관의 도관을 잘 보이게 하기 위하여, 손가락으로 난관과 주위의 자궁-난관 접합부의 아랫부분에 압력을 가하고, 정맥 내 카테터(24 게이지)를 삽입한 다음 상기 카테터를 통해 10% (v/v) FBS, 2 mM NaHCO3, 5 mg/ml BSA (Invitrogen, Carlsbad, CA)가 첨가된 헤페스-버퍼 조직 배양 배지 TCM-199 (난자 회수용 배지)를 관류시켜 난자가 흘러나오도록 하여 수핵 난자를 수득하였다.

(2) 수핵 난자의 탈핵

상기 실시예 1-(1)에서 수득한 난자를 표 1의 난자 회수용 배지에 넣고, 히알루로니다제(Sigma, USA)를 반복적으로 피펫팅함으로써 난구세포를 제거하였다. 그 다음 난구세포가 제거된 난자를 5㎍/mL 훽스트(Hoechst 33342)로 5분간 염색하고 형광 도립 현미경을 이용하여 x 200의 배율로 관찰하여 제1극체가 확인된 난자만을 선별하였다.

성분	함량
TCM powder 1L 용 (Gibco 31100-027)	9.9g
P/S 항생제	1%(페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)
HEPES 완충액	2.38g
FBS	10%(v/v)
NaHCO₃	0.1680g
BSA	5mg/L

선별된 난자를 5㎍/mL 사이토칼라신 B가 첨가된 상기 배지(표 1)에 넣고 미세조작장치(micromanipulator, Narishige, Tokyo, Japan)를 이용하여 탈핵을 수행하였다. 즉, 홀딩 마이크로 피펫(약 150㎛ 직경)으로 수핵 난자를 고정한 후 제1극체와 난자 핵 그리고 일부 세포질(5% 이하)을 흡입 피펫(약 20 μm 직경)을 이용하여 제거하였다. 상기 과정을 거쳐 탈핵된 난자는 10%(v/v) FBS가 첨가된 TCM-199 배지에 넣어 보관하였다.

eGFP 유전자 도입 및 eGFP 유전자가 도입된 공여 핵 세포의 선별 및 확인

(1) 유전자 도입용 벡터 제작

eGFP 유전자가 포함된 pTet2-GPTW 플라스미드는 다음과 같이 준비되었다.

상업적으로 시판되고 있는 pTRE-Tight(Clontech Mountain View, CA, USA)에 mCMV (minimal cytomegalovirus promoter), eGFP (enhanced green fluorescent protein), PGK (phosphoglycerate kinase promotor), rtTA2^s-M2 (reverse tetracycline transactivator) 및 WPRE (Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element sequence) 서열 (Woodchuck 간염 바이러스 2 게놈 DNA 로부터 cloning)을 함유하는 프래그먼트를 차례로 삽입하여 최종 pTet2-GPTW 플라스미드를 구축하였다 (도 1).

(2) eGFP 유전자 도입

PT 67 세포(Clontech Mountain View, CA, USA)를 일시적으로 pTet2-GPTW로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 PT 67세포로부터 수득한 바이러스를 이용하여 GP2-293 세포(Clontech Mountain View, CA, USA)를 감염시켰다. pTet2-GPTW-감염된 GP2-293 세포를 2주 동안 하이그로마이신 (150 μg/ml)을 이용하여 선별하고, 이러한 Hyg^R(hygromycin-resistant) 세포들을 pVSV-G(Clontech Mountain View, CA, USA)에로 트랜스펙션 하여 VSV-G 단백질을 발현시켰다.

트랜스펙션 후 48시간 후에 VSV-G 단백질로 포장된 바이러스들을 수득하였다. 바이러스를 생산하는 세포를 포함한 모든 세포는 4.5 g/l 글루코오스(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA), 소 태아 혈청(10%) 및 페니실린/스트렙토마이신(100 μg/ml)을 함유하고 있는 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 상기의 감염 및 트랜스팩션된 GP2-293 세포로부터 수거한 바이러스-함유 배지는 0.45㎛ 포어(pore) 크기의 필터를 통해 여과한 후 개 (beagle)의 섬유아세포들을 감염시키는데 사용하였다. 감염과정을 거친 섬유아세포 (Tet-on eGFP 세포)는 하이그로마이신 (150 μg/ml)으로 6일간 선별하였다.

(3) eGFP 유전자가 도입된 공여 핵 세포의 선별의 확인

Tet-on 벡터 시스템이 섬유아세포에 도입되었는지를 확인하기 위하여 형광 감도를 FACS를 통하여 확인하였다. Tet-on eGFP 세포들을 10% FBS 및 1% 비필수 아미노산 (NEAA, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) 및 1μg/ml의 doxycycline이 포함된 DMEM 배지에서 5일간 배양한 후, doxycycline을 제거하고 7일을 배양하였다. FACS 실험을 위하여, 세포를 트립신처리 후 중화시키고, PBS (Invitrogen)에 부유시켰다. 분석은 FACSCaliber (Becton-Dickinson, NY, USA)로 수행하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 3일간 doxycycline을 배지에 처리하여 배양한 군과 그렇지 않은 군은 약 42배의 형광감도 차이가 나타났다.

한편, 도 3에 나타난 바와 같이, doxycycline 처리를 중단한지 4일 만에 다시 형광감도가 제자리로 돌아감을 확인하였다. 이로써, 목적유전자를 조건적으로 발현하는 핵 공여세포가 선별되었음을 확인하였다.

체세포 핵이식 ( Somatic cell nuclear transfer , SCNT )를 이용한 핵 이식란의 제작

실시예 2의 과정으로 항생제 선별이 끝나 증식배양된 핵 공여 세포를 15 % 소태아혈청과 10 % 세포배양배지를 이용하여 세포를 부유한 다음 4℃에서 2시간, -70℃에서 12시간 이상 정치시킨 후 -150℃에서 동결보관하였다.

체세포 핵 이식을 하기에 앞서, 세포들을 해동하고, 15 μM의 로스코비틴이 첨가된 배양 배지(즉, DMEM + 10% FBS + 15 μM 로스코비틴) 에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 체세포 핵이식시 약 2분 동안 트립신 처리하여 단일층으로부터 세포를 회수하였다.

실시예 1에서 준비한 탈핵 난자에 형질전환된 공여 핵 세포의 미세주입은 이식용 피펫을 사용하여 공여 핵 세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입함으로써 수행하였다.

그 이후, 공여 핵 세포의 미세주입이 완료된 탈핵 난자는 세포 조작기를 이용하여 전기적으로 공여 핵 세포와 융합시켜 핵 이식란을 제작하였다. 203개의 in vivo 난자들을 준비하여 182개의 난자를 탈핵 후 미세주입하였고, 이 중 139개의 핵 이식란이 융합되었음을 확인하였다 (이식률 76.4%).

핵이식란을 대리모 내로 이식하여 산자의 생산 및 목적유전자 도입여부의 확인

(1) 산자의 생산

실시예 4의 융합된 핵 이식란 중 135개의 핵 이식란을 9마리의 대리모 내로 이식하였다. 핵 이식란을 이식하여 정상적으로 태아로 발생시킬 수 있는 대리모를 선발하되, 발정기를 파악하여 이식적기를 선정하였다. 적당한 이식시기는 발정 징후를 보이기 시작하고부터 대략 48∼72시간 후이므로 핵 이식란의 대리모 이식은 이로부터 계산하여 핵 이식란의 체외발육 단계와 시기를 동기화하여 정하였으며 대리모의 바람직한 발정주기 평가는 프로게스테론 농도를 기준으로 하였다.

핵 이식란의 대리모 이식은 개복수술에 의하여 대리모의 난관에 이식을 수행한하였다. 22일 후 3마리의 대리모에서 임신을 확인하였다 (임신율 33.3% : 임신한 대리모수/복제수정란 이식된 총 대리모수).

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 60일 후 3마리의 산 복제개가 태어났으며, 이들 각각을 Tet-on eGFP 1, Tet-on eGFP 2, Tet-on eGFP 3이라고 명명하였다 (출생율 2.3%). 도 4는 Tet-on eGFP 2, Tet-on eGFP 3의 생후 3일차 사진이다. 이로써 산 복제개의 생산을 확인하였다.

(2) 목적유전자 도입 여부의 확인

세 마리의 개는 핵 공여세포의 복제임을 마이크로세털라이트 (microsatellite)를 이용하여 확인하였다. 세 마리의 개의 피부에서 DNA 샘플 및 Tet-on eGFP 2의 내부 기관 조직의 DNA 샘플로 마이크로세털라이트를 시행하였다.

세 마리의 개는 핵 공여세포의 복제임을 마이크로세털라이트 (microsatellite)를 이용하여 확인하였다. 세 마리의 개의 피부에서 DNA 샘플 및 Tet-on eGFP 2의 내부 기관 조직의 DNA 샘플로 마이크로세털라이트를 시행하였다. 공여 핵 섬유아세포, 난자 제공견, 세마리 복제개, 대리모의 조직 및 혈액을 채취하여 혈통 분석을 실시하였다. 체세포 공여견, 복제개, 대리모의 혈액 샘플과 배양한 섬유아세포에서 G-spinTM Genomic DNA Extraction Kit를 이용하여 DNA를 추출하였다. 다음 PEZ1, PEZ2, PEZ3, PEZ5, PEZ6, PEZ8, PEZ10, PEZ012, PEZ13, PEZ 16, PEZ017, FHC2010, FHC2054와 FH2079을 마커로 하여 마이크로세털라이트를 시행하였다. 분리된 DNA를 TE buffer에 용해시키고 형광마커가 있는 위치 특이적 마커를 사용하여 증폭하였다. DNA sequencer(ABI 373; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 PAGE에서 길이의 변이를 측정하였다. 뉴클레오타이드 수준에서의 증폭된 크기를 평가하기 위해서 Proprietary software(GeneScan and Genotyper; Applied Biosystems)를 이용하였다.

그 결과, eGFP 유전자의 핵 공여세포의 복제개로 확인되었다 (data not shown).

따라서 Tet-on eGFP 1, Tet-on eGFP 2, Tet-on eGFP 3 개에 목적유전자가 도입되었는지 검증하기 위하여, 피부조직을 수집하여 서던블롯분석을 시행하였다. pTet2-EGFP-PTW 벡터의 3201-3913 부분, 즉 713 bp를 아래 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다.

서열번호 6

5' - AGCAAGGGCGAGGAGCTCTT - 3' (Forward)

서열번호 7

5' - GACTTGTACAGCTCGTCCATG - 3' (Backward)

증폭된 절편에 PCR DIG Probe Synthesis kit (Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여 서던 프로브를 생성하였다. 그 후, DIG luminescent detection kit (Roche)를 사용하여 신호를 검출하였다.

그 결과, 도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 세마리의 개에서 모두 eGFP 유전자가 검출되었으며, 특히 Tet-on eGFP2의 피부, 비장, 폐, 신장, 간, 심장에서 모두 eGFP 유전자가 검출된 바, 목적유전자가 성공적으로 도입되었음을 확인하였다.

형질전환 복제개에서 조건적으로 목적유전자가 발현되는지 여부

(1) 디옥시싸이클린 처리를 통해 Tet - on eGFP 개에서 eGFP 가 발현되는지 여부

실시예 4의 개의 출생시에는 어떠한 개에서도 녹색 형광이 검출되지 않았다 (표 2). 또한, 디옥시싸이클린 처리 전에도 형광이 검출되지 않았다. 이는 조건을 가하기 전에 목적유전자, 즉 eGFP의 의도되지 않은 발현이 없음을 뜻한다.

Pregnancy number	ID of cloned dogs	Gestation (days)	Birth Weight	Delivery Status	eGFP expression at birth
1	Tet-on eGFP 1	60	-	Dead ^*	Negative
2	Tet-on eGFP 2	60	240	Alive	Negative
3	Tet-on eGFP 3	60	290	Alive ^‡	Negative

따라서 위와 같은 실시예 4의 개에 100 mg/kg의 용량으로 디옥시싸이클린을 격일로 경구 투여하였다. 5% 수크로오스에 현탁하여 쓴 맛을 없애 투여하였으며, 2주간 투여하였다.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이, 2주간의 디옥시싸이클린 투여 동안 다른 부작용 없이 분명한 녹색 형광이 Tet-on eGFP 개의 모든 신체에서 관찰되었다. 한편 대조군으로 사용한 건강하고 나이가 비슷한 개는 어떠한 형광도 발현하지 않았다. 디옥시싸이클린 처리 2주 후 발현이 시작되었으며, 디옥시싸이클린 처리를 중단 한지 9주차에 발현이 중단되었다. 이로써 세포 독성 없이 조건(디옥시싸이클린)을 가하는 범위를 확인하였으며, 목적유전자를 조건적으로 발현시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

(2) 웨스턴 블롯을 통한 목적유전자 발현의 확인

실시예 4의 개의 피부 샘플은 디옥시싸이클린 처리 이전 (Pre-treatment) 및 처리 이후 2, 3, 4, 9주차에 수집하였으며, 영하 80도에서 동결 보존하였다. 샘플을 용해한 후, 상층액을 수집하여, 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 내렸다. 단백즐은 전기영동된 이후 폴리비닐이딘 플루오라이드 막에 옮겨졌다. 막은 0.1% 트윈 20 (Tween 20, MTBST)를 함유하는 5% 스킴밀크 TBS 용액으로 블로킹한 후, 4도에서 16시간동안 안티-EGFP항체 (Clontech)와 알파 튜불린 (Abcam, Cambridge, MA) 항체를 함유한 MTBST와 함께 배양하였다. 알파 튜불린은 양성 대조군으로 사용하였다. 그 후 막을 3회 세척한 후, HRP-결합된 염소 안티-마우스 IgG (Pierce, Rockford, IL, USA)를 함유한 MTBST에서 1시간동안 배양하였다. 그 후, SuperSignal West Pico Substrate (Pierce)를 첨가하고, X-ray 필름에 노출시켰다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, eGFP가 형질전환 핵 공여 세포 (P) 및 디옥시싸이클린 처리 2주, 3주, 6주까지 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 2주차에 분명한 eGFP 밴드를 보였다. 이로써, 형질전환 복제개에 조건 (디옥시싸이클린)을 가할 경우, 목적유전자를 성공적으로 발현할 수 있음을 확인하였다.

(3) 도입된 목적유전자의 자손 전달 가능여부의 확인

Tet-on eGFP 3 개는 9달째 사춘기에 도달하였으며 생식능을 갖추었기에, 배란 3일째에 건강한 비글 수컷 개의 정액으로 인공수정을 시켰다. 보다 상세하게는, Tet-on eGFP 3 개의 배란 72~79 시간 후에, 자궁각에 인공수정시켰다. 인공수정 30일 후, 개의 임신을 초음파로 검진하였으며, Tet-on eGFP 3 개는 60일 후 1 수컷 및 3 암컷을 각각 140, 180, 180, 230g의 몸무게로 출산하였다 (도 9).

자손에서 eGFP 유전자의 발현을 증명하기 위하여, Tet-on eGFP 3의 자손들의 피부 샘플을 생후 4일째에 수집하였다. PCR 분석을 위해서 사용한 eGFP 유전자 (289 bp)의 프라이머 서열은 아래와 같다:

서열번호 8

5' - CAGTGCTTCAGCCGCTACCC - 3' (Forward)

서열번호 9

5' - AGTTCACCTTGATGCCGTTCTT - 3' (Backward)

또한, 벡터에 존재하는 Hyg^R 유전자 (208 bp)의 프라이머 서열은 다음과 같다:

서열번호 10

5' - GCTCTCGATGAGCTGATGCTTTG - 3' (Forward)

서열번호 11

5' - TCTGCTGCTCCATACAAGCCAAC - 3' (Backward)

PCR 조건은 다음과 같다: 95도에서 10분간 둔 후, 95도에서 30초 (denaturation), 54도(eGFP) 또는 57도 (Hyg^R)에서 30초 (annealing) 및 72도에서 30초 (extension)으로 35 싸이클을 실시한 후, 72도에서 10분간 두었다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, eGFP 및 Hyg^R 유전자가 4마리의 자손 중 세 마리에서 검출되었는 바, 형질전환 유전자가 자손에게 성공적으로 전달된다는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Method for Producing Cloned Canidae Conditionally Expressing Transgene <130> P10-B191 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRE-Tight-mCMV <400> 1 gatctcgagt ttactcccta tcagtgatag agaacgtatg tcgagtttac tccctatcag 60 tgatagagaa cgatgtcgag tttactccct atcagtgata gagaacgtat gtcgagttta 120 ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt 180 atgtcgagtt tatccctatc agtgatagag aacgtatgtc gagtttactc cctatcagtg 240 atagagaacg tatgtcgagg taggcgtgta cggtgggagg cctatataag cagagctcgt 300 ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagaatt cgagctcggt acccggg 347 <210> 2 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eGFP <400> 2 tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg 60 gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg 120 gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc 180 tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc 240 agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct 300 tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg 360 tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca 420 agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg 480 gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg 540 accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact 600 acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc 660 tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaaa 720 gcggccgcg 729 <210> 3 <211> 543 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGK promoter <400> 3 aattcgtcga ctagactcga ggaattctac cgggtagggg aggcgctttt cccaaggcag 60 tctggagcat gcgctttagc agccccgctg ggcacttggc gctacacaag tggcctctgg 120 cctcgcacac attccacatc caccggtagg cgccaaccgg ctccgttctt tggtggcccc 180 ttcgcgccac cttctactcc tcccctagtc aggaagttcc cccccgcccc gcagctcgcg 240 tcgtgcagga cgtgacaaat ggaagtagca cgtctcacta gtctcgtgca gatggacagc 300 accgctgagc aatggaagcg ggtaggcctt tggggcagcg gccaatagca gctttgctcc 360 ttcgctttct gggctcagag gctgggaagg ggtgggtccg ggggcgggct caggggcggg 420 ctcaggggcg gggcgggcgc ccgaaggtcc tccggaggcc cggcattctg cacgcttcaa 480 aagcgcacgt ctgccgcgct gttctcctct tcctcatctc cgggcctttc gacctgcagc 540 cca 543 <210> 4 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rtTA2S-Mw <400> 4 atgtctagac tggacaagag caaagtcata aacggcgctc tggaattact caatggagtc 60 ggtatcgaag gcctgacgac aaggaaactc gctcaaaagc tgggagttga gcagcctacc 120 ctgtactggc acgtgaagaa caagcgggcc ctgctcgatg ccctgccaat cgagatgctg 180 gacaggcatc atacccactt ctgccccctg gaaggcgagt catggcaaga ctttctgcgg 240 aacaacgcca agtcattccg ctgtgctctc ctctcacatc gcgacggggc taaagtgcat 300 ctcggcaccc gcccaacaga gaaacagtac gaaaccctgg aaaatcagct cgcgttcctg 360 tgtcagcaag gcttctccct ggagaacgca ctgtacgctc tgtccgccgt gggccacttt 420 acactgggct gcgtattgga ggaacaggag catcaagtag caaaagagga aagagagaca 480 cctaccaccg attctatgcc cccacttctg agacaagcaa ttgagctgtt cgaccggcag 540 ggagccgaac ctgccttcct tttcggcctg gaactaatca tatgtggcct ggagaaacag 600 ctaaagtgcg aaagcggcgg gccggccgac gcccttgacg attttgactt agacatgctc 660 ccagccgatg cccttgacga ctttgacctt gatatgctgc ctgctgacgc tcttgacgat 720 tttgaccttg acatgctccc cggg 744 <210> 5 <211> 593 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE <400> 5 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tgt 593 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <223> primer <400> 6 agcaagggcg aggagctctt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <223> primer <400> 7 gacttgtaca gctcgtccat g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <223> primer <400> 8 cagtgcttca gccgctaccc 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <223> primer <400> 9 agttcacctt gatgccgttc tt 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <223> primer <400> 10 gctctcgatg agctgatgct ttg 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <223> primer <400> 11 tctgctgctc catacaagcc aac 23

Claims

다음의 단계를 포함하는, 복제된 개과동물에서 목적유전자를 조건적으로 발현시키는 방법:
(a) 개과동물에서 채취한 체세포주로부터 공여 핵 세포를 준비하고, 목적유전자서열; pTRE-Tight서열; rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터 서열; 및 WPRE서열을 함유하는 DNA 구조체를 상기 공여 핵 세포에 도입하는 단계;
(b) 상기 DNA 구조체가 도입된 공여 핵 세포를 선별 및 배양하는 단계;
(c) 상기 배양된 공여 핵 세포를 탈핵된 개 수핵난에 이식하여 형질전환 된 핵이식란을 제조한 다음, 활성화시키는 단계;
(d) 상기 활성화된 핵이식란을 대리모에 이식하여 산자를 생산하는 단계; 및
(e) 상기 산자의 성장 이후 테트라싸이클린(tetracycline)계열 화합물을 10내지 15일동안 격일로 처리하여, 총 600~1000 mg/kg 경구투여하여 목적유전자를 발현시키는 단계.
제 1항에 있어서,
상기 (e)단계에서 테트라싸이클린(tetracycline)계열 화합물을 처리하는 것은 약 100 mg/kg 의 용량으로, 격일로 2주간 처리하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (e) 단계에서 테트라싸이클린(tetracycline)계열 화합물은 클로르테트라싸이클린(Chlortetracycline), 테트라싸이클린(Tetracycline), 옥시테트라싸이클린(Oxytetracycline), 데메클로싸이클린(Demeclocycline), 메타싸이클린(Methacycline), 디옥시싸이클린(Doxycycline) 및 미노싸이클린(Minocycline)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서,
상기 (e)단계에서 테트라싸이클린(tetracycline)계열 화합물은 디옥시싸이클린(Doxycycline)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 체세포는 배아세포, 태아세포, 유세포 및 성체세포로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 성체세포는 섬유아세포 또는 난구세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 DNA 구조체는 추가적으로 PGK 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 의한 방법에 의해 생산된,
목적유전자서열; pTRE-Tight서열; rtTA2^S-M2 트랜스엑티베이터 서열; 및 WPRE서열을 함유하는 DNA 구조체를 포함하고 있는,
목적유전자를 5 내지 9주간 발현시키는 복제된 개과 동물.
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