RU2216592C2 - Способ получения эмбрионов животных и способ выращивания животного из эмбрионов - Google Patents
Способ получения эмбрионов животных и способ выращивания животного из эмбрионов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2216592C2 RU2216592C2 RU2000122047/13A RU2000122047A RU2216592C2 RU 2216592 C2 RU2216592 C2 RU 2216592C2 RU 2000122047/13 A RU2000122047/13 A RU 2000122047/13A RU 2000122047 A RU2000122047 A RU 2000122047A RU 2216592 C2 RU2216592 C2 RU 2216592C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- animals
- animal
- gene
- embryos
- fetal fibroblasts
- Prior art date
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 56
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 title claims description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 54
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 21
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 21
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 11
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 5
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 5
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical group C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 claims description 3
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 abstract 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 23
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 14
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 7
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 6
- 238000010449 nuclear transplantation Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 210000000723 mammalian artificial chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 5
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 5
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 4
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 4
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 3
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 3
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 3
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 2
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 8883yp2r6d Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)CC4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@@]21O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C1)[C@@H](C)\C=C\C=C/1[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\1)O)C[C@H]4C2 SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N Demecolcine Natural products C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000000507 anthelmentic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000035584 blastogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000012888 dietary physiology Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002692 epidural anesthesia Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001158 estrous effect Effects 0.000 description 1
- 229940032383 estrumate Drugs 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000004463 hay Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229940007210 ivomec Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 229940029985 mineral supplement Drugs 0.000 description 1
- 235000020786 mineral supplement Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000001776 parthenogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009304 pastoral farming Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000009597 pregnancy test Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 150000003169 prostaglandin F2α derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000004460 silage Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- IFEJLMHZNQJGQU-KXXGZHCCSA-M sodium;(z)-7-[(1r,2r,3r,5s)-2-[(e,3r)-4-(3-chlorophenoxy)-3-hydroxybut-1-enyl]-3,5-dihydroxycyclopentyl]hept-5-enoate Chemical compound [Na+].C([C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)C[C@H]1O)C\C=C/CCCC([O-])=O)OC1=CC=CC(Cl)=C1 IFEJLMHZNQJGQU-KXXGZHCCSA-M 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 208000010484 vulvovaginitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0273—Cloned vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/101—Bovine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает извлечение фетальных фибробластов, объединение ядра фетальных фибробластов с соответствующей клеткой-реципиентом, при этом фетальные фибробласты до объединения не подвергаются внешним манипуляциям для приведения в фазу G0, размножение полученных таким образом клеток в течение периода времени до образования бластоцист и в соответствующем случае пересадку выращенной клеточной массы животным-реципиентам. Способ позволяет повысить эффективность клонирования животных. 2 с. и 12 з.п.ф-лы, 1 табл.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение касается способа разведения животных посредством клонирования, а также животных, полученных разработанным способом. Особенностью разработки является создание способа клонирования животных посредством эффективной пересадки ядер определенных эмбриональных (фетальных) клеток.
Настоящее изобретение касается способа разведения животных посредством клонирования, а также животных, полученных разработанным способом. Особенностью разработки является создание способа клонирования животных посредством эффективной пересадки ядер определенных эмбриональных (фетальных) клеток.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Животные, в особенности домашние животные, уже длительное время разводятся человеком с различными целями, что приводит к развитию у них определенных свойств. Так, например, для того, чтобы получить животных с высоким удоем, спаривают коров и быков, имеющих высокие показатели молочной продуктивности.
Животные, в особенности домашние животные, уже длительное время разводятся человеком с различными целями, что приводит к развитию у них определенных свойств. Так, например, для того, чтобы получить животных с высоким удоем, спаривают коров и быков, имеющих высокие показатели молочной продуктивности.
В последние годы большой научный интерес представляют животные, особенно такие представители копытных как овцы, крупный рогатый скот или коровы, в качестве продукционных станций важных с точки зрения физиологии питания и фармацевтики веществ, так как с развитием генной инженерии стало возможным целенаправленно придавать животным новые свойства, например способность производить определенные лекарственные вещества. Проблема хозяйственного использования таких животных заключается в том, что пересаженная им генная конструкция интегрируется и стабильно передается потомству.
К настоящему времени были сделаны попытки решить проблему переноса генов таким образом, что все манипуляции будут выполняться в клетках, при этом из этих клеток посредством клонирования снова будут получены животные.
В научном мире термин "клонирование" определяют как копирование генетического материала, происходящего от одной единственной клетки, что в переносе на эмбриологию следует понимать как получение эмбрионов или животных с идентичным генотипом. В эмбриологии под эмбрионом понимают зародыш в процессе бластогенеза до начала развития зачатков примитивных органов, в то время как для обозначения последующих стадий развития используют термин плод. Эмбриональная фаза в зависимости от вида животных имеет различную продолжительность. Например, у крупного рогатого скота этот период длится около 4 недель, а у других видов отряда копытных может быть короче или длиннее.
Для клонирования животных, то есть для размножения одного свойственного для определенного животного генотипа в настоящее время описано много способов.
С одной стороны, ранние эмбриональные стадии и последующие стадии развития плода подвергались хирургическому вмешательству и полученные таким образом отдельные части в дальнейшем размножаются in vitro или in vivo.
Затем производились микроманипуляционные комбинирования асинхронных стадий развития, определяемые как "химерные клоны", при этом бластомер(ы) из эмбриона, находящегося на более поздних стадиях развития, объединялись с бластомерами эмбриона более ранних стадий с целью поддержать первые в их способности к дальнейшему развитию и таким образом получить множество идентичных близнецов. Наибольшее число полученных таким образом клонов достигало, однако, не более 5-8.
Следующим разработанным способом являлось партеногенетическое активирование или спаривание гомозиготных родителей для того, чтобы получить клоны с определенными свойствами.
Так как вышеназванные способы по своей эффективности и надежности не являются оптимальными, был разработан еще один способ, который в общем можно определить как пересадка ядер.
При этом ядра клеток, берущие свое происхождение из многоклеточных эмбрионов, переносятся в подготовленные соответствующим образом яйцеклетки, что приводит к получению генетически идентичных эмбрионов.
Для того чтобы успешно осуществлять клонирование посредством пересадки ядер, необходимо, однако, учитывать некоторые обязательные параметры.
Яйцеклетка, которая используется как клетка-реципиент, должна в своем развитии пройти стадию метафазы 2-го деления (метафаза II) и не должна больше содержать своей собственной ДНК, то есть она должна представлять собой так называемую энуклеированную яйцеклетку. При этом цитоплазма яйцеклетки должна подвергаться лишь минимальному воздействию, так как содержащиеся в ней вещества могут иметь большое значение для дальнейшего развития, например для деления клетки.
Затем необходимо перепрограммировать ядерную ДНК пересаживаемого ядра. Так как ядро-донор происходит из многоклеточного эмбриона, каждая донорская клетка уже прошла несколько циклов деления. Это означает, что клетка находится в более поздней стадии развития по отношению к тотипотентной оплодотворенной яйцеклетке, и в ней уже могут быть выключены определенные важные для раннего развития гены.
Исходя из этого, используемая ядерная ДНК должна быть перепрограммирована с тем, чтобы генетическая информация ядерной ДНК могла быть снова полностью использована и схема деления эмбриона вновь началась со стадии зиготы. Чем лучше выполнено такое репрограммирование или активирование, тем выше вероятность выполнения успешного клонирования, то есть получения полностью развитого живого клонированного животного.
Кроме ядерной ДНК большое значение имеет присутствующая в цитоплазме мРНК, так как в момент объединения яйцеклетки и донорской клетки она служит матрицей для образования необходимых для последующих стадий развития и дифференцирования белков, которые могут оказывать влияние на дальнейшее развитие клетки.
Используемые способы пересадки ядер характеризуются различной степенью успеха. Так, Willadsen et al. (Nature 320 (1986), 63-65) сообщили о клонировании ягнят, при этом ядра клеток-доноров происходили из 8-ми клеточных эмбрионов. Robi et al. (J. Anim. Sci. 64 (1987), 642-647) сообщили о первых экспериментах по пересадке ядер крупного рогатого скота, при этом работа велась только с использованием эмбрионов крупного рогатого скота, полученных ex vivo. В обоих попытках было использовано промежуточное культивирование in vivo в яйцеводах овец. В последующие годы было показано, что эмбриональные клоны у крупного рогатого скота могут быть получены и in vitro, как при использовании эмбрионов, так и полученных in vitro яйцеклеток (Sims et al, PNAS USA 91 (1991), 6143-6147).
В WO 97/07668 описан еще один способ возобновления эмбриона животного, при котором ядро с диплоидным набором хромосом переносится в энуклеированную яйцеклетку, находящуюся в стадии метафазы II, при этом яйцеклетка активируется по прошествии определенного периода времени после переноса ядра. Посредством выполняемого после переноса ядерной ДНК активирования яйцеклетки, должно достигаться лучшее репрограммирование перенесенной ядерной ДНК.
WO 97/0669 также касается способа возобновления эмбриона животного, при котором ядро донорской клетки, находящейся в покое, переносится в соответствующую клетку-реципиент. Предполагается, что донорская клетка до объединения с клеткой-реципиентом находится в фазе G0, что достигается посредством "голодания" клеток или контактного ингибирования.
Проблемой для использования данной технологии является наличие подходящих донорских клеток, способных наиболее целенаправленно и обоснованно привести к развитию эмбриона животного. Известно, что репрограммирование ядерной ДНК уже выбранной донорской клетки при клонировании эмбрионов сопряжено с большими трудностями, так как оно играет важную роль не только в дальнейшем раннем созревании эмбриона, но и в более позднем развитии после пересадки в организм матери. Таким образом, несмотря на успехи в этой области, существует проблема эффективного репрограммирования ядерной ДНК донора с целью приведения манипулированных яйцеклеток в состояние естественной зиготы. Кроме низкого выхода эмбриональных бластоцист, это выражается в низкой степени деления.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы исключить недостатки существующей технологии и предоставить соответствующую донорскую клетку для создания улучшенного способа клонирования животных.
Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы исключить недостатки существующей технологии и предоставить соответствующую донорскую клетку для создания улучшенного способа клонирования животных.
Поставленная задача решается посредством создания способа клонирования эмбриона животного, при котором в качестве донорской клетки используются фетальные фибробласты. Ядро такой клетки объединяется с соответствующей клеткой-реципиентом и полученная таким образом клетка выращивается определенный период времени до образования морулы. Полученная морула может быть вновь использована для клонирования и пересадки в организм матери.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения клеткой-реципиентом является энуклеированная яйцеклетка, в которую пересаживается ядро фетального фибробласта или весь фибробласт целиком путем слияния. При этом может быть использован фетальный фибробласт непосредственно из плода или после длительного размножения.
Животными, на которых может быть использован разработанный способ, могут быть, например, копытные, кролики, грызуны или птицы. При этом предпочтительно использование копытных, в особенности свиней, овец, коз, крупного рогатого скота.
В предпочтительном варианте осуществления способа используемые фетальные фибробласты являются трансгенными, то есть они содержат один или несколько генов, которые или получены из экзогенного источника, или представляют собой эндогенный, но другой неприродный локус используемого трансгена в геноме. Эти гены предпочтительно кодируют лекарственные вещества, например антитела или вещества, интересные с точки зрения физиологии питания, например химозин или трипсин, при этом гены могут находиться под контролем как эндогенного, так и экзогенного промоторов.
Для извлечения фетальных фибробластов у беременных животных извлекают плоды и измельчают. Полученные из плода клетки затем селекционируют с целью отбора желательных фетальных фибробластов, например, посредством прикрепления на поверхность культурального флакона и отделения надосадочной жидкости или посредством механического отбора с помощью пипетки. Фетальные фибробласты могут быть легко отличены от остальных клеток по своему фенотипу.
Для последующих шагов извлеченный фетальный фибробласт может быть использован целиком, или у него может быть изолировано ядро с целью дальнейшего использования.
В качестве клеток-реципиентов используются, как правило, энуклеированные яйцеклетки, созревшие in vivo или in vitro. Так, например, могут быть использованы созревшие in vitro неоплодотворенные яйцеклетки, у которых по достижении метафазы II удаляются окружающие их кумулюсные клетки.
Предпочтительно использование клеток-реципиентов, у которых отсутствует собственная ядерная ДНК. В настоящее время существует много способов удаления ДНК яйцеклетки, такие как, например, разделение яйцеклетки на две половины, из которых одна не содержит ядро и может быть использована для дальнейших манипуляций, или облучение ультрафиолетовым светом с целью разрушения собственной клеточной ДНК. Возможно также удаление ядра (пронуклеуса) или метафазной пластинки с помощью микроманипулятора Наилучшим образом зарекомендовала себя обработка яйцеклетки до микроманипуляций цитогалазином В с последующим отсасыванием с помощью пипетки расположенной вблизи полярного тельца цитоплазмы, например, посредством микроманипулятора Leitz (Leica, Bensheim, Германия). Так как ядерная ДНК яйцеклетки в этот момент локализуется вблизи полярного тельца, степень энуклеации, достигаемая данным методом, является очень высокой, при этом происходит отсасывание лишь небольшой части цитоплазмы.
После получения двух составных частей, необходимых для ядерной пересадки, дальше можно выбрать два различных пути. Ядро фетального фибробласта изолируется одним из способов, известных на момент подачи заявки, и переносится в подготовленную клетку-реципиент, например, посредством инъекции. С другой стороны, для слияния с клеткой-реципиентом может быть использован целый фибробласт.
Для слияния фетальный фибробласт с помощью соответствующих инструментов, например пипетки для переноса, переносится под зону пелюцида энуклеированной яйцеклетки. Для объединения клеточного ядра фетального фибробласта с цитоплазмой яйцеклетки выполняют слияние мембраны фибробласта с мембраной яйцеклетки. В настоящее время широко известно несколько способов слияния клеток, например слияние посредством использования вируса Сендаи, обработка полиэтиленгликолем (ПЭГ), лазерное слияние или электрический шок. Последний метод, так называемое электрослияние, представляет собой многократное, например, 2-10 кратное, кратковременное воздействие постоянного импульса от 1 до 10 кВ/см, преимущественно от 1 до 3 кВ/см, с продолжительностью от 2 микросекунд до 1 секунды, в результате чего индуцируются поры, обеспечивающие слияние цитоплазмы. Этот метод является предпочтительным в данной разработке, так как посредством электрического импульса соответствующей силы может одновременно осуществляться активирование слитой яйцеклетки. Активирование может также проводиться в течение нескольких часов (2-5 часов) после слияния, например, посредством инкубации слитой клетки в 7% растворе спирта, предпочтительно в 7% растворе этанола, а так же осуществляться любым другим из имеющихся сегодня в распоряжении способов.
Активирование слитой клетки является важным шагом, так как оно служит предпосылкой для придания продукту слияния делящейся активности. После успешного слияния и активирования производят выращивание комплексов фибробласта и яйцеклетки (эмбрионы, полученные пересадкой ядер) до стадий, на которых они могут быть пересажены реципиентам. При этом в используемые культуральные среды могут быть внесены дополнительные вещества, которые поддерживают или, наоборот, ингибируют агрегацию. Нокадазол и колцемид являются примерами веществ, ингибирующих агрегацию, таксол - стабилизирующих агрегацию. Использование этих веществ предотвращает возможное образование множественных пронуклеусов.
По существующей стандартной технологии образующиеся эмбрионы необходимо осторожно пересадить промежуточному реципиенту. Это достигается чаще всего помещением эмбриона в защитную среду, например агар, и упаковкой в яйцевод временного реципиента. При этом дальнейшее развитие до рождения возможно только в организме настоящего реципиента. Существуют также способы культивирования в системах in vitro без ухудшения выхода эмбрионов. Не склоняясь к какой-либо теории, следует подчеркнуть, что при удачном выборе клетки-донора могут быть получены эмбрионы, которые по своему развитию приближаются к эмбрионам, полученным естественным путем. Клетки содержатся в культуре до тех пор, пока они не образуют бластоцисты. Это происходит в период до 10 дней, преимущественно от 6 до 7 дней.
Как было установлено, вполне возможно выращивать клонированные эмбрионы до плодов, которые затем снова могут быть использованы для пересадки ядер. В рамках так называемого реклонирования число клонированных эмбрионов может быть еще больше увеличено.
Фетальные фибробласты для разработанного способа могут быть получены у большого числа животных: из млекопитающих, например, у копытных, кроликов, грызунов (крыс и мышей), а так же птиц (уток, гусей или кур). При этом, исходя из хозяйственной ценности, предпочтительно использование копытных, например, крупного рогатого скота, овец, коз, буйволов, верблюдов и свиней. Наиболее предпочтительно получение овец и коров.
Для облегчения выделения генного продукта можно направить его получение в собственный продукт животного. У коров и овец это может быть молоко, у птиц - яйца. Специфическая для отдельных органов экспрессия может быть достигнута посредством выбора соответствующих промоторов, которые к моменту создания данной технологии уже известны. Генный продукт может быть также извлечен непосредственно из животного, например, из сыворотки. Кроме того, возможно, что желаемый продукт представлен органами или тканями животного, например, для ксенотрансплантации.
Используемые в разработанном способе фетальные фибробласты, а также плоды или животные, от которых они были получены, могут быть трансгенными, при этом предпочтительным является трансген, кодирующий важный с точки зрения физиологии питания или фармацевтики белок, например антитело. У коров и овец, например, в генную конструкцию могут быть встроены гены химозина или трипсина, позволяющие синтезировать в молоко соответствующие ферменты или их предшественники. Выбранный трансген может находиться под контролем экзогенного, так же трансгенного промотора, или для этой цели может быть использован известный эндогенный лромотор. С помощью разработанного способа возможно улучшение извлечения гомологичных животных белков, изменение животных продуктов, таких как молоко, или извлечение органов животных, например, для медицинского использования.
Целый ряд белков до настоящего времени получают из органов животных посредством их очистки из этих органов и последующего использования в медицине или технике. Проблемой являются относительно низкие количества, в которых они присутствуют в тканях (например, ФСГ (фолликулостимулирующий гормон) в гипофизе), что приводит к высоким производственным затратам, так как для их выделения необходимо наличие большого количества исходного материала, то есть животных, что повышает риск контаминации, например, такими болезнетворными агентами как BSE или Еheс.
Примерами интересных белков из органов животных являются апротинин из легких, химозин из желудка, каталаза из печени, эластаза, панкреатин, инсулин или трипсин из поджелудочной железы, гиалорунидаза из семенников, хондроитин из трахеи, коллаген из кожи, фибронектин или витронектин из плазмы, ростовой фактор эпителиальных клеток или ЛГ (лютеинизирующий гормон) из гипофиза, фактор роста фибробластов или ганглиозид из мозга, а также гемоглобин, тромбин, трансферрин и другие. Это перечисление не следует, однако, рассматривать как какое-либо ограничение.
Для всех этих продуктов может быть достигнута эктопная экспрессия, то есть экспрессия в другой ткани, например в молочной железе, если в клетках, используемых для клонирования, предварительно выполняется дополнительный перенос генов, например, путем инъекции, трансформации, трансфекции или любым другим известным способом, и при этом рекомбинантная in vitro генная конструкция дополнительно интегрируется в геном. Исходя из этого, посредством гомологичной рекомбинации в клетках может быть достигнуто сцепление эндогенного гена с промотором, который обеспечит этому структурному гену другой рисунок экспрессии, например производство химозина посредством секреции в молоко вместо эндогенного синтеза в желудке. Кроме того, имеющийся в распоряжении эндогенный промотор, например промотор казеина или лактоглобулина, может быть сцеплен с новым структурным геном с целью обеспечения оптимальных условий для его экспрессии. В обоих представленных выше случаях промотор и структурный ген, которые гомологично рекомбинируются в геном, предварительно изолируются из генного банка, который получен, например, из фетальных фибробластов. Таким образом, используется не только ДНК собственного вида, но еще и изогенная ДНК.
Таким путем состав продуктов питания, полученных из продуктов животного происхождения, например молока, может быть изменен желательным образом так, что они приобретут положительные диетические и способствующие оздоровлению свойства, пониженный аллергический потенциал, повышенную стабильность при хранении или свойства, облегчающие их переработку. Так, может быть получено молоко с определенными свойствами, например молоко с антителами к Ehec или специальное молоко для больных с неусвояемостью лактозы.
Использование искусственных хромосом млекопитающих (MACs) позволит исключить интеграционные мутации, а также сделает возможным перенос больших фрагментов ДНК. Такие MACs представляют собой дополнительные мини- или микрохромосомы, реплицирующиеся в ядре точно так же, как и эндогенные хромосомы. Посредством использования MACs возможно, например, пересаживать генные кластеры одного вида животных другому, например, полный иммуноглобулиновый кластер человека - домашним животным, при этом домашние животные становятся продуцентами антител человека с целью их извлечения и последующего использования. Посредством переноса определенных MACs собственного вида может быть достигнуто повышение уровня синтеза генного продукта за счет аддитивного действия генов.
Важной является экспрессия гомологичных белков, а также тканей и органов у домашних животных, для белков - в тех же органах, в которых эти белки синтезируются у человека. Полученные таким образом белки могут быть очищены одним из известных к моменту подачи данной заявки способом, а ткани и органы - извлечены из животных непосредственно перед трансплантацией. Преимуществом описанного выше подхода является высокая идентичность синтезируемых белков, так как их процессинг, то есть посттрансляционные модификации протекают в тех же органах, в которых они экспрессируются в природе. Примером может служить синтез эритропоэтина в почках. Это приводит к тому, что извлеченные из различных тканей белки являются гликозилированными таким же образом, как и у человека, при этом по своей активности они близки к природным белкам. Так, могут быть получены трансгенные животные, например свиньи, крупный рогатый скот и другие, которые продуцируют инсулин, эритропоэтин и другие белки человека, которые затем могут быть с успехом использованы в медицине.
С помощью разработанного способа полученное один раз трансгенное животное с предпочтительными свойствами может быть стабильно размножено.
Настоящее изобретение касается также взаимосвязанных с данной разработкой клонированных животных, которые, как отмечалось выше, могут быть трансгенными или нетрансгенными.
Преимуществом созданного изобретения помимо отсутствия необходимости приведения клеток в фазу G0, является одинаковая или даже повышенная эффективность, рассчитанная по конечному выходу при реклонировании.
Так, при использовании разработанного способа были достигнуты результаты, по своей эффективности превышающие результаты, полученные для пунктированных ооцитов с последующим созреванием и оплодотворением, но без клонирования. Выявленная высокая степень развития значительно повышает эффективность программ по клонированию.
Мерой эффективности предлагаемого способа может служить так называемая степень беременности, определяемая как число беременных реципиентов от общего числа синхронизированных реципиентов, которым были пересажены 6-7 дневные культивируемые in vitro эмбрионы. Степень беременности может быть установлена посредством измерения уровня прогестерона, ультразвуковой диагностикой или ректальной пальпацией.
При этом на примере крупного рогатого скота с помощью различных способов были получены следующие результаты:
Степень беременности:
Пункция ооцитов с последующим IVM и IVF - 34%
Клонирование эмбрионов (в среднем) - 25%
Клонирование эмбрионов с помощью фетальных фибробластов - 55%
IVM = созревание in vitro.
Степень беременности:
Пункция ооцитов с последующим IVM и IVF - 34%
Клонирование эмбрионов (в среднем) - 25%
Клонирование эмбрионов с помощью фетальных фибробластов - 55%
IVM = созревание in vitro.
IVF = оплодотворение in vitro.
Разработка будет проиллюстрирована примером, который, однако, не должен ограничивать область ее применения.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Выделение фетальных фибробластов из плодов крупного рогатого скота.
Выделение фетальных фибробластов из плодов крупного рогатого скота.
Плоды извлекают из матки забитых нетелей или коров и транспортируют в лабораторию на ледяной воде в PBS (фосфатно-солевой раствор, без Са2+ и Мg2+ с пенициллином и стрептомицином и 10% бычьей фетальной сыворотки (FCS)). Затем плоды промывают несколько раз свежим PBS. После промывки плоды освобождают от головы и внутренних органов, вновь промывают в PBS, затем измельчают в 5 мл PBS и помещают в 50 мл культуральные пробирки. После добавления 10 мл PBS пробирки осторожно центрифугируют при 300 об/мин в течение 5 мин, после чего ресуспендируют осадок в 0,1% растворе трипсина. После 5-ти минутной инкубации при 37oС выполняют перенос в 50 мл центрифужную пробирку и вновь центрифугируют (300 об/мин, 5 мин). Эти шаги, начиная с обработки трипсином, повторяют дважды. Полученную таким образом клеточную суспензию фильтруют, переносят в 50 мл пробирку, центрифугируют (160 g, 5 мин) и ресуспендируют осадок в 1 мл культуральной среды (DMEM (Gibco) с добавлением 15% FCS, 2 мМ L-глютамина, 10-7 мМол β-меркаптоэтанола и пенициллина со стрептомицином).
После трипсинизации клеточную суспензию помещают в 10 см культуральные чашки и культивируют в культуральной среде (супра) с 10% FCS (Biochrom, Берлин) при 37oС в 5% СО2 до достижения субконфлюэнтного монослоя (2-3 дня). Одну часть пассажа "0" замораживают (10% диметилсульфоксид, Sigma) и хранят в жидком азоте.
Для сравнения эффективности способа одна часть фибробластов до пересадки ядер была синхронизирована в презумптивную фазу G0 посредством сильного уменьшения концентрации сыворотки в культуре, как это описано в WO 97/07669 (Campbell et al.). Для этого клетки на следующий день после пассажирования промывали трижды PBS и выращивали в свежей среде с 0,5% FCS в течение 8 дней ("голодные" клетки), после чего их использовали для клонирования. В способе, описанном Campbell, обязательным является приведение фибробластов посредством "голодания" или другими способами в фазу G0.
Фибробласты для описанного здесь способа, которые не подвергались процессу голодания, были непосредственно извлечены из субконфлюэнтной культуры и использованы для клонирования без какой-либо дополнительной обработки.
Затем бластомеры (эмбриональные клетки) из морул (эмбрионы в возрасте около 6 дней с числом клеток от 30 до 70 бластомеров), полученных посредством клонирования с использованием "голодных" и "неголодных" фибробластов, были вновь использованы для клонирования (реклонирование). Результаты представлены в таблице и показывают, что с использованием разработанного способа могут быть получены даже лучшие результаты по сравнению со стандартной технологией.
Кроме того, при оценке степени беременности было установлено, что этот показатель составил около 60%.
Дополнительный перенос генов
Рекомбинированные in vitro генные конструкции, как это описано в DE-OS-4012526, которые были здесь использованы, переносят в ядра изолированных фетальных фибробластов посредством традиционной микроинъекции ДНК (Вгет G. Transgenic Animals, Genetic Engineering of Animals, VCH Weinheim (1993), 83-170) или другими известными способами (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Доказательство интеграции в клетках осуществляют посредством ПЦР или Southern-блотинга (Maniatis, см. выше). Экспрессия в дифференцированных клетках показывает, что перенос генов выполняется успешно.
Рекомбинированные in vitro генные конструкции, как это описано в DE-OS-4012526, которые были здесь использованы, переносят в ядра изолированных фетальных фибробластов посредством традиционной микроинъекции ДНК (Вгет G. Transgenic Animals, Genetic Engineering of Animals, VCH Weinheim (1993), 83-170) или другими известными способами (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Доказательство интеграции в клетках осуществляют посредством ПЦР или Southern-блотинга (Maniatis, см. выше). Экспрессия в дифференцированных клетках показывает, что перенос генов выполняется успешно.
Клонирование
Через 18-20 часов после начала созревания изолированные из яичников яйцеклетки коров освобождают от кумулюсных клеток и энуклеируют в течение двух часов (Molecular Reproduction and Development 42 (1995), 53-57). Через 20-22 часа после начала созревания извлеченные, как описано выше, фетальные фибробласты были пересажены с помощью пипетки для переноса в перивителиновое пространство энуклеированных ооцитов. Образующиеся при этом комплексы кариопласта и цитопласта (КЦК) подвергались двукратному воздействию по 10 мкс электрического импульса 2,1 кВ/см с целью индукции слияния. КЦК выращивали в инкубаторе в среде Ham's F-12 (Sigma) с 10% FCS. Слияние контролировали чрез 30-60 минут после воздействия электрическим импульсом посредством наблюдения в микроскоп.
Через 18-20 часов после начала созревания изолированные из яичников яйцеклетки коров освобождают от кумулюсных клеток и энуклеируют в течение двух часов (Molecular Reproduction and Development 42 (1995), 53-57). Через 20-22 часа после начала созревания извлеченные, как описано выше, фетальные фибробласты были пересажены с помощью пипетки для переноса в перивителиновое пространство энуклеированных ооцитов. Образующиеся при этом комплексы кариопласта и цитопласта (КЦК) подвергались двукратному воздействию по 10 мкс электрического импульса 2,1 кВ/см с целью индукции слияния. КЦК выращивали в инкубаторе в среде Ham's F-12 (Sigma) с 10% FCS. Слияние контролировали чрез 30-60 минут после воздействия электрическим импульсом посредством наблюдения в микроскоп.
Через 24 часа после начала созревания КЦК активировали посредством 5-ти минутной инкубации в 7% спирте и затем выращивали в течение 5 часов в 10 мкг/мл циклогексимида (Sigma С-7698) и 5 мкг/мл цитогалазина В (Sigma С-6762). Затем КЦК переносили в 100 мкл капли среды CR-1 (Rosenkrans, First, 1991) с 10% эстральной сыворотки коров. Капли покрывали слоем парафинового масла и инкубировали в течение 7-8 дней при 39oС во влажной атмосфере с 5% СО2, 5% О2 и 90% N2.
Как следует из приведенной таблицы, уже в первом опыте была достигнута степень деления, равная 86%, и выход бластоцист 55%. Таким образом, были получены результаты, по своей эффективности превышающие результаты, полученные стандартным способом с использованием процедуры "голодания" фибробластов.
Пересадка эмбрионов
Выбор реципиентов
В качестве реципиентов использовались телки, отвечающие следующим критериям:
1. Разведение в хозяйствах, свободных от вируса Герпеса, Тип 1;
2. Серологические исследования на антитела BHV-1 (инфекционный ринотрахеит/ инфекционный вульвовагинит) - отрицательные;
3. Серологические исследования на BVD (вирус диареи КРС)/ MD-антиген (мукозная болезнь) - отрицательные;
4. Соответствующее возрасту (13-16 месяцев) развитие тела;
5. Раздельное половое созревание; у животных, которые должны вынашивать потомство, - раздельное созревание;
6. Гинекологические исследования без патологии.
Выбор реципиентов
В качестве реципиентов использовались телки, отвечающие следующим критериям:
1. Разведение в хозяйствах, свободных от вируса Герпеса, Тип 1;
2. Серологические исследования на антитела BHV-1 (инфекционный ринотрахеит/ инфекционный вульвовагинит) - отрицательные;
3. Серологические исследования на BVD (вирус диареи КРС)/ MD-антиген (мукозная болезнь) - отрицательные;
4. Соответствующее возрасту (13-16 месяцев) развитие тела;
5. Раздельное половое созревание; у животных, которые должны вынашивать потомство, - раздельное созревание;
6. Гинекологические исследования без патологии.
Все реципиенты после помещения в коровники получали минеральные добавки (All Trace, Ranching Consult GmbH) с целью равного обеспечения селеном, медью и кобальтом (Wittkowski et al., Zur Selensupplementierung bei Faersen; Jahrestagung derAET-d. 13.06.-14.06.1996, Маркредвитц).
Отрицательных по вирусу диареи животных иммунизировали против BVD/MD (Rumilis, Intervert) для уменьшения инфекционного риска при пересадке эмбрионов (Moedl et al., Control of bovine viral diarrhea virus in abttoir ovaries for in vitro fertilisation (IVF) of cloning programs; 11e Reunion A.E.Т. Е. -Hannover, 8-9 сентября 1995) или при помещении в коровники с неизвестным статусом по BVD. Кормление осуществляли вволю силажом, сеном и соломой. Весной и осенью проводили противогельминтные обработки (Ivomec, MCD Agvet). Содержание реципиентов было частично беспривязным (открытые коровники, группы по 6 животных), частично - привязным.
Подготовка реципиентов
Пересадку полученных in vitro эмбрионов проводили синхронизированным по половому циклу реципиентам, то есть стадия полового цикла соответствовала возрасту пересаживаемых эмбрионов. При этом день наступления охоты определяли как день 0 цикла. Синхронизацию охоты осуществляли посредством однократного внутримышечного введения аналога простагландина F2-α (2,0 мл Estrumate, Mallinckrodt Veterinary). Телки, у которых посредством ректальной пальпации не диагностировалось желтое тело, не использовались для синхронизации охоты. Охота обычно наступала через 2-3 дня после введения гормона и оценивалась по поведению животных и наличию слизи.
Пересадку полученных in vitro эмбрионов проводили синхронизированным по половому циклу реципиентам, то есть стадия полового цикла соответствовала возрасту пересаживаемых эмбрионов. При этом день наступления охоты определяли как день 0 цикла. Синхронизацию охоты осуществляли посредством однократного внутримышечного введения аналога простагландина F2-α (2,0 мл Estrumate, Mallinckrodt Veterinary). Телки, у которых посредством ректальной пальпации не диагностировалось желтое тело, не использовались для синхронизации охоты. Охота обычно наступала через 2-3 дня после введения гормона и оценивалась по поведению животных и наличию слизи.
Пересадка эмбрионов
Полученные in vitro эмбрионы после 7-ми дневного культивирования пересаживали соответствующим реципиентам. С этой целью после идентификации эмбрионов, их качественной оценки и контроля целостности зоны эмбрионы переносили в соответствующую среду для пересадки и засасывали в минипайеты. В качестве среды для пересадки использовали PBS +10% FCS (Biochrom), среду для культивирования эмбрионов (ICP, Neuseeland) + 10% FCS или TL-Hepes + 10% FCS.
Полученные in vitro эмбрионы после 7-ми дневного культивирования пересаживали соответствующим реципиентам. С этой целью после идентификации эмбрионов, их качественной оценки и контроля целостности зоны эмбрионы переносили в соответствующую среду для пересадки и засасывали в минипайеты. В качестве среды для пересадки использовали PBS +10% FCS (Biochrom), среду для культивирования эмбрионов (ICP, Neuseeland) + 10% FCS или TL-Hepes + 10% FCS.
Закрытые пайеты хранили в миниинкубаторе при 37,8oС около 90 мин до момента их пересадки.
Соответствие реципиентов оценивали по следующим критериям:
у животных приблизительно за 7 дней до пересадки наступала охота, при этом асинхронность в охоте не должна была превышать 24 часа (Hasler et at., Theriogenology 43 (1995), 141-152). Важное значение придавалось наличию и размеру желтого тела (Assey et al., Theriogenology 39, 1321-1330).
у животных приблизительно за 7 дней до пересадки наступала охота, при этом асинхронность в охоте не должна была превышать 24 часа (Hasler et at., Theriogenology 43 (1995), 141-152). Важное значение придавалось наличию и размеру желтого тела (Assey et al., Theriogenology 39, 1321-1330).
У используемых животных не наблюдалось заболеваний полового тракта.
После отбора животных выполняли эпидуральную анестезию (2,0 мл Udocain, Albrecht) и осторожно очищали наружные половые органы с помощью сухой бумаги. Пайету с эмбрионами помещали в катетер для пересадки (Minitüb), подогретый до температуры тела, который закрывали пластиковым колпачком (Sanisheath, (Minitüb)). Пересадку проводили бескровным способом под ректальным контролем прохождения катетера через шейку матки и его позиции в кончике рога матки (Reichenbach et al., J. Reprod. Fertil. 95 (1992), 363-370). При этом снятие пластикового колпачка осуществляли перед помещением катетера в матку с тем, чтобы исключить попадание микроорганизмов из влагалища в матку. Если предполагалось пересаживать несколько эмбрионов одному реципиенту, то пересадку проводили билатерально. С этой целью катетер вытягивали назад в матку, удаляли пустую пайету, после чего вставляли новую пайету с эмбрионом (эмбрионами) и продвигали катетер в другой рог матки. Сразу после пересадки эмбрионов осуществляли документацию данных (номер реципиента, происхождение, число и качество эмбрионов и т.п.).
Исследование беременности
Через 21 день после начала охоты, то есть через 14 дней после пересадки эмбрионов, проводили контроль охоты и определяли содержание прогестерона в крови. Если значение концентрации было ниже 0,1 нг/мл, то животное считали не стельным. Если уровень прогестерона был выше 2,0 нг/мл, то животное считали стельным. Первое непосредственное исследование стельности проводили на 35-ый день стельности посредством ультразвука, а на 42-ой день стельности выполняли мануальное исследование.
Через 21 день после начала охоты, то есть через 14 дней после пересадки эмбрионов, проводили контроль охоты и определяли содержание прогестерона в крови. Если значение концентрации было ниже 0,1 нг/мл, то животное считали не стельным. Если уровень прогестерона был выше 2,0 нг/мл, то животное считали стельным. Первое непосредственное исследование стельности проводили на 35-ый день стельности посредством ультразвука, а на 42-ой день стельности выполняли мануальное исследование.
Claims (14)
1. Способ получения эмбрионов животных, включающий следующие этапы: (а) извлечение фетальных фибробластов, (б) объединение ядра фетальных фибробластов с соответствующей клеткой-реципиентом, при этом фетальные фибробласты до объединения не подвергаются внешним манипуляциям для приведения в фазу G0, (в) размножение полученных таким образом клеток в течение периода времени до образования бластоцист и в соответствующем случае (г) пересадка выращенной клеточной массы животным-реципиентам.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соответствующей клеткой-реципиентом является энуклеированная яйцеклетка.
3. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что фетальные фибробласты сливаются с соответствующей клеткой-реципиентом.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что используемые на этапе (а) фетальные фибробласты происходят из полученных на этапе (г) клеток.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что фетальные фибробласты происходят от животных, выбранных из группы, состоящей из копытных, кроликов, грызунов или птиц.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что животные являются копытными.
7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что животное является крупным рогатым скотом.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, фетальный фибробласт извлекают из трансгенных плодов или животных.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что в генную конструкцию трансгенного плода или животного введен ген, представляющий интерес с точки зрения фармацевтики или физиологии питания.
10. Способ по любому из п. 8 или 9, отличающийся тем, что генный продукт введенного гена синтезируется в молоко.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что введенным геном является химозин или трипсин.
12. Способ по любому из пп. 8-11, отличающийся тем, что введенный ген находится под контролем эндогенного промотора.
13. Способ по любому из пп. 8-11, отличающийся тем, что введенный ген или эндогенный ген находится под контролем экзогенного чужеродного промотора или эндогенного для вида животных промотора.
14. Способ получения животного из искусственного эмбриона, включающий операции получения искусственного эмбриона и выращивания его до заданной степени развития плода, в организме животного-реципиента, отличающийся тем, что искусственный эмбрион получают способом, заявленным в пп. 1-13.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP1998/000230 WO1999036510A1 (de) | 1998-01-16 | 1998-01-16 | Effizienter kerntransfer mit fetalen fibroblasten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2000122047A RU2000122047A (ru) | 2002-10-20 |
| RU2216592C2 true RU2216592C2 (ru) | 2003-11-20 |
Family
ID=8166837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000122047/13A RU2216592C2 (ru) | 1998-01-16 | 1998-01-16 | Способ получения эмбрионов животных и способ выращивания животного из эмбрионов |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6600087B1 (ru) |
| EP (1) | EP0972017B1 (ru) |
| JP (1) | JP4102450B2 (ru) |
| AR (1) | AR018038A1 (ru) |
| AT (1) | ATE278775T1 (ru) |
| AU (1) | AU739902B2 (ru) |
| CA (1) | CA2259368C (ru) |
| DE (1) | DE59812083D1 (ru) |
| RU (1) | RU2216592C2 (ru) |
| WO (1) | WO1999036510A1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2495932C1 (ru) * | 2012-05-31 | 2013-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук (ИХФ РАН) | Способ лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности |
| RU2511418C2 (ru) * | 2007-04-06 | 2014-04-10 | Интернэшнл Стем Селл Корпорейшн | Специфичные для пациента линии стволовых клеток, полученные из человеческих партеногенетических бластоцистов |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9517779D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| US7332648B2 (en) | 1995-08-31 | 2008-02-19 | Roslin Institute | Unactivated oocytes in nuclear transfer to produce cultured inner cell mass cells and ungulates |
| US7361804B1 (en) | 1997-02-19 | 2008-04-22 | Roslin Institute (Edinburgh) | Unactivated oocytes in nuclear transfer to produce ungulates |
| CN101003800A (zh) * | 1997-07-03 | 2007-07-25 | 马萨诸塞大学 | 使用来自无血清饥饿的分化细胞的供体细胞核进行克隆 |
| CA2416877C (en) * | 2000-07-27 | 2013-03-12 | Apogene Gmbh & Co. Kg | Somatic cloning gene transfer for producing recombinant proteins, cells and organs |
| MXPA06003553A (es) * | 2003-09-30 | 2007-02-02 | Sterrenbeld Biotechnologie North America Inc | Un proceso para producir proteina exogena en la leche de mamiferos transgenicos y un proceso para purificar proteinas de la leche. |
| JP5087625B2 (ja) | 2006-09-01 | 2012-12-05 | セラピューティック・ヒューマン・ポリクローナルズ・インコーポレーテッド | 非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトまたはヒト化免疫グロブリンの発現強化 |
| US8618352B2 (en) | 2007-03-28 | 2013-12-31 | University Of Iowa Research Foundation | Transgenic porcine models of cystic fibrosis |
| US8912386B2 (en) | 2007-03-28 | 2014-12-16 | University Of Iowa Research Foundation | Transgenic pig model of cystic fibrosis |
| US7989675B2 (en) | 2007-03-28 | 2011-08-02 | University Of Iowa Research Foundation | Method of identifying compounds using a transgenic pig model of cystic fibrosis |
| US10010336B2 (en) | 2009-12-22 | 2018-07-03 | Cook Medical Technologies, Inc. | Medical devices with detachable pivotable jaws |
| US8545519B2 (en) | 2009-12-22 | 2013-10-01 | Cook Medical Technologies Llc | Medical devices with detachable pivotable jaws |
| BR112012018338B8 (pt) | 2009-12-22 | 2021-06-22 | Cook Medical Technologies Llc | dispositivos médicos com garras giratórias e desmontáveis |
| ES2738476T3 (es) | 2010-08-11 | 2020-01-23 | Inst Nat Sante Rech Med | Cocultivos de células del cúmulo y embriones durante procedimientos de fertilización in vitro |
| EP2627263B1 (en) | 2010-10-11 | 2016-12-07 | Cook Medical Technologies LLC | Medical devices with pivotable jaws |
| AU2011316696B2 (en) | 2010-10-11 | 2015-07-02 | Cook Medical Technologies Llc | Medical devices with detachable pivotable jaws |
| JP5676772B2 (ja) | 2010-10-11 | 2015-02-25 | クック メディカル テクノロジーズ エルエルシーＣｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｌｃ | 取り外し可能かつ回動可能なジョーを備える医療装置 |
| WO2012083041A2 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-21 | Cook Medical Technologies Llc | Medical devices with detachable pivotable jaws |
| CN103999820A (zh) * | 2014-05-12 | 2014-08-27 | 西南科技大学 | 一种杂交黄牛育肥方法 |
| CN105981686A (zh) * | 2015-02-27 | 2016-10-05 | 徐小芹 | 一种兔子的饲养方法 |
| CN107691363A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-02-16 | 黄业钧 | 一种哺乳犊牛饲养与管理方法 |
| CN111296361A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-06-19 | 固原富民农业科技发展有限公司 | 黄牛的科学繁育及生态养殖方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9517780D0 (en) * | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| US5945577A (en) * | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
| US6215041B1 (en) * | 1997-01-10 | 2001-04-10 | University Of Mmassachusetts | Cloning using donor nuclei from a non-quiesecent somatic cells |
| GB9703550D0 (en) | 1997-02-20 | 1997-04-09 | Ppl Therapeutics Scotland Ltd | Cell mediated transgenesis |
| US6011197A (en) * | 1997-03-06 | 2000-01-04 | Infigen, Inc. | Method of cloning bovines using reprogrammed non-embryonic bovine cells |
| CN101003800A (zh) * | 1997-07-03 | 2007-07-25 | 马萨诸塞大学 | 使用来自无血清饥饿的分化细胞的供体细胞核进行克隆 |
-
1998
- 1998-01-16 US US09/230,625 patent/US6600087B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-16 DE DE59812083T patent/DE59812083D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-16 AU AU66144/98A patent/AU739902B2/en not_active Ceased
- 1998-01-16 CA CA2259368A patent/CA2259368C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-16 WO PCT/EP1998/000230 patent/WO1999036510A1/de active IP Right Grant
- 1998-01-16 JP JP50362699A patent/JP4102450B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-16 EP EP98907950A patent/EP0972017B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-16 AT AT98907950T patent/ATE278775T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-01-16 RU RU2000122047/13A patent/RU2216592C2/ru not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-01-18 AR ARP990100169A patent/AR018038A1/es active IP Right Grant
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2511418C2 (ru) * | 2007-04-06 | 2014-04-10 | Интернэшнл Стем Селл Корпорейшн | Специфичные для пациента линии стволовых клеток, полученные из человеческих партеногенетических бластоцистов |
| RU2495932C1 (ru) * | 2012-05-31 | 2013-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук (ИХФ РАН) | Способ лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AR018038A1 (es) | 2001-10-31 |
| JP2000512159A (ja) | 2000-09-19 |
| ATE278775T1 (de) | 2004-10-15 |
| CA2259368A1 (en) | 1999-07-16 |
| JP4102450B2 (ja) | 2008-06-18 |
| US6600087B1 (en) | 2003-07-29 |
| DE59812083D1 (de) | 2004-11-11 |
| EP0972017A1 (de) | 2000-01-19 |
| AU739902B2 (en) | 2001-10-25 |
| CA2259368C (en) | 2010-10-05 |
| AU6614498A (en) | 1999-08-02 |
| EP0972017B1 (de) | 2004-10-06 |
| WO1999036510A1 (de) | 1999-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2216592C2 (ru) | Способ получения эмбрионов животных и способ выращивания животного из эмбрионов | |
| Krimpenfort et al. | Generation of transgenic dairy cattle using ‘in vitro’embryo production | |
| AU721132B2 (en) | Method for development of transgenic goats | |
| JP4153878B2 (ja) | Ｇｔ遺伝子が除去された複製豚及びその生産方法 | |
| US20050183145A1 (en) | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins | |
| US20050177883A1 (en) | Systems of transferring embryos and managing recipients | |
| US7351876B2 (en) | Efficient nuclear transfer with primordial gametes | |
| AU747070B2 (en) | Efficient nuclear transfer using primordial germ cells | |
| JP2011508600A (ja) | 形質転換された複製犬の生産方法 | |
| KR101832485B1 (ko) | 목적유전자를 조건적으로 발현하는 복제된 개과동물의 생산방법 | |
| JP2002543805A (ja) | 核移植胚の非除核、および融合後除核 | |
| Freitas et al. | The use of reproductive technologies to produce transgenic goats | |
| KR20090115025A (ko) | 개과 동물의 복제 생산 방법 | |
| Lian et al. | Application status of genome-editing tools in sheep and goats | |
| US20040055025A1 (en) | Immune response replication in cloned animals | |
| JP2004016115A (ja) | 効率的に体細胞から動物個体を生産する方法 | |
| US7601884B2 (en) | Method of producing cloned animals by demecolcine treatment | |
| JP2005525098A (ja) | ウサギの核クローニング方法並びにその用法 | |
| Spell et al. | Somatic cell cloning in the beef industry | |
| Lai et al. | Animal Cloning | |
| AU2002306437A1 (en) | Method for embryo after impregnation of the recipient female | |
| AU4277400A (en) | A process of cell reprogramming through production of a heterokaryon | |
| KR20080107508A (ko) | 복제 산양의 체세포 핵 이식에 의한 재복제 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070117 |